CN103712963A

CN103712963A - 一种荧光分析方法和装置

Info

Publication number: CN103712963A
Application number: CN201210378343.2A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Individual
Current assignee: Shanghai Xinpu Biotechnology Co ltd; Xinjiang Xingyi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2012-09-29
Filing date: 2012-09-29
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2032-09-29
Also published as: CN103712963B

Abstract

本发明涉及一种荧光分析方法和装置，具体地，本发明公开了一种用于定量检测样品中的待测物的渗漏检测装置，所述装置包括(1)包含检测区的多孔膜和(2)位于多孔膜下方的吸收垫。本发明还公开了一种基于所述渗漏检测装置的定量检测待测物的检测方法和一种基于所述检测方法的检测装置。

Description

一种荧光分析方法和装置

技术领域

本发明属于体外检测技术领域，具体地涉及一种基于测量荧光强度的分析方法和装置。

背景技术

在免疫检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，以“竞争抑制和双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如：放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法和荧光免疫法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测，从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。这类免疫反应分析方法，通常将捕获抗体固定于固相载体，然后与抗原(目标蛋白)反应，洗涤后再与标记抗体反应，洗涤，最后检测放射性强度、溶液吸光度或光信号等，从而报告检测样本中目标蛋白的浓度。上述方法的自动化免去了人工洗涤的烦琐，但正因为自动化，使得仪器体积庞大价格昂贵，一般只在大型实验室使用。

斑点金免疫渗滤技术(dot immunogold filtration assay,DIGFA)是Spielberg等最初于1989年通过检测抗HIV建立，随着胶体金技术、材料技术以及计算机的高速发展，斑点金免疫渗滤技术日臻完备，作为以膜为载体的胶体金快速诊断技术中的一种，具有检测快速、便捷、不需要特殊设备、结果判断直观等优点。由于该方法只需肉眼观察即可，非专业人士也可操作，使急诊、基层医院、病人床边和现场等远离大型实验室的地方开展相关检测成为可能，所以应用范围相当广泛。如：已应用于多种寄生虫病标志物、心脏病标志物、传染性疾病标志物、毒物、性传播疾病和其他生化指标的检测等，在其他领域如食品卫生、环境保护等领域都有报道。

DIGFA法已经超过20年的发展，但其基本的工作原理并未改变，这决定了到目前为止，它只用于定性或半定量检测且灵敏度也不如前述的定量免疫分析方法，进一步的应用遇到了瓶颈。因此，本领域急需对现有的DIGFA方法进行变革，在赋予其高灵敏度和定量准确的新优势的同时，保持其快捷、简便、成本低廉等特点，从而进一步扩展其应用领域。

发明内容

本发明提供了一种渗漏检测装置，用于定量检测样品中的待测物。

本发明提供了一种定量检测待测物的检测方法，所述方法灵敏度高，定量准确。

本发明还提供了一种定量检测待测物的检测装置。

在本发明第一方面中，提供了一种渗漏检测装置，该渗漏检测装置包括：

(a1)包含检测区的多孔膜，其中，所述的检测区包含固定化捕获剂，并且

所述固定化捕获剂能同时与可流动的荧光物质和可流动的第一结合剂结合，从而形成“荧光物质－捕获剂－第一结合剂”复合物；所述第一结合剂可与待测物结合，且所述待测物能与第二结合剂结合，从而形成“第一结合剂－待测物－第二结合剂”复合物；

从而当检测区接触所述的荧光物质、第一结合剂、待测物和第二结合剂后，在检测区形成“荧光物质－捕获剂－第一结合剂－待测物－第二结合剂”复合物，其中，所述的第二结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度；

