CN103649120A

CN103649120A - 具有效应功能的抗cxcr4抗体及其用于治疗癌症的用途

Info

Publication number: CN103649120A
Application number: CN201280030414.8A
Authority: CN
Inventors: C·克林格-阿穆
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2014-03-19
Also published as: KR20140041698A; EP2721069A1; MA35173B1; JP6223966B2; JP2014525899A; AU2012274104B2; MX2013015061A; CA2838484A1; AR086984A1; WO2012175576A1; NZ618655A; US20140120555A1; AU2012274104A1; BR112013032456A2; RU2013158624A

Abstract

本发明涉及通过施用能够诱导效应功能的抗CXCR4单克隆抗体治疗癌症的方法。

Description

具有效应功能的抗CXCR4抗体及其用于治疗癌症的用途

技术领域

背景技术

趋化因子是小的分泌肽，特别是免疫反应期间其控制着白细胞沿被称为趋化因子梯度的配体化学梯度的迁移（Zlotnick A.等人，2000）。基于其NH₂-端半胱氨酸残基的位置、及与G蛋白偶联受体（其两个主要亚家族被命名为CCR和CXCR）的结合，趋化因子被分为两个主要的亚家族，CC和CXC。到目前为止人们已发现了超过50个人趋化因子和18个趋化因子受体。

许多癌症具有复杂的趋化因子网络，其影响肿瘤的免疫细胞浸润以及肿瘤细胞生长、存活、迁移和血管生成。免疫细胞、内皮细胞和肿瘤细胞自身表达趋化因子受体，并可以响应趋化因子梯度。人类癌症活检样本和小鼠癌症模型的研究表明癌细胞趋化因子受体的表达与转移能力的增加有关。来自不同癌症类型的恶性细胞具有不同的趋化因子受体表达谱，但是趋化因子受体4（CXCR4）是最常发现的。来自至少23种不同类型的上皮起源、间充质起源和造血起源的人类癌症的细胞表达CXCR4受体（Balkwill F.等人，2004）。

趋化因子受体4（也称为融合素、CD184、LESTR或HUMSTR）作为包含352个或360个氨基酸的两种同种型存在。残基Asn11是糖基化的，残基Tyr21是通过添加硫酸基团修饰的，Cys109和186通过二硫桥在受体的细胞外部分进行结合（Juarez J.等人，2004）。

该受体由不同类型的正常组织、天然的（

）、非记忆T细胞、调节性T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、初级单核细胞、树突细胞、自然杀伤（NK）细胞、CD34+造血干细胞表达，且在心脏、结肠、肝、肾和脑中以低水平表达。CXCR4在白细胞转运（trafficking）、B细胞淋巴细胞生成和髓细胞生成中起关键作用。

CXCR4受体在大量癌症中过表达，所述癌症包括但不限于淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、结肠癌（Ottaiano A.等人，2004）、乳癌（Kato M.等人，2003）、***癌（Sun Y.X.等人，2003）、肺癌（小细胞癌和非小细胞癌（Phillips R.J.等人，2003））、卵巢癌（Scotton C.J.等人，2002）、胰腺癌（Koshiba T.等人，2000）、肾癌、脑癌（Barbero S等人，2002）、成胶质细胞瘤和淋巴瘤。

迄今描述的CXCR4受体的唯一配体是***衍生因子-1（SDF-1）或CXCL12。SDF-1在***、骨髓、肝、肺中大量分泌，肾、脑和皮肤分泌程度更少。CXCR4也被拮抗趋化因子识别，该拮抗趋化因子是III型人疱疹病毒编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白II（vMIP-II）。

CXCR4/SDF-1轴在癌症中起关键作用，直接参与导致转移的迁移、侵入。实际上，癌细胞表达CXCR4受体，它们迁移并进入***循环。然后，癌细胞被滞留（arrested）在产生高水平SDF-1的器官中的血管床中，在那儿其增殖、诱导血管生成和形成转移性肿瘤（Murphy PM.,2001）。该轴也通过激活细胞外信号调节的激酶（ERK）途径（Barbero S.等人，2003）和血管生成（Romagnani P.,2004）参与细胞增殖。实际上，CXCR4受体及其配体SDF-1通过刺激VEGF-A表达显然地促进了血管生成，其转而增加了CXCR4/SDF-1的表达（Bachelder R.E.等人，2002）。还已知与肿瘤相关的巨噬细胞（TAM）聚集在肿瘤的缺氧区域，经刺激后与肿瘤细胞合作，并促进血管生成。据观察缺氧选择性地上调包括TAM的各种细胞类型中CXCR4的表达（Mantovani A.等人，2004）。最近证实CXCR4/SDF-1轴调节CXCR4+造血干细胞/祖细胞（HSC）的转运/归巢，可在新生血管形成中起作用。证据显示除了HSC之外，功能性CXCR4也在来自其它组织（组织定向干细胞=TCSC）的干细胞上表达，因此SDF-1可在器官/组织再生所需的化学引诱（chemottracting）CXCR4+TCSC中起关键作用，但是这些TCSC也可以是癌症发展的细胞起源（癌症干细胞理论）。对于人类白血病，和最近对于几种实体肿瘤，比如脑和***，证实了癌症的干细胞起源。存在几个可以衍生自正常CXCR4+组织/器官特异性干细胞的CXCR4+的肿瘤实例，比如白血病、脑肿瘤、小细胞肺癌、乳癌、肝胚细胞瘤、卵巢癌和***（Kucia M.等人，2005）。

使用针对CXCR4受体的单克隆抗体在体内证实了通过干扰CXCR4受体可以靶向癌症转移（Muller A.等人，2001）。简而言之，已表明针对CXCR4受体（单抗173R&D***）的单克隆抗体显著地减少了SCID小鼠中常位（orthotopic）乳癌模型（MDA-MB231）中***转移的数量。另一个研究（Phillips R.J等人，2003）使用抗SDF-1的多克隆抗体也显示SDF-1/CXCR4轴在常位肺癌模型（A549）的转移中起决定性作用，但是在该研究中，其对于肿瘤生长和血管生成都没有作用。几个其它研究也描述了使用CXCR4的siRNA双链体（Liang Z.等人，2005）生物稳定的CXCR4肽拮抗剂（Tamamura H.等人，2003）对体内转移的抑制，或使用CXCR4的小分子拮抗剂如AMD3100（Rubin J.B.等人，2003；De Falco V.等人，2007）或单抗（专利WO2004/059285A2）对体内肿瘤生长的抑制。因此，CXCR4是经验证的用于癌症的治疗靶。

