CN103687877B - 人源化免疫调节单克隆抗体的变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人源化单克隆抗体，包含该人源化单克隆抗体的药物组合物，和其用于治疗多种适应症、特别是癌症和免疫缺陷疾患的用途。特别地，本发明提供了与被称为hBAT‑1的人源化单克隆免疫调节抗体相比，具有特定氨基酸修饰的经修饰的抗体或其片段。

Description

人源化免疫调节单克隆抗体的变体

发明领域

本发明涉及免疫治疗领域且更具体地涉及用于多种适应症的治疗、特别是在癌症和免疫缺陷疾患的治疗中有用的人源化单克隆抗体。

发明背景

最近几年中，关于免疫调节、特别是在T细胞应答水平的分子和细胞基础的快速增长的了解，提供了包括抗肿瘤疫苗的研发的免疫治疗方法的新的武器(arsenal)。某些单克隆抗体显示具有免疫调节活性，包括结合T细胞的表面的决定簇和诱导这些细胞的增殖、活化、成熟或分化的能力。

BAT(也称为mBAT-1或BAT-1)是针对Burkitt淋巴瘤细胞系(Daudi)的膜制备物产生的显示呈现针对多种类型的肿瘤的抗肿瘤和免疫刺激效果的鼠(murine)单克隆抗体(Hardy等人，2001,Int.J.Oncol.19:897)。该单克隆抗体最初在Hardy等人的美国专利号5,897,862中被公开。BAT-1由具有CNCM登录号I-1397的杂交瘤细胞系分泌。还体外研究了鼠BAT的免疫调节作用。鼠BAT活化CD4+T细胞并诱导IFN-γ从这些细胞的分泌(Hardy等人，2000,Int.Immunol.12:1623和Quaglino E.等人，2005,Vaccine 9:23(25):3280-7)。另外，发现BAT触发T细胞的增殖并增加它们的细胞溶解活性(Hardy,B.等人，1997,Hum.Antibodies,8:95)。

在Hardy等人的WO 00/58363和美国专利号7,695,715中公开了鼠BAT的多核苷酸和氨基酸序列。

基于鼠BAT的一些人源化单克隆抗体(mAb)在美国专利号7,332,582中被公开，其内容通过引用并入本文。在美国7,332,582的特定实施方案中，人源化单克隆抗体包含选自SEQ ID NO:1-4的轻链可变区(分别表示为BATRK_D、BATRK_A、BATRK_B和BATRK_C)和选自SEQ IDNO:5-9的重链可变区(分别表示为BATRH_C、BATRH_A、BATRH_B、BATRH_D和BATRH_E)。在本文以下的表1中描绘轻链和重链抗体变体的氨基酸序列。用灰色背景描绘所述可变区中不同的残基(轻链区的位置2、30、69、77、97和98和重链的位置35、69、70和71)。

根据美国7,332,582，人源化单克隆BAT抗体呈现诱导大于由亲本鼠BAT抗体诱导的抗肿瘤作用的抗肿瘤作用。在检测的多种模式***中，在SCID(严重联合免疫缺陷型疾病)小鼠、NK细胞缺陷的浅褐色小鼠和T细胞缺陷的裸鼠(nude mice)中研究了BAT抗肿瘤活性(Hardy,B.,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5756)。用随后在肺中形成肿瘤的鼠B16黑色素瘤细胞静脉注射所有小鼠。BAT抗体仅在用鼠或人淋巴细胞移植的SCID小鼠中发挥抗肿瘤作用。在无胸腺裸鼠和浅褐色小鼠中BAT抗体发挥抗肿瘤活性，尽管与BAT抗体在野生型小鼠中的抗肿瘤活性相比，该活性的效果更低。

应该牢牢记住的是BAT抗体不是预期靶向肿瘤细胞本身而是靶向受试者或患者的免疫功能细胞，以便以有益的方式调节免疫应答。

Berger等人(2008)公开了向患有晚期血液***恶性肿瘤的患者施用基于mBAT-1的人源化单克隆抗体CT-011和相关的药代动力学(Berger等人，Clin.Cancer Res.2008；14(10)2008年5月15日)。

WO 09/101611涉及用于抑制肿瘤生长、增加患有肿瘤的受试者的存活并针对哺乳动物中肿瘤复发诱导保护的方法，包括施用包含源自指定为mBAT-1的鼠单克隆抗体的CDR区的人源化单克隆抗体与至少一种化疗剂的组合。

在任何地方的背景技术中都没有教导或表明，使用包含至少一个位点特异性的氨基酸修饰的人源化mBAT-1单克隆抗体将对多种适应症的治疗、特别是在癌症和免疫缺陷相关的疾病和疾患的治疗中是有益的。

发明概述

本发明提供了突变的人源化单克隆抗体或其片段，与已知的人源化单克隆抗体hBAT-1相比，其具有位点特异性氨基酸修饰，包括但不限于，氨基酸取代和缺失。本发明还提供了包含经修饰的抗体或其片段的药物组合物，和其用于癌症和免疫缺陷疾患的治疗的用途。在一些实施方案中，本发明的经修饰的抗体保持hBAT-1的免疫调节活性，结合B淋巴母细胞并诱导外周血淋巴细胞的增殖和活化。

本发明的抗体凭借hBAT-1抗体变体的至少一个氨基酸的特定修饰，如本文以下的详细说明，显示优越的特征，例如，增强的生物活性和稳定性和/或减少的免疫原性。

表1-已知的hBAT-1轻链和重链的可变区和恒定区

表1列出hBAT-1抗体变体的轻链和重链的可变区和恒定区的氨基酸序列。在一些实施方案中，被取代以制备本发明的抗体的至少一个氨基酸呈粗体描绘。在特定实施方案中，至少一个氨基酸选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的位置5、20、71、75、76、93和97处的氨基酸；SEQ ID NO:5的位置54、55和107处的氨基酸；SEQ ID NO:11的位置157、158、169、170处的氨基酸；和SEQ ID NO:13的位置120、124、159、160、203、204、221、222、225、252、270、271、280、281、297、298、315、316、384、385、399、400、401、402、434、435、447和428处的氨基酸。

根据一个方面，本发明提供了包含选自由SEQ ID NO:1、2、3和4组成的组的轻链可变区和选自由SEQ ID NO:5、6、7、8和9组成的组的重链可变区的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含选自轻链可变区的Phe 97和Phe 93位置处到Ala、Leu或Val的至少一个氨基酸取代，或重链可变区的Trp 107到Ala、Leu、Val或Tyr的取代。

在本发明的一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区的Phe 97的氨基酸取代和重链可变区的Trp 107的氨基酸取代。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区的Phe 93的氨基酸取代和重链可变区的Trp 107的氨基酸取代。

在另一个实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:14、15、16、17、18、19、20和21。在一个实施方案中，轻链可变区包含如在SEQ ID NO:14中展示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，轻链可变区包含如在SEQ ID NO:15中展示的氨基酸序列。在特定实施方案中，轻链可变区包含如在SEQ ID NO:29中展示的氨基酸序列。在又另一个特定实施方案中，轻链可变区包含如在SEQ ID NO:30中展示的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，重链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:24、25、26、27和28。在特定实施方案中，重链可变区包含如在SEQ ID NO:24中展示的氨基酸序列。在又另一个特定实施方案中，重链可变区包含如在SEQ ID NO:31中展示的氨基酸序列。

在又另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段还包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸取代：轻链可变区的Thr 5、Thr 20、Cys71、Asn 75、Ser 76和重链可变区的Asp 54和Ser 55。

根据另一个方面，本发明提供了包含选自由SEQ ID NO:1、2、3和4组成的组的轻链可变区和选自由SEQ ID NO:5、6、7、8和9组成的组的重链可变区的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：轻链可变区的Thr5、Thr 20、Cys 71、Asn 75、Ser 76、Phe 93和Phe 97和重链可变区的Asp54、Ser 55和Trp 107。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据本发明的一些实施方案，氨基酸修饰是氨基酸取代。根据一个实施方案，氨基酸取代是保守取代。根据另一个实施方案，氨基酸取代是非保守取代。根据另一个实施方案，氨基酸修饰是氨基酸缺失。根据一些实施方案，本发明的经修饰的抗体包含氨基酸修饰的组合，诸如一个残基的氨基酸取代和另一个残基的氨基酸缺失。根据另一个实施方案，经修饰的抗体包含至少一个氨基酸取代和至少一个氨基酸缺失。

