CN103721300B - 一种抗凝血涂层材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗凝血涂层材料及制备方法。所述抗凝血涂层材料,包括透明质酸钠和水蛭素,透明质酸钠形成凝胶网络,水蛭素通过酰胺键与透明质酸钠共价结合。所述抗凝血涂层材料制备方法,包括以下步骤:(1)配置MES缓冲液;(2)配制透明质酸钠溶液,其浓度为1mg/ml至20mg/ml;(3)配制水蛭素溶液,其浓度为1mg/ml至10mg/ml;(4)将上述两种溶液均匀混合,使得水蛭素与透明质酸钠的质量比例为1:1至1:10;(5)向步骤(4)中得到的混合溶液中加入交联剂,均匀混合,使得水蛭素与透明质酸钠共价交联。本发明提供的抗凝血涂层材料,抗凝血活性较高,效果稳定,持续时间长,生物相容性好,且制备方法简单,条件温和,适合工业大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域,更具体地,涉及一种抗凝血涂层材料及其制备方法。
背景技术
抗凝血生物医用材料是一类重要的生物材料,被广泛应用于与人类血液和组织相接触的医用材料上,如血液透析***、体外循环***、人工心脏瓣膜、心脏起搏器、人工血管、血管支架、外科手术线和导管等。进入21世纪,心血管疾病发病率和死亡率在不断上升,心血管疾病的防治已成为国内外医学界关注的重点。抗凝血生物医用材料有着重要的应用价值。
目前已有抗凝血涂层,主要是采用肝素作为抗凝血因子,将肝素通过物理吸附或者化学结合的方法固定在材料表面。采用物理吸附的方法,将材料肝素化,肝素容易流失,抗凝血效果不长;采用化学结合的方法,将材料肝素化,由于肝素为大生物分子,共价结合在金属支架表面后,其构象受到限制,可能造成抗凝血活性降低。另外用于固定肝素的涂层聚合物还存在生物相容性问题,不能促进内皮愈合,对减少再狭窄率也没有明显贡献。
目前还没有一种具有理想抗凝血作用且不影响其生物相容性的抗凝血涂层材料。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种抗凝血涂层材料,其目的在于通过将分子量较小、抗凝血效果稳定的抗凝血因子水蛭素与具有良好生物相容性的透明质酸钠凝胶网络共价结合,由此解决目前抗凝血涂层材料抗凝血效果不稳定或者不长久、生物相容性差的技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种抗凝血涂层材料,包括透明质酸钠和水蛭素,所述透明质酸钠形成凝胶网络,所述水蛭素通过酰胺键与所述透明质酸钠共价结合。
优选地,所述的抗凝血涂层材料,其水蛭素与所述透明质酸钠的质量比例为1:1至1:10。
优选地,所述的抗凝血涂层材料,其水蛭素与所述透明质酸钠的质量比例为1:3至1:5。
优选地,所述的抗凝血涂层材料,还包括交联剂。
优选地,所述的抗凝血涂层材料,其交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。
按照本发明的另一方面,提供了一种抗凝血涂层材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)配制2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液(0.1mol/L,pH=6.4)。
(2)使用步骤(1)配制的MES缓冲溶液,加入透明质酸钠,浓度为1mg/ml至20mg/ml,充分溶解制得透明质酸钠溶液;
(3)使用步骤(1)配制的MES缓冲溶液,加入水蛭素,浓度为1mg/ml至10mg/ml,充分溶解制得水蛭素溶液;
(4)将步骤(2)中配制的透明质酸钠溶液和步骤(3)中配制的水蛭素溶液均匀混合,使得水蛭素与透明质酸钠的质量比例为1:1至1:10;
(5)向步骤(4)中得到的混合溶液中加入交联剂,均匀混合,使得水蛭素与透明质酸钠共价交联,即制得抗凝血涂层材料。
优选地,所述抗凝血涂层材料制备方法,其步骤(3)中的水蛭素溶液含有质量浓度为0.1%至1.0%的吐温80。