也已经描述了能够指导与CXCR4的相互作用、从而抑制CXCR4激活的鼠单克隆抗体。通过如下干预发生这种抑制：i）在配体SDF-1的细胞膜上特异性结合受体CXCR4，ii）GTPγS的细胞膜上特异性结合受体CXCR4，iii）CXCR4介导的cAMP产生的调节，和iv）CXCR4受体介导的细胞内钙库调节的动员（参见，WO2010/037831）。

但是，这些抗体或siRNA都不能导致表达CXCR4的癌细胞的杀死。因而，仍存在癌症复发的风险，应当停止CXCR4的靶向治疗。因而，需要直接靶向表达CXCR4的细胞的制剂，其能够杀死所述表达CXCR4的细胞。

本发明涉及关于靶向CXCR4抗体的从未被鉴定的新型特性。

发明内容

事实上，本发明人已发现针对CXCR4的人或人源化抗体能够诱导针对表达CXCR4的细胞的效应功能，因此引发针对所述细胞的细胞毒性作用。

更具体地，本发明涉及诱导针对表达CXCR4的癌细胞的效应功能的方法。

如现有技术所述，转移性表达CXCR4的肿瘤的治疗涉及抑制迁移、侵入、增殖或血管生成，而非直接杀死表达CXCR4的细胞。与之截然相反的是，本发明涉及诱导引发表达CXCR4的靶细胞死亡的细胞毒性作用。具体而言，本发明提供人或人源化单克隆抗体，其能诱导针对表达CXCR4的癌细胞的一种或多种效应功能，从而实现杀死所述细胞。因此，本发明凭借人或人源化单克隆抗体通过诱导针对表达CXCR4的癌细胞的一种或多种效应功能，提供治疗癌症的方法。

在第一方面，本发明涉及使用结合CXCR4的人或人源化抗体，或其包含CH2的结合片段杀死表达CXCR4的癌细胞的方法；所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；其中所述方法包括在效应细胞或补体成分存在时诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能的步骤。

在另一方面，本发明涉及结合CXCR4的人或人源化抗体，或其包含CH2的结合片段；其中所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；通过在效应细胞或补体成分存在时诱导至少一种效应功能，制备用于杀死表达CXCR4的癌细胞的组合物中的用途。

在又一方面，本发明也涉及结合CXCR4的人或人源化抗体，或其包含CH2的结合片段；所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；通过在效应细胞或补体成分存在时诱导至少一种效应功能，用以杀死表达CXCR4的癌细胞。

更具体而言，本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法通过使用结合CXCR4的人或人源化抗体、或其包含CH2的结合片段杀死表达CXCR4的癌细胞；所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；其中所述方法包括在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能的步骤。

在另一方面，本发明涉及结合CXCR4的人或人源化抗体，或其包含CH2的结合片段；其中所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；通过在效应细胞或补体成分存在时诱导至少一种效应功能，以制备通过杀死表达CXCR4的癌细胞治疗癌症的组合物中的用途。

在又一方面，本发明还涉及结合CXCR4的人或人源化抗体，或其包含CH2的结合片段；所述人或人源化抗体包含重链可变结构域，重链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及包含轻链可变结构域，轻链可变结构域包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；通过在效应细胞或补体成分存在时诱导至少一种效应功能，通过杀死表达CXCR4的癌细胞用于治疗癌症。

本文所用术语“抗体”在最广泛意义上和特别地包括下述任何同种型（isotype）的单克隆抗体（包括全长单克隆抗体）：如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，多克隆抗体，多特异性抗体（multispecific antibodies），嵌合抗体和抗体片段。通过例如在噬菌体或类似载体中筛选重组抗体文库、或者使用抗原或编码抗原的核酸以免疫动物等重组方法，可生成与特异性抗原反应的抗体。

“多克隆抗体”是指存在一种或更多其它不同抗体或其间所产生的抗体。一般来说，存在若干产生不同抗体的其它B淋巴细胞时，由B淋巴细胞产生多克隆抗体。多克隆抗体通常通过经免疫的动物直接获得。

本文所用的“单克隆抗体”，是获自一群实质上均质性抗体（homogeneousantibodies）的抗体，即除去可以以小量存在的可能天然发生的突变之外，形成这个群体的抗体基本上相同。换言之，单克隆抗体由源于单一细胞克隆（例如杂交瘤、使用编码均质性抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、用编码均质性抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞等）生长的均质性抗体组成。这些抗体针对单一表位，因此是高度特异的。

“表位”是抗原上结合抗体的位点。它可以通过连续的残基形成，或者通过折叠抗原蛋白使不连续的残基极为靠近而形成。在暴露于变性溶剂时，由连续的氨基酸形成的表位通常得以保留，然而在所述暴露中，由不连续的氨基酸形成的表位通常丢失。

优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。

典型的抗体包含通过二硫键结合的两条相同重链和两条相同轻链。每个重和轻链都包含恒定区和可变区。每个可变区包含三个被称为“互补决定区”（“CDR”）或“超变区”的段，其主要负责与抗原的表位相结合。其通常按照从N端的顺序编号被称作CDR1、CDR2和CDR3(见Lefranc M.-P.,Immunology Today18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))。可变区中较为高度保守的部分被称作“框架区”。

如本文所用，“VH”或“VH”指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab’)2片段的重链。关于“VL”或“VL”指抗体的免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab’)2片段的轻链。

抗体恒定结构域不直接参与抗体与抗原结合，但显示各种效应功能。与免疫球蛋白不同分类相对应的重链恒定区分别命名为α、δ、ε、γ和μ。抗体或免疫球蛋白根据其重链的恒定区的氨基酸序列可被分成不同类，即，IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，这些中的几个可被进一步分成亚类（同种型），例如，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4；IgAl和IgA2(见W.E.Paul,编,1993,Fundamental Immunology,RavenPress，纽约，纽约)。

木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段称为Fab片段，每个具有单一的抗原结合位点和残留的“Fc”片段。虽然免疫球蛋白重链的Fc结构域的边界可变，但人IgG重链Fc结构域通常限定为：从根据EU索引（index）在铰链区Cys226或Pro230位置的氨基酸残基处延伸至其包含重链CH2和CH3结构域的羧基端(Edelman等人,The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulinmolecule,PNAS1969;63:78-85)。为清楚起见，此处应该指明：根据EU索引的Cys226/Pro230残基与在Kabat编号***（Kabat numbering system）的Cys239/Pro243残基、以及根据IMGT的铰链残基Cys11/Pro15相对应。

术语“铰链区”一般定义为从人IgG1的Glu216至Pro230的延伸(Burton,MolImmunol,22:161-206,1985)。通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同位置，可将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列相比对。人IgGFc部分的“CH2结构域”(也被称作“Cγ2”结构域)通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。所述CH2结构域独特之处在于其与另一结构域并不紧密配对。而是两个N-连接的分支糖链被***至完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，糖可提供结构域-结构域配对的替代，帮助稳定CH2结构域(Burton,MoIImmunol,22:161-206,1985)。“CH3结构域”包括在Fc部分C端残基至CH2结构域的延伸（即，从IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447）。