根据本发明的多种实施方案，经修饰的抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区的组合，该组合选自由以下组成的组：SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:6/SEQ IDNO:2；SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:3；和SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:1。根据本发明的特定实施方案，抗体或其抗原结合片段包含对应于SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:1的可变区的组合。在一个实施方案中，重链和轻链可变区的组合包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：轻链可变区的Thr 5、Thr20、Cys 71、Asn 75、Ser 76、Phe 93和Phe 97和重链可变区的Asp 54、Ser 55和Trp 107。在另一个实施方案中，重链和轻链可变区的组合包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：轻链可变区的Phe 93和Phe 97和重链可变区的Trp 107。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据本发明的另一个实施方案，抗体包含如在SEQ ID NO:10中展示的轻链恒定区。根据又另一个实施方案，抗体包含经修饰的轻链恒定区，该经修饰的轻链恒定区包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：SEQ ID NO:10的Asn 51、Ser 52、Asp63和Ser 64。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据本发明的另一个实施方案，抗体包含如在SEQ ID NO:11中展示的轻链。根据又另一个实施方案，抗体包含如在SEQ ID NO:11中展示的经修饰的轻链，该经修饰的轻链包含选自由以下组成的组的位置处的一个氨基酸修饰：SEQ ID NO:11的Asn 157、Ser 158、Asp 169和Ser 170。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据本发明的另一个实施方案，抗体包含如在SEQ ID NO:12中展示的重链恒定区。根据又另一个实施方案，抗体包含经修饰的重链恒定区，该经修饰的重链恒定区包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：SEQ ID NO:12的Thr 3、Ser 7、Asn42、Ser 43、Asn 86、His 87、Asp 104、Lys 105、Thr 108、Met 135、Asp 153、Pro 154、Asp163、Gly 164、Asn 180、Ser 181、Asn 198、Gly 199、Asn 267、Gly 268、Asp 282、Ser 283、Asp 284、Ser 285、Asn 317、His 318、Lys 330和Met 311。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据本发明的另一个实施方案，抗体包含如在SEQ ID NO:13中展示的重链。根据又另一个实施方案，抗体包含如在SEQ ID NO:13中展示的重链，该重链包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：SEQ ID NO:13的Thr 120、Ser 124、Asn 159、Ser160、Asn 203、His 204、Asp 221、Lys 222、Thr 225、Met 252、Asp 270、Pro 271、Asp 280、Gly 281、Asn 297、Ser 298、Asn 315、Gly 316、Asn 384、Gly 385、Asp 399、Ser 400、Asp401、Ser 402、Asn 434、His 435、Lys 447和Met 428。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据另一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，该抗体包含选自由SEQID NO:1、2、3和4组成的组的轻链可变区和选自由SEQ ID NO:5、6、7、8和9组成的组的重链可变区，或与其至少85％相同的氨基酸序列，其中该抗体包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：

(i)具有SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列的轻链可变区的Thr 5、Thr 20、Cys 71、Asn75、Ser 76、Phe 93和Phe 97；

(ii)具有SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列的重链可变区的Asp 54、Ser55和Trp 107；

(iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链恒定区的Asn 51、Ser52、Asp 63和Ser 64；和

(iv)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链恒定区的Thr 3、Ser 7、Asn 42、Ser43、Asn 86、His 87、Asp 104、Lys 105、Thr 108、Met 135、Asp 153、Pro 154、Asp 163、Gly164、Asn 180、Ser 181、Asn 198、Gly 199、Asn 267、Gly 268、Asp 282、Ser 283、Asp 284、Ser 285、Asn 317、His 318、Lys 330和Met 311。

在本发明的另一个实施方案，抗体包含选自由SEQ ID NO:1、2、3和4组成的组的轻链可变区，或选自由SEQ ID NO:5、6、7、8和9组成的组的重链可变区，或与其至少88％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％相同的氨基酸序列，其中每一种可能性代表本发明单独的实施方案。

根据本发明的多种实施方案，抗体或其抗原结合片段包含经修饰的氨基酸的组合，包括但不限于，至少两个氨基酸修饰、至少三个氨基酸修饰、至少四个氨基酸修饰或至少五个氨基酸修饰，其中每一种可能性代表本发明单独的实施方案。

根据另一个实施方案，抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：SEQ ID NO:1-4的Thr 5、Thr 20、Cys71、Asn 75、Ser 76、Phe 93和Phe 97；和选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：SEQ ID NO:5-9的Asp54、Ser 55和Trp 107。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据另一个实施方案，轻链可变区具有选自由以下组成的组的一个氨基酸修饰：SEQ ID NO:1、2、3、4或11中任一项的Thr 5、Thr 20、Cys 71、Asn 75、Ser 76、Phe 93和Phe97。根据又另一个实施方案，重链可变区具有选自由以下组成的组的一个经修饰的氨基酸：SEQ ID NO:5、6、7、8、9或13中任一项的Asp 54、Ser 55和Trp 107。

在特定实施方案中，氨基酸修饰处于SEQ ID NO:1、4或11中任一项的位置Cys 71处。在另一个实施方案中，Cys 71被选自由以下组成的组的氨基酸取代：Ser、Val、Gly、Thr、Ile、Leu和Ala。不希望被任何理论或作用机制限制，所述半胱氨酸残基的取代降低了不需要的二硫键的风险。

不希望被任何理论或作用机制限制，修饰以下氨基酸对的一个或两个氨基酸降低了脱酰胺作用的风险从而增加了本发明的抗体的溶解性：Asn-Ser、Asp-Ser、Asn-His或Asn-Gly。在特定实施方案中，氨基酸修饰处于选自由以下组成的组的位置处：SEQ ID NO:1、2、3、4或11中任一项的Asn 75、Ser 76。在另一个实施方案中，氨基酸修饰处于选自由以下组成的组的位置处：SEQ ID NO:10的Asn 157、Ser 158。在另一个实施方案中，氨基酸修饰处于选自由以下组成的组的位置处：SEQ ID NO:11的Asn 159、Ser 160、Asn 297、Ser298。

在一个实施方案中，氨基酸对Asn-Ser被Ser-Asn取代。在另一个实施方案中，氨基酸对Asn-Ser被除了Asp-Ser、Asn-His或Asn-Gly之外的任何氨基酸对取代。在特定实施方案中，Asn被选自以下的任何氨基酸取代：Ala、Val、Ser、Leu、Gly、Glu或Ser。在另一个特定实施方案中，Asn被除了Gln或Asp之外的任何氨基酸取代。在特定实施方案中，Ser被选自以下的任何氨基酸取代：Ala、Val、Leu、Gly、Ile、Thr或Asn。在又另一个特定实施方案中，Ser被选自以下的任何氨基酸取代：Ala、Val、Leu、Gly、Ile或Asn。在另一个特定实施方案中，Ser被除了Gly之外的任何氨基酸取代。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，氨基酸修饰处于选自由以下组成的组的位置处：SEQ IDNO:5、6、7、8、9或13中任一项的Asp 54、Ser 55。

在一个实施方案中，氨基酸对Asp-Ser被Ser-Asp取代。在另一个实施方案中，氨基酸对Asp-Ser被除了Asn-Ser、Asn-His或Asn-Gly之外的任何氨基酸对取代。在特定实施方案中，Asp被选自以下的任何氨基酸取代：Ala、Val、Ser、Leu、Gly或Ser。在另一个特定实施方案中，Asp被除了Glu或Asn之外的任何氨基酸取代。在特定实施方案中，Ser被选自以下的任何氨基酸取代：Ala、Val、Leu、Ile、Gly或Asn。在另一个特定实施方案中，Ser被除了Gly之外的任何氨基酸取代。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，修饰是选自以下的残基对的至少一个残基的取代：SEQ IDNO:11的Asn 203和His 204、Asn 315和Gly 316、Asn 384和Gly 385、Asn 434和His 435。在特定实施方案中，氨基酸对是互换的(例如，Asn-His取代为His-Asn；Asn-Gly取代为Gly-Asn)。在另一个实施方案中，氨基酸对Asn-his被除了Asn-Ser、Asp-Ser或Asn-Gly之外的任何氨基酸对取代。在另一个实施方案中，氨基酸对Asn-Gly被除了Asn-Ser、Asp-Ser或Asn-His之外的任何氨基酸对取代。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，氨基酸修饰处于选自轻链可变区的Thr 5、Thr20的位置处。在另一个实施方案中，氨基酸修饰处于选自由以下组成的组的位置处：如展示为SEQ IDNO:12的重链恒定区的Thr 3、Ser 7和Thr108。在又另一个实施方案中，氨基酸修饰处于选自由以下组成的组的位置处：如展示为SEQ ID NO:13的重链的Thr 120、Ser 124、Thr 225。在另一个实施方案中，苏氨酸残基被除了丝氨酸之外的任何氨基酸取代。在另一个实施方案中，丝氨酸残基被除了苏氨酸之外的任何氨基酸取代。在特定实施方案中，苏氨酸和/或丝氨酸残基被丙氨酸残基取代。不希望被任何理论或作用机制限制，所述苏氨酸或丝氨酸残基的取代降低了不需要的O-连接的糖基化的风险。

不希望被任何理论或作用机制限制，修饰以下氨基酸对的一个或两个氨基酸：Asp-Ser、Asp-Lys、Asp-Gly，降低了天冬氨酸异构化的风险从而防止或减少降解的风险。在特定实施方案中，氨基酸修饰处于选自由以下组成的组的位置处：SEQ ID NO:10的Asn 63-Ser 64；SEQ ID NO:11的Asp 169-Ser 170；SEQ ID NO:12的Asp 104-Lys 105、Asp 163-Gly 164、Asp 282-Ser 283、Asp 285、Ser 286；和SEQ ID NO:13的Asp 221-Lys 222、Asp280-Gly 281、Asp 339-Ser 400、Asp 401、Ser 402。在特定实施方案中，氨基酸对是互换的(例如，Asp-Ser取代为Ser-Asp)。在另一个实施方案中，氨基酸对被除了Asp-Ser、Asp-Lys或Asp-Gly之外的任何氨基酸对取代。在一个实施方案中，Asp被Glu取代。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据多种实施方案，本发明的抗体或其抗原结合片段具有与mBAT-1相似的、或大于mBAT-1的抗肿瘤活性。根据另一个实施方案，所述抗体或其抗原结合片段具有与hBAT-1相似的、或大于hBAT-1的抗肿瘤活性。根据另一个实施方案，所述抗体或其抗原结合片段具有与hBAT-1相比增强的稳定性。

