CN103695325A - 一种热带假丝酵母及一种微生物法制备l-缬氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过诱变筛选微生物，利用微生物营养缺陷型菌株在L-缬氨酸发酵液中通过利用发酵液的杂酸生长，待菌体生长后再降解L-缬氨酸发酵液中的杂酸(主要是L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸），从发酵液中提纯获制备纯度高纯度L-缬氨酸的方法，属于发酵工程领域。本发明具有生产过程简单、条件温和、生产过程无污染、产品纯度高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，更具体地说，涉及一种微生物除杂法制备高纯度L-缬氨酸的方法。
背景技术
目前市场上的高纯度L—缬氨酸主要是由发酵法生产主原料，通过沉淀法或者色谱分离法分离L-缬氨酸中的其他杂氨基酸，L-缬氨酸，经浓缩、醇析、除盐、水解、精制、烘干得到到高纯度L-缬氨酸。采用化学法生产的高纯度-缬氨酸，生产过程中会采用大量的化学试剂，不仅成本高，收率低，同时生产过程中会产生大量的有机物、无机盐、固废和有机废水，对环境不友好。而且采用的生物技术是国家鼓励类的生产工艺。
此外，目前市场上的高纯度L-缬氨酸主要是通过发酵法得到含量大约在90%的L-缬氨酸，成品中主要含有的杂酸是L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸，目前去除杂酸的主要方法是沉淀法，用化学试剂沉淀杂酸，再还原成L-缬氨酸，得到高纯度L-缬氨酸。日本采用此专利生产。采用化学法生产的高纯度L-缬氨酸时会采用大量的化学试剂，不仅成本高，同时生产过程中会产生大量的有机物和有机废水，对环境不友好。
发明内容
本发明目的是提供一种以L—缬氨酸为原料生产高纯度L—缬氨酸的生物方法，具有生产过程简单、条件温和、生产过程无污染、产品纯度高的特点。
为了达到上述目的，本发明首先提供了一种热带假丝酵母（Saccharomycescerevisiae）DLPU-IL-，保藏编号CGMCC NO.7784。
本发明还提供了上述热带假丝酵母制备高纯度L-缬氨酸的应用。
具体说，本发明一种微生物法制备高纯度L-缬氨酸的方法，将热带假丝酵母DLPU-IL-加入到L-缬氨酸发酵液中培养发酵，消耗完L-缬氨酸中的L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸；去除菌体后的发酵清液中加入活性炭脱色，之后过滤除去活性炭，脱色液浓缩，结晶，用乙醇结晶和漂洗，离心得高纯度L-缬氨酸湿晶体；烘干后得到高纯度L-缬氨酸成品。其中，所述热带假丝酵母菌体选用保藏编号CGMCC NO.7784的热带假丝酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
优选方式下，微生物法制备高纯度L-缬氨酸的方法，包括如下步骤：
S1、以体积质量百分比计配制斜面培养基：0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%琼脂粉；121℃灭菌30min。
S2、将假丝酵母菌种DLPU-IL-接入所述斜面培养基中30℃、250～350rpm的条件下培养24～48h，离心取菌体；
S3、以体积质量百分比计配制发酵培养基：L-缬氨酸5～10%，蛋白胨0.2～2.0%，酵母膏0.2～1.5%；
S4、将菌体加入所述发酵培养基中，30℃、250～350rpm下进行反应，反应过程中每隔2～4小时滴加10%的硫酸调节pH，使其维持在6.0～6.2之间，64～72小时pH不再上升时结束发酵；
S5、离心除去菌体，上清液中加入活性炭100℃脱色30～40min，过滤、浓缩、结晶、烘干得到高纯度L-缬氨酸。
本发明利用以一株热带假丝酵母为出发菌株用硫酸二乙酯诱变选育到的一株营养缺陷型突变株CGMCC No.7784，该菌株能以L-缬氨酸发酵液中的亮氨酸为生长因子，同时能降解L-缬氨酸发酵液中的L-丙氨酸和L-异亮氨酸，通过发酵液除菌、发酵清液脱色、脱色脱色液减压浓缩、结晶等工序生产出高纯度L-缬氨酸。本发明摒弃传统的化学方法，不使用有机溶剂，无废水产生，是一种绿色生产工艺。
保藏说明
本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物（株）为，DLPU-IL-分类命名为假丝酵母，于2013年6月13日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏编号CGMCC NO.7784。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
本发明以热带假丝酵母为出发菌株，采用硫酸二乙酯诱变技术筛选到一株营养缺陷型菌株保藏号CGMCC No.7784（以下简称7784），该菌株DLPU-IL-能以L-缬氨酸中的杂酸L-亮氨酸为生长因子，同时降解发酵培养基中的L-丙氨酸和L-异亮氨酸等杂质氨基酸、通过提取得到高纯度L-缬氨酸。具体过程如下：
配制斜面培养基（培养基中的成分以体积质量百分比计）：0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%琼脂粉，121℃灭菌30min。
将菌种接入上述培养基中30℃、250～350rpm的条件下培养24～48h，离心取菌体。
以体积质量百分比计配制发酵培养基：5～10%L-缬氨酸，蛋白胨0.2～2.0%，酵母膏0.2～1.5%。