包含单克隆抗体的IgG免疫球蛋白已经被证明在每个重链的恒定区为N糖基化的。其在其两条重链的每一条的CH2结构域上的Asn297上都含有单一的N连接的聚糖。如本文所用术语“N聚糖”指例如通过天冬酰胺-N-乙酰氨基葡萄糖连接附着至多肽的天冬酰胺残基的N连接的寡糖。N聚糖有共同的Man₃GlcNAc₂的戊多糖核心（“Man”指甘露糖；“Glc”指葡萄糖；和“NAc”指N乙酰基；GlcNAc指的是N乙酰氨基葡萄糖）。

N聚糖的区别在于附着至Man3核心结构的含有外周糖（peripheral sugars）（例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸）的分支(天线)的数目和性质（nature）。N聚糖根据其分支成分（例如高甘露糖、复合的或杂合的）进行分类。“复合，双天线”型N聚糖通常具有附着至1,3甘露糖分支的至少一个GlcNAc和附着至三甘露糖（trimannose）核心的1,6甘露糖分支的至少一个GlcNAc。复合双天线N聚糖也可具有包含“二分（bisecting）”GlcNAc和核心岩藻糖("Fuc")的链内置换。“二分GlcNAc”为附着至成熟核心糖结构的β-1,4-甘露糖的GlcNAc残基。

复合双天线N聚糖也可具有以唾液酸可选地修饰的半乳糖("Gal")残基。唾液酸添加至寡糖链由唾液酸转移酶催化，但需要由半乳糖基转移酶之前将一个或多个半乳糖残基附着至末端N乙酰氨基葡萄糖。根据本发明的“唾液酸”包括5-N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)和5-羟乙酰神经氨酸(NeuNGc)。

寡糖可含有0个(G0)、一个(G1)或两个(G2)半乳糖残基，以及附着至或没有附着至第一个GlcNac的一个岩藻糖。这些形式（forms）分别记为G0/G0F、G2/G2F、G1/G1F（见Theillaud的图1,Expert Opin Biol Ther.,增刊1:S15-S27,2005）。换言之，当寡糖链的两臂都含有半乳糖残基时，每摩尔重链的最大摩尔半乳糖是2，当核心被岩藻糖基化（fucosylated）时所述结构被称作G2F，当核心不是岩藻糖基化时所述结构被称作G2。当一条臂具有末端半乳糖时，所述结构根据其是否被岩藻糖基化而被称作G1F或G1，当没有末端半乳糖时，所述结构分别被称作G0F或G0。

因此，分泌的IgG免疫球蛋白为显示出糖残基岩藻糖、半乳糖、唾液酸和二分N-乙酰氨基葡萄糖的可变添加的糖型（glycoforms）的异质性混合物。

Fc结构域在决定免疫球蛋白的生物学功能当中是重要的，这些生物学功能称为“效应功能”。这些Fc结构域-介导的活性是通过免疫效应细胞介导的，如杀伤细胞、自然杀伤细胞和激活的巨噬细胞、或各种补体成分。这些效应功能涉及通过抗体的Fc结构域结合至所述受体或补体成分以激活所述效应细胞表面上的受体。

表述“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞细胞毒性”或“ADCC”指细胞毒性的形式，其中Ig结合至存在于某些细胞毒性效应细胞上的Fc受体(FcR)，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至带有抗原的靶细胞，并随后用细胞毒素杀死靶细胞。靶细胞的裂解是细胞外的，需要直接的细胞-细胞接触，并且不涉及补体。

细胞破坏（destruction）可通过例如裂解或吞噬作用发生。“细胞毒性效应细胞”为表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞（PBMC）、自然杀伤（NK）细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优选的。效应细胞可从其天然来源如从血液或PBMC中得以分离。能够通过裂解方式破坏细胞的细胞毒性效应细胞包括，例如自然杀伤（NK）细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。

在各种人免疫球蛋白分类中，人IgGl和IgG3比IgG2和IgG4更有效地介导ADCC。

有利地是，本发明的人或人源化抗体或其包含CH2的片段，能够通过诱导抗体依赖的细胞细胞毒性（ADCC）杀死表达CXCR4的癌细胞。

因此，在本发明方法的第一优选的实施方案中，所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)组成。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)组成。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)组成。

作为非限定性实例，可以提到下列用于评估或体外定量ADCC的方法：使用碘化丙啶(propidium iodide，PI)或钙黄绿素（calcein）的血细胞计数，⁵¹Cr或荧光染料例如钙黄绿素-AM、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein succinimidylester，CFSE）、2’,7’-二-(2羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素(BCECF)或铕（Europium），或通过测量如乳酸脱氢酶（LDH）的胞质酶或ATP的释放。这些方法为本领域技术人员所熟知（见，例如Jiang等人,“Advances in the assessment and control of theeffector functions of therapeutic antibodies”,Nat Rev Drug Discov.,10:101-110,2011,和其参考文献），不需在此进一步详述。

通过“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”，它在本文指这样一种机制，其凭借特异性抗体结合至细胞表面的抗原，经一系列包含血液中补体相关蛋白组的级联（补体激活途经）触发补体激活，导致靶细胞裂解。此外，通过激活补体生成的蛋白片段可诱导免疫细胞的迁移和激活。补体依赖的细胞毒性（CDC）激活的第一步在于C1q蛋白结合至抗体的至少两个Fc结构域。“C1q”是包含免疫球蛋白Fc区的结合位点的多肽。C1q与两个丝氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成复合物C1，其为补体依赖的细胞毒性（CDC）途经的第一个成分。

在本发明的另一有利的实施方案中，人或人源化抗体或其包含CH2的片段，通过诱导补体依赖的细胞毒性（CDC）能够杀死表达CXCR4的癌细胞。

因此，本发明也涉及上述方法，其中效应功能由补体依赖的细胞毒性（CDC）组成。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述效应功能由补体依赖的细胞毒性（CDC）组成。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述效应功能由补体依赖的细胞毒性（CDC）组成。

有核细胞的细胞毒性根据CDC可通过几种方法在体外定量，例如：台盼蓝排除法、使用碘化丙啶（PI）的流式细胞术、⁵¹Cr释放、四唑盐MTT的还原、氧化还原染料Alamar蓝（redox dye Alamar blue）、细胞内ATP的流失、CellTiter-Glo、LDH释放或钙黄绿素-AM释放。这些方法为本领域技术人员所熟知（见，例如Jiang等人,“Advances in the assessment and control of the effector functions of therapeuticantibodies”,Nat Rev Drug Discov.,10:101-110,2011,和其参考文献），不需在此进一步详述。