根据多种实施方案，人源化抗体的片段选自由以下组成的组：Fv、F(ab')、F(ab')2和单链抗体。

根据另一个实施方案，本发明提供了编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸序列。

根据又另一个实施方案，提供了包含编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸序列的载体。根据特定的实施方案，提供了包含编码选自由以下组成的组的本发明的抗体或其片段的多核苷酸序列的载体：全人源化抗体(whole humanized antibody)、轻链可变区、重链可变区、可变区的两条链。

根据另一个方面，提供了包含载体的宿主细胞，该载体包含编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸序列。

根据另一个方面，提供了包含本发明的抗体或其抗原结合片段作为活性成分和药学上可接受的载体、稀释剂或稳定剂的药物组合物。

根据另一个实施方案，包含本发明的抗体作为活性成分的药物组合物被用于治疗癌症。根据另一个实施方案，可在受试者的原发性或继发性肿瘤的检测之后施用该药物组合物，或可施用药物组合物作为具有形成癌症的高风险的受试者的预防性治疗。根据一些实施方案，本发明的抗体在多种肿瘤中引起抗肿瘤作用。

根据另一个方面，本发明提供了用于治疗有相应需要的受试者的疾病或疾患的方法，包括向该受试者施用有效量的包含本发明的抗体或其抗原结合片段作为活性成分的药物组合物。在一些实施方案中，疾病或疾患是癌症。在一些实施方案中，疾病或疾患是免疫缺陷相关的疾病或疾患。

在一个实施方案中，受试者患有选自实体瘤或非实体瘤的肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤是非实体瘤。在一些实施方案中，非实体瘤是恶性血液病。

在特定实施方案中，癌症选自由以下组成的组：结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、乳腺癌；黑色素瘤；卵巢癌、***、胰腺癌、头颈癌、胃肠道癌、食管肿瘤、肝细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、***肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、套细胞淋巴瘤、卡波济氏肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据特定的实施方案，癌症选自由以下组成的组：结肠直肠癌、黑色素瘤、胰腺癌、头颈癌、食管肿瘤、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金病。

根据多种实施方案，受试者是非人哺乳动物。根据多种优选的实施方案，受试者是人。

在另外的方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，用于***。在另一个实施方案中，本发明提供了包含以下的抗体或其抗原结合片段：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的轻链可变区和选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的重链可变区，其中该抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：轻链可变区的Thr 5、Thr 20、Cys 71、Asn 75、Ser 76、Phe 93和Phe 97和重链可变区的Asp 54、Ser 55和Trp 107，用于***。

在另外的方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，用于制备用于***的药剂。在另一个实施方案中，本发明提供了包含以下的抗体或其抗原结合片段：选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的轻链可变区和选自由SEQ ID NO:5-9组成的组的重链可变区，其中该抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：轻链可变区的Thr 5、Thr 20、Cys 71、Asn 75、Ser 76、Phe 93和Phe 97和重链可变区的Asp 54、Ser 55和Trp 107，用于制备用于***的药剂。

本发明的其他目的、特征和优势从以下的详述和所附权利要求将变的明显。

附图简述

图1是显示在与人源化单克隆抗体BAT-1(表示为CT-011)和包含轻链可变区的位置Phe 97和重链可变区的位置Trp 107处的丙氨酸取代的CT-011双突变体一起孵育之后，CD4+T淋巴细胞生存力(viability)的图。

发明详述

本发明提供了人源化单克隆抗体、包含所述抗体的药物组合物、和其用于治疗多种适应症的用途，包括但不限于癌症和免疫缺陷疾患。特别地，本发明提供了与hBAT-1人源化单克隆免疫调节抗体变体相比，具有特定氨基酸修饰，诸如，氨基酸取代的经修饰的抗体或其片段。

根据另一个实施方案，提供了包含以下的抗体或其抗原结合片段：与SEQ ID NO:1-4中任一项至少85％相同的轻链可变区和与SEQ ID NO:5-9中任一项至少85％相同的重链可变区，该抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:1相比的选自由以下组成的组的至少一个经修饰的氨基酸：Thr5、Thr 20、Cys 71、Asn 75、Ser 76、Phe 93和Phe 97，或与SEQID NO:5相比的选自由以下组成的组的至少一个经修饰的氨基酸：Asp 54、Ser 55和Trp107。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

在本发明的另一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:1-4中任一项至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少98％相同的轻链可变区，和如在SEQ ID NO:5-9中任一项中展示的重链可变区。在另一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:5-9中任一项至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少98％相同的重链可变区，和如在SEQ ID NO:1-4中任一项中展示的轻链可变区。在另一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:1-4中任一项至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少98％相同的轻链可变区，和与SEQ ID NO:5-9中任一项至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少98％相同的重链可变区。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

术语“至少X％相同”或“具有至少X％的同一性”指当序列被最佳地比对时，在两条所比较的序列中相同的氨基酸残基的百分数。因此，例如，85％氨基酸序列同一性指两条或多条最佳比对的多肽序列中85％的氨基酸是相同的。

根据另一个实施方案，提供了包含以下的抗体或其抗原结合片段：选自SEQ IDNO:1-4的轻链可变区和选自SEQ ID NO:5-9的重链可变区，其中该轻链可变区包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：Thr 5、Thr 20、Cys 71、Asn 75、Ser 76、Phe 93和Phe 97；或其中重链可变区包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：Asp 54、Ser 55和Trp 107。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据一个实施方案，轻链可变区具有如在SEQ ID NO:1中展示的氨基酸序列(BATRK_D)。根据另一个实施方案，轻链可变区具有如在SEQ ID NO:2中展示的氨基酸序列(BATRK_A)。根据另一个实施方案，轻链可变区具有如在SEQ ID NO:3中展示的氨基酸序列(BATRK_B)。根据另一个实施方案，轻链可变区具有如在SEQ ID NO:4中展示的氨基酸序列(BATRK_C)。

根据另一个实施方案，抗体或其片段包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中任一项的Thr5、Thr 20、Cys 71、Asn 75、Ser76、Phe 93和Phe 97。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据另一个实施方案，抗体或其片段包含选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸修饰：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一项的Thr5、Thr 20、Asn 75、Ser 76、Phe93和Phe 97。每一种可能性都代表本发明单独的实施方案。

根据另一个实施方案，重链可变区具有如在SEQ ID NO:5中展示的氨基酸序列(BATRH_C)。根据另一个实施方案，重链可变区具有如在SEQ ID NO:6中展示的氨基酸序列(BATRH_A)。根据另一个实施方案，重链可变区具有如在SEQ ID NO:7中展示的氨基酸序列(BATRH_B)。根据另一个实施方案，重链可变区具有如在SEQ ID NO:8中展示的氨基酸序列(BATRH_D)。根据另一个实施方案，重链可变区具有如在SEQ ID NO:9中展示的氨基酸序列(BATRH_E)。

根据另一个实施方案，本发明的抗体或其抗原结合片段包含选自轻链可变区的Phe 93或Phe 97的位置处的氨基酸修饰。在另一个实施方案中，轻链可变区(SEQ ID NO:1-4中任一项)通过将Phe 93或Phe 97取代为除了Trp和Tyr之外的任何氨基酸而被修饰。Phe和/或Trp的氨基酸取代的非限制性实例包括Ala、Leu和Val。在特定实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20和21。在另一个特定实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、16、18、20和22。在又另一个特定实施方案中，轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、17、19、21和23。在另外的实施方案中，轻链可变区包含如展示为SEQID NO:14的氨基酸序列。在另一个实施方案中，轻链可变区包含如展示为SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，Phe残基被Ala残基取代。

在另一个实施方案中，轻链可变区包含Phe 93和Phe 97到Ala、Leu或Val的氨基酸取代。在特定实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，轻链可变区包含Phe 93和Phe 97到Ala的氨基酸取代。在特定实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，重链可变区(SEQ ID NO:5-9中任一项)通过将Trp107取代为除了Phe之外的任何氨基酸而被修饰。Trp的氨基酸取代的非限制性实例包括Ala、Leu、Tyr和Val。在特定实施方案中，重链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:24、25、26、27和28。在另一个实施方案中，重链可变区包含如展示为SEQ IDNO:24的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，Trp残基被Ala残基取代。

根据另一个实施方案，抗体或其抗原结合片段包含选自重链可变区的Trp 107和轻链可变区的Phe 97的位置处的氨基酸修饰。根据又另一个实施方案，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的Trp 107和轻链可变区的Phe 97的氨基酸修饰。根据另一个实施方案，抗体或其抗原结合片段包含选自重链可变区的Trp 107和轻链可变区的Phe 93的位置处的氨基酸修饰。根据又另一个实施方案，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的Trp107和轻链可变区的Phe 93的氨基酸修饰。在特定实施方案中，所述修饰是到丙氨酸残基的取代。

表2-包含F93、F97或W107氨基酸取代的hBAT-1突变的轻链和重链的示例性可变区

根据另一个实施方案，本发明提供了编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸序列。因此，通过多核苷酸的表达制备经修饰的抗体，其中多核苷酸可编码全人源化抗体或人源化抗体的轻链可变区或重链可变区或两条链的可变区。此外，可在各自包含编码重链或轻链的多核苷酸的不同的载体共转染之后，或通过包含重链和轻链二者的多核苷酸序列的单个载体的转染，在宿主细胞中表达人源化抗体。

