CN103667529A - 番茄斑萎病毒的液相芯片检测引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番茄斑萎病毒的液相芯片检测引物及检测方法。本发明提供了用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的试剂盒，包括引物组和探针，所述引物组由引物1和引物2组成。本发明的实验证明，本发明的检测方法能够对样品进行快速检测，从样品处理到出结果仅需4小时左右；本发明设计的引物与番茄上常见的几种植物病毒不发生交叉反应，可降低非特异性扩增造成的假阴性结果。

Description

番茄斑萎病毒的液相芯片检测引物及检测方法

技术领域

本发明属于植物病毒检测领域，具体涉及一种番茄斑萎病毒的液相芯片检测引物及检测方法。

背景技术

番茄斑萎病毒为布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的代表成员。自1915年在澳大利亚首次报道番茄斑萎病,并于1930年确定其病原为病毒后,许多国家相继有该病毒病发生和危害的报道。番茄斑萎病毒的寄主范围很广,包括温带、亚热带和热带的80多个科近千种双子叶和单子叶植物,可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害,造成极其严重的经济损失。在美国,1971年在德克萨斯州的南部种植的花生上首次发现该病毒,至1984年其危害加重,1986年该地一个县的花生生产受到严重影响,损失近300万美元。在法国和西班牙等欧洲国家和地区,曾因该病毒的传播介体的大量扩散而引起番茄、辣椒等作物的严重病害,造成毁灭性损失,重病地块损失达100%。为防止该病毒在我国的传播扩散，该病毒被列入我国的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。目前在番茄斑萎病毒的检测上，较常用的方法有两种，一种是血清学检测方法，常见的有DAS-ELISA；另一种是分子生物学检测方法，其中以RT-PCR最为常见。

液相芯片检测技术是一种快速高通量检测技术，是对生物芯片技术的继承和发展，该技术集多种生化技术于一体，具有独特的优点：可通过不同荧光编码微球同时检测上百种不同的病原分子，满足高通量检测需要；相对于固相芯片，反应在液态体系中进行，可大大缩短检测时间；检测所需样本少（最少可至1μL）。该技术已用于李痘病毒（Plum pox virus,PPV）等植物病毒的检测，并有一些获得专利；到目前为止，国内外还未见应用该技术检测番茄环斑病毒的报道。

发明内容

本发明的目的是提供番茄斑萎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，即一种操作简单、结果准确的番茄斑萎病毒液相芯片检测方法及其所用到的引物，从而弥补现有技术的不足。

本发明的一个目的是提供用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括引物组和探针，所述引物组由引物1和引物2组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列2；

所述探针的序列为NH3-C12-T1，所述T1的核苷酸序列为序列表中序列3。

上述C12与所述T1的5’末端连接，C12为12个C原子；NH3-为氨基修饰。

上述试剂盒中，所述引物组的各条引物及所述探针均为独立包装。

本发明的另一个目的是提供用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的引物组或探针。

本发明提供的所述引物组由引物1和引物2组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列2；

本发明提供的所述探针的序列为NH3-C12-T1，所述T1的核苷酸序列为序列表中序列3。

上述的试剂盒或上述的引物组或探针中，所述引物2的5’末端标记生物素。

上述的引物组或探针在制备用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的试剂盒中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第三个目的是提供用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或探针；所述试剂盒中的引物组的各条引物或所述探针均为独立包装。

上述的试剂盒或所述的引物组或探针在用液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒或用液相芯片检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄斑萎病毒中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第四个目的是提供用液相芯片检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄斑萎病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）提取待测样品中的RNA作为模板，反转录得到cDNA；

2）生物素化的扩增产物和交联探针的微球的获得：

所述生物素化的扩增产物按照如下方法制备：以所述cDNA为模板，用上述的试剂盒中的引物组进行RT-PCR扩增，得到生物素化的扩增产物；

所述交联探针的微球按照如下方法制备：上述的试剂盒中的探针与微球（此微球为液相芯片检测中常用的微球）进行共价偶联（探针的氨基和微球表面的羧基通过酰胺键连接），得到交联探针的微球；具体采用BIO-RAD公司的Bio-PlexCOOH Bead28试剂盒进行，产品目录号为：171-506028；或者按照实施例2的一的3中记载的方法制备。