优选地,所述抗凝血涂层材料制备方法,其步骤(5)中使用的交联剂为新鲜配制的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液。
优选地,所述抗凝血涂层材料制备方法,其水蛭素、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比例为1:5:1。
优选地,所述抗凝血涂层材料制备方法,还包括:
(6)将步骤(5)制得的抗凝血涂层材料进行透析,去除交联剂。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,由于采用分子量较小水蛭素与生物相容性较好的透明质酸钠交联物作为抗凝血涂层材料,能够取得下列有益效果:
(1)所述抗凝血涂层材料中包含有能直接抑制凝血酶的水蛭素作为抗凝血材料。水蛭素通过阻塞凝血酶的底物结合基团致使凝血酶失去活性,其自由羟基与凝血酶自由氨基通过静电引力而结合,产生的络合物在凝血酶保持活性的整个pH范围内不会解离,因此水蛭素具有抗凝血活性高、结构稳定、不易失活的特点。因此所述抗凝血涂层材料抗凝血活性较高,不易因构象变化导致抗凝血因子失活,抗凝血效果稳定。透明质酸钠单独作为涂层,具有一定的抗凝血作用,如附图2所示,血小板黏附数量在1200个/mm2至2000个/mm2之间,比正常水平低,本发明提供的经水蛭素修饰后的透明质酸钠涂层,能发挥显著的抗凝血效果,血小板黏附数量下降到500个/mm2以下,如图1所示。由此可见本发明提供的抗凝血涂层材料能发挥显著的抗凝血效果。
(2)由于水蛭素是小分子肽,因此单独作为抗凝血涂层材料,流失严重导致抗凝血时间短。本发明采用粘性较强的交联呈网状的透明质酸钠固定水蛭素,水蛭素与透明质酸钠通过酰胺键共价结合,形成稳定的凝胶网络,可持续长久的发挥抗凝血功效。
(3)透明质酸钠能提供高亲水性表层,适合长期与血液接触的表面,同时具有一定的抗凝血效果和良好的生物相容性,能与水蛭素协同作用,加强其抗凝血效果,使用本发明提供的抗凝血涂层材料,对植入物进行改造,使得植入物本身具有长期稳定的抗凝血效果,能帮助减少抗凝血药的使用,从而尽量避免或减轻抗凝血药的毒副作用。
(4)本发明提供的抗凝血涂层材料制备方法,针对水蛭素谷氨酸和天门冬氨酸含量较高的特点,采用酰胺键使水蛭素与透明质酸钠共价结合,能使水蛭素与透明质酸钠结合稳定,从而使抗凝血涂层材料发挥长久的抗凝血效果。目前尚无文献报道能使水蛭素与透明质酸钠之间形成稳定结合的方法。
(5)由于本发明提供的抗凝血涂层材料制备方法,采用交联剂帮助形成酰胺键,能大幅提高反应效率,且所选择的交联剂可通过透析去除,残留少,几乎没有毒副作用。
(6)本发明提供的抗凝血涂层材料制备方法,工艺较为简单,反应条件温和,适合大批量生产。
优选方案,通过对水蛭素和透明质酸钠的质量比例范围、交联剂的种类和交联剂添加比例做优化,使得抗凝血涂层材料在抗凝血效果、制备难度、生产时间和生产成本之间取得平衡,获得成本较为低廉,生产相对简单,抗凝血效果好、抗凝血时间长的抗凝血涂层材料。
附图说明
图1是本发明提供的抗凝血涂层材料进行血小板黏附测试的扫描电子显微镜照片;
图2是透明质酸钠涂层进行血小板粘附测试后的扫描电子显微镜照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
透明质酸钠是一种酸性粘多糖透明质酸的钠盐。透明质酸在人体各种软组织中分布广泛,可以形成凝胶,透明质酸具有高度粘弹性、渗透性和独特的流变学特性以及良好的生物相容性,并且透明质酸形成的凝胶还是一种可吸收生物材料。
水蛭素是一种由65个氨基酸组成的低分子量多肽,其中谷氨酸和天门冬酰胺的含量较高,分子量为7000左右,含有三个二硫键。水蛭素通过其自由羟基与凝血酶的自由氨基结合,致使凝血酶失去活性,在这个结合作用在凝血酶的活性pH范围内不会解离,因此水蛭素具有抗凝血活性高、结构稳定、不易失活等特点,此外,水蛭素后期纯化成本低,这些优点使得水蛭素成为一种抗凝、溶栓的理想原料。
