CN103748221A - 由蛋白g细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体组成的新型改性蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供不损害在中性区域的高的抗体结合活性的、相比含野生型的蛋白G的细胞膜外结构域的蛋白质,在弱酸性区域的免疫球蛋白的Fc区域和的结合性和/或同Fab区域的结合性更降低的优良的蛋白质,同时使用此蛋白质,可使抗体不变性而容易地捕捉、回收。本发明涉及不损害在中性区域的高的抗体结合活性,相比由具有对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性的野生型的细胞膜外结构域组成的多聚体,在弱酸性区域的免疫球蛋白的Fc区域和的结合性和/或同Fab区域的结合性降低的,由具有对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性的该细胞膜外结构域的突变体的串联型多聚体组成的蛋白质等。
Description
【技术领域】
本发明涉及(包含)由抗体结合性蛋白蛋白G的细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体组成的新型改性蛋白质、编码该蛋白质的核酸、及利用了该蛋白质的抗体结合性的抗体、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的捕获剂、和填充了该捕获剂而得到的蛋白质分离纯化用层析用柱等。
【背景技术】
蛋白G是来源于链球菌的蛋白质,其是在链球菌(Streptococcus)属链球菌的细胞膜中存在的膜蛋白质,已知对免疫球蛋白G(抗体中的一种)的Fc区域具有特异性结合活性(非专利文献1、专利文献1)。蛋白G是由多个结构域组成的多结构域型膜蛋白质,显示有对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性(以下,称为“抗体结合活性”)的是其中的一部分的细胞膜外结构域(非专利文献2)。例如在图1中显示的来源于G148株的蛋白G的情况中,显示抗体结合活性的是B1、B2、B3这3个结构域(有文献也记做C1、C2、C3结构域)。另外,在GX7805株的蛋白G中存在3个抗体结合结构域,在GX7809的蛋白G中存在2个抗体结合结构域。已知这些均为将近60个氨基酸的小型蛋白质,在其氨基酸序列之间显示了高的相同性)。另外已知,切断蛋白G而将各结构域单独分开,仍保持抗体结合活性(非专利文献3)。
对于蛋白G的细胞膜外结构域而言,现在已上市,利用其选择性的抗体结合活性的多种含有蛋白G细胞膜外结构域的制品(例如,用于抗体纯化的亲和层析用载体(专利文献3、4)或用于检测抗体的检查试剂、研究试剂等)。已知蛋白G的细胞膜外结构域和抗体的结合力在中性~弱酸性区域高,在强酸性区域低(非专利文献4)。所以,当目的是抗体的分离、回收、纯化时,首先,使含血清等的抗体的样品溶液处于中性状态,使接触固定化蛋白G的细胞膜外结构域的珠等的水不溶性的固相支持体,选择性地吸附抗体。此后,用中性~弱酸溶液(pH5~8)清洗而除去抗体以外的成分。最后,通常加pH2.4~3.5的强酸性溶液而使抗体从固定化的蛋白G脱离,与强酸性溶液一同洗脱(专利文献3)。由此,可以高的纯度分离、回收、纯化抗体。
但是,抗体置于pH2.4~3.5的强酸性溶液的话会因变性凝集等而品质下降,根据抗体的种类的不同,有时还会丧失原本的功能(非专利文献4)。为了防止其发生,尝试在比pH2.4~3.5更高的pH的弱酸性区域处理,但由于蛋白G的细胞膜外结构域和抗体的结合力强,在弱酸性区域抗体不从蛋白G上洗脱下来,得不到足够的回收量。另一方面,已知蛋白G细胞膜外结构域还与Fab结合(非专利文献2)、一个抗体分子可在Fc区域和Fab区域这2个区域与蛋白G细胞膜外结构域结合。一旦变成这样的结合状态,则抗体和蛋白G的细胞膜外结构域不容易解离,难以回收抗体。
至今本发明人等也开发过由有热稳定性、对变性剂的化学稳定性、及对蛋白质分解酶的抗性等(有时将这些特性总称,简称为“蛋白质稳定性”)的蛋白G的细胞膜外结构域突变体组成的改性蛋白质(专利文献5及专利文献6)、还开发过在弱酸性区域的免疫球蛋白的Fc区域和的结合性和/或同Fab区域的结合性降低的改性蛋白质(专利文献7)。但是,这些改性蛋白质均仅含显示抗体结合活性的1个结构域。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:特表平03-501801公报
专利文献2:专利第2764021号公报
专利文献3:特开平03-128400号公报
专利文献4:特开2003-088381号公报
专利文献5:特开2009-95322号公报
专利文献6:特开2009-118749号公报
专利文献7:特开2009-297018号公报
【非专利文献】
非专利文献1:Bjorck L,Kronvall G.(1984)Purification and someproperties of streptococcal protein G,a novel IgG-binding reagent.JImmunol.133,969-974。
非专利文献2:Boyle M.D.P.,Ed.(1990)BacterialImmunoglobulin Binding Proteins.Academic Press,Inc.,San Diego,CA,USA。
非专利文献3:Gallagher T,Alexander P,Bryan P,Gilliland GL.(1994)Two crystal structures of the B1immunoglobulin-bindingdomain of streptococcal protein G and comparison with NMR.Biochemistry 19,4721-4729。
非专利文献4:Gagnon P.(1996)Purification Tools for MonoclonalAntibodies,Validated Biosystems Inc.,Tucson,AZ,USA。
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
从而,本发明要解决的课题是解决上述现有技术中的问题,再者,提供用于抗体纯化等的实用性优良的新的蛋白质、再者,提供以固定化了该蛋白质为特征的、可用作抗体纯化用亲和层析填充剂等的抗体、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质(抗体等)的捕获剂。
更具体而言,提供不损害在中性区域的高的抗体结合活性的、相比含野生型的蛋白G的细胞膜外结构域的蛋白质,在弱酸性区域的免疫球蛋白的Fc区域和的结合性和/或同Fab区域的结合性更降低的优良的蛋白质,同时实现使用此蛋白质而使抗体不变性,进而容易地捕捉、回收抗体的目的。
再者,本发明要解决的课题是提供填充该捕获剂而成的蛋白质分离纯化用层析用柱,特别是,抗体纯化用的亲和层析用柱。
【解决课题的技术方案】
本发明人想到,从固定化蛋白G的细胞膜外结构域的固相支持体进行抗体的酸洗脱时,为了防止抗体被强酸降低质量,认为可以通过改变蛋白G的细胞膜外结构域的氨基酸序列使之可被弱酸性溶液从固相支持体洗脱。锐意研究的结果终于开发出串联连结抗体结合性蛋白质的蛋白G的细胞膜外结构域突变体而构成的由串联型多聚体组成的蛋白质,该蛋白质有与野生型蛋白G同等的在中性区域的与免疫球蛋白Fc区域的结合性,并且,在弱酸性区域的与免疫球蛋白Fc区域的结合性比野生型蛋白G细胞膜外结构域的串联型多聚体还大大降低,还有,由此串联型多聚体组成的蛋白质对IgG1及IgG3等不同亚类的人免疫球蛋白Fc区域显示同样的效果,此外,经确认此串联型多聚体相比由相同的结构域突变体组成的单体中性区域的抗体结合性更为优良,从而完成本发明。
即,本发明的各实施方式如下。
【实施方式1】
蛋白质,其由细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体组成,所述细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体具有对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性。
【实施方式2】
实施方式1所述的蛋白质,其为串联型三聚体、串联型四聚体、或者串联型五聚体。
【实施方式3】
实施方式1或2所述的蛋白质,其中构成多聚体的细胞膜外结构域突变体彼此相同。
【实施方式4】
实施方式1~3中任一项所述的蛋白质,其中各细胞膜外结构域突变体由接头序列连结的。
【实施方式5】
实施方式1~4中任一项所述的蛋白质,其中具有对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性的细胞膜外结构域是链球菌(Streptococcus)属链球菌的蛋白G的B1、B2、或者B3中的任一个。
【实施方式6】
实施方式1~5中任一项所述的蛋白质,其中具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比由野生型蛋白G·B结构域的串联型多聚体组成的蛋白质,至少,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
【实施方式7】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(a)所示的氨基酸序列组成,或由在(a)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B1结构域蛋白质,至少,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的突变体蛋白质:
(a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu,X47表示Asp或Pro,X48表示Ala、Lys或Glu,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况)。
【实施方式8】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(b)所示的氨基酸序列组成,或由在(b)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B2结构域蛋白质,至少,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的突变体蛋白质:
(b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu,X47表示Asp或Pro,X48表示Ala、Lys或Glu,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或His、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况。)
【实施方式9】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(c)所示的氨基酸序列组成,或由在(c)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B3结构域蛋白质,至少,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的突变体蛋白质:
(c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu,X47表示Asp或Pro,X48表示Ala、Lys或Glu、X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或His、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr,并且排除X17成Thr的情况)。
【实施方式10】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(d)所示的氨基酸序列组成,或由在(d)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且相比野生型蛋白G·B1结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质:
(d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况)。
【实施方式11】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(e)所示的氨基酸序列组成,或由在(e)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且相比野生型蛋白G·B2结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质:
(e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况)。
【实施方式12】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(f)所示的氨基酸序列组成,或由在(f)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且相比野生型蛋白G·B3结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质:
(f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况)。
【实施方式13】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(g)所示的氨基酸序列组成,或由在(g)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B1结构域蛋白质,对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质:
(g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp,并且排除X42是Glu的情况)。
【实施方式14】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的各突变体蛋白质,由以下的(h)所示的氨基酸序列组成,或由在(h)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且相比野生型蛋白G·B2结构域蛋白质,对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质:
(h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp,并且排除X42是Glu的情况)。
【实施方式15】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的各突变体蛋白质,由以下的(i)所示的氨基酸序列组成,或由在(i)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且相比野生型蛋白G·B3结构域蛋白质,对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质:
(i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln,并且排除X40是Asp的情况)。
【实施方式16】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体由SEQ ID NO:13~20中任何一个所示的氨基酸序列组成,或由在该氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成。
【实施方式17】
实施方式1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成三聚体的3个细胞膜外结构域突变体由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、或者在该氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成。
【实施方式18】
融合蛋白质,其由将实施方式1~17中任一项所述的蛋白质的氨基酸序列和其他蛋白质的氨基酸序列连结的氨基酸序列组成。
【实施方式19】
核酸,其编码实施方式1~18中任一项所述的蛋白质。
【实施方式20】
实施方式19所述的核酸,其中构成多聚体的细胞膜外结构域突变体是由SEQ ID NO:22~29中任何一个所示的碱基序列组成的核酸。