(a2)位于多孔膜下方的吸收垫，所述吸收垫具有吸收能力，使得加至检测区的样品和液体透过多孔膜并被吸收垫吸收。

在另一优选例中，所述固定化捕获剂为链亲和素，所述荧光物质被生物素标记，所述第一结合剂被生物素标记。

在另一优选例中，所述的第一结合剂和第二结合剂的种类或数量为一种或多种；较佳地，可同时用于检测一种或多种待测物。

在另一优选例中，所述的渗漏检测装置是定量检测装置。

在另一优选例中，所述待测物为抗原或抗体。

在另一优选例中，所述的待测物是抗原，则所述的第一结合剂和第二结合剂是可同时结合于所述抗原的抗体；或者所述的待测物是抗体，则所述的第一结合剂和第二结合剂是可同时结合于所述抗体的抗原或所述抗体的抗体(抗抗体)。

在本发明第二方面中，提供了一种渗漏检测装置，该渗漏检测装置包括：

(b1)包含检测区的多孔膜，其中，所述的检测区包含固定化捕获剂，并且

所述固定化捕获剂能同时与可流动的荧光物质和可流动待测物等同物结合，从而形成“荧光物质－捕获剂－待测物等同物”复合物；所述待测物等同物能与结合剂结合，从而形成“待测物等同物－结合剂”复合物，且所述结合剂能与待测物结合；

从而当检测区接触所述的荧光物质、结合剂、待测物和待测物等同物后，在检测区形成“荧光物质－捕获剂－待测物等同物－结合剂”复合物，其中，所述的结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度；

(b2)位于多孔膜下方的吸收垫，所述吸收垫具有吸收能力，使得加至检测区的样品和液体透过多孔膜并被吸收垫吸收。

在另一优选例中，所述固定化捕获剂为链亲和素，则所述荧光物质被生物素标记，所述待测物等同物被生物素标记。

在另一优选例中，所述的结合剂的种类或数量为一种或多种；较佳地，可同时用于检测一种或多种待测物。

在另一优选例中，所述的渗漏检测装置是定量检测装置。

在另一优选例中，所述待测物为抗原或抗体。

在另一优选例中，所述的待测物是抗原，则所述的结合剂是可结合于所述抗原的抗体；或者所述的待测物是抗体，则所述的结合剂是可结合于所述抗体的抗原或所述抗体的抗体(抗抗体)。

在另一优选例中，所述的渗漏检测装置还包括：

在吸收垫下方存在一底部装置；

在多孔膜上方还存在一盖部装置，所述盖部装置上具有可供加入样品的开孔，且所述多孔膜位于该开孔下方。

在另一优选例中，所述荧光物质的激发或发射光谱与所述吸光物质的吸收光谱全部或部分重叠。

在另一优选例中，所述多孔膜上还包括不同于检测区的对照区，所述对照区含有固定化的对照剂，其中，所述对照剂用于特异性结合被吸光物质标记的结合剂。

在另一优选例中，所述对照区用于显示待测物的检测结果的有效性。

在另一优选例中，所述的待测物包括：蛋白、核酸或小分子化合物。

在另一优选例中，所述的待测物是液相(溶液)、悬浮液或固相。

在另一优选例中，所述荧光物质选自下组：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或稀土元素离子或其螯合物。

在另一优选例中，所述的吸光物质选自下组：胶体金、纳米金棒、纳米银棒或其组合。

在另一优选例中，所述的吸光物质为纳米金棒。

在另一优选例中，所述的纳米金棒的纵横比为1.5-10，较佳地为1.5-5。

在另一优选例中，所述的纳米金棒的长度为10-200nm，较佳地为20-100nm。

在另一优选例中，所述的胶体金是平均粒径为10-70nm的胶体金颗粒。

在本发明第三方面中，提供了一种定量检测待测物的荧光分析方法，包括步骤：

(a1)将第一结合剂、待测物样品和第二结合剂分别添加于渗漏检测装置的检测区，或将第一结合剂、待测物样品和第二结合剂的混合后添加于所述的检测区，

并且将荧光物质添加于所述的检测区；其中，所述的检测区包含固定化捕获剂，并且所述固定化捕获剂能同时与可流动的荧光物质和可流动的第一结合剂结合，从而形成“荧光物质－捕获剂－第一结合剂”复合物；所述第一结合剂可与待测物结合，且所述待测物能与第二结合剂结合，从而形成“第一结合剂－待测物－第二结合剂”复合物；