在本发明的进一步有利的实施方案中，抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性（CDC）两者都被诱导，即人或人源化抗体或其包含CH2的片段通过诱导抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)两者能够杀死表达CXCR4的癌细胞。

在优选的实施方案中，本发明方法的效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性（CDC）组成。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性（CDC）组成。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)和抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)组成。

抗体的这两个效应功能直接关联抗体Fc部分与免疫细胞表面上特异性受体的结合，对于ADCC基本上为NK细胞、巨噬细胞、单核细胞上表达的FcγRIIIa(也称为FcγRIIIA)和FcγRIIa(也称为FcγRIIA)，以及对于CDC为补体级联蛋白C1q。

抗体的Fc部分和FcγR以及C1q之间的精确相互作用已经被精确作图，涉及这种相互作用的主要Fc结构域与CH2结构域相对应。Fc部分和Fc受体之间的亲和性直接关联至所触发的免疫反应的程度。

如上所述，针对CXCR4的人或人源化抗体能够诱导针对表达CXCR4的细胞的效应功能，因此导致针对所述细胞的细胞毒性作用。很显然，效应功能的诱导越高，针对表达CXCR4的细胞的细胞毒性作用就越强。虽然某些抗体可表现天然升高的ADCC和/或CDC活性，在其它情况下可能有必要去工程化针对CXCR4的人或人源化抗体以提高抗体免疫反应以及更具体地为ADCC和/或CDC。这样经工程化的抗体也包括在本发明的范围内。

有几种方式去工程化和去提高抗体免疫反应以及更具体地为ADCC和/或CDC，其中的大多数对ADCC而言基于直接增加Fc部分与同源FcγR的结合。主要目标为增加与人FcγRa和人FcγRIIa的结合，并降低与人FcγRIIb（降低免疫反应的抑制受体）的结合。可通过在Fc部分内突变个别氨基酸残基或者通过修饰连接至CH2结构域天冬酰胺297的聚糖部分（moiety）以增加岩聚糖基化聚糖部分实现这个目标。可以例如通过关闭(siRNA,KO,等;Toyohide Shinkawa等人,Theabsence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine ofhuman IgG1complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancingantibody-dependent cellular cytotoxicity.J.Biol.Chem2003;278:3466–3473)产生抗体的宿主细胞上的FUT8基因，或者产生抗体的细胞上过表达GlcNAc III转移酶(见例如Pablo Umana等人,Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1withoptimized antibody-dependent cellular cytotoxicity activity.Nat Biotechnol 1999;17:176-180)实现糖工程化（Glycoengineering）。

通过在抗体的恒定结构域产生单一或多个置换可获得这样的抗体，并因此增加其与Fc受体的相互作用。设计这样突变的方法可见于例如Lazar等人(2006,PNAS,103(11):4005-4010)和Okazaki等人(2004,J.MoI.Biol.336(5):1239-49)。

还可能使用经专门工程化的细胞系用于产生改良的抗体。特别地，这些系已经改变糖基化途经的调节，从而导致抗体岩藻糖基化不足或者甚至完全去岩藻糖基化。这样的细胞系和用于其工程化的方法公开于例如Shinkawa等人(2003,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473)、Ferrara等人(Biotechnol.Bioeng.93(5):851-61)。

增加ADCC的其它方法也已描述在Li等人(2006,Nat Biotechnol.24(2):210-5)、Stavenhagen等人(2008,Advan.Enzyme Regul.48:152-164)、Shields等人(2001,J.Biol.Chem.,276(9):6591-6604)；和WO2008/006554。

增加CDC的方法已经描述于Idusogie等人(2001,J Immunol.166(4):2571-5)、Dall'Acqua等人(2006,J Immunol,177(2):1129-38)、Michaelsen等人(1990,Scand JImmunol,32(5):517-28)、Brekke等人(1993,Mol Immunol,30(16):1419-25)、Tan等人(1990,Proc;Natl.Acad.Sci.USA,87:162-166)和Norderhaug等人(1991,Eur JImmunol,21(10):2379-84)。

一个详细描述的技术是Kyowa开发的补体技术（Complement technology），其在于产生具有增强的CDC的嵌合人IgG1/IgG3Fc部分（见例如WO2007/011041）。

描述用于增加ADCC和CDC的方法的参考文献包括Natsume等人(2008,Cancer Res.68(10):3863-3872)。这些参考文献的每个的公开通过交叉引用包括在本文中。

这对本领域技术人员是显而易见的，因为增强的ADCC和/或CDC将引发杀死表达CXCR4的癌性细胞，所以其在癌症治疗领域特别受关注，因此其将明确限制癌症复发的风险，CXCR4靶向的治疗应该被停止。

通过表述“包含CH2的结合片段”，其应该理解为包含母体抗体的6个CDR的抗体的任何片段或部分以及至少CH2结构域，其已知负责诱导效应功能。在最优选的实施方案中，CH2必须是二聚的，也就是说其包含CH2的两个拷贝。

在另一实施方案中，所述包含CH2的结合片段包括母体抗体的6个CDR和至少CH2以及铰链结构域。

在又一实施方案中，所述包含CH2的结合片段包括母体抗体的6个CDR和至少CH1、铰链和CH2结构域。

在另一实施方案中，所述包含CH2的结合片段包括母体抗体的6个CDR和至少CH1和CH2结构域。

在又一实施方案中，所述包含CH2的结合片段包括母体抗体的6个CDR和至少CH1、CH2和CH3结构域。

在还一实施方案中，所述包含CH2的结合片段包括母体抗体的6个CDR和至少CH1、铰链、CH2和CH3结构域，即全长Fc。

更优选地，本发明包含通过遗传重组或化学合成获得的人源化抗体，其包含CH2的结合片段。

根据优选的实施方案，根据本发明的人或人源化抗体特征在于其由单克隆抗体组成。

换言之，本发明的方法包括人或人源化抗体，或包含CH2的结合片段的用途，其根据IMGT包含含有下列三个CDR的重链，分别为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中：

-CDR-H1包含序列SEQ ID No.1，或与序列SEQ ID No.1经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

-CDR-H2包含序列SEQ ID No.2，或与序列SEQ ID No.2经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和

-CDR-H3包含序列SEQ ID No.3，或与序列SEQ ID No.3经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。

甚至更优选，本发明的方法包括人或人源化抗体，或包含CH2的结合片段的用途，其根据IMGT包含含有下列三个CDR的轻链，分别为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：

-CDR-L1包含序列SEQ ID No.4，或与序列SEQ ID No.4经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

-CDR-L2包含序列SEQ ID No.5，或与序列SEQ ID No.5经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；和