【实施方式21】
核酸,其与由与实施方式19或20所述的核酸的碱基序列互补的序列组成的核酸在严格的条件下杂交,编码具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比由野生型蛋白G·B结构域的串联型多聚体组成的蛋白质,至少,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的蛋白质。
【实施方式22】
重组载体,其含有实施方式19~21中任一项所述的核酸。
【实施方式23】
转化体,其被导入实施方式22所述的重组载体。
【实施方式24】
固定化蛋白质,其特征在于实施方式1~18中任一项所述的蛋白质固定化在水不溶性的固相支持体上。
【实施方式25】
抗体、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的捕获剂,其含实施方式1~18中任一项所述的蛋白质。
【实施方式26】
抗体、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的捕获剂,其含实施方式24所述的固定化蛋白质。
【发明效果】
通过本发明可提供,在中性区域维持原本的抗体结合活性,相比例如,由[SEQ ID NO:1]所表示的氨基酸序列组成的野生型的蛋白G·B1结构域的串联型多聚体,与IgG1及IgG3等的不同亚类的人免疫球蛋白G的Fc区域的在弱酸性区域的结合性更大降低,另一方面,相比由相同的结构域突变体组成的单体,在中性区域的抗体结合性优良的由串联型多聚体组成的蛋白质。结果,通过利用本发明的串联型多聚体,使捕捉的抗体在弱酸性区域中,在无变性的状态下更容易地洗脱变得可能。
从而,在填充含该蛋白质的本发明的捕获剂的蛋白质分离纯化用层析用柱中,使捕捉的抗体在弱酸性区域中,在无变性的状态下更容易地洗脱变得可能。
再有,在本说明书中引用的专利文献7中,尽管公开了相当于本发明的串联型多聚体的一般概念,但实际上未记载合成例,对如上述一样的显著的效果更无任何记载或提示。
【附图说明】
【图1】是显示链球菌属(Streptococcus sp.)G148来源的蛋白G的基因的结构的图。
【图2】是显示蛋白G的抗体结合结构域的氨基酸序列的图(加下划线部是与B1结构域的相异部分)。
【图3】是显示链球菌属(Streptococcus sp.)G148来源的蛋白G的基因的碱基序列(SEQ ID NO:30)的图(加下划线部对应于结构基因、粗体字部对应于抗体结合结构域)。
【图4】是显示草酰乙酸脱羧酶α-亚基c-末端结构域(OXADac)-蛋白G突变体融合蛋白质的N末序列(SEQ ID NO:31)的图(加下划线部是对应于OXADac的氨基酸序列)。
【图5】是显示蛋白G·B2结构域和人免疫球蛋白G1的Fc区域的复合物的立体结构的图。
【图6】是显示蛋白G·B3结构域和小鼠免疫球蛋白G1的Fab区域的复合物的立体结构的图。
【图7】是显示使用固定化柱的突变体蛋白质的在弱酸性区域的抗体解离性评价(1)的结果的坐标图。
【图8】是显示使用固定化柱的突变体蛋白质的在弱酸性区域的抗体解离性评价(2)的结果的坐标图。
【图9】是将突变体蛋白质的抗体结合解离活性由表面等离子体共振(SPR)法评价的结果。从上段分别示M-PG01、M-PG07、M-PG19的传感图。突变体蛋白质的浓度是100,200,300,400,500nM。
【图10】是显示突变体蛋白质的抗体亲和性(1/KD)的pH依赖性的坐标图。
【图11】是显示突变体蛋白质的抗体亲和性的相对的变化的坐标图。将在各pH的解离常数(KD)用pH7.4的KD标准化。
【图12】是显示突变体蛋白质M-PG19的立体结构(左)的图。为了比较,一并显示野生型蛋白G·B1结构域的立体结构(右)。
【图13】显示在3’末端侧融合半胱氨酸残基、His标签的三聚体野生型PG(CGB01H-3D,图13上)及作为本发明的蛋白质的变异型PG(CGB19H-3D,图13下)的结构域结构及变异氨基酸。
【图14】是显示由环氧活化的CGB01H-3D固定化柱的pH梯度亲和层析的结果的坐标图。
【图15】是显示由环氧活化的CGB19H-3D固定化柱的pH梯度亲和层析的结果的坐标图。
【图16】是显示由CGB19H-3D固定化SulfoLink柱的pH梯度亲和层析的结果的坐标图。
【图17】是显示由环氧活化的CGB01H-3D固定化柱的pH阶段的变化亲和层析的结果的坐标图。
【图18】是显示由环氧活化的CGB19H-3D固定化柱的pH阶段的变化亲和层析的结果的坐标图。
【图19】是显示由环氧活化的固定化柱的pH阶段的变化亲和层析的结果的坐标图。
【图20】是显示由CGB19H-3D固定化SulfoLink柱的pH阶段的变化亲和层析的结果的坐标图。
【图21】是显示蛋白G的细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体和同突变体的单体的比较的坐标图。
【图22】显示蛋白G的细胞膜外结构域突变体的单体(CGB19H-1D)、本发明的串联型三聚体(CGB19H-3D)、本发明的串联型四聚体(CGB19H-4D)、及本发明的串联型五聚体(CGB19H-5D)的结构域结构。
【图23】是显示蛋白G的细胞膜外结构域突变体的单体(CGB19H-1D)和本发明的串联型三聚体(CGB19H-3D)、本发明的串联型四聚体(CGB19H-4D)、或者本发明的串联型五聚体(CGB19H-5D)的比较的相同质量的在蛋白质固定化条件下的SPR测定的结果。
【图24】是图23的相同分子数的在蛋白质固定化条件下的SPR测定的结果。
【图25】是显示从图22,23的SPR测定结果求出的在中性缓冲液中的抗体结合率的比较的柱状图(固定化量:相同质量(上)、相同分子数(下))。
【图26】是显示从图22,23的SPR测定结果求出的在酸性缓冲液中的抗体解离率的比较的柱状图(固定化量:相同质量(上)、相同分子数(下))。
【实施方式】
作为链球菌来源的蛋白质的蛋白G已知有对免疫球蛋白G(一种抗体)的Fc区域的特异性结合活性(参考文献1)、是在利用此抗体结合性的抗体的纯化或除去、及利用抗体的诊断、治疗、检查等中有用的蛋白质。蛋白G在由多个结构域组成的多结构域型膜蛋白质中,显示对有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性(以下。称为“抗体结合活性”)是其中的一部分的细胞膜外结构域(参考文献2)。例如,在图1、图3、及[SEQ ID NO:30]中所示的G148株来源的蛋白G的情况中,显示抗体结合活性的是B1、B2、B3的3个结构域(根据文献也表示为C1、C2、C3结构域)。另外,在GX7805株的蛋白G中存在3个抗体结合结构域,在GX7809的蛋白G中存在2个抗体结合结构域。这些均为将近60个氨基酸的小型蛋白质,在其氨基酸序列之间见到高的相同性(图2)。另外已知,切断蛋白G而分离各结构域单独,仍保持抗体结合活性(参考文献3)。
本发明涉及这样的由具有对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性的细胞膜外结构域的突变体的串联型多聚体组成的蛋白质。多聚体以上述野生型为基准,可适宜作为、例如,二聚体、三聚体、四聚体、或者五聚体。再者,本发明的蛋白质中含的构成多聚体的各自的细胞膜外结构域突变体彼此不同,或彼此相同。
再者,各细胞膜外结构域突变体也可由接头序列连结。这样的接头配可考虑各突变体的氨基酸序列等,本领域技术人员适宜设计而制备。
又、本发明的蛋白质也可为由在N末端侧或C末端侧连结任意其他蛋白质的氨基酸序列的融合型氨基酸序列组成的融合蛋白质。例如,也可作为[氨基酸序列(a)]-接头序列E-蛋白质A、或者,蛋白质B-接头序列F-[氨基酸序列(a)]-接头序列G-蛋白质C-接头序列H-[氨基酸序列(c)]。作为这样的融合蛋白质中使用的其他氨基酸序列,可举出例如,图4或[SEQ ID NO:31]所示的草酰乙酸脱羧酶α-亚基c-末端结构域(OXADac)的氨基酸序列。此时的OXADac-蛋白G突变体融合蛋白质在单一分子中具有OXADac区域来源的亲和素结合活性和蛋白G突变体区域来源的抗体结合活性的多个功能,可如后述实施例所示。
例如,以His标签附带或与其他蛋白质的融合蛋白质的形态合成本发明的蛋白质时,合成之后,将标签和突变体蛋白质之间,或者其他蛋白质和本发明的蛋白质之间用序列特异性蛋白分解酶分解,也有在本发明的蛋白质的N末端侧或C末端侧残留1个至数个氨基酸残基的情况,另外,在使用大肠杆菌等生产本发明的蛋白质时,有在N末端侧附加起始密码子来源的甲硫氨酸等的情况,由这些的氨基酸残基的附加,如下所示,本发明的蛋白质的活性不变。另外,由这些的氨基酸残基的附加,也无丧失设计的变异带来的效果的情况。从而,本发明的蛋白质当然也含这些变异。再有,为了制成无这样的氨基酸残基的附加的本发明的蛋白质,例如,可将使用大肠杆菌等生产的蛋白质再使用甲硫氨酰氨基肽酶等的酶选择性地切断N末的氨基酸残基(参考文献7)、由反应混合物通过层析等分离纯化而得到。
成为本发明的蛋白质中含的串联型构成多聚体的突变体的原来的,具有对具有作为免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的结合活性的细胞膜外结构域的适宜例,可举出链球菌(Streptococcus)属链球菌的蛋白G的B1、B2、或者B3中的任一个。
本发明的蛋白质有具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比由野生型蛋白G·B结构域的串联型多聚体组成的蛋白质,至少,对免疫球蛋白G(IgG1及IgG3)的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性显著地降低的优良的特性。
作为本发明的蛋白质中含的串联型构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体的优选的实施方式,列举以下的突变体蛋白质。
A.本发明的突变体蛋白质的第1实施方式如以下的(1)、(2)所示。
(1)特征在于是以由SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列组成的野生型蛋白G·B1或同B2结构域蛋白质中的,Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44之中之任何1个以上的氨基酸残基作为突变对象部位而被其他氨基酸残基取代的突变体蛋白质,该突变对象部位的各氨基酸残基被以下(i)~(iii)之中任何一个所示的氨基酸残基取代的,对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且相比野生型蛋白G·B1或B2结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fc区域的在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。
(i)在突变对象部位的氨基酸残基是非带电荷氨基酸残基时,向带电荷氨基酸残基的取代
(ii)在突变对象部位的氨基酸残基是带电荷氨基酸残基时,向显示相反电荷的带电荷氨基酸残基的取代
(iii)突变对象部位的氨基酸残基的向组氨酸残基的取代。
(2)特征在于是以由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的野生型蛋白G·B3结构域蛋白质中的,Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44之中之任何1个以上的氨基酸残基作为突变对象部位而被其他氨基酸残基取代的突变体蛋白质,该突变对象部位的各氨基酸残基被以下(i)~(iii)之任何中所示的氨基酸残基取代的,对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且相比野生型蛋白G·B3结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fc区域的在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。
(i)在突变对象部位的氨基酸残基是非带电荷氨基酸残基时,向带电荷氨基酸残基的取代
(ii)在突变对象部位的氨基酸残基是带电荷氨基酸残基时,向显示反电荷的带电荷氨基酸残基的取代
(iii)突变对象部位的氨基酸残基的向组氨酸残基的取代。
上述(1)及(2)的突变体蛋白质是基于以下选定的突变对象部位及该部位的氨基酸残基的取代设计,由基因工程学的方法得到的。
〔基于与Fc的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定〕
导入用于设计本发明的突变体蛋白质的氨基酸序列的变异的部位使用蛋白G·B2结构域和免疫球蛋白G的Fc区域结合的复合物的立体结构原子座标数据(参考文献4)选定。为了降低在弱酸性区域的蛋白G的细胞膜外结构域的抗体结合性,将与和Fc区域的结合直接相关的蛋白G的细胞膜外结构域的结合表面的氨基酸残基及其周边的氨基酸残基从野生型取代为非野生型即可。从而,首先,在蛋白G·B2结构域和免疫球蛋白G的Fc区域结合的复合物中,特别指定在从Fc区域一定的距离的范围内存在的蛋白G·B2结构域的氨基酸残基,将其作为突变对象部位的候选。接下来,为了使伴随氨基酸取代的蛋白G的细胞膜外结构域的结构不稳定化处于最小限度,上述的候选之中,仅将露出到蛋白G·B2结构域的分子表面的氨基酸残基确定为突变对象部位。
从而,具体而言,如后述实施例中所示,将上述的距离范围设定为以内,并且将露出表面积比设为40%以上,从而蛋白G·B2结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:2)之中的,Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44的13个被选定为突变对象部位。
另外,如上所述,由于蛋白G的各细胞膜外结构域序列相同性极其高,也几乎无B1、B2、B3结构域的立体结构的差异,对B2结构域-Fc复合物的立体结构的见解也可适用于B1及B3结构域-Fc复合物。从而,从B2结构域-Fc复合物的立体结构导出的13个是,突变对象部位只要在相当的位置有相同的种类的氨基酸,不仅是在B2结构域,在B1及B2结构域中也可选定为突变对象部位。即,蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1)之中的,Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44的13个,另外,蛋白G·B3结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:3)之中的,Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44的10个被选定为突变对象部位。
另一方面,取代该突变对象部位的原来的氨基酸残基的氨基酸残基特别指定以下的(i)~(iii)中的任何一种。
(i)突变对象部位的野生型的氨基酸残基有非带电荷的侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Pro)时,被有带电荷的侧链的氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His)取代。带电荷氨基酸依赖于pH而化学状态变化大,所以可使蛋白G·B2结构域的抗体结合性在中性区域和弱酸性区域变化。
(ii)突变对象部位的野生型的氨基酸残基是带电荷氨基酸时,被显示反电荷的带电荷氨基酸取代。与上述同样地,带电荷氨基酸依赖于pH而化学状态变化大,所以可使蛋白G·B2结构域的抗体结合性在中性区域和弱酸性区域变化。
(iii)突变对象部位的野生型的氨基酸残基是组氨酸以外的情况时被组氨酸取代。由于组氨酸在中性区域和弱酸性区域化学状态变化大,可使蛋白G·B2结构域的抗体结合性在中性区域和弱酸性区域变化。
具体而言,如后述实施例中所示,作为取代位置的氨基酸残基,对于Asp22特别指定Lys、Arg、或者His,对于Ala24(仅B1,B2结构域)特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Thr25特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys28特别指定Asp、Glu、或者His,对于Val29(仅B1,B2结构域)特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys31特别指定Asp、Glu、或者His,对于Gln32特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Asn35特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Asp36特别指定Lys、Arg、或者His,对于Gly38特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Asp40特别指定Lys、Arg、或者His,对于Glu42(仅B1,B2结构域)特别指定Lys、Arg、或者His,对于Thr44特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His。但是,由这些氨基酸残基的特别指定的氨基酸序列是,Asn35被Lys取代和/或Asp36被Glu取代,除去该取代位置以外的氨基酸序列成为与野生型蛋白G的各细胞膜结构域的氨基酸序列相同的情况。由此,与后述的本发明人的申请中涉及的升高蛋白G细胞膜结构域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