(2)检测所述检测区的荧光强度F，从而测得待测物的存在与否或数量。

在本发明第四方面中，提供了一种定量检测待测物的荧光分析方法，包括步骤：

(b1)将待测物样品、待测物等同物和结合剂依次添加于渗漏检测装置的检测区，

或者

首先提供一将待测物样品和待测物等同物的第一混合物，然后将结合剂和第一混合物依次添加于所述的检测区，或者将结合剂和第一混合物所形成的第二混合物添加于所述的检测区，

或者

首先提供一待测物样品和结合剂的第三混合物，然后将待测物等同物和第三混合物依次添加于所述的检测区、或者将待测物等同物与第三混合物所形成的第四混合物添加于所述的检测区，

并且将荧光物质添加于所述的检测区；其中，所述的检测区包含固定化捕获剂，并且所述固定化捕获剂能同时与可流动的荧光物质和可流动待测物等同物结合，从而形成“荧光物质－捕获剂－待测物等同物”复合物；所述待测物等同物能与结合剂结合，从而形成“待测物等同物－结合剂”复合物，且所述结合剂能与待测物结合；

从而当检测区接触荧光物质、待测物样品、待测物等同物和结合剂后，在检测区形成“荧光物质－捕获剂－待测物等同物－结合剂”复合物，其中，所述的结合剂被吸光物质标记，且所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度；

在另一优选例中，所述的步骤(2)包括：将检测区的荧光强度F和标准曲线或者与未加样的初始荧光强度F0进行比较，从而确定待测物的存在与否或数量。

在另一优选例中，当待测物为固相时，步骤(1)还包括加入溶剂(如水或缓冲液)

在另一优选例中，所述的方法还包括用已知浓度的待测物标准品进行测量，从而制作标准曲线的步骤。

在本发明第五方面中，提供了一种定量检测待测物的荧光测量装置，所述的装置包括：

(a)一本发明第一方面或本发明第二方面所述的渗漏检测装置；和

(b)一用于检测荧光强度的检测器。

在另一优选例中，所述装置还包括光源和计算机。

所述光源照射到检测区处，激发出的荧光进入检测器，由计算机进行数据处理和分析。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A是渗漏检测装置示意图。

图1B是渗漏检测装置示意图。

图2是检测装置示意图。

图3是实施例1的AFP标准系列浓度(lgC)与相应荧光强度(F)标准曲线图。

图4是实施例2的CRP标准系列浓度(C)与相应荧光强度(F)标准曲线图。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究，发现了一种基于荧光淬灭原理的检测方法，所述方法通过亲和素将可流动的荧光物质和含吸光物质的复合物结合，不仅可以通过目测检测区的颜色来判断是否含有待测物，还可以通过测量检测区处荧光强度的方式来定量检测待测物。所述方法不仅具有灵敏度高，定量准确的优点，而且操作仍然十分简便、快捷、且成本低廉。所述方法是基于本发明提供的一种渗滤测试装置，通过一种含有光源和检测器的装置实现了对待测物的定量检测。在此基础上，发明人完成了本发明。

渗漏检测装置

现在更详细地描述用于制造本发明渗漏检测装置的方法和材料。应注意，渗漏检测装置的具体构造可以变化，这取决于意图用渗漏检测装置来进行的具体测试。在实施例之外制造渗漏检测装置的变动方法，也落于本发明范围之中。

渗漏检测装置可包括盖部装置1，所述盖部装置具有一个便于加样的开孔11，所述开孔可以是圆形、方形等多种形状。

多孔膜2(或微孔膜)位于盖部装置1的开孔下方，所述多孔膜包括：检测区和优选的设置有对照区，且通常对照区与检测区之间有适当的空间。

吸收垫3位于多孔膜下方。

位于吸收垫下方还具有一底部装置4。

按图1B所示，分别将多孔膜2、吸收垫3、盖部装置1和底部装置4装配成渗滤测试装置。

所述渗漏检测装置可以是多种形式存在，例如板，片或盒等。以盒为例，所述盖部装置为盒盖，所述底部装置为盒底，可以将多孔膜安放在盒盖开孔(如0.4～0.8cm的圆孔)正下方，吸收垫在多孔膜的正下方，紧密闭合盖、底，使多孔膜贴紧吸收垫，即制备成图1A所示的渗漏检测装置。