3）将所述生物素化的扩增产物与所述交联探针的微球杂交，得到的杂交产物再进行液相芯片检测，若液相芯片定性比值（样品荧光强度中位值平均值与空白对照MFI的平均值的比值）大于等于2，则待测样品中携带或候选携带番茄斑萎病毒；

若液相芯片定性比值（样品荧光强度中位值平均值与空白对照MFI的平均值的比值）小于2，则待测样品中不携带或候选不携带番茄斑萎病毒。

上述方法中，所述RT-PCR扩增的体系中，所述引物组中的各条引物按照等摩尔比配置；

所述RT-PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min。

本发明为实现上述目的，采用了液相芯片技术。该技术是在核酸水平上的一种检测技术，具有准确性好和灵敏度高的特点。其原理是将编码微球单个逐一通过检测通道时受到双色激光同时照射，第一束激光激发微球的分类荧光，根据荧光编码确定微球的类别，即微球内部的两种荧光物质受激发后可发射两种不同波长的荧光，不同类别微球内部这两种荧光物质比例不同，则荧光强度比例也不同，从而将不同的特异性反应区分开来；第二束激光激发报告分子上的荧光素，根据荧光强度确定微球上结合的报告分子的数量从而确定目标分子的数量。各种荧光信号经分析软件进行数字化处理，可获得检测物的种类和数量。

本发明的实验证明，本发明的引物和探针能够对样品进行快速检测，从样品处理到出结果仅需4小时左右；本发明设计的引物与番茄上常见的几种植物病毒不发生交叉反应，可降低非特异性扩增造成的假阴性结果。由于液相芯片检测技术具有特异性强、通量高及快速的特点，适合在进境种苗量较大的口岸应用，可以在保障安全的情况下有效的提高通关速度，从而促进国际贸易的发展。该方法还适用于经常发生复合侵染的块茎类种苗的口岸检疫及田间监测，可以大幅提高检测效率。这为防止番茄斑萎病毒进入我国提供了技术储备，也为其他同类病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。总之，本发明引物及探针特异性好，检测方法快速简单，准确性好，灵敏度高，为可能携带番茄斑萎病毒植物材料的进出口安全提供了保证。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

番茄斑萎病毒（TSWV）：记载在“3种番茄斑萎病毒属病毒多重RT-PCR检测方法的建立.上海农业学报，2012，（28）3：32-36.”一文上，公众可从中国检验检疫科学研究院获得，用该病毒感染番茄（Lycopersicon.esculentum）叶片。

番茄黑环病毒（TBRV）：记载在“番茄黑环病毒分子生物学检测方法及分离物序列分析.植物检疫，2006，20（5）：275-278.”一文上，公众可从中国检验检疫科学研究院获得，用该病毒感染番茄（Lycopersicon.esculentum）叶片。

马铃薯A病毒（PVA）：记载在“双引物探针RT-Real timePCR检测马铃薯A病毒.植物检疫，2009，26（1）：26-28.”一文上，公众可从中国检验检疫科学研究院获得，用该病毒感染本生烟（Nicotiana benthamiana）叶片。

马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）：记载在“乌鲁木齐地区马铃薯纺锤块茎类病毒的检测与序列分析.西北农业学报，2010，19（9）：38-42.”一文上，公众可从中国检验检疫科学研究院获得，用该病毒感染马铃薯（Solanum tuberosum）叶片。

南芥菜花叶病毒（ArMV）的昆诺阿藜（Chenopodium quinoa）叶片：记载在“南芥菜花叶病毒RT-PCR扩增产物胶体金层析和酶联检测方法的建立.植物检疫，2011，25（5）：33-36.”一文上，公众可从中国检验检疫科学研究院获得，用该病毒感染昆诺阿藜（Chenopodium quinoa）叶片。