B.本发明的突变体蛋白质的第2实施方式如以下的(3)所示。
(3)特征在于将由SEQ ID NO:1~3中任何一个所示的氨基酸序列组成的野生型蛋白G·B1、B2或B3结构域蛋白质中的,作为Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38之中的任何1个以上的氨基酸残基作为突变对象部位,被除半胱氨酸之外的其他种类的氨基酸残基取代的,对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且相比各对应的野生型蛋白G·B1、B2或B3结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合性降低的突变体蛋白质。上述(3)的突变体蛋白质是基于如下选定的突变对象部位及该部位的氨基酸残基的取代设计,由基因工程学方法得到的。
〔基于与Fab的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定〕
导入用于设计本发明的突变体蛋白质的氨基酸序列的变异的部位使用蛋白G·B3结构域和免疫球蛋白G的Fab区域结合的复合物的立体结构原子座标数据(参考文献5)选定。已知蛋白G的细胞膜外结构域对于免疫球蛋白G的Fc区域也结合,对于Fab区域也结合(参考文献2)。从而,1个抗体分子可同时与多个蛋白G的细胞膜外结构域结合,成为这样的状态,则抗体和蛋白G的细胞膜外结构域的相互作用成为多价,变得无容易地被切断。从而,要想降低在弱酸性区域的蛋白G的细胞膜外结构域的抗体结合性,将与和Fab区域的结合直接相关的蛋白G的细胞膜外结构域的结合表面的氨基酸残基从野生型取代为非野生型即可。从而,首先,在蛋白G·B3结构域和免疫球蛋白G的Fab区域结合的复合物中,特别指定在从Fab区域一定的距离的范围内存在的蛋白G-各细胞膜B3结构域的氨基酸残基,将其作为突变对象部位的候选。接下来,为了使伴随氨基酸取代的蛋白G的细胞膜外结构域的结构不稳定化处于最小限度,上述的候选之中,仅将露出到蛋白G·B3结构域的分子表面的氨基酸残基确定为突变对象部位。
具体而言,如后述实施例中所示,将上述的距离范围设定为以内,并且使露出表面积比成为40%以上,从而[SEQ ID NO:3]所示的蛋白G·B3结构域的野生型氨基酸序列之中的,Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38的10个被选定为突变对象部位。另外,如上所述,蛋白G的各细胞膜外结构域如上所述相同性极其高,这些的突变对象部位在B1、B2、B3的何结构域中也共同存在。从而,这些不仅是在B3结构域,在B1及B2结构域中也可被选定为突变对象部位。
另一方面,取代该突变对象部位的原来的氨基酸残基的氨基酸残基可由以下的方法特别指定。(iV)被野生型的氨基酸和半胱氨酸以外的其他种类的氨基酸残基取代。由此,除了避免伴随半胱氨酸的导入的交联反应的危险性,还可导致与由野生型的氨基酸的变异的Fab区域的结合性的降低。
具体而言,如后述实施例中所示,作为取代野生型蛋白G各细胞外结构域蛋白质的氨基酸残基,对于Lys10特别指定Lys和Cys之外的残基,对于Thr11特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Lys13特别指定Lys和Cys之外的残基,对于Gly14特别指定Gly和Cys之外的残基,对于Glu15特别指定Glu和Cys之外的残基,对于Thr16特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Thr17特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Asn35特别指定Asn和Cys之外的残基,对于Asp36特别指定Asp和Cys之外的残基,对于Gly38特别指定Gly和Cys之外的残基。但是,由这些的氨基酸残基的选定的氨基酸序列是,Asn35被Lys和/或Asp36被Glu取代,除去该取代位置以外的氨基酸序列成为与野生型蛋白G的各细胞膜结构域的氨基酸序列相同的情况。由此,与后述的本发明人的申请中涉及的升高蛋白G细胞膜结构域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
C.本发明的突变体蛋白质的第3实施方式共有用于改良对上述免疫球蛋白Fc区域的结合性的氨基酸残基的取代和用于改良向Fab区域的结合性的氨基酸残基的取代。
〔基于与Fc及Fab的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定〕
将基于上述与Fc的结合表面解析特定的突变对象部位和取代的氨基酸残基,及基于上述Fab的结合表面解析特别指定的突变对象部位和取代的氨基酸残基组合,进行突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定。具体而言,作为突变对象部位,蛋白G·B1、B2结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1,2)之中的,Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38的20个被选定为突变对象部位。其中Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44是用于改良对Fc区域的结合性的靶部位,另外,Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17是用于改良对Fab区域的结合性的靶部位。其中,Asn35、Asp36、Gly38是对Fc区域的结合性的改良部位的同时是对Fab区域的结合性的改良部位。从而,被用于对于对Asn35、Asp36、Gly38的Fc区域的结合性的改良的上述A中所示的氨基酸残基取代也同时是用于对Fab区域的结合性的改良的,除半胱氨酸残基之外的向其他氨基酸残基的取代。
即,本说明书中所说的氨基酸残基取代的“共有”是指,在用于对Fc区域的结合性的改良的突变对象部位和用于对Fab区域的结合性的改良的突变对象部位被不同地选定时,除了组合氨基酸残基的取代的情况之外,作为用于这两者的结合性的改良的突变对象部位,选定相同的部位,在进行上述A中所示的氨基酸残基的取代时也以该意义定义。
作为取代的氨基酸残基,对于Asp22选定Lys、Arg、或者His,对于Ala24选定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Thr25选定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys28选定Asp、Glu、或者His,对于Val29选定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys31选定Asp、Glu、或者His,对于Gln32选定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Asp40选定Lys、Arg、或者His,对于Glu42选定Lys、Arg、或者His,对于Thr44选定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys10选定Lys和Cys之外的残基,对于Thr11选定Thr和Cys之外的残基,对于Lys13选定Lys和Cys之外的残基,对于Gly14选定Gly和Cys之外的残基,对于Glu15选定Glu和Cys之外的残基,对于Thr16选定Thr和Cys之外的残基,对于Thr17选定Thr和Cys之外的残基,对于Asn35选定Asn和Cys之外的残基,对于Asp36选定Asp和Cys之外的残基,对于Gly38选定Gly和Cys之外的残基。
另一方面,对于蛋白G·B3结构域而言,野生型氨基酸序列(SEQID NO:3)之中的,Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38的17个被选定为突变对象部位。其中Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44是用于改良对Fc区域的结合性的突变对象部位,另外,Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17是用于改良对Fab区域的结合性的突变对象部位。其中Asn35、Asp36、Gly38是对Fc区域的结合性的改良部位的同时也是对Fab区域的结合性的改良部位的点是共同的,被用于对于对Asn35、Asp36、Gly38的Fc区域的结合性的改良的上述A中所示的氨基酸残基取代也同时是用于对Fab区域的结合性的改良的除半胱氨酸残基之外的向其他氨基酸残基的取代,这与上述蛋白G·B1或B2结构域同样。
但是,基于上述氨基酸残基的选定设定的氨基酸序列是Asn35被Lys取代和/或Asp36被Glu取代,除去该取代位置以外的氨基酸序列成为与野生型蛋白G的各细胞膜结构域的氨基酸序列相同的情况。由此,与后述的本发明人的申请中涉及的升高蛋白G细胞膜结构域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
本发明的突变体蛋白质的具体例如以下(a)~(c)中所示。
(a)是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(a)所示的氨基酸序列组成,或由在(a)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B1结构域蛋白质,至少,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的突变体蛋白质。
(a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu,X47表示Asp或Pro,X48表示Ala、Lys或Glu,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况。)
(b)是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(b)所示的氨基酸序列组成,或由在(b)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B2结构域蛋白质,至少,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的突变体蛋白质。
(b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu,X47表示Asp或Pro,X48表示Ala、Lys或Glu,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况。)
(c)是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(c)所示的氨基酸序列组成,或由在(c)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B3结构域蛋白质,至少,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的突变体蛋白质。
(c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu,X47表示Asp或Pro,X48表示Ala、Lys或Glu、X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况。)
再有,上述(a)~(c)的氨基酸残基的定义中,条件是与野生型蛋白G的各细胞膜结构域蛋白质及后述的本发明人的申请中涉及的升高蛋白G细胞膜结构域的稳定性的突变体蛋白质区别开来。
更具体性的本发明的突变体蛋白质加以下的(d)~(i)中所示。
(d)是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(d)所示的氨基酸序列组成,或由在(d)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且相比野生型蛋白G·B1结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。
(d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况。)
(e)是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(e)所示的氨基酸序列组成,或由在(e)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且相比野生型蛋白G·B2结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。
(e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况。)
(f)是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(f)所示的氨基酸序列组成,或由在(f)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且相比野生型蛋白G·B3结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。
(f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况。)
(g)是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(g)所示的氨基酸序列组成,或由在(g)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B1结构域蛋白质,对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。
(g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp,并且排除X42是Glu的情况。)
(h)是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的各突变体蛋白质,由以下的(h)所示的氨基酸序列组成,或由在(h)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且相比野生型蛋白G·B2结构域蛋白质,对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。
(h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp,并且排除X42是Glu的情况。)
(i)是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的各突变体蛋白质,由以下的(i)所示的氨基酸序列组成,或由在(i)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,具有对免疫球蛋白G的Fc区域的结合活性,并且相比野生型蛋白G·B3结构域蛋白质,对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质。
(i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln,并且排除X40是Asp的情况)。再有,上述(d)~(i)的氨基酸残基的定义中,条件是,与野生型蛋白G的各细胞膜结构域蛋白质区别开来。