所述盖部装置和底部装置可以用任何稳定的、无孔的材料制成。因为许多测定用水作为扩散介质，因此底部装置较佳地是基本上不透水的，且其强度应足以支承粘于其的渗漏检测装置。在一个优选例中，背衬片是用聚合物物(如塑料)制成的。

所述吸收垫可以用任何能吸收作为样品和缓冲液的液体的材料制成。吸收垫片的吸收能力应足够大，以便吸收添加至渗漏检测装置的液体。适用于吸收垫片的材料的例子包括纤维素和玻璃纤维。

所述多孔膜可以用任何材料制成，只要该材料有足够孔隙度从而允许在表面和内部发生流体的毛细管作用。多孔膜应有足够的孔隙度，从而允许涂有抗体或抗原的颗粒移动。多孔膜还可被含待检测分析物的样品中所用的液体润湿(例如，对于水性液体具有亲水性，对于有机溶剂具有疏水性)。通过例如在美国专利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(这些方法描述了将疏水表面转变成亲水表面)，可以改变其疏水性从而使其具有亲水性以便用于水性液体。可用于制造多孔膜的材料例子包括：聚脂膜、纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一优选例中，所述多孔膜为硝酸纤维素膜片。

检测方法

本发明渗漏检测装置可用于大量不同的渗漏分析方法，而这些分析方法涉及使用一种可流动的荧光物质、一种或多种结合剂和一种固定化捕获剂，其中，至少一种结合剂被吸光物质标记。当捕获剂捕获所述的荧光物质和吸光物质标记的结合剂后，可形成含有吸光物质和荧光物质的复合物。具体地，当所述吸光物质影响(部分淬灭或全部淬灭)所述荧光物质的荧光强度时，本发明的检测方法即可通过检测荧光物质的荧光强度来测定待测物的数量。

如本文所用，术语“待测物”、“其等同物”或“分析物”指待用渗漏检测装置检测以及可任选地被定量测定的、样品中的任何组份，待测物或其等同物或分析物的例子包括：蛋白质，如激素或其他分泌蛋白质、酶和细胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗体(包括单克隆抗体或多克隆抗体及其片段)；核酸；药物(包括地高辛等强心甙类药物)；毒素；病毒或病毒颗粒；细胞壁组份；或其他具有表位的化合物。

优选地，所述的待测物包括肿瘤标志物、心肌标志物等特异性的蛋白，所述肿瘤标志物选自下组：甲胎蛋白(AFP)、C-反应蛋白(CRP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总***特异性抗原(PSA)、游离***特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、或人绒毛膜***(β-HCG)。

结合剂

本发明所用的结合剂可以是任何能够结合于待测物或其等同物的物质。具体地，为特异性结合待测物或其等同物的物质。

有各种不同类型的分子可用作分析物结合剂，其中包括例如：寡核苷酸、抗体、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(该抗原具有分析物结合位点)的异源混合物的裂解物。P.Holliger等人,Trends in Biotechnology 13:7-9(1995);S.M.Chamow等人,Trends in Biotechnology 14:52-60(1996)。如果待检测分析物是配体，那么可使用结合于该配体的受体，反之亦然。

标记物质

用于结合剂的标记物，本发明优先选用吸光物质标记物(简称吸光物质)。当荧光物质和吸光标记物通过特定的方式结合后，当荧光物质的激发或发射光谱与吸光物质的吸收光谱部分或完全重叠时，吸光物质会影响(部分淬灭或全部淬灭)荧光物质的荧光，从而通过检测荧光物质的荧光强度来测定待测物的数量。