本发明提供的一种抗凝血涂层材料,包括透明质酸钠和水蛭素,所述透明质酸钠形成凝胶网络,所述水蛭素通过酰胺键与所述透明质酸钠共价结合。所述水蛭素与所述透明质酸钠的质量比例为1:1至1:10,优选范围为1:3至1:5。为了缩短交联反应时间,促进酰胺键形成,所述抗凝血涂层材料还包括交联剂,如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
本发明提供的一种抗凝血涂层材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)配制2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液,浓度为0.1mol/L,调节pH值至6.4。
(2)配制透明质酸钠溶液:
取透明质酸钠(HA,分子量约200万)于2-(N-***啉)乙磺酸缓冲溶液(MES,0.1M,pH=6.4)中,使其充分溶解得到透明质酸钠溶液,透明质酸钠溶液浓度为1mg/ml至20mg/ml。可采用磁力搅拌加速透明质酸钠溶解,搅拌12小时。制得的透明质酸钠溶液可密封冷冻保存备用。
(3)配制水蛭素溶液:
取水蛭素于MES缓冲液中,使水蛭素均匀分散于MES缓冲液中。为增加水蛭素的溶解度,可添加表面活性剂,例如质量比例为0.1%至1.0%的吐温80。制得的水蛭素溶液可密封冷冻保存备用。
(4)将步骤(2)中配制的透明质酸钠溶液和步骤(3)中配制的水蛭素溶液均匀混合:
在MES缓冲液中加入步骤(2)中制得的透明质酸钠溶液,然后加入水蛭素溶液,使得水蛭素与透明质酸钠的质量比例为1:1至1:10,混合均匀。
(5)向步骤(4)中得到的混合溶液中加入交联剂:
选择1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液作为交联剂,即EDC/NHS交联剂。取新鲜配制的50mg/ml的EDC溶液,加入步骤(4)中得到的混合溶液中,加入比例为水蛭素与EDC质量比例1:5,混合均匀后静置15分钟。然后取新鲜配制的10mg/ml的NHS溶液,加入所述混合溶液,加入比例为水蛭素与NHS质量比例1:1。在避光条件下均匀混合,12小时候得到透明质酸钠与水蛭素交联混合物,即制得所述抗凝血涂层材料。
(6)将步骤(5)制得的抗凝血涂层材料进行透析,去除交联剂,从而纯化抗凝血涂层材料。
本发明提供的抗凝血涂层材料,以浸涂法修饰并常温干燥,即可修饰上具有抗凝血性能的涂层。对本发明提供的抗凝血涂层材料进行血小板黏附测试,测试后用扫面电子显微镜成像,照片如图1所示。仅采用透明质酸钠涂层材料进行血小板黏附测试,其测试结果如图2所示。对测试结果进行对比,可观察到,本发明提供的抗凝血涂层材料发挥了显著的抗凝血效果。
以下为实施例:
实施例1
一种抗凝血涂层材料,包括透明质酸钠和水蛭素,所述透明质酸钠形成凝胶网络,所述水蛭素通过酰胺键与所述透明质酸钠共价结合。所述水蛭素与所述透明质酸钠的质量比例为1:1。所述抗凝血涂层材料还包括交联剂,1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
所述抗凝血涂层材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)配制2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液,浓度为0.1mol/L,调节pH值至6.4。
(2)配制透明质酸钠溶液。
取透明质酸钠(HA,分子量约200万)于2-(N-***啉)乙磺酸缓冲溶液(MES,0.1M,pH=6.4)中,使其充分溶解得到透明质酸钠溶液,透明质酸钠溶液浓度为1mg/ml。可采用磁力搅拌加速透明质酸钠溶解,搅拌12小时。制得的透明质酸钠溶液可密封冷冻保存备用。
(3)配制水蛭素溶液。
取水蛭素于MES缓冲液中,水蛭素浓度为1mg/ml,通过磁力搅拌,使水蛭素均匀分散于MES缓冲液中,加入质量浓度为0.1%的吐温80。制得的水蛭素溶液可密封冷冻保存备用。
(4)将步骤(2)中配制的透明质酸钠溶液和步骤(3)中配制的水蛭素溶液均匀混合。