实施例1、番茄斑萎病毒液相芯片检测引物、探针及试剂盒的制备

根据NCBI已报道的番茄斑萎病毒的核苷酸序列，利用Primer Premier5.0软件设计引物和探针，最终筛选出一对具有高特异性的引物和探针并进行人工合成，序列如表1所示。

表1设计的引物和预期目的片段长度

上述序列2所示的引物的5’端用生物素Biotin标记。

上述每条引物和探针独立包装后，可以作为番茄斑萎病毒液相芯片检测的试剂盒的组分。

实施例2、番茄斑萎病毒液相芯片检测引物、探针及试剂盒的应用

一、番茄斑萎病毒液相芯片检测方法的建立

1、检测样品cDNA的获得

1）检测样品RNA的提取

采用Invitrogen公司的Trizol Reagent（货号:15596-026）提取待测样品RNA，按照说明书的步骤进行操作。

2）cDNA合成：即在0.2mL的反应管中加入1μL总RNA、2μL（10μmol/L）下游引物TSWV-S-R（不需要生物素标记）、1μL dNTP Mix（10mmol/L）及10μLDEPC-H₂O；混匀后于70℃加热10min，迅速转移到冰上骤冷5min，瞬时离心；然后向反应管中加入5×反转录缓冲液5μL，0.5μL RNA酶抑制剂（40U/μL），0.5μL反转录酶（200U/μL）；轻轻混匀，瞬时离心；42℃反应1h，冰上骤冷5min，获得cDNA。

2、PCR扩增目的片段

25μL扩增体系如下：1μL cDNA、上游引物TSWV-S-F（10μmol/L，终浓度为0.4μmol/L）1μL、下游引物TSWV-S-R（带生物素标记，10μmol/L，终浓度为0.4μmol/L）1μL、dNTP Mix（10mmol/L，每个dNTP在反应体系中的终浓度为0.2mmol/L）0.5μL、Taq酶（5U/μL，终浓度为0.06U/μL）0.3μL、PCR缓冲液（10×）2.5μL、MgCl₂（25μmol/L，终浓度为2.5μmol/L）2.5μL及DEPC-H₂O16.2μL。

PCR反应程序：95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min。

根据上述反应体系和程序，得到已生物素化的扩增产物。

3、寡核苷酸探针与微球共价偶联（采用BIO-RAD公司的Bio-Plex COOH Bead28试剂盒，产品目录号为：171-506028）

交联探针的微球按照如下方法制备：上述的试剂盒中的探针与微球进行共价偶联（探针的氨基和微球表面的羧基通过酰胺键连接），得到交联探针的微球，具体如下：

取100μL微球涡旋30s后超声30s，将其加入滤管中，13000rpm离心15min；再加入30μL的MES，13000rpm离心15min；加入8.5μL的MES，13000rpm离心2min；弃上清液，以8.5μL MES重悬微球；加入1μL的探针TSWV-S-P（0.1nmol/L）及10μL NHS（10mg/mL）并立即涡旋；加入0.5μL新鲜的EDC（10mg/mL）并立即涡旋；避光室温25℃孵育30min；加入10μL NHS（同上）并立即涡旋；加入0.5μL新鲜的EDC（同上）并立即涡旋；避光室温孵育30min；加入1mL Tween20（0.02%）并涡旋；微球经13000rpm离心2min；移出上清液，1mL SDS（0.1%）悬浮微球并涡旋40s；13000rpm离心2min；用20μL TE（pH8.0）重悬微球；涡旋30s后4℃条件下避光保存，得到交联探针的微球。

4、偶联探针与RT-PCR扩增产物杂交

1.5×TMAC杂交液配方（250mL）：5M TMAC225mL，20%Sarkosyl1.88mL，1M Tris-HCl（pH8.0）18.75mL，0.5M EDTA（pH8.0）3.0mL。