在一优选例中，可检测标记物是颗粒。可使用的颗粒例子包括(但并不限于)：胶体金颗粒；胶体硫颗粒；胶体硒颗粒；胶体硫酸钡颗粒；胶体硫酸铁颗粒；金属碘酸盐颗粒；卤化银颗粒；二氧化硅颗粒；胶体(水合)金属氧化物颗粒；胶体金属硫化物颗粒；胶体硒化铅颗粒；胶体硒化镉颗粒；胶体金属磷酸盐颗粒；胶体金属铁酸盐颗粒；涂有有机或无机层的上述任一种胶体颗粒；蛋白质或肽分子；脂质体；或有机聚合物乳胶颗粒，例如聚苯乙烯乳胶珠。

荧光物质和吸光物质的选择

用于本发明标记的荧光物质和吸光物质应配合使用，基本原则是荧光物质的激发或发射光谱与吸光物质的吸收光谱部分或完全重叠。最优的是完全重叠，如此会有较高的检测灵敏度。

代表性的荧光物质包括(但并不限于)：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)、量子点、稀土元素离子(如Eu³⁺)及其螯合物等组合，只要所选荧光物质的激发或发射光谱与所选吸光物质的吸收光谱有重叠即可。

代表性的吸光物质包括(但并不限于)：胶体金、纳米金棒、纳米银棒等组合，只要所选吸光物质的吸收光谱与所选荧光物质的激发或发射光谱重叠即可。

胶体金颗粒可用任何常规方法制造，例如总结于G.Frens,1973 NaturePhysical Science,241:20(1973)中的方法。其他方法描述于美国专利No.5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775。

如本文所用，术语“纳米金棒”指具有一定纵横比、且横轴和纵轴处于5-200纳米范围的金颗粒。

一种特别优选的吸光物质是胶体金，尤其是粒径为20-40nm的胶体金。

优选地，本领域技术人员常用荧光标记物质包括PE，PE的吸收光谱在550~650nm之间，最大发射波长为575nm，而30nm胶体金的吸收光谱在300~800nm，较宽泛，最大吸收峰为525~530nm处，与PE的发射光谱有部分重叠，所以选择30nm胶体金作为相应的吸光物质。

荧光淬灭原理

含有荧光标记的物质与含有吸光物质标记的物质结合后，当荧光物质的激发或发射光谱与作为荧光淬灭剂的吸光物质的吸收光谱全部或部分重叠时，因共振能量转移，吸光物质会对该荧光物质的荧光产生淬灭作用。

本发明中，引起荧光淬灭的原因包括两个方面：一是复合物内部吸光物质对荧光物质的淬灭；二是堆积在一起的复合物之间的相互淬灭，如：复合物甲的吸光物质淬灭复合物乙的荧光，复合物乙的吸光物质淬灭复合物丙的荧光，复合物丙的吸光物质淬灭复合物甲的荧光，依此类推。

工作原理

现结合图1A和图1B和具体的实施方式说明本发明检测方法的工作原理：

方法一、

检测区处也可固定其他能捕获“夹心复合物”的荧光标记物质。

(1.1)用针对待测物(记为Ag，如抗原)的一抗体(记为Ab1)标记biotin(记为biotin-Ab1)，用针对该待测物的另一抗体(记为Ab2)标记吸光物质G(记为Ab2-G，也称为抗原的金标抗体)，将2个被标记的抗体与待测物混合，复溶，形成如biotin-Ab1-Ag-Ab2-G的复合物1；

(1.2)用一荧光物质(记为F)标记biotin，形成如biotin-F的复合物2，其中G的吸收光谱与F的激发和(或)发射光谱完全和(或)部分重叠；

(1.3)通过加样孔11，将复合物1与复合物2(或复合物2与构成复合物1的各种物质，反应后仍得到复合物1与复合物2)加在多孔膜上，待完全渗入，于小孔内滴加缓冲液，待完全渗入，固定在此的捕获剂亲和素(streptavidin，SA)捕获上述复合物1与复合物2，形成同时含有荧光物质和吸光物质的沉积物，其中的金淬灭荧光物质的荧光。