根据又另一个实施方案，提供了包含编码本发明的经修饰的抗体或其片段的多核苷酸序列的载体。

根据又另一个实施方案，提供了包含编码选自由以下组成的组的本发明的经修饰的抗体或其片段的多核苷酸序列的载体：全人源化抗体、轻链可变区、重链可变区、可变区的两条链。

根据又另一个实施方案，载体还包含编码选自由以下组成的组的组成部分的至少一条序列：抗性基因、启动子、信号肽、polyA转录终止子、选择标记、基因组人κ恒定区。

根据又另一个优选的实施方案，载体的组成部分选自由以下组成的组：氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、HCMV立即早期启动子(HCMV Immediate Early Promoter)、基因组人κ恒定区、小鼠免疫球蛋白信号肽序列、Kozak序列、信号序列内含子、BGH polyA转录终止子、Neo/G418选择标记、仓鼠二氢叶酸还原酶选择标记。

根据又另一个实施方案，载体还包含编码选自由以下组成的组的组成部分的至少一条序列：抗性基因、启动子、信号肽、polyA转录终止子、选择标记、基因组人Ig恒定区。

根据又另一个优选的实施方案，载体的组成部分选自由以下组成的组：氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、HCMV立即早期启动子、基因组人IgG1恒定区、小鼠免疫球蛋白信号肽序列、Kozak序列、信号序列内含子、BGH polyA转录终止子、Neo/G418选择标记、仓鼠二氢叶酸还原酶选择标记。

根据另一个方面，提供了包含载体的宿主细胞用于保存、增殖、抗体制备和治疗应用的目的，该载体包含编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸序列。

根据另一个实施方案，宿主细胞可选自由以下组成的组：CHO、CHOdhfr、NSO、NSO/GS、COS、COS7。

定义

术语“经修饰的抗体”、“突变的抗体”和相似的语法表达指，如与原始、已知的人源化单克隆抗体BAT-1免疫球蛋白的序列相比的氨基酸序列的改变，例如通过一个或多个氨基酸残基的取代或缺失或化学修饰的氨基酸序列的改变。

“人源化单克隆抗体hBAT-1”指基于鼠BAT(mBAT-1)、在美国专利号7,332,582(其内容通过引用并入本文)中公开的一些人源化单克隆抗体。hBAT-1mAb包含选自由以下组成的组的轻链可变区：SEQ ID NO:1、2、3和4(分别表示为BATRK_D、BATRK_A、BATRK_B和BATRK_C)和选自由以下组成的组的重链可变区：SEQ ID NO:5、6、7、8和9(分别表示为BATRH_C、BATRH_A、BATRH_B、BATRH_D和BATRH_E)。轻链和重链抗体变体的氨基酸序列(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9)在表1中描绘。用灰色背景描绘在所述可变区中不同的残基(轻链区的位置2、30、69、77、97和98和重链的位置35、69、70和71)。鼠BAT(mBAT-1)的多核苷酸和氨基酸序列在美国专利号7,695,715中公开，其内容通过引用并入本文。hBAT-1抗体的重链可变区和轻链可变区的特定组合选自由以下组成的组：SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:6/SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:3；和SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:1。在本发明的特定实施方案中，突变的抗体基于以上重链和轻链可变区的特定组合并包含诸如选自公开的氨基酸的取代的至少一个位点的特定修饰。

如本文所用的“氨基酸修饰”指氨基酸的改变，例如通过所述氨基酸的取代或缺失或化学修饰。此外，通过自然过程，诸如加工或其他转录后修饰，或通过化学修饰技术，本发明的抗体在一个或多个氨基酸残基处可被化学修饰。化学修饰包括，不限于，乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖化、糖基化、GPI锚结构形成、脂质或脂质衍生物的共价附着、甲基化、十四烷基化、聚乙二醇化、异戊烯化、磷酸化、泛素化或任何相似的过程。

术语“氨基酸”以其最广泛的意义被用于包括天然形成的氨基酸和包括氨基酸类似物的非天然形成氨基酸。鉴于该广泛的定义，本领域技术人员将了解本文提及的氨基酸包括，例如，天然形成的蛋白原性(proteogenic)(L)-氨基酸、(D)-氨基酸，化学修饰的氨基酸诸如氨基酸类似物，天然形成的非蛋白原性氨基酸诸如正亮氨酸，和具有作为本领域已知的氨基酸特征性特性的化学合成的化合物。如本文所用的，术语“蛋白原性”指氨基酸可通过代谢途径在细胞中被并入蛋白。用于本发明的氨基酸是商业可得或通过常规合成方法可得的氨基酸。某些残基可需要特殊的方法来并入肽，且针对肽序列的顺序的、发散的(divergent)和会聚的(convergent)合成方法在本发明中是有用的。当没有指示时，可使用L或D异构体。

如本领域技术人员已知的氨基酸的保守取代在本发明的范围内。保守氨基酸取代包括将一个氨基酸取代为具有相同类型的官能团或侧链例如，脂肪族的、芳香族的、带正电荷的、带负电荷的另一个氨基酸。技术人员将认识到改变、添加或缺失被编码的序列中的单个氨基酸或氨基酸的小部分的针对肽、多肽或蛋白序列的单个取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被取代为化学相似的氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。

以下的六个组各自包含为彼此的保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(Ala；A)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)；

2)天冬氨酸(Asp；D)、谷氨酸(Glu；E)；

3)天冬酰胺(Asn；N)、谷氨酰胺(Gln；Q)；

4)精氨酸(Arg；R)、组氨酸(His：H)、赖氨酸(Lys；K)；

5)异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、甲硫氨酸(Met；M)、缬氨酸(Val；V)；和

6)苯丙氨酸(Phe；F)、酪氨酸(Tyr；Y)、色氨酸(Trp；W)。

根据一个实施方案，氨基酸取代是保守取代。

根据另一个实施方案，氨基酸取代是非保守取代。如本文所用的，“非保守取代”是除了以上描述的保守取代之外的任何氨基酸取代。非保守取代的非限制性实例包括苯丙氨酸或色氨酸到丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸的取代。

在特定实施方案中，本发明的氨基酸修饰取代(即，为了制备本发明的经修饰的抗体)是不同于美国专利号7,332,582中描述的取代的取代。

术语“抗体”(还称为“免疫球蛋白”)以其最广泛的意义被使用并具体地包含单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)和抗体片段，只要它们呈现期望的生物活性。“抗体片段”包含全长抗体的部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；直链抗体(linear antibodies)；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。

天然形成抗体结构的基本单元是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白复合物，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链通过非共价缔合和通过二硫键连接在一起组成。每一条重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫键。存在五个人抗体的类(IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)，且在这些类中，基于结构差异识别多种亚类，结构差异诸如单个抗体分子中免疫球蛋白单元的数目、单个单元的二硫键结构和链长和序列的差异。抗体的类和亚类是其同种型。

序列中重链和轻链的氨基末端区比羧基末端区更多样化，并因此被称为可变域。抗体结构的该部分给予抗体的抗原结合特异性。重链可变(VH)域和轻链可变(VL)域一起形成单个抗原结合位点，因此，基本的免疫球蛋白单元具有两个抗原结合位点。特定的氨基酸残基被认为形成轻链和重链可变域之间的接触面(Chothia等人，J.Mol.Biol.186,651-63(1985)；Novotny和Haber,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824592-4596)。

重链和轻链的羧基末端部分形成恒定域，即CH1、CH2、CH3、CL。尽管这些域中存在少得多的多样性，但一个动物物种和另一个则具有差异，且此外，在相同的个体内，具有抗体的几种不同的同种型，每一种具有不同的功能。

术语“构架区”或“FR”指抗体的可变域中不同于如本文定义的高变区氨基酸残基的氨基酸残基。如本文所用的术语“高变区”指抗体的可变域中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。CDR主要负责与抗原的表位结合。FR和CDR的范围已被精确界定(见，Kabat等人，同上)。

术语“受体人免疫球蛋白”指提供用于人源化抗体的构架的人免疫球蛋白。

如本文所用的，术语“人源化抗体”指包含来自人抗体的构架区和来自非人(通常小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的抗体。除了可能地CDR，人源化免疫球蛋白的部分与天然的人免疫球蛋白序列的对应部分基本上相同。然而，在某些情况下，特定的氨基酸残基，例如构架区中的氨基酸残基可被修饰，以优化人源化抗体的性能。重要地，人源化抗体预期与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。关于进一步的详细信息，见例如被转让给Medical Research Council，UK的美国专利号5,225,539。

术语“来自受体人免疫球蛋白的构架区”和“源自受体人免疫球蛋白的构架区”，和相似的语法表达在本文被互换地使用以指具有受体人免疫球蛋白的相同的氨基酸序列的构架区或其部分。

术语“人抗体”指由实际存在于人的基因、或等位基因编码的抗体、其变体或突变体。

优选通过重组DNA技术，利用CDR移植产生本发明的经修饰的人源化单克隆抗体。

术语“哺乳动物”指任何哺乳动物，包括宠物动物，诸如狗和猫；农场动物，诸如猪、牛、绵羊和山羊；实验动物，诸如小鼠和大鼠；灵长类动物，诸如猴、猿和黑猩猩；和优选地，人。