用1.5×TMAC杂交液将各组微球稀释至150个/μL；向每个反应孔及空白对照孔中加入33ul稀释液；向每个空白孔中加入17μL TE（pH8.0）；向每个样品孔中分别加入步骤2得到的已生物素化的扩增产物5μL及TE（pH8.0）12μL；用枪上下吹吸数次以混匀各反应孔；盖好反应板以防止挥发，将其置于98℃5分钟以使PCR产物双链变性；之后再将反应板置于52℃15min；用1×TMAC杂交液将链霉亲和素-藻红蛋白配成4μg/mL（注：每孔需75μL显色液）；用1×TMAC杂交液将1.2μm的Millipore filter plate预湿，之后再负压抽空；将杂交好的反应液移入已预湿的孔中，用负压抽空以去除上清；用1×TMAC100μL清洗二次，之后再每孔加入75μL显色液，并用排枪上下吹吸数次以重悬反应液；迅速将反应液移回PCR板中；将反应板再置于52℃杂交15min，得到杂交产物，用Bio-plex液相芯片***检测。

5、液相芯片仪结果分析

利用Bio-plex液相芯片***（Bio-Rad公司）对杂交产物进行分析，参与计数的荧光编码微球均≥100个，表明用于计数的荧光编码微球数量有效，所产生的MFI值可信，各个荧光编码微球的空白对照MFI＜500，表明结果有效，实验可以进行结果判定。

液相芯片定性比值结果(luminex qualitative ratio result,LQRR)等于样品荧光强度中位值（median florescence intensity,MFI）平均值（MFIs）与空白对照MFI的平均值（MFIb）的比值，即LQRR=MFIs/MFIb。LQRR≥2，结果判为阳性；LQRR<2，结果判为阴性。

二、番茄斑萎病毒液相芯片检测引物及探针的特异性分析

为了验证实施例1制备的番茄斑萎病毒液相芯片检测引物及探针的特异性，本实验选择能够与番茄斑萎病毒侵染共同寄主植物的番茄黑环病毒（TBRV）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）和南芥菜花叶病毒（ArMV）作为对照病毒进行试验。

1、样品cDNA的获得

参照步骤一的1中的方法，从感染了番茄斑萎病毒（TSWV）的番茄（Lycopersicon.esculentum）叶片、感染了番茄黑环病毒（TBRV）的番茄（Lycopersicon.esculentum）叶片、感染了马铃薯A病毒（PVA）的本生烟（Nicotianabenthamiana）叶片、感染了马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）的马铃薯（Solanumtuberosum）叶片和感染了南芥菜花叶病毒（ArMV）的昆诺阿藜（Chenopodiumquinoa）叶片样品中提取5份总RNA，反转录得到5份cDNA。

2、PCR扩增目的片段：用步骤一中的2的PCR方法分别对上述5份总cDNA进行扩增，得到5份已生物素化的扩增产物；同时设置空白对照；

3、寡核苷酸探针与微球共价偶联：方法同上述步骤一的3，得到交联探针的微球。

4、偶联探针与RT-PCR扩增产物杂交：用步骤一中的4的杂交方法分别将5份已生物素化的扩增产物杂交到交联探针的微球上，得到5份杂交产物。

5、液相芯片仪结果分析：方法同上述步骤一的5，用液相芯片检测体系对5份杂交产物进行检测，判断整个液相芯片检测特性对非目标物有无检测信号。

实验重复3次。

上述将TSWV探针与荧光编码微球偶联，分别与TSWV、TBRV、PVA、PSTVd、及ArMV的PCR产物杂交，检测数据见表2。TSWV的LQRR为29.41，大于2；而TBRV、PVA、PSTVd及ArMV的LQRR均小于2，表明本发明的引物对和探

针及所建立的液相芯片检测体系运行良好，具有良好的特异性。

表2液相芯片检测方法特异性结果

注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性。

三、番茄斑萎病毒液相芯片检测引物及探针的灵敏度分析

1、样品cDNA的获得

参照步骤一的1中的方法，从感染了番茄斑萎病毒（TSWV）的番茄（Lycopersicon.esculentum）叶片中提取总RNA，将总RNA（浓度为1ng/uL）进行10倍比稀释，分别以10¹～10⁵共五个稀释度稀释，反转录得到5份cDNA。