(1.4)同时游离金标抗体被对照剂(如抗金标抗体的抗体)捕获，呈现红色，说明检测有效。

(1.5)测定检测区处荧光物质的荧光强度，荧光越强说明待测物浓度越低，反之则待测物的浓度越高；如样本中无抗原时，则检测区处的荧光强度为原始荧光强度，最强。

本发明还适用于竞争抑制法：

方法二、

(2.1)用待测物的标准抗原(记为Ag0)标记biotin，形成biotin-Ag0；用针对待测物(如抗原，记为Ag)的一抗体(记为Ab1)标记吸光物质G，形成Ab1-G，将Ab1-G与biotin-Ag0混合，复溶，形成如biotin-Ag0-Ab1-G的复合物1；

(2.2)用一荧光物质(记为F)标记biotin，形成如biotin-F的复合物2，其中G的吸收光谱与F的激发和(或)发射光谱完全和(或)部分重叠；

(2.3)将biotin-Ag0、待测物(记为Ag)、Ab1-G和biotin-F混合，通过加样孔11，将所形成的混合物加至多孔膜上，固定在检测区的捕获剂亲和素(streptavidin，SA)同时捕获上述复合物1与复合物2，形成含有荧光物质和吸光物质的沉积物，其中的金淬灭荧光物质的荧光；

优选地，在加至多孔膜之前，将biotin-F、biotin-Ag0和待测物(记为Ag)混合后，再与Ab1-G混合，或者将biotin-Ag0和待测物(记为Ag)混合后，再与Ab1-G和biotin-F混合；

(2.4)测定检测区处荧光物质的荧光强度，biotin-Ag0与Ag竞争性地与Ab1-G结合，Ag越多，生成的复合物1越少，从而使得荧光强度越强。

因此，荧光越强，待测物浓度越高，反之，则待测物的浓度越低；若样本中无待测物，则多孔膜上检测区处形成的复合物1最多，相应地，荧光最弱。

检测装置

现结合图2说明本发明的检测装置：

如图2所示，所述装置可以包括：渗漏检测装置、检测器、光源、光导纤维和计算机。还可以包括一份检测方法的使用说明。其中渗漏检测装置的工作原理如上所述，荧光强度的检测方法可以如下所述(但不仅限于此)，任何可用于检测荧光强度的方法均可用于本发明的检测装置。

激发光通过Y型光导纤维的1个分支照射到多孔膜的检测区处，激发出的荧光通过Y型光导纤维的另1分支进入检测器，由计算机进行数据处理和分析。

本发明中，光源用于提供某一发射波长的光线，从而激发荧光物质发出荧光。可选用任何可以提供合适波长的光源，包括(但不限于)：LED、氙灯、卤钨灯、激光等。一种优选的光源是激光光源，激光光源可用本领域常规的方法和设备(如激光器)产生。代表性的激光器包括(但并不限于)：半导体激光器、氦氖激光器、氩离子激光器、还包括波长可选的激光器、多波长激光器和双波长激光器等。

激光器产生的激光波长与激光介质有关，常见的激光波长见下表：

激光种类	波长(纳米)
		氩氟激光(紫外光)	193
氪氟激光(紫外光)	248
		氙氯激光(紫外光)	308
氮激光(紫外光)	337

氩激光(蓝光)	488
		氩激光(绿光)	514
氦氖激光(绿光)	543
		氦氖激光(红光)	633
罗丹明6G染料(可调光)	570-650
		红宝石(CrAlO₃)(红光)	694
钕-钇铝石榴石(近红外光)	1064

本发明中的检测器可以是(但不限于)光电倍增管、CCD或光电池等。

标准曲线

在本发明中，可以直接通过测定检测区处的荧光强度，确定所述待测物的数量。

在优选例中，可通过与标准曲线进行比较，从而获得定量结果。

标准曲线可用以下方法获得：将已知的不同浓度(C)的待测物样品通过上述检测方法后，分别测量其在检测区处的荧光强度(F)，将各浓度或其对数值(log C)和相应的荧光强度或其对数值(log F)作图，得到标准曲线。