-CDR-L3包含序列SEQ ID No.6，或与序列SEQ ID No.6经最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。

在本发明的描述中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”可互换。

无论抗原受体、链类型或物种如何，IMGT唯一的编号已限定为比较可变结构域（Lefranc M.-P.,Immunology Today18,509(1997)/Lefranc M.-P.,TheImmunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)）。在IMGT唯一编号中，保守性氨基酸总是具有相同位置，例如半胱氨酸23（第一个CYS）、色氨酸41（保守性TRP）、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104（第二个CYS）、苯丙氨酸或色氨酸118（J-PHE或J-TRP）。所述IMGT唯一编号提供了框架区（FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128）和互补决定区（CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117）的标准化定界。由于空位（gap）代表未占用的位置，CDR-IMGT长度（在括号之间显示，并用点分开，例如[8.8.13]）成为决定性的信息。在2D图解的图表中使用IMGT唯一编号，命名为IMGT Colliersde Perles（Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.和Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)），以及在IMGT/3D结构DB中的3D结构中使用IMGT唯一编号（Kaas,Q.,Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.,T cellreceptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)）。

在本发明的意义上，两条核酸或氨基酸序列之间的“百分比同一性”指两条进行比较的序列之间在最佳比对后获得的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比是纯粹统计学上的，并且两条序列之间的差异沿其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列之间的比较传统上在已对其进行最佳比对后通过比较序列而进行，所述比较能够分段进行或使用“比对窗口”进行。用于比较的序列的最佳比对，除手工比较之外，可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)（Ad.App.Math.2：482）、通过Neddleman和Wunsch的局部同源性算法(1970)（J.Mol.Biol.48:443）、通过Pearson和Lipman的相似性搜索法(1988)（Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444）或通过使用这些算法的计算机软件（威斯康星遗传学软件包，遗传学计算机组，575Science Dr.,Madison,WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或通过比较软件BLAST NR或BLAST P）进行。

通过比较两条最佳比对的序列确定两条核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性，其中与用于两条序列之间最佳比对的参考序列相比，待比较的核酸或氨基酸序列可具有添加或缺失。通过如下方法计算百分比同一性：确定两条序列优选两条全序列之间相同氨基酸核苷酸或残基的位置数目，将相同位置的数目除以在比对窗口中的位置总数，并将结果乘以100以获得两条序列之间的百分比同一性。

例如，从网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上可获得的BLAST程序“BLAST2序列”（Tatusova等人，“Blast2sequences-a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol，1999，Lett.174：247-250），可以与缺省参数一起使用（特别是参数“开放空位罚分”：5，和“延伸空位罚分”：2；所选的矩阵是例如程序建议的“BLOSUM62”矩阵）；直接通过所述程序计算两条待比较序列之间的百分比同一性。

对于显示出与参考氨基酸序列具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列而言，优选的实例包括包含参考序列，某些修饰，特别是至少一个氨基酸的缺失、添加或置换，截短或延伸的那些。在置换一个或多个连续或不连续氨基酸的情况下，优选其中被置换的氨基酸被“等同的”氨基酸所取代的置换。在此，表述“等同的氨基酸”指可能被结构性氨基酸之一所置换的，然而并未改变相应抗体的生物活性的任何氨基酸和下述限定的那些具体实例。

等同氨基酸可根据其与被置换氨基酸的结构同源性或根据可能产生的各种抗体之间生物活性的比较性测试结果而确定。

作为非限制性实例，下表1概述可进行的却没有引起相应经修饰的抗体的生物活性发生显著改变的可能置换；在相同条件下，反向置换自然是可能的。

表1

原始残基	置换
		Ala(A)	Val,Gly,Pro
Arg(R)	Lys,His
		Asn(N)	Gln
Asp(D)	Glu
		Cys(C)	Ser
Gln(Q)	Asn
		Glu(E)	Asp
Gly(G)	Ala
		His(H)	Arg
Ile(I)	Leu
		Leu(L)	Ile,Val,Met
Lys(K)	Arg
		Met(M)	Leu
Phe(F)	Tyr
		Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr,Cys
		Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr
		Tyr(Y)	Phe,Trp
Val(V)	Leu,Ala

本领域技术人员已知，在本领域的现状下，发现六个CDR之间的最大可变性（长度和组成）位于三个重链CDR上，更具体地位于这个重链的CDR-H3上。因此，显然本发明抗体或其衍生化合物或功能片段之一的优选特征性CDR将为重链的三个CDR。

本发明另一个实施方案公开人或人源化抗体、或包含CH2的结合片段的用途，其包括：

包含下列三个CDR的重链：

CDR-H1，其序列为SEQ ID No.1，或与序列SEQ ID No.1在最佳比对之后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

CDR-H2，其序列为SEQ ID No.2，或与序列SEQ ID No.2在最佳比对之后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

CDR-H3，其序列为SEQ ID No.3，或与序列SEQ ID No.3在最佳比对之后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

以及包含下列三个CDR的轻链：

CDR-L1，其序列为SEQ ID No.4，或与序列SEQ ID No.4在最佳比对之后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

CDR-L2，其序列为SEQ ID No.5，或与序列SEQ ID No.5在最佳比对之后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列；

CDR-L3，其序列为SEQ ID No.6，或与序列SEQ ID No.6在最佳比对之后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。

为更清楚起见，下表2a概述与本发明的抗体hz515H7的CDR相对应的各种氨基酸序列；然而，表2b概述与本发明的人源化抗体的各种变体的可变结构域和全长序列相对应的各种氨基酸序列。

表2a

表2b

作为实例，为避免疑问，表述“VH1”相似于表述“VH变体1”（“VH Variant1”）、“VH变体1”（“VH variant1”）、“VH Var1”或“VH var1”。

此处可以提到：本发明所用的抗体获自鼠杂交瘤产生的鼠抗体的人源化，所述鼠杂交瘤已于2008年6月25日以编号I-4019提交至法国微生物培养物中心（CNCM，法国，巴黎，巴斯德研究所）。通过将Balb/C免疫接种的小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/O-Ag14系的细胞相融合获得所述杂交瘤。

在此处称为515H7的鼠单克隆抗体由2008年6月25日以编号I-4019提交至CNCM的杂交瘤所分泌。

在优选的实施方案中，用于本发明方法的抗体为人源化抗体。

如本文所用，术语“人源化抗体”指含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。如本文所用的“嵌合抗体”为恒定区或其部分被改变、取代或更换的抗体，所以可变区连接至不同物种的、或属于另一抗体类或亚类的恒定区。“嵌合抗体”也指可变区或其部分被改变、取代或更换的抗体，所以恒定区连接至不同物种的、或属于另一抗体类或亚类的可变区。