2、RT-PCR扩增目的片段：用步骤一中的2的RT-PCR方法分别对上述5份总cDNA进行扩增，得到5份已生物素化的扩增产物；

3、寡核苷酸探针与微球共价偶联：方法同上述步骤一的3，得到交联探针的微球。

4、偶联探针与RT-PCR扩增产物杂交：用步骤一中的4的杂交方法分别将5份已生物素化的扩增产物杂交到交联探针的微球上，得到5份杂交产物。

5、液相芯片仪结果分析：方法同上述步骤一的5，用液相芯片检测体系对5份杂交产物进行检测。

将TSWV的总RNA进行10¹～10⁵梯度稀释后用作模板进行液相芯片检测，结果表明（表3），检测灵敏度为10⁴（约为1pg/μL总RNA），LQRR值约为21.77。结果表明实施例1制备的番茄斑萎病毒液相芯片检测引物及探针具有良好的灵敏度。

表3液相芯片检测方法灵敏度结果

注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性。

实施例3、番茄斑萎病毒液相芯片检测引物及检测方法检测实际待检样品

为了更好的验证本发明的引物探针的实际应用效果，本发明用番茄斑萎病毒侵染过的番茄（Lycopersicon.esculentum）叶片（样品1）和用RT-PCR方法检测确定没有被番茄斑萎病毒侵染过的4份样品（样品2、样品3、样品4、样品5）同时进行检测。

方法同实施例2中的步骤一。

结果表明（表4），被侵染的样品检测结果为阳性，而没有被番茄斑萎病毒侵染过的样品为阴性，从而证明本发明的方法能够有效的检测出待检样品中是否存番茄斑萎病毒。

表4液相芯片方法检测实际样品结果

Claims (10)

1.用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的试剂盒，包括引物组和探针，所述引物组由引物1和引物2组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列2；

所述探针的序列为NH3-C12-T1，所述T1的核苷酸序列为序列表中序列3。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物组的各条引物及所述探针均为独立包装。

3.用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的引物组或探针：

所述引物组由引物1和引物2组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列2；

所述探针的序列为NH3-C12-T1，所述T1的核苷酸序列为序列表中序列3。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒或权利要求3所述的引物组或探针，其特征在于：所述引物2的5’末端标记生物素。

5.权利要求3或4所述的引物组或探针在制备用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的试剂盒中的应用。

6.用于液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒的试剂盒，包括权利要求3或4所述的引物组或探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述引物组的各条引物或所述探针均为独立包装。

8.权利要求1或2或6或7所述的试剂盒或权利要求3或4所述的引物组或探针在用液相芯片检测或辅助检测番茄斑萎病毒或用液相芯片检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄斑萎病毒中的应用。

9.用液相芯片检测或辅助检测待测样品中是否携带番茄斑萎病毒的方法，包括如下步骤：

1）提取待测样品中的RNA作为模板，反转录得到cDNA；

2）生物素化的扩增产物和交联探针的微球的获得：

所述生物素化的扩增产物按照如下方法制备：以所述cDNA为模板，用权利要求1或2所述的试剂盒中的引物组进行RT-PCR扩增，得到生物素化的扩增产物；

所述交联探针的微球按照如下方法制备：权利要求1或2所述的试剂盒中的探针与微球进行共价偶联，得到交联探针的微球；

3）将所述生物素化的扩增产物与所述交联探针的微球杂交，得到的杂交产物再进行液相芯片检测，

若液相芯片定性比值大于等于2，则待测样品中携带或候选携带番茄斑萎病毒；

若液相芯片定性比值小于2，则待测样品中不携带或候选不携带番茄斑萎病毒。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述RT-PCR扩增的体系中，所述引物组中的各条引物按照等摩尔比配置；

所述RT-PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min。