将菌体加入到发酵培养基（L-缬氨酸发酵液）中，30℃、250～350rpm下进行反应，反应过程中每隔2～4小时滴加10%的硫酸调节pH，使其维持在6.0～6.2之间，4～5天发酵结束。离心除去菌体，上清液中加入活性炭100℃脱色30～40min，过滤、浓缩、结晶、烘干得到高纯度医药级标准L-缬氨酸(L-缬氨酸含量98.5～100%)。
实施例1：
先将菌种7784在斜面培养基上培养，30℃培养24小时。
配制发酵培养基配方，称取L-缬氨酸8.5克、蛋白胨2克、酵母膏1.0克，自然pH，用自来水定容到100毫升装在1000毫升的三角烧瓶中，121℃灭菌20分钟，备用。
将7784活化的菌接种于装有100ml发酵培养基中，32℃培养，摇床转速为260转每分钟，发酵24小时后开始流加10%盐酸，发酵66小时后点样分析发酵液中无杂酸存在，发酵结束。
发酵液85℃灭菌32分钟，用离心机离心除菌后，上清液100毫升加入1.2克的活性炭95℃脱色30min，趁热抽滤，除去活性炭，取脱色清液减压浓缩（真空度为-0.09MPa)到有晶体出现后停止，冷却至28℃，抽滤。晶体用乙醇50毫升漂洗65分钟，离心得到晶体，95℃烘干3小时。得到高纯度L-缬氨酸8.0克。收率为94.12%。经过高效液相色谱法测定L-缬氨酸的纯度为99.12%。
实施例2：
先将菌种7784在斜面培养基上培养，30℃培养24小时。
配制发酵培养基配方，称取L-缬氨酸17克、蛋白胨4.0克、酵母膏2.0克，自然pH，用自来水定容到200毫升装在3000毫升的三角烧瓶中，121℃灭菌20分钟，备用。
将7784活化的菌接种于装200ml发酵培养基中，33℃培养，摇床转速为250转每分钟，发酵24小时后开始流加10%盐酸，每隔8小时流加一次，pH维持在6.5～7.0之间，发酵68小时后点样分析发酵液中无杂酸存在，发酵结束。
发酵液85℃灭菌35分钟，用离心机离心除菌后，上清液200毫升加入3克的活性炭90℃脱色35min，趁热抽滤，除去活性炭，取脱色清液减压浓缩（真空度为-0.09MPa)到有晶体出现后停止，冷却至30℃，抽滤。晶体用乙醇100毫升漂洗75分钟，离心得到晶体，93℃烘干4小时。得到L-缬氨酸15.6克。收率为92%。经过高效液相色谱法测定L-缬氨酸的阈值为98.88%。
实施例3：
先将菌种7784在斜面培养基上培养，30℃培养24小时。
配制发酵培养基配方，称取L-缬氨酸34克、蛋白胨8克、酵母膏4.0克，自然pH，用自来水定容到400毫升装在3000毫升的三角烧瓶中，121℃灭菌20分钟，备用。
将7784活化的菌接种于装400ml发酵培养基中，34℃培养，摇床转速为285转每分钟，发酵24小时后开始流加10%盐酸，每隔8小时流加一次，pH维持在6.5-7.0之间，发酵70小时后点样分析发酵液中无杂酸存在，发酵结束。
发酵液90℃灭菌30分钟，用离心机离心除菌后，上清液400毫升加入7.2克的活性炭98℃脱色35min，趁热抽滤，除去活性炭，取脱色清液减压浓缩（真空度为-0.09MPa)到有晶体出现后停止，冷却至29℃，抽滤。晶体用乙醇100毫升漂洗65分钟，离心得到晶体，92℃烘干2.5小时。得到L-缬氨酸32克。收率为94.12%。经过高效液相色谱法测定L-缬氨酸的纯度为99.05%。
本发明摒弃传统的化学方法，不使用有机溶剂，无废水产生，是一种绿色生产工艺。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.热带假丝酵母（Saccharomyces cerevisiae）DLPU-IL-，其特征在于，保藏编号CGMCC NO.7784。
2.权利要求1所述热带假丝酵母制备高纯度L-缬氨酸的应用。
3.一种微生物法制备高纯度L-缬氨酸的方法，其特征在于，热带假丝酵母DLPU-IL-加入到L-缬氨酸发酵液中培养发酵，消耗完L-缬氨酸中的L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸；
去除菌体后的发酵清液中加入活性炭脱色，之后过滤除去活性炭，脱色液浓缩，结晶，用乙醇结晶和漂洗，离心得高纯度L-缬氨酸湿晶体；烘干后得到高纯度L-缬氨酸成品。
其中，所述热带假丝酵母菌体选用保藏编号CGMCC NO.7784的热带假丝酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
4.根据权利要求3所述微生物法制备高纯度L-缬氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1、以体积质量百分比计配制斜面培养基：0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%琼脂粉；121℃灭菌30min。
S2、将假丝酵母菌种DLPU-IL-接入所述斜面培养基中30℃、250～350rpm的条件下培养24～48h，离心取菌体；
S3、以体积质量百分比计配制发酵培养基：L-缬氨酸5～10%，蛋白胨0.2～2.0%，酵母膏0.2～1.5%；
S4、将菌体加入所述发酵培养基中，30℃、250～350rpm下进行反应，反应过程中每隔2～4小时滴加10%的硫酸调节pH，使其维持在6.0～6.2之间，64～72小时pH不再上升时结束发酵；
S5、离心除去菌体，上清液中加入活性炭100℃脱色30～40min，过滤、浓缩、结晶、烘干得到高纯度L-缬氨酸。
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