在6mL MES缓冲液中加入步骤(2)中制得的透明质酸钠溶液20mL,然后加入步骤(3)制得的水蛭素溶液20mL,透明质酸钠与水蛭素的质量比例为1:1,搅拌混合均匀。
(5)向步骤(4)中得到的混合溶液中加入交联剂。
选择1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液作为交联剂,即EDC/NHS交联剂。取新鲜配制的50mg/ml的EDC溶液2mL,加入步骤(4)中得到的混合溶液中,水蛭素与EDC质量比例1:5,混合均匀后静置15分钟。然后取新鲜配制的10mg/ml的NHS溶液2mL,加入所述混合溶液,水蛭素与NHS质量比例1:1。在避光条件下均匀混合,12小时候得到透明质酸钠与水蛭素交联混合物,即制得所述抗凝血涂层材料。
(6)将步骤(5)制得的抗凝血涂层材料进行透析,去除交联剂,从而纯化抗凝血涂层材料。
将所述抗凝血涂层材料采用浸凃法涂覆在测试材料聚乙烯(PE)片上,对聚乙烯片做红外光谱检测,观察到1650-1750cm-1(C=O)和1200-1320cm-1(C-N)的酰胺(R1-CO-NH-R2)峰增强,说明透明质酸钠与水蛭素发生酰胺键交联。
对所述抗凝血涂层材料进行抗凝血测试:
将所述抗凝血涂层材料,采用浸涂法涂覆在聚乙烯片上,将聚乙烯片剪成2cm*2cm的正方形,将新鲜血液离心收集富血小板血浆,接种于涂覆了抗凝血涂层的聚乙烯片上,孵育固定脱水后,通过扫描电子显微镜观察血小板粘附情况,将未修饰水蛭素的透明质酸钠涂层作为对照组,结果表明,修饰水蛭素的透明质酸钠涂层的单位面积血小板粘附数量为未添加水蛭素的透明质酸钠涂层的样品的45%,共价结合水蛭素后提高了涂层的抗凝血能力。
实施例2
一种抗凝血涂层材料,包括透明质酸钠和水蛭素,所述透明质酸钠形成凝胶网络,所述水蛭素通过酰胺键与所述透明质酸钠共价结合。所述水蛭素与所述透明质酸钠的质量比例为1:3。所述抗凝血涂层材料还包括交联剂,1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
所述抗凝血涂层材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)配制2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液,浓度为0.1mol/L,调节pH值至6.4。
(2)配制透明质酸钠溶液。
取透明质酸钠(HA,分子量约200万)于2-(N-***啉)乙磺酸缓冲溶液(MES,0.1M,pH=6.4)中,使其充分溶解得到透明质酸钠溶液,透明质酸钠溶液浓度为3mg/ml。可采用磁力搅拌加速透明质酸钠溶解,搅拌12小时。制得的透明质酸钠溶液可密封冷冻保存备用。
(3)配制水蛭素溶液。
取水蛭素于MES缓冲溶液中,水蛭素浓度为1mg/ml,通过磁力搅拌,使水蛭素均匀分散于MES缓冲液中,加入质量浓度为0.1%的吐温80。制得的水蛭素溶液可密封冷冻保存备用。
(4)将步骤(2)中配制的透明质酸钠溶液和步骤(3)中配制的水蛭素溶液均匀混合。
在6mL MES缓冲液中加入步骤(2)中制得的透明质酸钠溶液20mL,然后加入步骤(3)制得的水蛭素溶液20mL,水蛭素与透明质酸钠的质量比例为1:3,搅拌混合均匀。
(5)向步骤(4)中得到的混合溶液中加入交联剂。
选择1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液作为交联剂,即EDC/NHS交联剂。取新鲜配制的50mg/ml的EDC溶液2mL,加入步骤(4)中得到的混合溶液中,水蛭素与EDC质量比例1:5,混合均匀后静置15分钟。然后取新鲜配制的10mg/ml的NHS溶液2mL,加入所述混合溶液,水蛭素与NHS质量比例1:1。在避光条件下均匀混合,12小时候得到透明质酸钠与水蛭素交联混合物,即制得所述抗凝血涂层材料。
将所述抗凝血涂层材料采用浸凃法涂覆在测试材料聚乙烯(PE)片上,对聚乙烯片做红外光谱检测,观察到1650-1750cm-1(C=O)和1200-1320cm-1(C-N)的酰胺(R1-CO-NH-R2)峰增强,说明透明质酸钠与水蛭素发生酰胺键交联。