本发明的方法

癌症免疫治疗一般来说旨在调节免疫***的应答以诱导或增强杀死肿瘤细胞并控制肿瘤生长。该方法利用使用包括与T细胞上的特异性决定簇选择性结合的单克隆抗体的多种免疫调节剂，从而启动活化通路或诱导抑制作用。

根据另一个方面，本发明提供了用于疾病或疾患特别是癌症的诊断或治疗的方法，包括向有相应需要的受试者施用有效量的包含本发明的抗体或其片段作为活性成分的药物组合物。

通过本发明的方法可以治疗所有类型肿瘤。肿瘤可以是实体的或非实体的。

用本发明的组合可被治疗的实体瘤的一些实例包括癌、肉瘤、胚细胞瘤或神经胶质瘤。此类肿瘤的一些实例包括表皮样瘤，鳞状上皮肿瘤、诸如头颈部肿瘤，结肠直肠肿瘤，***肿瘤，乳腺肿瘤，肺肿瘤、包括小细胞和非小细胞肺肿瘤，胰腺肿瘤，甲状腺肿瘤，卵巢肿瘤，肝肿瘤，食管肿瘤和胃肿瘤。其他实例包括卡波济氏肉瘤、CNS肿瘤、成神经细胞瘤、毛细血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑色素瘤、胃肠和肾癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤，优选地多形性成胶质细胞瘤和平滑肌肉瘤。血管化皮肤癌的实例包括鳞状细胞癌、基底细胞癌和可通过抑制恶性角质形成细胞、诸如人恶性角质形成细胞的生长治疗的皮肤癌。

非实体瘤的一些实例包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些实例包括急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、红细胞白血病或单核细胞性白血病。淋巴瘤的一些实例包括与霍奇金病、非霍奇金病相关的淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。

目前优选的肿瘤类型选自以下的组：结肠直肠癌；肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)；乳腺癌；黑色素瘤；卵巢癌、***、胰腺癌；头颈癌；胃肠道癌；食管肿瘤；肝细胞癌；多发性骨髓瘤；肾细胞癌；***肿瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金病；套细胞淋巴瘤；卡波济氏肉瘤；鳞状细胞癌；基底细胞癌；急性髓细胞样白血病(AML)；慢性髓细胞性白血病(CML)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

如本文所用的术语“抗肿瘤作用”，指有益的生物作用，其可通过以下的任何一种或多种体现：肿瘤体积的减小或稳定化、肿瘤细胞数目的减少或稳定化、肿瘤生长速率的减少或稳定化、转移数目的减少或稳定化、保护免受肿瘤复发、患有肿瘤的受试者的预期寿命或存活的增加、患有肿瘤的受试者的不具有疾病进展的预期寿命或存活的增加或与癌性病症相关的多种生理症状的改善。还可通过首先预防肿瘤的发生或肿瘤的复发的能力体现“抗肿瘤作用”。考虑到其性质，本发明的方法可被用于治疗休眠的急性癌症、被控制或稳定的癌症，及被用于癌症的预防。

如本文所用的术语“增加的存活(enhanced survival)”指用本发明的方法治疗之后，受试者或患者活着的时间的延长的长度。增强的存活表示在特定治疗之后，遭受癌症的个体保持无疾病进展的增加的可能性。其也被用于描述，与对照组相比，在指定的持续时间之后组中其疾病有可能保持稳定(不显示进展的症状)的个体的升高的百分比。其也被用于描述，与对照组相比，在指定的持续时间之后组中其疾病有可能被治愈(不显示疾病的症状)的个体的升高的百分比。该参数可通过表示为用作特定治疗的疗效的指示的“无进展存活(progression-free survival)”、“总存活(overall survival)”和“无疾病存活(disease free survival)”的任一传统临床终点被测量。

术语“肿瘤复发”指在原始肿瘤的生长已被逆转、控制或抑制的阶段之后，相同类型的肿瘤在相同的部位或不同的部位的再发生、再现、再生长或增殖。

如本文所用的术语“增强或增加的淋巴细胞存活”指与没有与本发明的抗体接触的相同细胞群体的生存力相比，本发明的抗体延长体外或体内淋巴细胞的生存力的能力。关于本发明的组合治疗，该术语指与仅具有一种治疗的相同细胞群体的生存力相比，治疗的特定组合延长体外或体内淋巴细胞的生存力的能力。

与mBAT-1或hBAT-1相似的抗肿瘤活性指约5％、或不超过10％的抗肿瘤作用，与mBAT-1或hBAT-1的抗肿瘤作用相似。大于mBAT-1或hBAT-1的抗肿瘤活性指与mBAT-1或hBAT-1的抗肿瘤活性相比，超过10％、或超过30％的抗肿瘤活性。

根据另一个实施方案，与其他剂的施用一起、在其他剂的施用之前或之后施用本发明的抗体，该其他剂可以以叠加(additive)或协同的方式与本发明的抗体一起起作用。

根据又另一个实施方案，与选自由以下组成的组的剂的施用一起、在选自由以下组成的组的剂的施用之前或之后施用本发明的抗体：细胞因子、IL-1(白介素-1)、IL-2、IL-6、IFN-α(干扰素-α)、细胞疫苗、抗体、T细胞刺激抗体、抗肿瘤治疗抗体。每一种可能性都是本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，被本发明的方法治疗的疾病或疾患是选自以下的与免疫缺陷相关的疾病或疾患：严重联合免疫缺陷型疾病，获得性免疫缺陷综合征，和包括淋巴细胞、特别地T细胞、NK细胞、NK-T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任何组合的耗竭、减少和/或功能失常的任何疾患。

在另一个实施方案中，疾病或疾患是在化疗或放射之后确立的、在下文共同被称为免疫缺陷疾患的免疫缺陷、免疫功能失常或免疫功能不全。根据某些实施方案，与源自骨髓、脐带血或外周血和供体白细胞输注的自体的、异基因的或同基因干细胞移植联合使用包含本发明的抗体的药物组合物。

根据又另一个实施方案，免疫缺陷疾患选自由以下组成的组：严重联合免疫缺陷型疾病、获得性免疫缺陷综合征、X-连锁无丙种球蛋白血症、常见变异型免疫缺陷、IgA缺乏症、IgG亚类缺乏症、威斯科特-奥尔德里奇综合征、DiGeorge异常、共济失调性毛细血管扩张症、腺苷脱氨酶缺乏症和活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶缺乏症。

根据又另一个实施方案，免疫缺陷疾患涉及病毒感染、真菌感染或细菌感染。根据又另一个实施方案，免疫缺陷疾患与中毒有关。

根据又另一个实施方案，本发明的方法用于治疗贫血，特别地，再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征(MDS)，主要用于避免由于免疫缺陷疾患的另外的贫血并发症。

与化疗的组合治疗

根据本发明的某些方面，与至少一种抗肿瘤化疗剂联合施用包含经修饰的氨基酸的免疫刺激人源化抗体以起增强化疗剂的抗肿瘤作用的作用，且反之亦然。在优选的实施方案中，与每一种单独的治疗相比，免疫刺激抗体与至少一种化疗剂一起的组合以显著的方式改善了临床结果。在优选的实施方案中，当用本发明的人源化抗体与至少一种化疗剂联合、且任选地与放射进一步联合***时具有协同效应。

换句话说，根据本发明的一个方面，当与至少一种化疗剂组合时，超过预期地提高了本发明的人源化抗体的抗肿瘤作用。

由本发明的组合诱导的抗肿瘤作用包括肿瘤的预防、肿瘤进展的抑制、肿瘤生长的减少和针对肿瘤复发的保护，包括癌性和非癌性肿瘤。肿瘤的进展包括肿瘤的侵袭性、转移、复发和肿瘤大小的增加。肿瘤生长的减少还包括破坏或消除肿瘤，导致完全缓解。

在另一个实施方案中，本发明的抗体用于改善对化疗剂的耐受性是有效的。如本领域已知的，关于经受癌症化疗的患者的主要挫折是由大多数化疗剂的强有力的毒性所致的严重并有害的不良副作用的出现。

本发明还提供了增强患有肿瘤的受试者的存活的方法，其包括独立地或任选地与一种或多种化疗剂的进一步施用组合施用本发明的人源化抗体。

本发明还提供了减少或预防肿瘤的复发的方法，其包括独立地或任选地与一种或多种化疗剂的进一步施用组合施用本发明的人源化抗体。在一些实施方案中，使用本发明的人源化抗体和化疗剂组合处理实验动物诱导“记忆”效应，如此以致当用原始肿瘤类型再攻击时肿瘤的复发被抑制。

根据另一个实施方案，本发明提供了***的方法，该方法包括(i)向有相应需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其片段；和(ii)向该受试者施用有效量的至少一种化疗剂；从而***。

根据另一个实施方案，本发明还提供了改善对至少一种化疗剂的耐受性的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其片段，其中该受试者经受至少一种化疗剂的化疗；从而改善对所述化疗剂的耐受性。

术语“对化疗剂的耐受性”指受试者耐受与用一种或多种化疗剂的治疗相关的不良副作用的生理、物理化学和免疫能力。因此，术语“改善对化疗剂的耐受性”指增加对此类不良副作用的生理和物理化学能力，如此以致不良副作用的严重程度被减少和/或副作用的数目被减少。因此，“改善对化疗剂的耐受性”可以指改善用化疗剂治疗的癌症患者的生活质量。