在某些实施方案中，抗体的可变区和恒定区两者、或抗原结合片段、变体、或其衍生物是完全人的。完全人抗体可使用本领域已知的技术来制成。例如，通过将抗原施用至转基因动物可制备针对特异性抗原的完全人抗体，所述转基因动物已经过改造以产生响应抗原挑战的这样的抗体，其內源基因座已被失活。可用于制作这样抗体的示例性技术描述在美国专利:6,150,584;6,458,592;6,420,140。其它技术是本领域已知的。通过各种展示技术，例如噬菌体展示或其它病毒展示***，同样可产生完全人抗体。还参见美国专利No.4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；和国际专利申请公布号WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741(所述参考文献以其全文通过引用并入)。

如本文所用的“人源化抗体”，指包含源自非人源的抗体的CDR区、源自一个（或几个）人抗体的抗体分子其它部分的抗体。此外，可改变某些骨架段的残基（称作FR）以保持结合亲和性（Jones等人,Nature,321:522-525,1986;Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988;Riechmann等人,Nature,332:323-327,1988）。

人源化的目标是减少如鼠抗体等异种抗体在引入人中的免疫原性，同时维持抗体的完全抗原结合亲和性和特异性。可通过本领域技术人员已知的技术制备本发明的人源化抗体或其片段(例如，如那些描述见于Singer等人,J.Immun.,150:2844-2857,1992;Mountain等人,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,10:1-142,1992;和Bebbington等人,Bio/Technology,10:169-175,1992)。这样的人源化抗体优选其用于涉及体外诊断或体内预防的和/或治疗性治疗的方法。其它人源化技术也为本领域技术人员所知，例如如“CDR嫁接”（CDR grafting）技术由PDL描述于专利EP0451261、EP0682040、EP0939127、EP0566647或US5,530,101、US6,180,370、US5,585,089和US5,693,761。也可引用美国专利5,639,641或6,054,297、5,886,152和5,877,293。

引申开来，在本说明书的情况下，嵌合抗体c151H7将包含在表述“人源化抗体”内。更具体而言，c515H7特征在于其包含序列SEQ ID No.70（与核苷酸SEQID No.72相对应）的重链和序列SEQ ID No.71（与核苷酸SEQ ID No.73相对应）的轻链。

本发明涉及起源于上述鼠抗体515H7的人源化抗体，所述抗体由其重和/或轻链可变结构域的序列所限定。的确，所有本文描述的人源化抗体可用在本发明的方法中，即其通过在效应细胞或补体成分存在时诱导至少一种效应功能可用于杀死表达CXCR4的癌细胞，或者其经由在效应细胞或补体成分存在时诱导至少一种效应功能通过杀死表达CXCR4的癌细胞以用于治疗癌症。

在本发明方法的优选实施方案中，人或人源化抗体由包含选自序列SEQ ID No.7至10的重链可变结构域和选自序列SEQ ID No.11至17的轻链可变结构域的人源化抗体所组成。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述人或人源化抗体由包含选自序列SEQ ID No.7至10的重链可变结构域和选自序列SEQ ID No.11至17的轻链可变结构域的人源化抗体所组成。

再换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于其由包含选自序列SEQ IDNo.7至10的重链可变结构域和选自序列SEQ ID No.11至17的轻链可变结构域的人源化抗体所组成。

根据本发明的优选的人源化抗体由包含序列SEQ ID No.8的重链可变结构域和选自序列SEQ ID No.11至17的轻链可变结构域的人源化抗体所组成。

根据本发明的又一优选的人源化抗体由包含选自序列SEQ ID No.7至10的重链可变结构域和序列SEQ ID No.13的轻链可变结构域的人源化抗体所组成。

本发明也涉及起源于上述鼠抗体515H7的人源化抗体，所述抗体由其全长重和/或轻链的序列所限定。

在本发明方法的优选的实施方案中，人或人源化抗体由包含选自序列SEQ IDNo.18至21的重链和选自序列SEQ ID No.22至28的轻链的人源化抗体所组成。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述人或人源化抗体由包含选自序列SEQ ID No.18至21的重链和选自序列SEQ ID No.22至28的轻链的人源化抗体所组成。

再换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于其由包含选自序列SEQ IDNo.18至21的重链和选自序列SEQ ID No.22至28的轻链的人源化抗体所组成。

根据本发明的优选的人源化抗体由包含序列SEQ ID No.19的重链和/或选自序列SEQ ID No.22至28的轻链的人源化抗体所组成。

根据本发明的另一优选的人源化抗体由包含选自序列SEQ ID No.18至21的重链和/或序列SEQ ID No.24的轻链的人源化抗体所组成。

在优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1D76N VL2或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.8的重链可变区和序列SEQ ID No.13的轻链可变区。

在另一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1D76N VL2或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.19的重链和序列SEQ ID No.24的轻链。

在又一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1D76N VL2.1或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.8的重链可变区和序列SEQID No.14的轻链可变区。

在再一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1D76N VL2.1或其衍生化合物或功能片段，包含序列SEQ ID No.19的重链和序列SEQ ID No.25的轻链。

在另一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1D76N VL2.2或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.8的重链可变区和序列SEQID No.15的轻链可变区。

在又一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1D76N VL2.2或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.19的重链和序列SEQ ID No.26的轻链。

在另一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1D76N VL2.3或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.8的重链可变区和序列SEQID No.16的轻链可变区。

在又一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1D76N VL2.3或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.19的重链和序列SEQ ID No.27的轻链。

在另一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1V48L D76NVL1或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.9的重链可变区和序列SEQ ID No.11的轻链可变区。

在又一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1V48L D76NVL1或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.20的重链和序列SEQ IDNo.22的轻链。

在另一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1V48L D76NVL1 T59A E61D或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.9的重链可变区和序列SEQ ID No.12的轻链可变区。

在又一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1V48L D76NVL1 T59A E61D或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.20的重链和序列SEQ ID No.23的轻链。

在另一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7 VH1 VL1或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.7的重链可变区和序列SEQ ID No.11的轻链可变区。

在又一优选的实施方案中，本发明涉及人源化抗体Hz515H7VH1VL1或其衍生化合物或功能片段，其包含序列SEQ ID No.18的重链和序列SEQ ID No.22的轻链。

应当理解，上述示例性的VH/VL组合并非限制性的。本领域技术人员当然可以无需过度负担以及无需应用创造***地重排在本说明书中公开的所有VH和VL。

在本发明方法更优选的实施方案中，所述人或人源化抗体由包含序列SEQ IDNo.8的重链可变结构域和序列SEQ ID No.13的轻链可变结构域的人源化抗体所组成。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述人或人源化抗体由包含序列SEQ IDNo.8的重链可变结构域和序列SEQ ID No.13的轻链可变结构域的人源化抗体所组成。