对所述抗凝血涂层材料进行抗凝血测试:
将所述抗凝血涂层材料,采用浸涂法涂覆在聚乙烯片上,将聚乙烯片剪成2cm*2cm的正方形,将新鲜血液离心收集富血小板血浆,接种于涂覆了抗凝血涂层的聚乙烯片上,孵育固定脱水后,通过扫描电子显微镜观察血小板粘附情况,将未修饰水蛭素的透明质酸钠涂层作为对照组,结果表明,修饰水蛭素的透明质酸钠涂层的单位面积血小板粘附数量为未添加水蛭素的透明质酸钠涂层的样品的23%,共价结合水蛭素后提高了涂层的抗凝血能力。
实施例3
一种抗凝血涂层材料,包括透明质酸钠和水蛭素,所述透明质酸钠形成凝胶网络,所述水蛭素通过酰胺键与所述透明质酸钠共价结合。所述水蛭素与所述透明质酸钠的质量比例为1:4。所述抗凝血涂层材料还包括交联剂,1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
所述抗凝血涂层材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)配制2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液,浓度为0.1mol/L,调节pH值至6.4。
(2)配制透明质酸钠溶液。
取透明质酸钠(HA,分子量约200万)于2-(N-***啉)乙磺酸缓冲溶液(MES,0.1M,pH=6.4)中,使其充分溶解得到透明质酸钠溶液,透明质酸钠溶液浓度为5mg/ml。可采用磁力搅拌加速透明质酸钠溶解,搅拌12小时。制得的透明质酸钠溶液可密封冷冻保存备用。
(3)配制水蛭素溶液。
取水蛭素于MES缓冲溶液中,水蛭素浓度为2.5mg/ml,通过磁力搅拌,使水蛭素均匀分散于MES缓冲液中,加入质量浓度为0.5%的吐温80。制得的水蛭素溶液可密封冷冻保存备用。
(4)将步骤(2)中配制的透明质酸钠溶液和步骤(3)中配制的水蛭素溶液均匀混合。
在6mL MES缓冲液中加入步骤(2)中制得的透明质酸钠溶液8mL,然后加入步骤(3)制得的水蛭素溶液4mL,水蛭素与透明质酸钠的质量比例为1:4,搅拌混合均匀。
(5)向步骤(4)中得到的混合溶液中加入交联剂。
选择1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液作为交联剂,即EDC/NHS交联剂。取新鲜配制的50mg/ml的EDC溶液1mL,加入步骤(4)中得到的混合溶液中,水蛭素与EDC质量比例1:5,混合均匀后静置15分钟。然后取新鲜配制的10mg/ml的NHS溶液1mL,加入所述混合溶液,水蛭素与NHS质量比例1:1。在避光条件下均匀混合,12小时候得到透明质酸钠与水蛭素交联混合物,即制得所述抗凝血涂层材料。
(6)将步骤(5)制得的抗凝血涂层材料进行透析,去除交联剂,从而纯化抗凝血涂层材料。
将所述抗凝血涂层材料采用浸凃法涂覆在测试材料聚乙烯(PE)片上,对聚乙烯片做红外光谱检测,观察到1650-1750cm-1(C=O)和1200-1320cm-1(C-N)的酰胺(R1-CO-NH-R2)峰增强,说明透明质酸钠与水蛭素发生酰胺键交联。
对所述抗凝血涂层材料进行抗凝血测试:
将所述抗凝血涂层材料,采用浸涂法涂覆在聚乙烯片上,将聚乙烯片剪成2cm*2cm的正方形,将新鲜血液离心收集富血小板血浆,接种于涂覆了抗凝血涂层的聚乙烯片上,孵育固定脱水后,通过扫描电子显微镜观察血小板粘附情况,将未修饰水蛭素的透明质酸钠涂层作为对照组,结果表明,修饰水蛭素的透明质酸钠涂层的单位面积血小板粘附数量为未添加水蛭素的透明质酸钠涂层的样品的25%,共价结合水蛭素后提高了涂层的抗凝血能力。
实施例4
一种抗凝血涂层材料,包括透明质酸钠和水蛭素,所述透明质酸钠形成凝胶网络,所述水蛭素通过酰胺键与所述透明质酸钠共价结合。所述水蛭素与所述透明质酸钠的质量比例为1:5。所述抗凝血涂层材料还包括交联剂,1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