本发明的主要优点有：

(1)本发明提供了一种渗漏检测装置。

(2)本发明提供了一种上述渗漏检测装置的检测方法，所述方法基于荧光淬灭原理，通过测量荧光物质的荧光强度从而测定待测物的数量，所述方法快捷、简便、成本低廉，而且灵敏度高，定量准确。

(3)本发明还提供了一种检测装置，所述装置基于上述检测方法，可广泛用于定量检测领域。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

试剂和设备：

针对AFP的1对单克隆抗体（Ab1和Ab2），市售品；

针对C-反应蛋白（CRP）的单克隆抗体，市售品；

CRP抗原，市售品；

AFP抗原购自Biodesign；

30nm的胶体金，市售品；

PE购自Invitrogen公司；

Streptavidin（SA），市售品；

小牛血清白蛋白（BSA），市售品；

Biotin，市售品；

检测器：USB4000-FL(美国海洋光学公司)；

光源：532nm激光光源。

实施例1：血清中甲胎蛋白(AFP)的检测（反应体系中含有可流动的荧光物质）

1、金标抗体的制备

1.1胶体金-抗体保存液

四硼酸钠	0.1g
		小牛血清白蛋白(BSA)	0.25g
NaN₃	0.025g

加水溶解后用6N HCl调pH至7.4，补水至250ml，用0.45μm滤膜过滤后，4～8℃保存。

1.2工作液

Na₂HPO₄·12H₂O	6.1g
		NaCl	8.5g
PVP40	5.0g
		硼酸	2.1g
PEG	1.0g
		10%BSA	50ml
NaN₃	0.2g

加水溶解后用6N HCL调pH至7.0～7.5补水至1000ml，用0.45μm滤膜过滤后，4～8℃保存。

1.3金标抗体（Gold-Ab1）的制备

1.3.1取20～30nm颗粒胶体金液20ml，在磁力搅拌下缓慢加入已纯化的Ab1抗体1.0ml(1mg/ml)，在室温下搅拌30min；

1.3.2加10%的BSA 0.8ml(终浓度0.4%)，室温搅拌5min；

1.3.3加10%的PEG 0.4ml(终浓度0.2%)，室温搅拌5min；

1.3.412000～1500r/min离心60～40min，小心吸离心上清，沉淀溶于0.5ml保存液中，金标抗体的光密度（O.D）约为100O.D，其中Ab1抗体的浓度为1mg/ml，置4℃保存备用；

2、biotin标记Ab2抗体（biotin-Ab2）

2.1Ab2预处理

2.2取上述预处理的Ab2 10μL，加入25μL的1mg/ml NHSS-Biotin DMSO溶液，混匀，4℃冰箱避光反应2小时，透析过夜备用。

3．biotin标记PE（biotin-PE）

实验方法同步骤2，不同的是将预处理的Ab2和PE混合，复溶，所得biotin-PE中，PE终浓度为0.5mg/ml。

4、SA固定于微孔膜

取SA 2mg/ml的磷酸盐缓冲液（pH7.2）0.5μl点在图1B中微孔膜的中心位置，避光室温干燥，组装成如图1A的渗滤装置；

5、标准曲线制备

5.1用工作液配制AFP系列标准溶液（浓度见表1）；

5.2每个浓度点标准溶液50μl分别加入0.5μl Gold-Ab1、1μl biotin-Ab2和1μl biotin-PE，混匀；

5.3取6只渗滤装置，水平放置，分别在小孔内加上一步的6种混合溶液，待完全渗入，于小孔处滴加2滴pH7.4的PBS缓冲液；

5.4待完全渗入后测定各渗滤装置斑点处的荧光强度，数据见表1，制成如图3所示的标准曲线。

表1：AFP标准系列浓度与相应荧光强度

标准系列浓度(ng/ml)	荧光强度(F)
		0	36000
6.45	30500
		32.25	23500
129	15000
		430	9800
1290	4500