根据本发明的又另一个实施方案，提供了增强患有肿瘤的受试者的存活或抑制患有肿瘤的受试者的疾病进展的方法，其中用至少一种化疗剂治疗该受试者，该方法包括施用有效量的本发明的抗体或其片段，从而增强该受试者的存活。

根据又另一个实施方案，本发明提供了减少或防止肿瘤复发的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其片段，从而减少或防止肿瘤复发。根据一个实施方案，减少或防止肿瘤复发的方法还包括向该受试者施用至少一种化疗剂。根据特定的实施方案，该受试者经受或具有至少一种化疗剂的化疗的完整的一个疗程。

根据多种实施方案，基本上同时地、并行地、交替地、顺序地或相继地实施本发明的抗体和至少一种化疗剂的施用。在一些实施方案中，根据重叠的时间表施用抗体和至少一种化疗剂。

根据特定的实施方案，在至少一种化疗剂的最初施用之前实施抗体的施用。

根据其他实施方案，通过选自由以下组成的组的途径实施抗体和至少一种化疗剂的任一项或二者的施用：静脉内、口服、腹膜内、皮下、隔离肢体灌注(isolated limbperfusion)、注入器官和其组合。

在特定实施方案中，本发明的方法还包括评价选自由以下组成的组的至少一种参数：肿瘤生长速率、肿瘤体积、转移的数目、肿瘤复发和其组合。

应注意的是，根据本发明的教导，本发明的经修饰的人源化抗体可在开始化疗和任选地放疗及其任何组合的之前、期间或之后，即，开始化疗和任选地放疗之前和期间、之前和之后、期间和之后、或之前、期间和之后被施用。例如，可在开始化疗之前或之后1和30天之间施用本发明的抗体。还可在化疗的疗程之间施用抗体。

在本发明的组合治疗方法中，可与化疗平行、例如基本上同时地或并行地施用抗体。还可使用其他施用时间表，例如，重叠时间表或包括交替地、顺序地或相继地施用两种类型的治疗的时间表。

根据多种实施方案，至少一种化疗剂选自由以下组成的组：抗代谢药、基于铂的药物、有丝***抑制剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗血管生成剂和其组合。

根据另一个特定实施方案，选择至少一种化疗剂以致当与化疗剂组合使用时，本发明的经修饰的hBAT-1增强淋巴细胞的存活。典型地，可体外方便地分析增强的或增加的存活。

因此，在多种实施方案中，化疗剂可选自抗代谢药，诸如嘧啶类似物5-氟尿嘧啶或阿糖胞苷，或基于铂的药物，诸如奥沙利铂或顺铂。此外，在多种实施方案中，化疗剂可以不同于选自以下的剂：拓扑异构酶I抑制剂(诸如SN-38)和烷化剂(诸如环磷酰胺)。

根据一些实施方案，至少一种化疗剂是抗代谢药，包括嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂和叶酸拮抗剂。根据一些实施方案，抗代谢药是嘧啶拮抗剂。根据一些实施方案，抗代谢药选自由以下组成的组：5-氟尿嘧啶、尿嘧啶氮芥、尿嘧啶、卡培他滨、6-巯基嘌呤、氨甲喋呤、吉西他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨和培美曲塞。

根据一些实施方案，至少一种化疗剂是5-氟尿嘧啶。根据一些实施方案，至少一种化疗剂是阿糖胞苷。根据一些实施方案，至少一种化疗剂是选自由以下组成的组的基于铂的药物：顺铂、卡铂和奥沙利铂。根据又其他实施方案，至少一种化疗剂是选自由以下组成的组的有丝***抑制剂：紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、长春花碱、长春新碱和长春瑞滨。根据又其他实施方案，至少一种化疗剂是选自由以下组成的组的蒽环类抗生素：柔红霉素、respinomycin D和伊达比星。根据一些实施方案，至少一种化疗剂是选自由以下组成的组的抗血管生成剂：贝伐单抗、多巴胺、四硫钼酸盐和VEGF的抗血管生成变体。根据一些实施方案，至少一种化疗剂不同于拓扑异构酶I抑制剂。根据一些实施方案，至少一种化疗剂不同于烷化剂。

基于它们对癌细胞、细胞活性或药物干扰的过程或药物影响的细胞周期的特定阶段的影响将化疗药物分为几个组。因此，化疗药物落入以下类别的一种：烷化剂、亚硝基脲、抗代谢药、蒽环类、拓扑异构酶I和II抑制剂、有丝***抑制剂、尤其是基于铂的药物、类固醇和抗血管生成剂。

抗代谢药，也称为“核苷类似物”，代替天然的物质作为DNA分子中的构件(building block)，从而改变细胞代谢和蛋白合成所需的酶的功能。在它们模拟细胞生长所需的养分的情况下，细胞最终经历溶解。如果核苷被无功能的核苷类似物代替，那么后者被并入DNA和RNA，最终通过抑制细胞合成DNA的能力诱导细胞周期停滞和凋亡。抗代谢药是细胞周期特异性的且在细胞***的S期期间是最有效的，由于它们主要在细胞经受用于新细胞的形成的新的DNA的合成时起作用。与这些药物相关的毒性见于快速生长和***的细胞。抗代谢药的实例包括嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂和叶酸拮抗剂。这些剂在S期期间损伤细胞并通常被用于治疗白血病，乳腺、卵巢和胃肠道的肿瘤，及其他癌症。抗代谢药的具体实例包括5-氟尿嘧啶(还称为5FU)、卡培他滨、6-巯基嘌呤、氨甲喋呤、吉西他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨和培美曲塞。

基于铂的化疗药物以几种不同的方式交联DNA，干扰通过有丝***的细胞***。被损伤的DNA引起DNA修复机制，当修复证明不可能时，其反过来激活凋亡。DNA改变中最值得注意的是与嘌呤碱基的1,2-链内交联。这些包括形成几乎90％的加合物的1,2-链内d(GpG)加合物和较不常见的1,2-链内d(ApG)加合物。1,3-链内d(GpXpG)加合物存在，但通过核苷酸切除修复(NER)容易被切除。其他加合物包括已被假定有助于基于铂的药物的活性的链间交联和无功能的加合物。与细胞蛋白，特别地HMG域蛋白的互作也已被提出作为干扰有丝***的机制，尽管这可能不是其主要的作用方法。基于铂的化疗药物包括顺铂(cisplatin)(也称为顺铂(cisplatinum)或顺-二氯二氨合铂II(CDDP)、卡铂和奥沙利铂。顺铂经常被指定为烷化剂，尽管其不具有烷基基团且不能实施烷化反应。将其正确地分类为烷化-样。基于铂的化疗药物被用于治疗多种类型的癌症，包括肉瘤、一些癌(例如小细胞肺癌和卵巢癌)、淋巴瘤和生殖细胞肿瘤。

有丝***抑制剂干扰细胞***。在该类别中最著名的化疗剂是紫杉醇(也称为“植物碱”、“紫杉烷”和“抗微管剂”)。其与多西他赛一起形成紫杉烷类的药物类别。然而，已知其他有丝***抑制剂，包括，但不限于，依托泊苷、长春花碱和长春新碱。紫杉醇在细胞***的过程中通过干扰正常的微管生长通过抑制它们的功能起作用；其超稳定它们的结构。这破坏了细胞以灵活的方式利用其细胞骨架的能力。特定地，紫杉醇与微管的“构件”微管蛋白的β亚基结合，且紫杉醇的结合将这些构件锁在适当的位置。所得的微管/紫杉醇复合物不具有解开的能力。这不利地影响细胞功能，因为微管的缩短和延长(称为动态不稳定)是用于它们行使转运其他细胞成分的机制的功能必需的。例如，在有丝***期间，微管在它们的复制和随后分开进入两个子细胞核的整个过程中定位染色体。此外，紫杉醇通过与凋亡阻止蛋白Bcl-2(B-细胞白血病-2)结合并因此抑制其功能诱导癌细胞的程序性细胞死亡(凋亡)。

在抗癌化疗中广泛使用的另一组DNA互作药物是蒽环类抗生素的组，其包括，尤其是，柔红霉素、阿霉素(也称为和盐酸阿霉素)、respinomycin D和伊达比星。这些药物通过嵌入和大分子生物合成的抑制与DNA互作从而抑制酶拓扑异构酶II的进展，酶拓扑异构酶II解开DNA用于转录。它们在拓扑异构酶II复合物已破坏用于复制的DNA链之后，稳定拓扑异构酶II复合物，防止DNA双螺旋被重新封装并从而阻止复制的过程。其在广泛范围的癌症的治疗中通常被使用。

烷化抗肿瘤剂直接攻击DNA。它们将一个烷基基团附着至DNA，交联DNA双螺旋链中的鸟嘌呤核碱基。这使得链不能够展开并分开。由于这在DNA复制中是必需的，因此细胞不再能够***。这些药物非特异性地起作用。环磷酰胺是烷化剂，然而，其是高度有效的免疫抑制物质。