从上述可知,在本发明的突变体蛋白质的设计中,选定的突变对象部位及取代该部位的氨基酸残基不限于各一个,所以可从取代突变对象部位及该部位的氨基酸残基之中适宜选择,设计突变体蛋白质的氨基酸序列。例如,为了对免疫球蛋白G的Fc区域的结合性的改良,作为突变对象部位,选择野生型蛋白G·B1或B2结构域的氨基酸序列中的Asp22、Thr25、Gln32、Asp40、及Glu42,作为与其对应的取代的氨基酸残基,选择Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、及Glu42His,对蛋白G·B1或B2结构域的野生型氨基酸序列(SEQ IDNO:1、2)进行任何1个氨基酸取代或组合这些氨基酸取代的至最大5个变异位置/5取代的点变异或多重变异,可设计多个突变体蛋白质的氨基酸序列。上述的,(g)、(h)的氨基酸序列呈现这样的至最大5个变异位置/5取代的点变异及多重变异,是本发明的突变体蛋白质之一例。
另外,除了对上述免疫球蛋白G的Fc区域的结合性的改良之外,作为再加对Fab区域的结合性的改良的突变体蛋白质的例,可举出对蛋白G·B1或B2结构域的野生型氨基酸序列进行例如,选择野生型蛋白G·B1或B2结构域的Thr11及Thr17,作为与其对应的取代的氨基酸残基,选择Thr11Arg及Thr17Ile,将这些加到上述至最大5个变异位置/5取代的变异而导入的最大7个变异位置/7取代的变异的突变体蛋白。上述(d)及(e)的氨基酸序列显示这样的至最大7个变异位置/7取代的点变异或多重变异的例,这些氨基酸序列之中,有Thr11Arg和/或Thr17Ile的变异,并且有上述Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、及Glu42His所示的变异之中任何一个以上的变异,除了对免疫球蛋白G的Fc区域的结合性的改良之外,还改良对Fab区域的结合性。
另一方面,上述(i)的氨基酸序列虽是野生型蛋白G·B3的突变体蛋白质的氨基酸序列的例,但除了成为作为上述用于对Fc区域的结合性改良的变异的Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His中的任何1个以上、至最大4个变异位置/4取代的变异之外,与(g)、(h)的氨基酸序列同样地设计。另外,上述(f)的氨基酸序列虽是野生型蛋白G·B3的突变体蛋白质的氨基酸序列的例,但除了成为作为上述用于对Fc区域的结合性改良的变异的Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、作为上述用于对Fab区域的结合性的改良的变异的Thr11Arg、Thr17Ile中的任何1个以上、至最大6个变异位置/6取代的变异之外,与(d)、(e)的氨基酸序列同样地设计。
在本发明中,除了这样的变异之外,还可再加已知使蛋白G的细胞膜外结构域的性质优化的变异。由本发明人的从前的研究可知例如,升高对蛋白G的细胞膜外结构域的热稳定性、变性剂的化学稳定性、及对分解酶的抗性的变异方法(专利文献6)。即,Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys、及Ala48Glu之中一以上的变异的导入升高蛋白G·B1、B2或B3结构域之上述稳定性。这些的变异可通过组合本发明中的用于对免疫球蛋白G的Fc区域的结合特性和/或对Fab区域的结合特性的改良的上述变异,从而使本发明的突变体蛋白质变得更有用。
例如,对蛋白G·B1或B2结构域的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1,2)进行将这些变异加到上述的最大7个变异位置/7取代而导入的至最大12个变异位置/14取代的多重变异,从而可设计更稳定化的,多个突变体蛋白质的氨基酸序列。
上述的,(a)、(b)的氨基酸序列显示这样的最大12个变异位置/14取代的点变异及多重变异,但排除加到野生型的序列而仅用于稳定化的变异。
这些的(a)、(b)的氨基酸序列中,Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys及Ala48Glu之中,任何一个以上的变异的导入除了上述的最大7个变异位置/7取代的效果的对免疫球蛋白G的Fab区域的结合特性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合特性的改良之外,升高蛋白G·B1或B2结构域突变体蛋白质的稳定性。
另一方面,上述(c)显示野生型蛋白G·B3的突变体蛋白质的氨基酸序列的例,显示最大11个变异位置/13取代的点变异及多重取代,但除了成为上述用于对Fc区域的结合性改良用的变异的,Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His中的任何1个以上、至最大4变异位置/4取代的变异之外,与(a)、(b)的氨基酸序列同样地设计。从而,(c)的氨基酸序列中,Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys及Ala48Glu之中,任何一个以上的变异的导入除了对免疫球蛋白G的Fab区域的结合特性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合特性的改良之外,同样地升高蛋白G·B3结构域突变体蛋白质的稳定性。
本发明中的突变对象部位,如上所述使用蛋白G的B2结构域-Fc复合物及同B3结构域-Fab复合物的各立体结构原子座标数据选定,但B1结构域不仅是在氨基酸序列(图2)、在立体结构上也与B2结构域几乎无差异,所以上述选定的变异的效果对各自的结构域等同有效。另外,B3结构域,不仅在氨基酸序列(图2)、在立体结构上也与B2结构域几乎无差异,所以B2结构域中的上述选定的变异的效果对各结构域等同有效。
例如,上述选定的12个变异位置的野生型氨基酸残基在上述B2结构域和上述B1结构域之间全部共同。从而,对与B2结构域相同性高的B1氨基酸序列导入将上述选定的5个变异位置/5取代、或者7个变异位置/7取代、或者12个变异位置/14取代组合的点变异及多重变异,可作为B1结构域的突变体蛋白质的氨基酸序列。另外,上述选定的12个变异位置的野生型氨基酸只要除去42位,在上述B2结构域和上述B3结构域之间全部共同(42位的野生型氨基酸残基在B2结构域中是Glu42、在B3结构域中是Val42)。从而,对与B2结构域相同性高的B3结构域的氨基酸序列导入将从上述选定的5个变异位置/5取代、或者7个变异位置/7取代、或者12个变异位置/14取代,除去仅42位的变异位置的4个变异位置/4取代、或者6个变异位置/6取代、或者11个变异位置/13取代组合的点变异及多重变异,可作为B3结构域的突变体蛋白质的氨基酸序列。这如后述实施例中所示,还可从使用蛋白G的B2结构域-Fc复合物及同B3结构域-Fab复合物的各立体结构原子座标数据选定的B1结构域的突变体蛋白质有期望的性能得知。
以上、本发明的突变体蛋白质的氨基酸序列不限于一个,存在多个,这些中,具体例示优选的序列,则可举出例如,[SEQ ID NO:13]、[SEQ ID NO:14]、[SEQ ID NO:15]、[SEQ ID NO:16]、[SEQ IDNO:17]、[SEQ ID NO:18]、[SEQ ID NO:19]、或者[SEQ ID NO:20]所示的氨基酸序列。
[SEQ ID NO:13]所示的突变体蛋白质是,对[SEQ ID NO:1]所示的蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列,向从发明人的从前的研究得知升高对蛋白G的细胞膜外结构域的热稳定性、变性剂的化学稳定性、及对分解酶的抗性的部位导入变异的蛋白质,[SEQ ID NO:14]、[SEQ ID NO:15]、[SEQ ID NO:19]、及[SEQ ID NO:20]所示的突变体蛋白质是,除此之外,向基于与Fc的结合表面解析选定的部位导入变异的蛋白质。
另一方面,[SEQ ID NO:16]、[SEQ ID NO:17]、及[SEQ IDNO:18]所示的突变体蛋白质是,对[SEQ ID NO:1]所示的蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列,向由发明人的从前的研究得知升高蛋白G的细胞膜外结构域的热稳定性、对变性剂的化学稳定性、及对分解酶的抗性的部位,和基于Fab的结合表面解析选定的部位导入变异的蛋白质。
本发明的突变体蛋白质只要对抗体或免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质有结合活性,相比野生型的蛋白G的各细胞膜外结构域蛋白质,至少,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低,则在上述本发明的突变体蛋白质中任何一个所示的氨基酸序列中,一个或数个(例如,2个~5个)的氨基酸残基发生缺失、取代、***、附加等的变异也可,从而,它们对成为基准的各氨基酸序列,序列相同性是90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上。
作为本发明的蛋白质之一例,可举出实施例中记载的,构成串联型多聚体的3个细胞膜外结构域突变体由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
1.蛋白质的制造
(1)由基因工程学方法的蛋白质的制造
a.编码突变体蛋白质的基因
在本发明中为了制造上述设计的蛋白质,可使用基因工程学方法。
这样的方法中使用的基因是由编码上述A~C中所示的蛋白质、更具体而言,上述(a)~(i)中的任一个所示的氨基酸序列,或者在(a)~(i)中任何一个所示的氨基酸序列中1或数个氨基酸残基有缺失、取代或附加的氨基酸序列的蛋白质,并且编码与抗体或免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质有结合活性,并且相比中性区域在弱酸性区域的结合活性降低的蛋白质的核酸组成,例如,更具体而言,由[SEQ ID NO:22]~[SEQ ID NO:29]所示的任何的碱基序列组成的核酸。
另外,作为本发明中使用的基因,可举出与由与以上的核酸的碱基序列互补的序列组成的核酸在严格的条件下杂交的核酸,并且编码对抗体或免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质有结合活性,并且相比对应的各野生型蛋白G-细胞膜外结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的上述突变体蛋白质的蛋白质的核酸。其中,严格的条件是指,形成特异性的杂交体,不形成非特异性的杂交体的条件。例如,例如,是指有高的相同性(相同性为60%以上、优选为80%以上、更优选为90%以上、最优选为90%以上)的核酸杂交的条件。更具体而言是指,钠浓度是150~900mM、优选为600~900mM,温度是60~68℃、优选为65℃的条件。例如杂交条件是65℃,清洗的条件是在含0.1%SDS的0.1×SSC中65℃、10分钟的情况,由惯例方法、例如DNA印迹、点印迹杂交等确认杂交时,称之为在严格的条件下杂交。
作为编码本发明的蛋白质的基因,根据本发明的蛋白质的希望得到的结构,含以上的核酸和编码上述任意的接头序列的核酸。也可为编码构成串联型多聚体的各突变体蛋白质的核酸和编码接头序列的核酸分别交替多个连结,或者也可将该核酸和编码任意的蛋白质的氨基酸序列的核酸连结,设计为编码融合型氨基酸序列。
b.基因、重组载体及转化体
上述的本发明的基因可由化学合成、PCR、盒变异法、位点特异性变异导入法等合成。例如,化学合成多个在末端有20个碱基对左右的互补区域的至100碱基左右的寡核苷酸,可通过将这些组合进行重叠延伸法(参考文献8)来全合成目的基因。
本发明的重组载体可通过向适当的载体连结(***)含上述的碱基序列的基因而得到。作为本发明中使用的载体,只要是可在宿主中复制的或可将目的基因重组进宿主基因组的,就不特别限定。例如,可举出噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等。
作为质粒DNA,可举出放线菌来源的质粒(例如pK4,pRK401,pRF31等)、大肠杆菌来源的质粒(例如pBR322,pBR325,pUC118,pUC119,pUC18等)、枯草芽孢杆菌来源的质粒(例如pUB110,pTP5等)、酵母来源的质粒(例如YEp13,YEp24,YCp50等)等,作为噬菌体DNA,可举出λ噬菌体(λgt10、λgt11、λZAP等)。再者,也可使用逆病毒或痘苗病毒等的动物病毒、杆状病毒等的昆虫病毒载体。
为了将载体***基因,首先采用,将纯化的DNA用适当的限制性内切酶切断,***适当的载体DNA的限制性内切酶部位或多克隆位点而连结到载体的方法等。基因有必要整合入载体至表达本发明的突变体蛋白质。从而,在本发明的载体中,启动子、基因的碱基序列之外,根据期望可连结增强子等的顺式元件、剪接信号、聚A附加信号、选择标志物、核糖体结合序列(SD序列)、起始密码子、终止密码子等。另外,也可连结用于使制造的蛋白质的纯化容易的标签序列。作为标签序列,可利用编码His标签、GST标签、MBP标签、BioEase标签等的公知的标签的碱基序列。
是否基因被***载体的确认可利用公知的基因工程学技术进行。例如,在质粒载体等的情况中,可通过使用感受态细胞将载体亚克隆,提取DNA后,使用DNA测序仪特定其碱基序列来确认。对于其他载体也可使用细菌或其他宿主进行亚克隆的,可利用同样的方法。另外,利用药剂抗性基因等的选择标志物的载体筛选也有效。
转化体可通过将本发明的重组载体以本发明的突变体蛋白质可表达的方式导入宿主细胞来得到。作为转化中使用的宿主,只要是可表达蛋白质或多肽,就无特别限定。例如,可举出细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)、酵母、植物细胞、动物细胞(COS细胞、CHO细胞等)、昆虫细胞。
在以细菌作为宿主时,优选重组载体可在该细菌中自律复制的同时,由启动子、核糖体结合序列、起始密码子、编码本发明的突变体蛋白质的核酸、转录终止序列构成。作为大肠杆菌,可举出例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21等,作为枯草芽孢杆菌,可举出例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。向细菌的重组载体的导入方法,只要是向细菌导入DNA的方法,就无特别限定。例如可举出热休克法、使用钙离子的方法、电穿孔法等。
以酵母作为宿主时,使用例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。向酵母的重组载体的导入方法,只要是向酵母导入DNA的方法,就无特别限定,可举出例如电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法等。
以动物细胞作为宿主时,使用猴细胞COS-7、Vero、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠L细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。作为向动物细胞的重组载体的导入方法,可举出例如电穿孔法、磷酸钙法、脂转染法等。
以昆虫细胞作为宿主时,使用Sf9细胞等。作为向昆虫细胞的重组载体的导入方法,可举出例如磷酸钙法、脂转染法、电穿孔法等。
确认基因是否被导入宿主可由PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等进行。例如,从转化体制备DNA,设计DNA特异性引物进行PCR。接下来,对于PCR的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等,由溴化乙啶、SyberGreen液等染色,通过作1条条带检测扩增产物,可确认转化。另外,也可使用预先由荧光染料等标记的引物进行PCR,检测扩增产物。
c.由转化体培养的蛋白质的取得
在作为重组蛋白质制造时,本发明的蛋白质可通过培养上述的转化体,从该培养物采集来得到。培养物可指,培养上清、培养细胞或培养菌体或细胞或菌体的破碎物之任何。培养本发明的转化体的方法根据宿主的培养中使用的通常的方法进行。
培养以大肠杆菌或酵母菌等的微生物作为宿主而得到的转化体的培养基含有微生物可利用的碳源、氮源、无机盐类等,只要是可有效进行转化体的培养的培养基,也可使用天然培养基、合成培养基之任何。作为碳源,可举出葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等的碳水化物、醋酸、丙酸等的有机酸、乙醇、丙醇等的醇类。作为氮源,可举出氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等的无机酸或有机酸的铵盐或其他含氮化合物之外,还可举出胨、肉提取物、玉米浆等。作为无机物,可举出磷酸一钾、磷酸二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。培养,通常在振荡培养或通气搅拌培养等的好氧的条件下,于20~37℃进行12小时~3天。