再换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于其由包含序列SEQ ID No.8的重链可变结构域和序列SEQ ID No.13的轻链可变结构域的人源化抗体所组成。

对于上述不同序列，优选的抗体（而不是唯一）也将由其全长重和轻链序列的序列所描述。

在本发明方法更优选的实施方案中，人或人源化抗体由包含序列SEQ ID No.19的重链和序列SEQ ID No.24的轻链的人源化抗体所组成。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述人或人源化抗体由包含序列SEQ IDNo.19的重链和序列SEQ ID No.24的轻链的人源化抗体所组成。

再换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于其由包含序列SEQ ID No.19的重链和序列SEQ ID No.24的轻链的人源化抗体所组成。

对本领域技术人员将是显而易见的：本发明的抗体必须显示出表现效应功能所必须的结构元件。更具体而言，抗体必须是允许ADCC和/或CDC的合适同种型。例如，已知在各种人免疫球蛋白类中，人IgGl和IgG3比IgG2和IgG4更有效地介导ADCC。在另一方面，对于CDC的效能（potency）的顺序为：IgG3≥IgG1>>IgG2≈IgG4(Niwa等人,J Immunol Methods,306:151–160,2005)。

在本发明方法的优选的实施方案中，所述人或人源化抗体是IgG1同种型。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述人或人源化抗体是IgG1同种型。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于其是IgG1同种型。

在具体的实施方案中，本发明涉及由IgG1Hz515H7VH1D76N VL2组成的本发明优选的抗体的包含CH2的结合片段。

更具体地，优选的包含CH2的结合片段由包含如下的片段组成：i)包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变结构域；ii)包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变结构域；和iii)至少含有序列SEQ ID No.60的CH2结构域。

在本发明方法的优选实施方案中，包含CH2的结合片段由包含如下的片段组成：分别含有SEQ ID No.1、2和3的三个重链CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；分别含有SEQ ID No.4、5和6的三个轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和至少含有SEQ ID No.60的CH2结构域。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述包含CH2的结合片段由包含如下的片段组成：分别含有SEQ ID No.1、2和3的三个重链CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；分别含有SEQ ID No.4、5和6的三个轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和至少含有SEQ ID No.60的CH2结构域。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述包含CH2的结合片段由包含如下的片段组成：分别含有SEQ ID No.1、2和3的三个重链CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；分别含有SEQ ID No.4、5和6的三个轻链CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和至少含有SEQ ID No.60的CH2结构域。

另一优选的包含CH2的结合片段由包含如下的片段组成：i)包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变结构域；ii)包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变结构域；iii)至少含有序列SEQ ID No.60的CH2结构域；和iv)至少含有序列SEQ ID No.61的铰链结构域。

又一优选的包含CH2的结合片段由包含如下的片段组成：i)包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变结构域；ii)包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变结构域；iii)至少含有序列SEQ ID No.60的CH2结构域；iv)至少含有序列SEQ ID No.61的铰链结构域；和v)至少含有序列SEQ ID No.62的CH1结构域。

再一优选的包含CH2的结合片段由包含如下的片段组成：i)包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变结构域；ii)包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变结构域；iii)至少含有序列SEQ ID No.60的CH2结构域；iv)至少含有序列SEQ ID No.61的铰链结构域；v)至少含有序列SEQ ID No.62的CH1结构域；和vi)至少含有序列SEQ ID No.63的CH3结构域。

在本发明的又一优选的实施方案中，优选的包含CH2的结合片段由包含如下的片段组成：i)包含分别含有序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变结构域；ii)包含分别含有序列SEQ ID No.4、5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变结构域；和iii)至少含有序列SEQ ID No.64的全长Fc结构域。

为更清楚起见，下表3说明抗体Hz515H7VH1D76N VL2的每个结构域的序列。

表3

基于这些元件，本领域技术人员将清楚地生成源自在本申请中所描述的任何序列的任何包含CH2的结合片段，而无需任何过度实验。因而，任何其它包含CH2的结合片段必须视为本申请范围的部分。

下表4a概述与本发明的抗体hz515H7的CDR相对应的优化的核苷酸序列；而表4b概述与本发明的人源化抗体的各种变体的可变结构域和全长序列相对应的各种优化的核苷酸序列。

表4a

表4b

表述“优化的序列”表示编码构成目标蛋白（本文为抗体可变结构域）的氨基酸的密码子已被改变以在指定细胞类型中（此处为哺乳动物细胞）可被翻译机制更好地识别。的确，本领域技术人员已知：取决于用于表达的基因和细胞的来源，密码子优化可有助于增加本发明编码的多肽的表达。通过“密码子优化”，它被称作对本发明多肽的编码序列的改变，其改善用在宿主细胞中的密码子的序列。用于比如例如CHO细胞的哺乳动物细胞以及各种其它生物体的密码子使用表是本领域已知的。此外，优化还可通过改变多核苷酸序列来实现，其包括G/C含量调整和防止稳定的RNA二级结构（参见作为实例的Kim等人，1997Gene199(1-2):293-301）。

术语“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本说明书中可互换地使用，指修饰或未修饰的核苷酸的精确序列，其限定核酸的片段或区域，其包含或不包含非天然核苷酸，以及其是双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物。

本发明的核序列已全部得到分离和/或纯化，即它们是直接或间接取样的，例如通过拷贝，其环境至少已部分改变。“显示出与优选序列在最佳比对后具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%的百分比同一性的核序列”，指核序列相对参考核序列显示某些修饰，例如特别是删除、截短、延伸、嵌合融合和/或置换，尤其是定点的（punctual）。优选地，这些为编码与参考序列相同氨基酸序列的序列，这与遗传密码子的简并性相关，或是可能与参考序列特异性杂交（优选在高度严谨条件下）的互补性序列，尤其为下列所限定的那些。

在高度严谨条件下杂交指以这样的方式选择涉及温度和离子强度的条件使得其允许杂交维持在两条互补性DNA片段之间。基于纯粹解释的基础上，为了限定如上所述多核苷酸片段的目的，杂交步骤的高度严谨条件有利地为如下。

DNA-DNA或DNA-RNA杂交以两个步骤进行：（1）在42℃在磷酸盐缓冲液（20mM，pH7.5）中预杂交3小时，所述磷酸缓冲液包含5×SSC（1×SSC相当于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠的溶液）、50%甲酰胺、7%十二烷基磺酸钠（SDS）、10×Denhardt’s、5%硫酸葡聚糖和1%鲑精DNA；（2）初步杂交20小时于取决于探针长度的温度（即，对于＞100个核苷酸长的探针为42℃），接着在20℃下在2×SSC+2%SDS中洗涤2次，每次20分钟，在20℃下在0.1×SSC+0.1%SDS中洗涤一次20分钟。对于＞100个核苷酸长的探针，最后的洗涤为在60℃下，在0.1×SSC+0.1%SDS中进行30分钟。上述对于确定尺寸的多核苷酸的高度严谨性杂交条件可由本领域技术人员根据Sambrook等人（Molecularcloning：a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory；第3版，2001）描述的程序对较长或较短的寡核苷酸进行调整。