拓扑异构酶I和II抑制剂分别干扰拓扑异构酶I和2的酶促活性，最终导致DNA复制和转录二者的抑制。拓扑异构酶I抑制剂的实例包括拓扑替康和依立替康。依立替康，是通过羧酸酯酶转化酶转化为生物活性代谢物7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)的前体药物。SN-38效力超过其亲本化合物依立替康1000倍，通过稳定拓扑异构酶I和DNA之间的可裂解的复合物抑制拓扑异构酶I活性，导致抑制DNA复制并触发凋亡细胞死亡的DNA中断(DNAbreak)。因为不间断的DNA合成是用于依立替康发挥其细胞毒性作用必需的，其也被分类为S期特异性剂。拓扑异构酶II抑制剂的实例包括依托泊苷和替尼泊苷。

抗血管生成剂干扰新血管的产生，最终导致肿瘤的“饥饿”。抗血管生成剂的非限制性实例包括单克隆抗体贝伐单抗、多巴胺和四硫钼酸盐。

血管内皮生长因子(VEGF)是32-42kDa的二聚体糖蛋白，其介导血管舒张、增加的血管通透性和内皮细胞有丝***发生。VEGF基因的不同的外显子剪接导致三种主要的mRNA种类，其编码三种分泌的同种型(下标表示氨基酸的数目)：VEGF189、VEGF165和VEGF121。还描述了一些小的剪接变体(VEGF206、VEGF183、VEGF145和VEGF148)。VEGF多肽的变体和它们在癌症治疗中的用途在例如WO/2003/012105中被公开。

与放射的组合治疗

根据多种实施方案，本方法还包括用放射治疗受试者。根据多种实施方案，本方法包括以下的全部：施用本发明的抗体、施用至少一种化疗剂并用放射治疗受试者。根据一些实施方案，基本上同时地、并行地、交替地、相继地或根据重叠的时间表施用抗体、至少一种化疗剂和放射治疗。

可与本发明的经修饰的抗体组合使用放射源，且化疗剂可以在被治疗的患者的外部或内部。当源在患者外部时，治疗被称为体外射束放射治疗(EBRT)。当放射源在患者内部时，治疗被称为近程治疗(BT)。

使用制造用于该目的的标准设备，诸如AECL Theratron和Varian Clinac，根据众所周知的标准技术施用放射。

外部放射源和进入患者的点之间的距离可以是代表杀死靶细胞和最小化副作用之间的可接受的平衡的任何距离。典型地，外部放射源在距离进入患者的点的70cm和100cm之间。

通常通过将放射源放置入患者中实施近程治疗。典型地，将放射源放置在距离待被治疗的组织的约0-3cm处。已知的技术包括间质、腔内和表面近程治疗。永久地或临时地植入放射性粒子。已被用于永久植入的一些典型的放射性原子包括碘-125和氡。已被用于临时植入的一些典型的放射性原子包括镭、铯-137和铱-192。已被用于近程治疗的一些另外的放射性原子包括镅-241和金-198。

放射的剂量取决于如本领域众所周知的许多因素。此类因素包括被治疗的器官、在放射的路径中可能被非故意地不利地影响的健康的器官、患者对放射治疗的耐受性、和需要治疗的身体区域。剂量将典型地在1Gy和100Gy之间，且更特别地在2Gy和80Gy之间。已被报道的一些剂量包括针对脊髓的35Gy、针对肾脏的15Gy、针对肝的20Gy和针对***的65-80Gy。然而，应强调的是，本发明不限于任何特定的剂量。剂量将由治疗医师根据给定情境下的特定因素、包括以上提及的因素而确定。

用于近程治疗的放射的剂量可以与以上提及的用于体外射束放射治疗的相同。除了以上提及的用于确定体外射束放射治疗的剂量的因素之外，在确定近程治疗的剂量时所使用的放射性原子的性质也被考虑。

本发明的人源化抗体

如本文所用的，术语“BAT”和“BAT抗体”以其广泛的意义被使用并具体地覆盖与被称为mBAT-1的鼠单克隆抗体相同或基于被称为mBAT-1的鼠单克隆抗体的抗体，或其抗原结合片段。单克隆抗体mBAT-1由以登录号1-1397保藏在Collection Nationale de Culturesde Microorganismes(CNCM)的杂交瘤细胞系分泌，如在美国专利号5,897,862中公开的。此外，“BAT”和“BAT抗体”可以指与mBAT-1识别相同的抗原表位的抗体，例如，如在美国专利申请公布号2003/0026800中描述的嵌合抗体。BAT抗体还包括人源化抗体，其多种实例在WO03/099196和美国专利申请公布号2008/0025980中公开，并可互换地表示为“CT-011”、“hBAT”和“hBAT-1”。

通常，人源化单克隆抗体的轻链可变区通过以下式被表征：

FR_L1-CDR_L1-FR_L2-CDR_L2-FR_L3-CDR_L3-FR_L4

其中每一个FR都独立地是人抗体的构架区且每一个CDR都独立地是单克隆mBAT-1抗体的互补决定区。

通常，人源化单克隆抗体的重链可变区通过以下式被表征：

FR_H1-CDR_H1-FR_H2-CDR_H2-FR_H3-CDR_H3-FR_H4

其中每一个FR都独立地是人抗体的构架区且每一个CDR都独立地是单克隆mBAT-1抗体的互补决定区。

在特定实施方案中，FR源自人TEL9抗体的轻链可变区，或是来自其在某些氨基酸残基被修饰。在从未免疫的供体的外周血淋巴细胞制备的免疫球蛋白重(VH)链和轻(Vκ和Vλ)链可变(V)基因的多样化文库中鉴定了人TEL-9抗体(Marks等人J MoI Biol.1991,222:581-97)。该抗体显示与吐绶鸡(turkey)蛋清溶菌酶(TEL)抗原特异性结合。

在特定实施方案中，FR源自人hsighv1295抗体的重链可变区，或来自其在某些氨基酸残基被修饰。从稳定的杂交瘤和埃-巴二氏病毒转化的来自患有类风湿性关节炎的三名患者和患有全身性红斑狼疮的一名患者的滑液或外周血的B细胞系分离人hsiggv1295抗体(Fang等人，J Exp Med.1994,179:1445-56)。

组合物、施用和剂量

为了在本发明的方法中使用，可如本领域已知的使用一种或多种药学上可接受的载体、稳定剂或赋形剂(媒介物)以传统方式配制人源化抗体以形成药物组合物，特别是关于蛋白活性剂。载体从与组合物的其他成分是相容的意义上说是“可接受的”并对其接收者是无毒的。适合的载体典型地包括生理盐水或乙醇多元醇诸如丙三醇或丙二醇。

可将抗体配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与游离氨基形成)且其是与无机酸诸如盐酸或磷酸或诸如乙酸、草酸、酒石酸和马来酸的此类有机酸形成的盐。与游离的羧基形成的盐也可源自无机碱诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因的有机碱。

可适当地配制组合物用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内施用且方便地包含抗体的无菌水溶液，其优选地与接受者的血液等渗。典型地通过将固体活性成分溶解在包含生理上相容的物质诸如氯化钠、甘氨酸，等等并具有与生理条件相容的缓冲的pH的水中以产生水溶液并使得所述溶液无菌制备此类制剂。可在单位剂量或多剂量容器例如，密封的安瓿或小瓶中制备这些制剂。

该组合物可并入稳定剂，诸如例如，聚乙二醇、蛋白、糖类(例如海藻糖)、氨基酸、无机酸和其混合物。以适合的浓度和pH将稳定剂用于水溶液。将水溶液的pH调节在5.0-9.0的范围内，优选在6-8的范围内。在配制抗体中，可使用抗吸附剂。其他适合的赋形剂典型地可包括抗氧化剂诸如抗坏血酸。

可将组合物配制为控释制品，其可通过使用聚合物以复合或吸附蛋白而实现。用于控释制剂的适合的聚合物包括，例如，聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯醋酸乙烯酯和甲基纤维素。用于控释的另一个可能的方法是将抗体并入聚合材料诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯醋酸乙烯酯共聚物的粒子。可选地，代替将这些剂并入聚合粒子，例如通过凝聚技术或通过界面聚合，分别将这些物质捕获在制备的微米胶囊中，例如，羟甲基纤维素或明胶-微米胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微米胶囊，或将这些物质捕获在胶质药物递送***中，例如，脂质体、白蛋白微米球、微米乳液、纳米粒子和纳米胶囊或将这些物质捕获在粗乳液(macroemulsion)中。

当需要口服制品时，可将组合物与载体诸如乳糖、蔗糖、淀粉、滑石硬脂酸镁、结晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、甘油、海藻酸钠或***树胶组合。

优选肠胃外地，通常通过静脉输注施用本发明的人源化抗体。施用还可以通过腹膜内、口服、皮下、或肌内途径。通常呈约0.1mg/kg至约20mg/kg的患者体重、一般在约0.5mg/kg至约10mg/kg、且经常在约1mg/kg至约5mg/kg的范围施用抗体。就这一点而言，使用具有至少12小时、优选至少4天、更优选直至21天的循环半衰期的抗体是优选的。预期嵌合抗体和人源化抗体分别具有直至4天和直至14-21天的循环半衰期。在某些情况下，在治疗阶段施用大的负荷剂量、之后通过定期地(例如，每周一次)保持剂量可以是有益的。还可通过缓慢释放递送***、泵和用于连续输注的其他已知的递送***递送抗体。剂量方案可不同以基于其药代动力学提供特定抗体的期望的循环水平。因此，剂量将被计算以便保持治疗剂的期望的循环水平。