培养后,在菌体内或细胞内生产本发明的蛋白质时,通过重复实施超声波处理、冷冻融解,均浆器处理等破碎菌体或细胞而采集该蛋白质。另外,在菌体外或细胞外生产该蛋白质时,直接使用培养液,由离心分离等除去菌体或细胞。其后,通过单独或适宜组合使用蛋白质的分离纯化中使用的一般生物化学方法、例如硫酸铵沉淀、凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等,可从上述培养物中分离纯化本发明的蛋白质。
另外,利用混合蛋白质的生物合成反应中涉及的因子(仅酶、核酸、ATP、氨基酸等)的,所谓的无细胞合成***,则不使用活细胞,可由载体将本发明的突变体蛋白质在试管内合成(参考文献9)。其后,使用与上述同样的纯化法,可从反应后的混合溶液分离纯化本发明的突变体蛋白质。
为了确认分离纯化的本发明的蛋白质是否是由目的氨基酸序列组成的蛋白质,分析含该蛋白质的样品。作为分析方法,可利用SDS-PAGE、蛋白印迹、质谱分析、氨基酸分析、氨基酸测序仪等(参考文献10)。
(2)由其他方法的蛋白质的制造
本发明的蛋白质也可由有机化学方法、例如固相肽合成法等制造。利用这样的方法的蛋白质的生产方法在当技术领域公知,接下来对其进行简洁说明。
由固相肽合成法以化学方式制造蛋白质时,优选利用自动合成机,通过重复活化的氨基酸衍生物的缩聚反应,在树脂上合成有本发明的蛋白质的氨基酸序列的保护多肽。接下来,将此保护多肽从树脂上切断,则一同侧链的保护基也同时切断。已知在此切断反应中,根据树脂或保护基的种类、氨基酸的组成,有适宜的混合物(参考文献11)。此后,从有机溶剂层将粗纯化蛋白质移到水层,纯化目的蛋白质。作为纯化法,可利用逆相层析等(参考文献11)。
2.蛋白质的固定化
本发明的蛋白质,利用其抗体结合性,可作为抗体等的捕获剂利用。该抗体捕获剂可在抗体的纯化或除去、利用抗体的诊断、治疗、检查等中使用。
本发明的抗体捕获剂只要含本发明的蛋白质,可为任何形态,优选为,将本发明的突变体蛋白质固定化到水不溶性的固相支持体的形态是适宜的。作为使用的水不溶性载体,可举出玻璃珠、硅胶等的无机载体、交联聚乙烯基醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等的合成高分子或结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等的多糖类制成的有机载体、还有由这些的组合得到的有机-有机、有机-无机等的复合载体等,在其中,由于亲水性载体非特异吸附比较少,抗体或免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的选择性是良好而优选。这里说到的亲水性载体是指,使构成载体的化合物成为平板状时的与水的接触角是60度以下的载体。作为这样的载体,可举出纤维素、壳聚糖、葡聚糖等的多糖类、聚乙烯基醇、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物皂化物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸接枝化聚乙烯、聚丙烯酰胺接枝化聚乙烯、玻璃等制成的载体作为代表例。
作为市售品,可例示作为多孔质纤维素凝胶的GCL2000、GC700、烯丙基葡聚糖和亚甲基双丙烯酰胺由共价键交联的Sephacryl S-1000、作为丙烯酸系的载体的Toyopearl、作为琼脂糖系的交联载体的SepharoseCL4B、作为由环氧基活化的聚甲基丙烯酰胺的EupergitC250L等。但是,在本发明中不仅限于这些载体、活化载体。上述的载体可各自单独使用,也可将任意2种以上混合。另外、作为本发明中使用的水不溶性载体,从本抗体捕获剂的使用目的及方法来看,表面积大是优选的,有多数适当大小的细孔,即,多孔质是优选的。
作为载体的形态,珠状、纤维状、膜状(也包括中空丝)等均可,可选任意的形态。从具有特定的排除极限分子量的载体制作的容易度来看珠状是特别优选使用的。珠状的平均粒径以10~2500μm的容易使用,尤其是,从配体固定化反应的容易度的方面来看,25μm~800μm的范围是优选的。
再者,在载体表面存在可在配体的固定化反应中使用的官能基,则适合于配体的固定化。作为这些官能基的代表例,可举出羟基、氨基、醛基、羧基、巯基、硅烷醇基、酰胺基、环氧基、琥珀酰亚胺基、酸酐基、碘乙酰基等。
在向上述载体的突变体蛋白质的固定化中,通过使突变体蛋白质的立体障碍变小来升高捕捉效率,再者,为了抑制非特异性的结合,经亲水性间隔物固定化是更优选的。作为亲水性间隔物,例如,使用将两末端用羧基、氨基、醛基、环氧基等取代的聚亚烷基氧化物的衍生物是优选的。
导入上述的载体的突变体蛋白质及作为间隔物使用的有机化合物的固定化方法及条件不特别限定,一般而言例示将蛋白质或肽固定化到载体时采用的方法。可举出使载体与溴化氰、表氯醇、二缩水甘油基醚、甲苯磺酰氯化物、三氟乙磺酰氯化物、肼等反应而活化载体(由载体原本具有的官能基而作为配体固定化的化合物变成易反应的官能基)、与作为配体固定化的化合物反应、固定化的方法、另外,通过向载体和作为配体固定化的化合物存在的***加如碳二亚胺一样的缩合试剂、或者,如戊二醛一样分子中具有多个官能基的试剂而缩合、交联的固定化方法,但在捕获剂的灭菌时或利用时适用蛋白类不容易从载体脱离的固定化方法是更优选的。
1.蛋白质及抗体捕获剂的性能确认试验
如上述一样制造的突变体蛋白质及蛋白质(以下,也简称为“蛋白质”)、及抗体捕获剂可选择可进行以下的性能确认试验的良好的物质,本发明的蛋白质及抗体捕捉材料均有良好的性能。
(1)抗体结合性试验
本发明的蛋白质的抗体结合性可利用蛋白印迹、免疫沉降、下拉测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、表面等离子体共振(SPR)法等确认-评价。在其中,SPR法由于可无需标记地实时经时观察活体间的相互作用,从而可从速度论的观点定量评价突变体蛋白质的结合反应。
另外,固定化到水不溶性的固相支持体的突变体蛋白质的抗体结合性可用上述的SPR法或液相层析法确认-评价。在其中,液相层析法可的确评价给抗体结合性带来的pH依赖性。
(2)蛋白质的热稳定性试验
本发明的突变体蛋白质的热稳定性可利用圆二色性(CD)光谱、荧光光谱、红外分光法、示差扫描热量测定法、加热后的残留活性等进行评价。在其中,CD光谱由于是敏锐反映蛋白质的二级结构的变化的分光学分析方法,观测突变体蛋白质的对温度的立体结构的变化,可热力学地定量评价结构稳定性。
〔参考文献〕
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参考文献11;大野茂男、西村善文监修(1997)蛋白质实验流程2-结构解析编、秀润社
以下,使用实施例具体说明本发明。但是,本发明的技术的范围不限于这些实施例。再有,在本说明书中,各种氨基酸残基用以下的缩写记载。Ala;L-丙氨酸残基、Arg;L-精氨酸残基、Asp;L-天冬氨酸残基、Asn;L-天冬酰胺残基、Cys;L-半胱氨酸残基、Gln;L-谷氨酰胺残基、Glu;L-谷氨酸残基、Gly;L-甘氨酸残基、His;L-组氨酸残基、Ile;L-异亮氨酸残基、Leu;L-亮氨酸残基、Lys;L-赖氨酸残基、Met;L-甲硫氨酸残基、Phe;L-苯丙氨酸残基、Pro;L-脯氨酸残基、Ser;L-丝氨酸残基、Thr;L-苏氨酸残基、Trp;L-色氨酸残基、Tyr;L-酪氨酸残基、Val;L-缬氨酸残基。另外,在本说明书中,将肽的氨基酸序列,以其氨基末端(以下称为N末端)位于左侧,羧基末端(以下称为C末端)位于右侧的方式,根据常规方法记述。
【实施例】
【实施例1】
在本实施例中,选定用于设计向蛋白G的B1、B2、或者B3结构域导入变异的成为本发明的基础的突变体蛋白质(此后称为“改性蛋白G”)的氨基酸序列的导入变异的部位,特别指定取代的氨基酸残基。
【1.基于与Fc的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定】
首先,蛋白G·B2结构域和人免疫球蛋白G1的Fc区域的复合物的立体结构座标数据从作为国际性的蛋白质立体结构数据库的Protein Data Bank(PDB;http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下载(PDB编码:1FCC)。接下来,将是在从Fc区域的距离的范围内存在的蛋白G·B2结构域的氨基酸残基,并且,在蛋白G·B2结构域单独的情况具有40%以上的露出表面积比的氨基酸残基使用该立体结构座标数据进行计算,选定为突变对象部位。选定的部位的氨基酸残基是[SEQ ID NO:2]所示的蛋白G·B2结构域的野生型氨基酸序列之中的,Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44的13个。图5表示了这些的突变对象部位的位置。这些突变对象部位在B1结构域中也共同存在。从而,这些不仅是在B2结构域,在B1结构域中也可选定为突变对象部位。即,将[SEQ ID NO:1]所示的蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列之中的,Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44的13个选定为突变对象部位。另外,这些的突变对象部位之一部分在B3结构域中也共同存在。从而,这些不仅是在B2结构域,在B3结构域中也可选定为突变对象部位。即,选定[SEQ ID NO:3]所示的蛋白G·B3结构域的野生型氨基酸序列之中的,Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44的10个为突变对象部位。
另一方面,取代选定的突变对象部位的原来的氨基酸残基的氨基酸残基,(i)在原来的氨基酸残基有非带电荷的侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Pro)时,特别指定为有带电荷的侧链的氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His),(ii)在原来的氨基酸残基是带电荷氨基酸时,特别指定为显示反电荷的带电荷氨基酸。或者,(iii)在原来的氨基酸残基是组氨酸以外的氨基酸残基时,特别指定组氨酸。即,对于Asp22特别指定Lys、Arg、或者His,对于Ala24特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Thr25特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys28特别指定Asp、Glu、或者His,对于Val29特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys31特别指定Asp、Glu、或者His,对于Gln32特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Asn35特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Asp36特别指定Lys、Arg、或者His,对于Gly38特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Asp40特别指定Lys、Arg、或者His,对于Glu42特别指定Lys、Arg、或者His,对于Thr44特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His取代的氨基酸残基。
再有,本实施例的计算使用ccp4i4.0(Daresbury Laboratory,UK Science and Technology Facilities Council)、Surface Racer3.0forLinux(Dr.Oleg Tsodikov,The University of Michigan)、Red HatEnterprise Linux WS release 3(Red Hat)(以上软件)、Dell PrecisionWorkstation370(Dell)(以上硬件)执行。
【2.基于与Fab的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定】
首先,将蛋白G·B3结构域和小鼠免疫球蛋白G1的Fab区域的复合物的立体结构座标数据从作为国际性的蛋白质立体结构数据库的Protein Data Bank(PDB;http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下载(PDB编码:1IGC)。接下来,将是在从Fab区域的距离的范围内存在的蛋白G·B3结构域的氨基酸残基,并且,在蛋白G·B3结构域单独的情况具有40%以上的露出表面积比的氨基酸残基使用该立体结构座标数据进行计算,选定为突变对象部位。选定的部位的氨基酸残基是[SEQ ID NO:3]所示的蛋白G·B3结构域的野生型氨基酸序列之中的,Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38的10个。图6表示了这些的突变对象部位的位置。这些的突变对象部位在B1、B2、B3的何结构域中共同存在。从而,这些不仅是在B3结构域,在B1及B2结构域中也可选定为突变对象部位。即,将[SEQ ID NO:1]及[SEQ ID NO:2]所示的蛋白G·B1结构域及B2结构域的野生型氨基酸序列之中的,Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38的10个选定为突变对象部位。
另一方面,取代选定的突变对象部位的原来的氨基酸残基的氨基酸残基特别指定为(iv)原来的氨基酸和半胱氨酸以外的其他种类的氨基酸残基。即,对于Lys10特别指定Lys和Cys之外的残基,对于Thr11特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Lys13特别指定Lys和Cys之外的残基,对于Gly14特别指定Gly和Cys之外的残基,对于Glu15特别指定Glu和Cys之外的残基,对于Thr16特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Thr17特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Asn35特别指定Asn和Cys之外的残基,对于Asp36特别指定Asp和Cys之外的残基,对于Gly38特别指定Gly和Cys之外的残基取代的氨基酸残基。
再有,本实施例的计算使用ccp4i 4.0(Daresbury Laboratory,UK Science and Technology Facilities Council)、Surface Racer 3.0 forLinux(Dr.Oleg Tsodikov,The University of Michigan)、Red HatEnterprise Linux WS release 3(Red Hat)(以上软件)、Dell PrecisionWorkstation370(Dell)(以上硬件)执行。
【3.基于与Fc及Fab的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定】
将基于上述Fc和的结合表面解析及上述Fab的结合表面解析选定的突变对象部位和特别指定的取代的氨基酸残基组合。
即,将[SEQ ID NO:1]所示的蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列之中的,Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38的20个选定为突变对象部位。取代原来的氨基酸残基的氨基酸残基是,对于Asp22特别指定Lys、Arg、或者His,对于Ala24特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Thr25特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys28特别指定Asp、Glu、或者His,对于Val29特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys31特别指定Asp、Glu、或者His,对于Gln32特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Asp40特别指定Lys、Arg、或者His,对于Glu42特别指定Lys、Arg、或者His,对于Thr44特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys10特别指定Lys和Cys之外的残基,对于Thr11特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Lys13特别指定Lys和Cys之外的残基,对于Gly14特别指定Gly和Cys之外的残基,对于Glu15特别指定Glu和Cys之外的残基,对于Thr16特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Thr17特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Asn35特别指定Asn和Cys之外的残基,对于Asp36特别指定Asp和Cys之外的残基,对于Gly38特别指定Gly和Cys之外的残基。