6、样本检测

用血清样本替代标准系列溶液，重复5.2、5.3、5.4步骤，将F代入标准曲线，测得6个样本的AFP值见表2。

表2：本发明方法检测结果与罗氏电化学发光法检测结果

样本号	本发明方法（ng/ml）	罗氏电化学发光法（ng/ml）
			1	12.5	10.17
2	34.64	43.00
			3	122.36	98.40
4	148.23	175.80
			5	520.38	496.70
6	698.9	796.50

检测结果的相关性良好，R²=0.9853。

实施例2：竞争抑制法检测C-反应蛋白（CRP）

1、CRP单抗标金（Gold-Ab）

过程同实施例1的步骤1，不同的是采用CRP单抗代替Ab1，标记后胶体金O.D值为75，CRP单抗浓度为1mg/ml。

2、CRP抗原标记biotin（biotin-CRP）

过程同实施例1中的步骤2，不同点在于，用已纯化的CRP替代经预处理的Ab2，标记后CRP抗原浓度2mg/ml。

3、biotin标记PE

用实施例1的biotin-PE。

4、SA固定于微孔膜

取SA 3mg/ml的磷酸盐缓冲液（pH7.2）1μl点在附图1B中微孔膜的中心位置，避光室温干燥，组装成如附图1A的渗滤装置；

5、标准曲线制备

5.1用工作液配制0、1、5、10μg/ml的CRP系列标准溶液；

5.2每个浓度点标准溶液10μl分别加入0.5μl Gold-Ab、0.5μl biotin-CRP和1μl biotin-PE和40μl pH7.4的PBS缓冲液，混匀；

5.3取5只渗滤装置，水平放置，分别在小孔内加上一步的5种混合溶液，待完全渗入，于小孔处滴加2滴pH7.4的PBS缓冲液；

5.4待完全渗入后测定各渗滤装置斑点处的荧光强度，数据见表3，制成如图4所示的标准曲线。

表3：CRP标准系列浓度及相应荧光强度

标准系列浓度(μg/ml)	荧光强度(F)
		0	4800
1	6000
		5	11900
10	21000

6、样品检测

用血清样本替代标准系列溶液，重复5.2、5.3、5.4步骤，将F代入标准曲线测得6个样本的CRP值见表4。

表4：本发明方法检测结果与酶联免疫法法检测结果

样本号	本发明方法（μg/ml）	酶联免疫法（μg/ml）
			1	2.5	3.17
2	1.64	1.80
			3	3.36	3.64
4	7.23	5.80
			5	8.64	7.33
6	7.86	8.70

检测结果的相关性良好，R²=0.9001。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种渗漏检测装置，其特征在于，该渗漏检测装置包括：

2.一种渗漏检测装置，其特征在于，该渗漏检测装置包括：

3.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述的渗漏检测装置还包括：

在吸收垫下方存在一底部装置；

4.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述荧光物质的激发或发射光谱与所述吸光物质的吸收光谱全部或部分重叠。

5.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述多孔膜上还包括不同于检测区的对照区，所述对照区含有固定化的对照剂，其中，所述对照剂用于特异性结合被吸光物质标记的结合剂。

6.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述的待测物包括：蛋白、核酸或小分子化合物。

7.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述荧光物质选自下组：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或稀土元素离子或其螯合物。

8.如权利要求1或2所述的渗漏检测装置，其特征在于，所述的吸光物质选自下组：胶体金、纳米金棒、纳米银棒或其组合。

9.一种定量检测待测物的荧光分析方法，其特征在于，包括步骤：

10.一种定量检测待测物的荧光分析方法，其特征在于，包括步骤：

或者

11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：将检测区的荧光强度F和标准曲线或者与未加样的初始荧光强度F0进行比较，从而确定待测物的存在与否或数量。

12.一种定量检测待测物的荧光测量装置，其特征在于，所述的装置包括：

(a)一权利要求1或2所述的渗漏检测装置；和

(b)一用于检测荧光强度的检测器。