典型地，将通过受试者的病症、及待被治疗的受试者的体重或表面积确定有效剂量。还将通过伴随本发明的经修饰的抗体在特定受试者中的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度确定剂量的大小和剂量方案。在确定待被施用的治疗组合物的有效量中，医师尤其需要评价循环血浆水平、毒性和疾病的进展。

关于本发明的人源化抗体和化疗剂的术语“有效量”应被理解为指实现治疗效果、不造成过度或无法控制的不良副作用所需的这些活性剂的每一种的量。实现治疗最终结果必需的有效量可取决于一些因素，包括，例如，肿瘤的特定类型和患者病症的严重程度和是否与放射进一步共施用组合。在本发明的情况下，活性剂的有效量(剂量)应在受试者中足以实现随时间推移的有益的治疗反应，包括肿瘤生长的抑制、肿瘤生长速率的减少、肿瘤和转移生长的预防和增强的存活。

在本发明的组合方法的多种实施方案中，可根据涉及每一种活性剂的施用频率和施用顺序的一些治疗时间表、也称为“给药时间表”和“施用方案”的任一个施用抗体和化疗剂。例如，可使用例如组合的剂型或单独的剂型基本上同时地，即，同时施用抗体和化疗剂。这种类型的施用还可被称为“伴随(concomitant)”施用。并行(concurrent)施用指在相同的一般时间段内施用活性剂，例如，在同一天但不必然在同时。例如，一种活性剂可需要与食物一起施用，而其他活性剂则需要在半空腹(semi-fasting)状态施用。交替施用包括在特定的时间段中例如，经过几天或一周的疗程施用一种剂，随后，在随后相同的时间段施用其他剂，且随后持续一个或几个循环重复该模式。顺序或相继的施用包括使用一种或多种剂量在第一时间段施用一种剂，随后，使用一种或多种剂量在第二时间段施用其他剂。还可采用重叠时间表，其包括在经过治疗阶段的不同天施用活性剂，不必然根据常规顺序。根据所使用的剂和受试者的病症，还可采用这些一般指导的变化形式。

在一些特定组合中，使用施用的特定顺序，例如，在另一种剂之前施用一种剂可以是有益的。

现在已一般地描述了本发明，通过参考下面的实施例，相同的内容将更容易地被理解，实施例通过阐述的方式被提供且不预期限制本发明。

实施例

实施例1

与CT-011双突变体孵育之后CD4⁺T淋巴细胞的生存力

形成包含Trp 107到Ala和Phe 97到Ala的氨基酸取代的CT-011双突变体抗体(表示为w222+F97)。48小时活化人CD4⁺T淋巴细胞的代表性实例持续另外的72小时与1μg/ml或0.1μg/ml的CT-011或CT-011双突变体W222+F97或同种型对照抗体一起孵育。通过台盼蓝(Trypan Blue)排除法评价细胞生存力。

如在图1中看出的，在包括双突变体抗体的培养物中淋巴细胞生存力较高。图1的Y-轴指示活细胞的浓度。

实施例2

经修饰的hBAT-1在鼠肿瘤模型中的体内作用

为了检查本发明的经修饰的抗体是否能够传递mBAT-1或hBAT-1特征性的生物作用，体内研究了经修饰的抗体的疗效。

用B16黑色素瘤细胞接种C57BL小鼠以诱导肺转移。在肿瘤接种后的第12天，注射本发明的经修饰的mAb的递增的量(1μg、10μg和20μg)并与10μg最佳剂量的mBAT-1和/或hBAT-1比较。可在肿瘤接种后的第24天测量肺重量以指示肿瘤的建立。平均肺重量每处理指示多种被检测的mAb。

实施例3

经修饰的hBAT-1抑制SCID小鼠中的人黑色素瘤(SK-28)

已显示小鼠和人BAT-1mAb在人外周血淋巴细胞(hPBL)的存在下抑制人肿瘤转移的形成。为了评价经修饰的hBAT-1在抑制人癌症中的疗效，在结合人起源的肿瘤和淋巴细胞二者的模型中研究该经修饰的抗体。用hPBL移植严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)以恢复免疫力(immune-competence)。用人黑色素瘤细胞(SK-28)攻击小鼠并在肿瘤接种后的第11天以单次静脉剂量施用递增浓度的人源化抗体处理小鼠。

实施例4

裸鼠中经修饰的hBAT-1mAb免疫治疗人结肠直肠癌肝转移

LIM6和HM7是由于它们的高粘蛋白合成和转移潜能而被选择的人CRC细胞系LS174T的两种亚克隆。将这些肿瘤细胞注射入经麻醉的裸鼠的暴露的脾中。1分钟后，移除脾并闭合切口。12天后施用本发明的低剂量的mBAT-1、hBAT-1和经修饰的hBAT-1抗体并在肿瘤接种后35天处死小鼠。称肝重、计数转移的结节的数量，并处理肝组织用于组织学和免疫组织化学研究。

实施例5

经修饰的hBAT与CD4和CD8的共定位

已显示小鼠和人BAT-1结合人淋巴细胞，识别CD4+和CD8+二者的亚群。为了建立本发明的经修饰的人源化mAb的结合特异性，如本文以下描述的从正常供体的血液中分离人外周血淋巴细胞(PBL)，并对其分析hBAT与已知的淋巴细胞标志物的共定位。

通过聚蔗糖(ficoll)分离外周血单核细胞(PBMC)并将其在组织培养板中孵育以去除贴壁细胞。通过大小和粒度门控分离物的淋巴细胞并通过碘化丙啶(PI)排除法门控分离物的活细胞。在4℃持续1小时执行结合，并通过对经门控的淋巴细胞的流式细胞术确定结合。

实施例6

经修饰的hBAT-1与B淋巴细胞的结合

针对人B淋巴瘤细胞系Daudi细胞的膜产生本发明的经人源化的mAb。如本领域已知的，通过聚蔗糖从正常供体中分离PBL，随后粘附至组织培养板。检查未贴壁细胞中抗体与包含CD19和CD20的B细胞标志物的共定位。在4℃持续1小时执行结合，并通过对经门控的淋巴细胞的流式细胞术确定结合。

实施例7

经修饰的hBAT-1的稳定性

如本领域已知的形成包含选自以下的位置中的至少一个氨基酸修饰的CT-001mAb：具有SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列的轻链可变区的Thr 5、Thr 20、Cys 71、Asn 75、Ser 76、Phe 93和Phe 97；和具有SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列的重链可变区的Asp 54、Ser55和Trp 107；具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链恒定区的Asn 51、Ser 52、Asp 63和Ser 64；或具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链恒定区的Thr 3、Ser 7、Asn 42、Ser43、Asn 86、His 87、Asp 104、Lys 105、Thr 108、Met 135、Asp 153、Pro154、Asp 163、Gly 164、Asn 180、Ser 181、Asn 198、Gly 199、Asn 267、Gly 268、Asp 282、Ser 283、Asp 284、Ser285、Asn 317、His 318、Lys 330和Met 311。

使用评价抗体的大小、聚集状态、结构和分子间接触的多种生物化学和生物物理技术评价经修饰的mAb的稳定性，如本领域已知的。例如，可通过尺寸排阻色谱(SEC)和分析超速离心(AUC)研究抗体的纯度和聚集状态。

特定实施方案的前述描述如此充分地显示了本发明的一般特性以致他人在没有过多实验和不偏离一般概念的情况下，可通过应用现有的知识容易修改和/或调整此特定的实施方案用于多种应用，且，因此，此调整和修改应该并预期被包含在本公开实施方案的等同物的含义和范围内。将被理解的是本文所采用的用语或术语是用于描述而不是限制的目的。用于实施多种公开的功能的工具、材料和步骤可采用多种可选的形式而不偏离本发明。

Claims (16)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含

SEQ ID NO:1所列的轻链可变区，其中Phe97被Ala取代；和

SEQ ID NO:5所列的重链可变区，其中Trp 107被Ala取代。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有与mBAT-1相似的、或大于mBAT-1的抗肿瘤活性。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有与hBAT-1相似的、或大于hBAT-1的抗肿瘤活性。

4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fv、F(ab')、F(ab')2和单链抗体。

5.一种编码根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。

6.一种包含根据权利要求5所述的多核苷酸序列的载体。

7.一种含有包含根据权利要求5所述的多核苷酸序列的载体的宿主细胞。

8.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段作为活性成分、和药学上可接受的载体、稀释剂或稳定剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗有相应需要的受试者的癌症或免疫缺陷疾患。

10.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗有相应需要的受试者的肿瘤的药剂中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述受试者患有选自实体瘤或非实体瘤的肿瘤。

12.根据权利要求10所述的用途，其中所述受试者患有非实体瘤。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述受试者患有恶性血液病。

14.根据权利要求10所述的用途，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、乳腺癌；黑色素瘤；卵巢癌、***、胰腺癌、头颈癌、胃肠道癌、食管肿瘤、肝细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、***肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、套细胞淋巴瘤、卡波济氏肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

15.根据权利要求10所述的用途，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：结肠直肠癌、黑色素瘤、胰腺癌、头颈癌、食管肿瘤、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金病。

16.包含以下的抗体或其抗原结合片段用于制备用于***的药剂的用途：

SEQ ID NO:1所列的轻链可变区，其中Phe97被Ala取代；和

SEQ ID NO:5所列的重链可变区，Trp 107被Ala取代。