所述抗凝血涂层材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)配制2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液,浓度为0.1mol/L,调节pH值至6.4。
(2)配制透明质酸钠溶液:
取透明质酸钠(HA,分子量约200万)于2-(N-***啉)乙磺酸缓冲溶液(MES,0.1M,pH=6.4)中,使其充分溶解得到透明质酸钠溶液,透明质酸钠溶液浓度为10mg/ml。可采用磁力搅拌加速透明质酸钠溶解,搅拌12小时。制得的透明质酸钠溶液可密封冷冻保存备用。
(3)配制水蛭素溶液。
取水蛭素于MES缓冲溶液中,水蛭素浓度为5mg/ml,通过磁力搅拌,使水蛭素均匀分散于MES缓冲液中,加入质量浓度为0.5%的吐温80。制得的水蛭素溶液可密封冷冻保存备用。
(4)将步骤(2)中配制的透明质酸钠溶液和步骤(3)中配制的水蛭素溶液均匀混合。
在2mL MES缓冲液中加入步骤(2)中制得的透明质酸钠溶液10mL,然后加入步骤(3)制得的水蛭素溶液4mL,水蛭素与透明质酸钠的质量比例为1:5,搅拌混合均匀。
(5)向步骤(4)中得到的混合溶液中加入交联剂。
选择1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液作为交联剂,即EDC/NHS交联剂。取新鲜配制的50mg/ml的EDC溶液2mL,加入步骤(4)中得到的混合溶液中,水蛭素与EDC质量比例1:5,混合均匀后静置15分钟。然后取新鲜配制的10mg/ml的NHS溶液2mL,加入所述混合溶液,水蛭素与NHS质量比例1:1。在避光条件下均匀混合,12小时候得到透明质酸钠与水蛭素交联混合物,即制得所述抗凝血涂层材料。
将所述抗凝血涂层材料采用浸凃法涂覆在测试材料聚乙烯(PE)片上,对聚乙烯片做红外光谱检测,观察到1650-1750cm-1(C=O)和1200-1320cm-1(C-N)的酰胺(R1-CO-NH-R2)峰增强,说明透明质酸钠与水蛭素发生酰胺键交联。
对所述抗凝血涂层材料进行抗凝血测试:
将所述抗凝血涂层材料,采用浸涂法涂覆在聚乙烯片上,将聚乙烯片剪成2cm*2cm的正方形,将新鲜血液离心收集富血小板血浆,接种于涂覆了抗凝血涂层的聚乙烯片上,孵育固定脱水后,通过扫描电子显微镜观察血小板粘附情况,将未修饰水蛭素的透明质酸钠涂层作为对照组,结果表明,修饰水蛭素的透明质酸钠涂层的单位面积血小板粘附数量为未添加水蛭素的透明质酸钠涂层的样品的30%,共价结合水蛭素后提高了涂层的抗凝血能力。
实施例5
一种抗凝血涂层材料,包括透明质酸钠和水蛭素,所述透明质酸钠形成凝胶网络,所述水蛭素通过酰胺键与所述透明质酸钠共价结合。所述水蛭素与所述透明质酸钠的质量比例为1:10。所述抗凝血涂层材料还包括交联剂,1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
所述抗凝血涂层材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)配制2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液,浓度为0.1mol/L,调节pH值至6.4。
(2)配制透明质酸钠溶液。
取透明质酸钠(HA,分子量约200万)于2-(N-***啉)乙磺酸缓冲溶液(MES,0.1M,pH=6.4)中,使其充分溶解得到透明质酸钠溶液,透明质酸钠溶液浓度为20mg/ml。可采用磁力搅拌加速透明质酸钠溶解,搅拌12小时。制得的透明质酸钠溶液可密封冷冻保存备用。
(3)配制水蛭素溶液。
取水蛭素于MES缓冲溶液中,水蛭素浓度为10mg/ml,通过磁力搅拌,使水蛭素均匀分散于MES缓冲液中,加入质量浓度为1.0%的吐温80。制得的水蛭素溶液可密封冷冻保存备用。
(4)将步骤(2)中配制的透明质酸钠溶液和步骤(3)中配制的水蛭素溶液均匀混合。
在4mL MES缓冲液中加入步骤(2)中制得的透明质酸钠溶液10mL,然后加入步骤(3)制得的水蛭素溶液2mL,水蛭素与透明质酸钠的质量比例为1:10,搅拌混合均匀。