另外,将[SEQ ID NO:2]所示的蛋白G·B2结构域的野生型氨基酸序列之中的,Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38的20个选定为突变对象部位。取代原来的氨基酸残基的氨基酸残基是,对于Asp22特别指定Lys、Arg、或者His,对于Ala24特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Thr25特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys28特别指定Asp、Glu、或者His,对于Val29特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys31特别指定Asp、Glu、或者His,对于Gln32特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Asp40特别指定Lys、Arg、或者His,对于Glu42特别指定Lys、Arg、或者His,对于Thr44特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys10特别指定Lys和Cys之外的残基,对于Thr11特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Lys13特别指定Lys和Cys之外的残基,对于Gly14特别指定Gly和Cys之外的残基,对于Glu15特别指定Glu和Cys之外的残基,对于Thr16特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Thr17特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Asn35特别指定Asn和Cys之外的残基,对于Asp36特别指定Asp和Cys之外的残基,对于Gly38特别指定Gly和Cys之外的残基。
另外,将[SEQ ID NO:3]所示的蛋白G·B3结构域的野生型氨基酸序列之中的,Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38的17个选定为突变对象部位。
取代原来的氨基酸残基的氨基酸残基是,对于Asp22特别指定Lys、Arg、或者His,对于Thr25特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys28特别指定Asp、Glu、或者His,对于Lys31特别指定Asp、Glu、或者His,对于Gln32特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Asp40特别指定Lys、Arg、或者His,对于Thr44特别指定Asp、Glu、Lys、Arg、或者His,对于Lys10特别指定Lys和Cys之外的残基,对于Thr11特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Lys13特别指定Lys和Cys之外的残基,对于Gly14特别指定Gly和Cys之外的残基,对于Glu15特别指定Glu和Cys之外的残基,对于Thr16特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Thr17特别指定Thr和Cys之外的残基,对于Asn35特别指定Asn和Cys之外的残基,对于Asp36特别指定Asp和Cys之外的残基,对于Gly38特别指定Gly和Cys之外的残基。
【实施例2】
在本实施例中,利用上述选定的突变对象部位和上述特别指定的取代的氨基酸残基的信息设计改性蛋白G的氨基酸序列。
从上述可知,由于突变对象部位及取代该部位的氨基酸残基不限于各一个,可从突变对象部位及取代该部位的氨基酸残基之中适宜选择而设计突变体蛋白质的氨基酸序列。其选择可随机进行,也可考虑结构活性相关等的其他公知的信息。另外,也可与已知使蛋白G的细胞膜外结构域的性质优化的变异组合。在本实施例中,从在实施例1的“1.基于与Fc的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定”选定的部位,选择Asp22、Thr25、Gln32、Asp40、及Glu42,作为与其对应的取代的氨基酸残基,选择Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、及Glu42His,对[SEQ ID NO:1]所示的蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列进行将这5个变异位置/5取代组合的点变异或多重变异,由此设计[SEQ ID NO:10]所示的多个改性蛋白G的氨基酸序列。
另外,从在实施例1的“2.基于与Fab的结合表面解析的突变对象部位的选定和取代的氨基酸残基的特别指定”选定的部位,选择Thr11及Thr17,作为与其对应的取代的氨基酸残基,选择Thr11Arg及Thr17Ile,对[SEQ ID NO:1]所示的蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列进行将这些加到上述的5个变异位置/5取代而得到的7个变异位置/7取代组合的点变异或多重变异,由此设计[SEQ ID NO:7]所示的多个改性蛋白G的氨基酸序列。
再者,选择从发明人的从前的研究已知升高蛋白G的细胞膜外结构域的热稳定性、对变性剂的化学稳定性、及对分解酶的抗性的Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys、及Ala48Glu,对[SEQ ID NO:1]所示的蛋白G·B1结构域的野生型氨基酸序列进行将这些加到上述的7个变异位置/7取代而得到的12个变异位置/14取代组合的点变异或多重变异,由此设计[SEQ ID NO:4]所示的多个改性蛋白G的氨基酸序列。
在本实施例中,作为对应于上述12个变异位置/14取代的具体氨基酸序列,最终筛选[SEQ ID NO:13]~[SEQ ID NO:20],实际合成显示此序列的改性蛋白G,评价其分子特性。
【实施例3】
在本实施例中,设计编码改性蛋白G的氨基酸序列的核酸的碱基序列。
对于编码改性蛋白G的基因的碱基序列而言,基于设计的改性蛋白G的氨基酸序列,利用Gene Designer(DNA2.0Inc.),设计为在大肠杆菌的表达效率最适。再有,由于突变体蛋白质从蛋白质合成的实际的观点出发,分成以下的2***而制造,基因的碱基序列考虑载体的碱基序列而每***进行微调节。OXADac-PG蛋白质制造为在N末端侧有草酰乙酸脱羧酶α-亚基c-末端结构域(OXADac)的序列,C末端侧有改性蛋白G的序列的融合蛋白质。即,合成为[SEQ ID NO:31]和[SEQ ID NO:13]~[SEQ ID NO:20]连结的氨基酸序列。M-PG蛋白质是,作为无标签,无融合的单纯蛋白质,使用大肠杆菌制造。因此,向设计的氨基酸序列附加起始密码子序列。即,M-PG蛋白质合成为在[SEQ ID NO:13]~[SEQ ID NO:20]的N末端附加Met的氨基酸序列。
【实施例4】
在本实施例中,合成含编码改性蛋白G的基因的质粒载体,接下来使用大肠杆菌,制造表1中所示的草酰乙酸脱羧酶α-亚基c-末端结构域(OXADac)和突变体蛋白质的融合蛋白质(OXADac-PG01、OXADac-PG07、OXADac-PG13、OXADac-PG14、OXADac-PG15、OXADac-PG16、OXADac-PG17、OXADac-PG19、OXADac-PG20)。
【(1)OXADac-PG表达用质粒的合成】
对于整合由[SEQ ID NO:21]~[SEQ ID NO:29]的碱基序列组成的PG基因(pg01、pg07、pg13、pg14、pg15、pg16、pg17、pg19、或者pg20)的进入质粒pDONR221-PG(DNA2.0)和表达用质粒Champion pET104.1-DEST(Invitrogen),使用Gateway LR ClonaseEnzyme Mix(Invitrogen)进行相同重组。使用反应液转化保存用大肠杆菌DH5a株(东洋纺,Competent high)。将得到的转化体用集落PCR、DNA测序(GE Healthcare Bioscience,BigDye Terminatorv1.1)筛选,使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)提取OXADac-PG表达用质粒。
【(2)OXADac-PG融合蛋白质的表达和固定化】
使用OXADac-PG表达用质粒转化表达用大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)。将预培养的转化体以2.5ml/500ml在LB培养基中继代,振荡培养至达到O.D.600=0.8~1.0。为了表达OXADac-PG融合蛋白质而加IPTG(0.5mM),再于37℃振荡培养2小时。将回收的菌体悬浮于10ml的PBS中,进行超声波破碎之后过滤灭菌,将其作为全蛋白质溶液。使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(GE HealthcareBioscience)microspin尝试纯化全蛋白质溶液之一部分,由SDS-PAGE确认表达及纯化。将其余注入设置HiTrap链霉亲和素HP柱(GEHealthcare Bioscience)的液相层析装置AKTApurifier(GEHealthcare Bioscience),以0.3ml/min的条件(运行缓冲液:20mM Na磷酸盐(pH6.7),150mM NaCl)运转,从而将OXADac-PG融合蛋白质固定化到柱上。OXADac由于在分子内有1个生物素化赖氨酸,选择性地并且非可逆地结合于柱内的链霉亲和素上。再有,为了使固定化量最大化,相对于HiTrap链霉亲和素HP柱的结合容许量,注入大过量(10倍以上)的OXADac-PG融合蛋白质。
【表1】
表1:制造的改性蛋白G
a:合成为草酰乙酸脱羧酶α-亚基c-末端结构域(OXADac)融合蛋白质之后,分离纯化
b:合成为无标签单纯蛋白质之后,分离纯化
【实施例5】
在本实施例中,合成含编码改性蛋白G的基因的质粒载体,接下来使用大肠杆菌制造表1中所示的Met附加改性蛋白G(M-PG01、M-PG07、M-PG19、M-PG20)。
【(1)M-PG表达用质粒的合成】
将实施例4中制成的OXADac-PG表达用质粒作为模板,加含限制性内切酶识别序列的引物而进行PCR(退火45℃,15秒钟→55℃,5秒钟)、扩增PG基因区域。使用的引物,对于M-PG01及M-PG07使用正义引物(ATAGCTCCATG GACACTTACAAATTAATCC(SEQ IDNO:32))和反义引物(ATTGGATCC TTATTCAGTAACTGTAAAGGT(SEQ ID NO:33))、对于M-PG19及M-PG20使用正义引物(ATAGCTCCATG GATACCTACAAACTGATCC(SEQ ID NO:34))和反义引物(ATTGGATCC TTATTCGGTAACGGTGAAGGT(SEQ IDNO:35))。将得到的扩增物用琼脂糖电泳法(3%,100V)确认后,使用QIAquick PCR Purification kit(Qiagen)纯化。其后,将用限制性内切酶Nco I和BamH I(日本基因,37℃,一昼夜)消化而脱磷酸化(宝酒造,CIAP,50℃,30分钟)的质粒pET16b(Novagen)和用相同的限制性内切酶消化的PG基因(pg01、pg07、pg19、或者pg20)连接(东洋纺,Ligation High,16℃,1小时),使用得到的质粒载体转化保存用大肠杆菌DH5α株(东洋纺,Competent high),用含100μg/mL氨苄西林的LB板培养基进行选择。由集落PCR、DNA测序(AB,BigDye Terminator v1.1)筛选具有正确的***序列的转化体,使用Qiaprep Spin Miniprep kit(Qiagen)提取M-PG表达用质粒。使用其,再转化表达用大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。
【(2)重组蛋白质的表达和纯化】
将在LB培养基中预培养的大肠杆菌BL21(DE3)转化体以2.5ml/500ml在LB培养基中继代,振荡培养至达到O.D.600=0.8~1.0。加IPTG至最终浓度0.5mM,再于37℃振荡培养2小时。将回收的菌体悬浮于10ml的PBS中,进行超声波破碎。将破碎液过滤灭菌后,将滤液注入设置IgG Sepharose 6 Fast Flow柱(GE HEALTHCAREBioscience)的液相层析装置AKTApurifier(GE HEALTHCAREBioscience),通过亲和层析法(运行缓冲液:50mM Tris-HCl(pH7.6),150mM NaCl,0.05%Tween20;洗脱缓冲液:0.5M醋酸)和/或注入设置RESOURCE S柱(GE HEALTHCARE Bioscience)的液相层析装置AKTApurifier(GE HEALTHCARE Bioscience),通过离子交换层析法(运行缓冲液:20mM柠檬酸,pH3.5;洗脱缓冲液:20mM柠檬酸,1M NaCl,pH3.5)纯化M-PG重组蛋白质。将分级分离的级分用NaOH中和后,用离心浓缩机(RABCONCO,CentriVapconcentrator)浓缩,用50mM磷酸缓冲液(pH6.8)透析。将各溶液冷冻干燥,将粉末状的重组蛋白质(M-PG01、M-PG07、M-PG19、M-PG20)于-20℃保存。
【实施例6】
在本实施例中,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法确认改性蛋白G的纯度。
将纯化前后的改性蛋白G制备成各自75μM左右的浓度的水溶液之后,进行Tricine-SDS-PAGE(16%T,2.6%C,100V,100min)而用CBB(G-250)染色检测条带来确认纯度。结果,改性蛋白G检测为测定的全部的样品的主条带,确认改性蛋白G(OXADac-PG19、OXADac-PG20、M-PG01、M-PG07)的合成收率高(>10mg/L-培养基)、另外纯化度也充分。
【实施例7】
在本实施例中,用MALDI-TOF型质谱分析计测量改性蛋白G的分子量,由此鉴定制造的蛋白质。
首先,将分离纯化的突变体蛋白质制备成15~25μM的浓度的水溶液。接下来,向质谱分析用样品板滴下1μl底物溶液(在50%(v/v)乙腈-0.1%TFA水溶液中饱和α-氰基-4-羟基桂皮酸的溶液),向其滴下1μl各样品溶液而在样品板上混合、干燥。其后,用质谱分析装置Voyager(Applied Biosystems)照射强度2500-3000的激光而得到质量光谱。比较由质量光谱检测的峰的分子量和由制造的突变体蛋白质的氨基酸序列算出的理论分子量的结果,两者在测定误差内一致,确认制造出目的蛋白质(OXADac-PG19)。
【实施例8】
在本实施例中,使用固定化OXADac-PG融合蛋白质的柱进行pH梯度亲和层析,研究单克隆抗体洗脱的pH,由此评价改性蛋白G的在弱酸性区域的抗体解离性。
将OXADac-PG融合蛋白质固定化柱设置于液相层析装置AKTApurifier(GE Healthcare Bioscience),使TST缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.6),150mM NaCl,0.05%Tween20)以1ml/min的条件下流过而平衡化之后,注入制备为100μg/200μl的IgG1类型的人化单克隆抗体。接下来,将TST缓冲液取代为50mM Na3柠檬酸盐(pH7.0),再以0.5ml/min的流速经10min连续地向0.5M醋酸盐(pH2.5)取代,由此实现pH梯度(pH7.0→2.5/10min)。从附属于液相层析装置的UV仪(280nm)和pH仪的输出记录单克隆抗体洗脱的峰的pH。
结果得知,在固定化测定的全部的改性蛋白G(OXADac-PG13、OXADac-PG17、OXADac-PG19、OXADac-PG20)的柱中,相比固定化有野生型的氨基酸序列的对照蛋白质(OXADac-PG01)的柱,以高的pH人化单克隆抗体洗脱(图7)。例如,其中最优良的改性蛋白G(OXADac-PG20)以相比野生型都高1.1的pH洗脱。(表2)
【表2】表2.制造的改性蛋白质M·PG07、M·PG19、M·PG20的性质
n.d.未测定
【实施例9】
在本实施例中,使用固定化OXADac-PG融合蛋白质的柱进行逐步pH亲和层析,以几个pH研究单克隆抗体的洗脱,评价改性蛋白G的在弱酸性区域的抗体解离性。
将OXADac-PG融合蛋白质固定化柱设置于液相层析装置AKTAprime plus(GE Healthcare Bioscience),使磷酸缓冲液(50μmNa2HPO4/NaH2PO4(pH7.0))在0.4ml/min的条件下流过而平衡化之后,添加100μL的1mg/ml的样品(ChromPure Human IgG,FcFragment)。用12ml的磷酸缓冲液清洗、用10ml的洗脱缓冲液(100mM CH3COOH/CH3COONa,pH4)进行洗脱。其后,用pH2.5、500mM的CH3COOH清洗柱,最后,用12ml的磷酸缓冲液将柱再平衡。从附属于液相层析装置的UV仪(280nm)的输出得到人多克隆Fc区域的逐步pH的洗脱图案。
结果得知,在固定化测定的改性蛋白G(OXADac-PG19、OXADac-PG20)的柱中,相比固定化有野生型的氨基酸序列的对照蛋白质(OXADac-PG1)的柱,以高的pH人多克隆抗体Fc区域洗脱(图8)。在pH4区域的PG1、PG19、PG20的洗脱率分别是10%、88%、71%,确认改性蛋白G(OXADac-PG19、OXADac-PG20)相比野生型高7倍以上(表2)。
【实施例10】
在本实施例中,由表面等离子体共振(SPR)法评价突变体蛋白质(蛋白G突变体)的结合解离性。SPR法被认为是,经时测定活体高分子间的特异性相互作用,可从速度论的观点定量解释反应的优良的方法。
首先,向传感器芯片SA(Biacore)的测定池,经生物素固定化OXADac-PG融合蛋白质。接下来,将人免疫球蛋白IgG溶解于作为运行缓冲液的HBS-P(10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl,0.05%v/vSurfactant P20),制备1μM的样品溶液。使用Biacore T100(Biacore),于25℃反应温度进行SPR的测定。样品溶液的添加后,测定由解离溶液(10mM醋酸钠pH4.0)的IgG的解离行为。在观测结果的解析中使用BIAevaluation版本4.1。解离前后的RU变化除以IgG的结合RU值而算出IgG的残留量比,另外,将该解离曲线向1:1的朗缪尔模型拟合而确定解离速度常数koff。
在实验中使用的解离条件下之下、有野生型的氨基酸序列的OXADac-PG01不显示显著的解离,与此相比,突变体蛋白质(OXADac-PG13,OXADac-PG14,OXADac-PG19,OXADac-PG20)呈现显著的解离行为(表2)。例如,OXADac-PG19在本条件下解离吸附IgG的60%以上,其解离速度常数呈现为相比野生型升高3个量级以上。
【实施例11】
在本实施例中,在中性区域、及组氨酸残基的95%以上质子化的弱酸性区域中,由表面等离子体共振(SPR)法评价突变体蛋白质的抗体结合性。
首先,将人免疫球蛋白的Fc区域由胺偶联法固定化到传感器芯片的测定池。作为测定的对照,使用将羧甲基用乙醇胺封闭的对照池。作为传感器芯片,在中性区域的测定中使用CM5(Biacore)、在弱酸性区域下的测定中使用CM4(Biacore)。接下来,将分离纯化的突变体蛋白质溶解于作为中性区域的运行缓冲液的HBS-P(10mMHEPES pH7.4,150mM NaCl,0.05%v/v Surfactant P20)、或者弱酸性区域的运行缓冲液(10mM醋酸钠pH4.5,150mM NaCl,0.05%v/v Surfactant P20),制备分别500,400,300,200,100nM、及1000,800,600,400,200nM的5种浓度的样品溶液。使用BiacoreT100(Biacore),于25℃反应温度进行SPR的测定。收集的数据使用Biacore T100Evaluation Software解析,向1:1的朗缪尔模型拟合,算出解离平衡常数KD(图9)。
结果得知,突变体蛋白质M-PG19相比有野生型的氨基酸序列的对照蛋白质M-PG01,在中性区域显示11倍以上的亲和性,另一方面在酸性区域的亲和性减少至0.6倍左右(表3、图10)。另外,在各蛋白质中,计算pH4.0的KD和pH7.0的KD的比,则突变体蛋白质M-PG19的其值显著大(图11)。这表明,随pH的变动而洗脱的抗体的量大,即表明,使用突变体蛋白质M-PG19而大大升高亲和层析中的抗体的回收率是可能的。
【表3】表3.制造的改性蛋白质M·PG07、M·PG19、M·PG20的性质
n.d.未测定
【实施例12】
在本实施例中,评价突变体蛋白质的热稳定性。圆二色性(CD)光谱已知是敏锐反映蛋白质的二级结构的变化的分光学分析方法。通过改变样品的温度而观测与CD光谱的强度相当的摩尔椭圆率,可知在何程度的温度各改性蛋白G变性。制备成以分别15~25μM的浓度含分离纯化的突变体蛋白质的水溶液(50mM磷酸钠缓冲液、pH6.8)。将此样品溶液注入圆筒型池(池长0.1cm),使用J805型圆二色性分光光度计(日本分光),于20℃的温度使测定波长移动到260nm~195nm而得到CD光谱。将相同的样品加热至98℃、再冷却至98℃~20℃而得到260nm~195nm的圆二色性光谱。加热后再冷却的光谱的摩尔椭圆率恢复60%以上,确认改良型蛋白G的立体结构对于热变性以某种程度可逆。
接下来,将测定波长固定于222nm,于20℃~100℃,以1℃/min的速度升温而测定摩尔椭圆率的经时变化。对于得到的热融解曲线使用二状态相转移模型的理论式(非专利文献:有坂、为生物科学的蛋白质科学入门)进行解析,确定变性温度Tm、及在Tm的变性的焓变化ΔHm。结果得知,对于测定的改性蛋白G之中M-PG07和M-PG19的热稳定性相比有野生型的氨基酸序列的对照蛋白质(M-PG01)升高(表3)。
【实施例13】
在本实施例中,制成突变体蛋白质的单晶,由X射线衍射解析确定立体结构。
首先,将分离纯化的突变体蛋白质M-PG19使用接下来示的悬滴法结晶化。为了得到属于空间组P43212的结晶,将此蛋白质样品溶解于10mMTris盐酸缓冲液pH7.4至达到5~10mg/ml的浓度的蛋白样品溶液1μl,和等量的结晶化剂溶液(70%MPD、20mM HEPES缓冲液pH7.4)使用自动移液器滴在盖玻片(Hampton公司制)上混合而作为结晶化溶液。将上述的结晶化剂溶液注入Hampton公司制24孔板,用滴下结晶化溶液的盖玻片盖住而使用高真空润滑脂密封。将此板在保持在20℃温育器中储存。大概1~2周后,在结晶化溶液中得到优质的单晶。
接下来,将得到的单晶与微量的母液一同用结晶解析用环救出,使用液氮气体急速冷冻,供于X射线衍射实验。衍射测定用高能加速器研究机构的放射光科学研究设施的Beam LineBL-6A根据定法进行,收集至分解能的衍射数据。将得到的衍射像使用程序HKL-2000(HKL Research公司)进行衍射点的指数及积分强度的测定-数值化而得到68935个强度数据。在此阶段,使用的单晶的结晶参数被确定。即,结晶的空间组是正方晶系P43212、格子常数是及再使用HKL-2000进行合并和标度,得到8862个独特的强度数据。这些的Rsym值是6.8%。
结构确定通过使用野生型蛋白G B1结构域的立体结构座标数据和程序Molrep(Vagin,A.,及Teplyakov,A.(1997)Journal of AppliedCrystallography 30,1022-1025)的分子取代法进行,连续使用程序CNS(Brunger,A.et al.(1998)Acta.Crystallogr.D Biol.Crystallogr.54,905-921)、REFMAC5(Murshudov,G.N.,et al.(1997)Acta.Crystallogr.D Biol.Crystallogr.53,240-255)、Coot(Emsley,P.,及Cowtan,K.(2004)Acta.Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60,2126-2132)进行结构精密化。结果,在本领域技术人员中作为参数精度的指标的R值相对于全强度数据而成为23%。
如此得到的突变体蛋白质M-PG19的3维结构与野生型蛋白G B1结构域极其相似。即,比较确定的M-PG19的主链的座标和记录在Protein Data Bank的野生型的主链的座标(PDB编码:1PGA),则其均方根偏差(RMSD)是由此证明,在本发明中向突变体蛋白质实施的氨基酸取代几乎不改变野生型蛋白G B1结构域的立体结构(图12)。
【实施例14】
本发明的蛋白G的细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体的制造及使用该蛋白质的柱的制成
【(1)表达重组PG的质粒的制成】
从整合编码在羧基末端侧附加半胱氨酸残基、His标签的三聚体野生型PG(CGB01H-3D,图13上、SEQ ID NO:36)或作为本发明的蛋白质的变异型PG的串联型三聚体(CGB19H-3D,图13下、SEQID NO:37)的基因的2种人工合成质粒(各自SYN2608-2-18、SYN2608-1-4,宝生物)使用限制性内切酶NcoI、BamHI切出各自的基因片段。将目的片段用琼脂糖电泳分离,使用QIAquick GelExtraction Kit(Qiagen)进行纯化之后,同样地限制性内切酶处理及与使用牛小肠来源碱脱磷酸化酶(CIP,宝酒造)进行脱磷酸化的表达用质粒pET16b(Invitrogen)进行连接。由反应液转化保存用大肠杆菌DH5α株(Competent high、东洋纺)。由集落PCR法、DNA测序法(BigDye Terminator v1.1,GE Healthcare Bioscience)筛选得到的转化体,使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)提取表达重组PG的质粒。
【(2)重组PG的表达和纯化】
由表达重组PG的质粒转化表达用大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。将预培养的转化体以2.5ml/500ml在LB培养基中继代,振荡培养至达到O.D.600=0.8~1.0。为表达目的蛋白质而加0.5mMIPTG,再于37℃振荡培养2小时。将回收的菌体悬浮于10ml的PBS中,进行超声波破碎之后过滤灭菌,将其作为全蛋白质溶液。使重组PG吸附于Ni Sepharose(GE Healthcare Bioscience)2ml柱,用20mM咪唑清洗后,用500mM咪唑洗脱,作为纯化蛋白质。
【(3)使用环氧活化的Sepharose6B的重组PG的固定化和柱制成】
将纯化的重组PG2.5mg溶解于50mM磷酸缓冲液(pH8.0),与相同地平衡化的环氧活化的Sepharose6B(GE Healthcare)0.3g混合,于37度反应一昼夜,使与树脂结合。反应后的未固定上清样品量,在CGB01H-3D中是1.28mg、在CGB19H-3D中是0.97mg,由此固定化率分别被推测为49%、61%。用50mM磷酸缓冲液清洗后,加1M乙醇胺(pH7.5)于37度反应6小时而罩住未反应官能基。继清洗液1(0.1M醋酸、0.1M氯化钠)而用清洗液2(0.1MTris盐酸、0.5M氯化钠、pH8.0)清洗。将固定化树脂1ml填装到Tricon5/20柱上。
【(4)使用SulfoLink固定化试剂盒(Pierce)的重组PG的固定化和柱制成】
将纯化的CGB19H-3D2.5mg溶解于样品制备缓冲液(0.1M磷酸钠、5mM EDTA、pH6.0),加到附属的巯基乙醇瓶中,于37度反应1个半小时。向附属的脱盐柱加反应液而除去巯基乙醇之后,使用偶联缓冲液(50mMTris盐酸、5mM EDTA、pH8.5)制备,加到SulfoLink树脂中。于室温反应15分钟而与树脂结合。反应后的未固定样品量是0.18mg,由此推测固定化率是75%。用1M氯化钠清洗后,加50mML-半胱氨酸盐酸而于室温反应1小时罩住未反应官能基。用PBS进行清洗之后,将固定化树脂1ml填装到Tricon5/20柱上。
【2.pH梯度亲和层析】
将重组PG固定化柱设置在液相层析装置AKTApurifier(GEHealthcare Bioscience)上,使TST缓冲液(50mMTris盐酸、150mM氯化钠、0.05%Tween20、pH7.6)以0.3ml/min(1.-(4)是0.5ml/min)的条件流过而平衡化之后,注入制备成100μg/200μl的IgG1类型的人化单克隆抗体或制备成50μg/μl的人IgG3。将TST缓冲液用50mM柠檬酸钠(pH7.0)取代,以0.3ml/min(1.-(4)是0.5ml/min)的流速经10min连续地向0.5M醋酸(pH2.5)取代而研究IgG1或IgG3洗脱的pH条件。在CGB01H-3D固定化柱中IgG1在pH3.9-2.9之间洗脱,在pH3.3附近形成峰(图14上)、IgG3在pH5.1-3.8之间洗脱,在pH3.4附近形成峰(图14下)。另一方面,在CGB19H-3D固定化柱中,在环氧活化的柱中,IgG1在pH5.4-3.8之间洗脱,在pH4.3附近形成峰(图15上)、IgG3在pH6.2-4.1之间洗脱,在pH4.9附近形成峰(图15下)。在SulfoLink柱(仅CGB19H-3D)中,IgG1在pH5.9-3.7之间洗脱,在pH4.3附近形成峰(图16上)、IgG3在pH6.2-4.2之间洗脱,在pH5.2附近形成峰(图16下)。由此可知,在任何的情况中,CGB19H-3D固定化柱相比CGB01H-3D固定化柱,可在温和的酸性条件下洗脱,无论是IgG1抗体,还是IgG3抗体均可用CGB19H-3D固定化柱纯化。
【3.pH阶段性变化亲和层析】
将重组PG固定化柱设置在液相层析装置AKTApurifier(GEHealthcare Bioscience)上,使磷酸缓冲液(20mM磷酸钠、150mM氯化钠、pH7.0)以0.3ml/min(1.-(4)是0.5ml/min)的条件流过而平衡化之后,注入制备成100μg/200μl的IgG1类型的人化单克隆抗体或制备成50μg/μl的人IgG3。以0.3ml/min(1.-(4)是0.5ml/min)的流速取代为20mM柠檬酸钠(pH4.0或pH3.75)后,再取代为20mM柠檬酸(pH2.4)而研究IgG1或IgG3洗脱的pH条件。在CGB01H-3D固定化柱中,IgG1(图17上)、IgG3(图17下)均在pH7.0~pH4.0变化时不洗脱,在向pH4.0~2.4的变化时洗脱。另一方面,在CGB19H-3D固定化柱中,IgG1(图18上)、IgG3(图18下)均在pH7.0~pH4.0的变化时洗脱,在向pH4.0-2.4的变化时不洗脱。再者,在更严的酸条件pH3.75下也变得同样,在CGB01H-3D固定化柱中,在pH7.0~pH3.75的变化时不洗脱,在向pH3.75~2.4的变化时洗脱(图19上)、在CGB19H-3D固定化柱中,在pH7.0~pH3.75的变化时洗脱,在向pH3.75~2.4的变化时不洗脱(图19下)(均仅IgG1)。在SulfoLink柱(仅CGB19H-3D)中,IgG1(图20上)、IgG3(图20下)也均成为同样的结果。由此可知,在任何的情况中,CGB19H-3D固定化柱,相比CGB01H-3D固定化柱,可在温和的酸性条件下洗脱,无论是IgG1抗体还是IgG3抗体均可用CGB19H-3D固定化柱纯化。
【实施例15】
在本实施例中比较了本发明的蛋白G的细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体和同单体。
由表面等离子体共振(SPR)法评价蛋白G的细胞膜外结构域突变体的单结构域型及3种结构域型分子(各自作为M-PG19、CGB19H-3D)的中性区域的抗体结合解离性。SPR法被认为是,经时测定活体高分子间的特异性相互作用,可从速度论的观点定量解释反应的优良的方法。
首先,将IgG1类型的人化单克隆抗体通过胺偶联法固定化到传感器芯片CM-5(GE Healthcare)的测定池。固定化量作为5000RU。接下来,将M-PG19及CGB19H-3D溶解于运行缓冲液(10mM HEPESpH7.4,150mM NaCl,1mM Cystein,0.05%v/v SurfactantP20),制备分别25,50,100,200nM(M-PG19)及6.25,12.5,25,50nM(CGB19H-3D)的样品溶液。使用Biacore T100(GE Healthcare),于25℃反应温度进行SPR的测定。在观测结果的速度论解析中使用BIAevaluation版本4.1。将解离曲线向1:1的朗缪尔模型拟合而确定平衡解离常数KD。单结构域型的M-PG19以19nM的KD结合于IgG1(图21上)。另一方面,3种结构域型的CGB19H-3D以0.10nM的KD结合于IgG1(图21下)。以上的结果表明,通过将蛋白G突变体多结构域化,可实现190倍的亲和性升高。另外得知,此亲和性升高相比结合速度更主要归因于解离速度的减少。仅以解离速度常数比较,则两者的差有约370倍。此原因被认为是由于伴随多结构域化的亲合力效果(多价效果)。