(5)向步骤(4)中得到的混合溶液中加入交联剂。
选择1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液作为交联剂,即EDC/NHS交联剂。取新鲜配制的50mg/ml的EDC溶液2mL,加入步骤(4)中得到的混合溶液中,水蛭素与EDC质量比例1:5,混合均匀后静置15分钟。然后取新鲜配制的10mg/ml的NHS溶液2mL,加入所述混合溶液,水蛭素与NHS质量比例1:1。在避光条件下均匀混合,12小时候得到透明质酸钠与水蛭素交联混合物,即制得所述抗凝血涂层材料。
将所述抗凝血涂层材料采用浸凃法涂覆在测试材料聚乙烯(PE)片上,对聚乙烯片做红外光谱检测,观察到1650-1750cm-1(C=O)和1200-1320cm-1(C-N)的酰胺(R1-CO-NH-R2)峰增强,说明透明质酸钠与水蛭素发生酰胺键交联。
对所述抗凝血涂层材料进行抗凝血测试:
将所述抗凝血涂层材料,采用浸涂法涂覆在聚乙烯片上,将聚乙烯片剪成2cm*2cm的正方形,将新鲜血液离心收集富血小板血浆,接种于涂覆了抗凝血涂层的聚乙烯片上,孵育固定脱水后,通过扫描电子显微镜观察血小板粘附情况,将未修饰水蛭素的透明质酸钠涂层作为对照组,结果表明,修饰水蛭素的透明质酸钠涂层的单位面积血小板粘附数量为未添加水蛭素的透明质酸钠涂层的样品的50%,共价结合水蛭素后提高了涂层的抗凝血能力。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种抗凝血涂层材料,其特征在于,包括透明质酸钠和水蛭素,所述透明质酸钠形成凝胶网络,所述水蛭素通过酰胺键与所述透明质酸钠共价结合,所述水蛭素与所述透明质酸钠的质量比例为1:1至1:10。
2.如权利要求1所述的抗凝血涂层材料,其特征在于,所述水蛭素与所述透明质酸钠的质量比例为1:3至1:5。
3.如权利要求1或2所述的抗凝血涂层材料,其特征在于,所述抗凝血涂层材料还包括交联剂。
4.如权利要求3所述的抗凝血涂层材料,其特征在于,所述交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。
5.一种抗凝血涂层材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)配制2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液。
(2)使用步骤(1)配制的MES缓冲溶液,加入透明质酸钠,浓度为1mg/ml至20mg/ml,充分溶解制得透明质酸钠溶液;
(3)使用步骤(1)配制的MES缓冲溶液,加入水蛭素,浓度为1mg/ml至10mg/ml,充分溶解制得水蛭素溶液;
(4)将步骤(2)中配制的透明质酸钠溶液和步骤(3)中配制的水蛭素溶液均匀混合,使得水蛭素与透明质酸钠的质量比例为1:1至1:10;
(5)向步骤(4)中得到的混合溶液中加入交联剂,均匀混合,使得水蛭素与透明质酸钠共价交联,即制得抗凝血涂层材料。
6.如权利要求5所述的抗凝血涂层材料制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中的水蛭素溶液含有质量浓度为0.1%至1.0%的吐温80。
7.如权利要求5所述的抗凝血涂层材料制备方法,其特征在于,所述步骤(5)中使用的交联剂为新鲜配制的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液。
8.如权利要求7所述的抗凝血涂层材料制备方法,其特征在于,所述水蛭素、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比例为1:5:1。
9.如权利要求5至8任意一项所述的抗凝血涂层材料制备方法,其特征在于,还包括:
(6)将步骤(5)制得的抗凝血涂层材料进行透析,去除交联剂。
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