【实施例16】
在本实施例中,制造蛋白G的细胞膜外结构域突变体的单体及本发明的串联型四聚体、五聚体。
导入编码在羧基末端附加半胱氨酸残基、His标签的单体变异型PG(CGB19H-1D、图22、SEQ ID NO:38)、串联型四聚体PG(CGB19H-4D、图22、SEQ ID NO:39)、及串联型五聚体PG(CGB19H-5D、图22、SEQ ID NO:40)的基因的3种人工合成表达用质粒(各自12AACDAC,12AACDCC,12AACDEC,Lifetechnologies)转化表达用大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。将预培养的转化体以2ml/200ml在2YT培养基中继代,振荡培养至达到O.D.600=0.8~1.0。为表达目的蛋白质而加0.5mM IPTG,再于37℃振荡培养2小时。将回收的菌体悬浮于10ml的PBS中,进行超声波破碎之后过滤灭菌,将其作为全蛋白质溶液。使重组PG吸附于NiSepharose(GE Healthcare)2ml柱,用20mM咪唑清洗后,用500mM咪唑洗脱,作为第一次纯化蛋白质。再向IgG sepharose(GEHealthcare)0.5ml添加第一次纯化蛋白溶液而吸附重组PG,用Tris缓冲液清洗后,用醋酸缓冲液(pH3.4)洗脱,作为第二次纯化蛋白质。最终用PBS溶液透析而作为最终纯化蛋白质。
【实施例17】
在本实施例中,将蛋白G的细胞膜外结构域突变体的单体及本发明的串联型多聚体经羧基末端的半胱氨酸残基固定化到固相,由SPR法比较评价各变异蛋白质的抗体结合性。
首先,将蛋白G的细胞膜外结构域突变体的单体(CGB19H-1D)及串联型三聚体、串联型四聚体、串联型五聚体(各自CGB19H-3D,CGB19H-4D,CGB19H-5D)的各自通过使用EMCH(N-[ε-马来酰亚胺己酸]酰肼,三氟乙酸)(Thermo scientific)的马来酰亚胺偶联法固定化于传感器芯片CM-5(GE Healthcare)的测定池。固定化量以无关于结构域数而使相同的质量的蛋白质被固定化的情况(图23),和随结构域数而改变固定化量(100(CGB19H-1D),300(CGB19H-3D),400(CGB19H-4D),500(CGB19H-5D)RU)而使相同的分子数被固定化的情况(图24)的2种方式进行调节。接下来,将IgG1类型的人化单克隆抗体溶解于运行缓冲液(10mMHEPES pH7.4,150mM NaCl,0.005%v/v Surfactant P20),调节10μM的样品溶液。使用Biacore T100(GE Healthcare),于25℃反应温度进行SPR测定。
接下来,使样品抗体流过将单体及本发明的串联型多聚体蛋白G以相同的质量固定化的芯片,10分钟后,测定芯片上结合的抗体量的结果,相比单体,在固定化多聚体的芯片见到抗体结合率的增大(图25上)。另外,在将单体及本发明的串联型多聚体蛋白G以相同的分子数固定化的芯片上,见到随结构域数增加而抗体结合率的升高(图25下)。在酸性条件的抗体解离率显示,在固定化相同质量的情况下,在pH3和5随结构域数的增加的差异不那么大(图26上)、在pH2的抗体解离率显示用串联型五聚体显著地变高(图26上)。另一方面,固定化相同分子数时,在pH3和5随结构域数的增加而解离率减少,相反,在pH2的解离率增大(图26下)。
由此可知,本发明的串联型多聚体蛋白G相比单体蛋白G,在中性区域的抗体结合性优良,另一方面,在弱酸性区域的结合性更大地降低。
结果,通过利用本发明的串联型多聚体,使捕捉的抗体在弱酸性区域中,在无变性的状态下更容易地洗脱变得可能。
【工业实用性】
现在,野生型的蛋白G细胞膜外结构域作为抗体的纯化用的亲和层析载体或抗体检测用的检查试剂是市售的,在生命科学各领域广范利用。另外,随近年的以抗体医药为首的抗体关联产业的发展,这些制品的需要飞跃性地扩大。从而,在多种含有蛋白G细胞膜外结构域的制品中,通过用本发明的蛋白质代替野生型,使降低伴随酸洗脱的抗体的劣化成为可能,在涉及抗体的广范的技术领域中,大大有益于其技术发展。
Claims (26)
1.蛋白质,其由对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质有结合活性的、细胞膜外结构域突变体的串联型多聚体组成。
2.权利要求1所述的蛋白质,其为串联型三聚体、串联型四聚体、或者串联型五聚体。
3.权利要求1或2所述的蛋白质,其中构成多聚体的细胞膜外结构域突变体彼此相同。
4.权利要求1~3中任一项所述的蛋白质,其中各细胞膜外结构域突变体由接头序列连结。
5.权利要求1~4中任一项所述的蛋白质,其中对具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质有结合活性的细胞膜外结构域是链球菌(Streptococcus)属链球菌的蛋白G的B1、B2、或B3中的任一种。
6.权利要求1~5中任一项所述的蛋白质,其对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且相比由野生型蛋白G·B结构域的串联型多聚体组成的蛋白质,至少,其对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低。
7.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(a)所示的氨基酸序列组成,或由在(a)所示的氨基酸序列中,缺失、取代、***或附加1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列组成,其对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B1结构域蛋白质,至少,其对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低:
(a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu,X47表示Asp或Pro,X48表示Ala、Lys或Glu,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或Leu、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况)。
8.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(b)所示的氨基酸序列组成,或由在(b)所示的氨基酸序列中,缺失、取代、***或附加1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列组成,其对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B2结构域蛋白质,至少,其对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低:
(b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu,X47表示Asp或Pro,X48表示Ala、Lys或Glu,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或His、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况)。
9.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(c)所示的氨基酸序列组成,或由在(c)所示的氨基酸序列中,1个或数个氨基酸残基缺失、取代、***或附加的氨基酸序列组成,其对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B3结构域蛋白质,至少,其对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低:
(c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X35表示Asn或Lys,X36表示Asp或Glu,X37表示Asn、His、或者Leu,X47表示Asp或Pro,X48表示Ala、Lys或Glu、X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X35是Asn或Lys、X36是Asp或Glu、X37是Asn或His、X47是Asp或Pro、X48是Ala、Lys或Glu、X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况)。
10.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(d)所示的氨基酸序列组成,或由在(d)所示的氨基酸序列中,缺失、取代、***或附加1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列组成,对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且相比野生型蛋白G·B1结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低:
(d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况)。
11.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(e)所示的氨基酸序列组成,或由在(e)所示的氨基酸序列中,缺失、取代、***或附加1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列组成,对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且相比野生型蛋白G·B2结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低:
(e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X42是Glu、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况)。
12.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(f)所示的氨基酸序列组成,或由在(f)所示的氨基酸序列中,氨基酸残基缺失、取代、***或附加1个或数个的氨基酸序列组成,对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且相比野生型蛋白G·B3结构域蛋白质,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低:
(f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X11表示Thr或Arg,X17表示Thr或Ile;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp、X11是Thr,并且排除X17是Thr的情况)。
13.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B1结构域蛋白质的突变体蛋白质,由以下的(g)所示的氨基酸序列组成,或由在(g)所示的氨基酸序列中,缺失、取代、***或附加1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列组成,对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且,相比野生型蛋白G·B1结构域蛋白质,对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低:
(g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp,并且排除X42是Glu的情况)。
14.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B2结构域蛋白质的各突变体蛋白质,由以下的(h)所示的氨基酸序列组成,或由在(h)所示的氨基酸序列中,缺失、取代、***或附加1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列组成,对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且相比野生型蛋白G·B2结构域蛋白质,对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低:
(h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His,X42表示Glu或His;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln、X40是Asp,并且排除X42是Glu的情况)。
15.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体是以下的突变体蛋白质:
是野生型蛋白G·B3结构域蛋白质的各突变体蛋白质,由以下的(i)所示的氨基酸序列组成,或由在(i)所示的氨基酸序列中,缺失、取代、***或附加1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列组成,对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且相比野生型蛋白G·B3结构域蛋白质,对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低:
(i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上述氨基酸序列中,X22表示Asp或His,X25表示Thr或His,X32表示Gln或His,X40表示Asp或His;不过,同时X22是Asp、X25是Thr、X32是Gln,并且排除X40是Asp的情况)。
16.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中构成多聚体的至少一个细胞膜外结构域突变体由SEQ ID NO:13~20中任何一个所示的氨基酸序列组成,或由在该氨基酸序列中,缺失、取代、***或附加1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列组成。
17.权利要求1~6中任一项所述的蛋白质,其中在构成三聚体的3个细胞膜外结构域突变体由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、或者该氨基酸序列中,缺失、取代、***或附加1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列组成。
18.融合蛋白质,其由权利要求1~17中任一项所述的蛋白质的氨基酸序列和其他蛋白质的氨基酸序列连结而成的氨基酸序列组成。
19.核酸,其编码权利要求1~18中任一项所述的蛋白质。
20.权利要求19所述的核酸,其中构成多聚体的细胞膜外结构域突变体是由SEQ ID NO:22~29中任何一个所示的碱基序列组成的核酸。
21.核酸,其与由与权利要求19或20所述的核酸的碱基序列互补的序列组成的核酸在严格的条件下杂交,编码对免疫球蛋白G的Fc区域有结合活性,并且,相比由野生型蛋白G·B结构域的串联型多聚体组成的蛋白质,至少,对免疫球蛋白G的Fab区域的结合活性和/或对Fc区域在弱酸性区域的结合活性降低的蛋白质。
22.重组载体,其含有权利要求19~21中任一项所述的核酸。
23.转化体,其被导入了权利要求22所述的重组载体。
24.固定化蛋白质,其特征在于,权利要求1~18中任一项所述的蛋白质被固定化在水不溶性的固相支持体上。
25.抗体、免疫球蛋白G或具有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的捕获剂,其含权利要求1~18中任一项所述的蛋白质。
26.抗体、免疫球蛋白G或有免疫球蛋白G的Fc区域的蛋白质的捕获剂,其含权利要求24所述的固定化蛋白质。
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