为表达本发明的人或人源化抗体的重和/或轻链，或其包含CH2的结合片段，将编码所述重和/或轻链的多核苷酸***至表达载体中，使得所述基因可操作连接至转录和翻译控制序列。

“可操作连接的”序列包括与目标基因相邻的表达控制序列、以及通过反式和远处作用以控制目标基因的表达控制序列两者。本文所用术语“表达控制序列”指多核苷酸序列，其对引起其所连接至的编码序列的表达和加工是必要的。表达控制序列包括恰当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的RNA加工信号，例如剪切和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（即Kozak共有序列）；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时增强蛋白分泌的序列。这样的控制序列的性质根据宿主生物体的不同而不同；在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，这样的控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在以最低程度包括其存在对表达和加工必不可少的所有成分，以及也可包括其存在为有利的附加成分，例如前导序列（leader sequence）和融合配偶体序列（fusion partnersequence）。

本文所用的术语“载体”，旨在指能够运输其所连接的另一核酸的核酸分子。载体中的一种类型是“质粒”，其指附加DNA段可被连接其中的环状双链DNA环。载体的另一类型是病毒载体，其中附加DNA段可被连接至病毒基因组中。某些载体在其所引入的宿主细胞中能够自发地复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型（episomal）哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）可通过引入至宿主细胞得以整合至宿主细胞的基因组内，因此同宿主基因组一起复制。

某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文中称作“重组表达载体”（或简称“表达载体”）。一般来说，在重组DNA技术中应用的表达载体为质粒的形式。在本说明书中，因为质粒是最常用的载体形式，所以“质粒”和“载体”可互换使用。然而，本发明意欲包括这样的表达载体形式，例如细菌质粒、YAC、粘粒、逆转录病毒、EBV-衍生的游离体（episome）、和技术人员将方便知道的用于确保本发明抗体的重和/或轻链表达的全部其它载体。技术人员将认识到可将编码重和轻链的多核苷酸克隆至不同载体或相同载体中。在优选的实施方案中，将所述多核苷酸克隆至相同载体中。

除抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可携带附加的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列（如复制起点）和可选的标记基因。可选的标记基因有助于筛选载体被引入的宿主细胞（见，例如U.S.专利No.4,399,216、4,634.665和5,179,017）。例如，在载体已被引入的宿主细胞中，可选的标记基因通常给予抗药性，例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。优选的可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因（用于在dhfr宿主细胞中使用氨甲蝶呤筛选/扩增）和neo基因（用于G418筛选）。根据本发明可使用一些筛选***，包括但不限于分别在tk、hgprt或aprt细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,Cell11:223,1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska等人,Proc Natl Acad Sci USA48:202,1992)、在蛋氨酸砜(酰)亚胺（methionine sulfoximide）存在下的谷氨酸合成酶的筛选(Adv Drug Del Rev,58:671,2006,和Lonza Group Ltd的网站或文献)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,Cell22:817,1980)基因。抗代谢物抗性也可用作下列基因筛选的依据：给予氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler等人,Proc Natl Acad Sci USA77:357,1980)；给予霉酚酸抗性的gpt(Mulligan等人,Proc Natl Acad Sci USA78:2072,1981)；给予氨基糖苷G-418抗性的neo(Wu等人,Biotherapy3:87,1991)；和给予潮霉素抗性的hygro(Santerre等人,Gene30:147,1984)。本领域已知的重组DNA技术的方法可常规使用以筛选所需的重组克隆，这样的方法描述于例如Ausubel等人编，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1993)。可通过载体扩增以增加抗体的表达水平。当标记在载体***中表达时抗体是可扩增的，在培养物中存在的抑制剂水平的升高将增加标记基因拷贝数。因为被扩增的区与编码本发明IgG抗体的基因相关联，所述抗体的生产也将增加（Crouse等人,Mol Cell Biol3:257,1983）。

包含这些分子的本发明的多核苷酸和载体可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞，或技术人员已知的任何其它宿主细胞类型。如本文所用的术语“重组宿主细胞”（或简称“宿主细胞”），意欲指重组表达载体已被引入的细胞。应当理解：这样的术语不仅意欲指具体的对象细胞，还指这样细胞的后代。因为在继代（succeeding generations）中由于突变或环境影响可发生某些变化（modifications），这样的后代实际上可能与亲代细胞不同，但其仍然包含在本文所用术语“宿主细胞”的范围中。

转化可以是将多核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法。这样的方法为本领域技术人员所熟知，包括葡聚糖介导的转化、磷酸钙沉淀法、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的包封、基因枪注射和直接将DNA微注射至核内。表达本发明重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢（CHO细胞）、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入至哺乳动物宿主细胞时，在一段足够长以允许抗体在宿主细胞中表达的时间中，通过培养宿主细胞产生抗体，或更优选地抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中。

可使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。本发明抗体的可溶形式可从培养物上清中回收。随后通过本领域任何已知用于纯化免疫球蛋白分子的方法可将其纯化，例如通过色谱（例如，离子交换、亲和性、特别是通过亲和Fc的蛋白A等）、离心、溶解性的差异（differential solubility）或通过任何其它用于蛋白纯化的标准技术。对本领域普通技术人员而言，合适的纯化方法将是显而易见的。

本发明人已经表明针对CXCR4的人或人源化抗体通过诱导所述抗体的至少一种效应功能，能够杀死表达CXCR4的癌细胞。

通过“表达CXCR4的癌细胞”，其在本文中指相对于在正常成体细胞中的CXCR4表达水平显示高CXCR4表达的癌症的细胞。这样的癌症包括（而非限制于）下列：包括膀胱、***、结肠、头和颈、***、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺和皮肤的癌和腺癌，并包括鳞状细胞癌；淋巴谱系造血肿瘤，包括多发性骨髓瘤、白血病、急性和慢性的淋巴细胞（或淋巴）白血病、急性和慢性的成淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤（例如伯基特淋巴瘤）；髓系造血肿瘤，包括急性和慢性的髓性（myelogenous）（髓的或髓细胞的）白血病、和早幼粒细胞白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经***的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；及其它肿瘤，包括黑素瘤、畸胎瘤、着色性干皮症、角化棘皮瘤、和***瘤和表达CXCR4的待确定的其它癌症。

在本发明权利要求的方法的优选实施方案中，所述表达CXCR4的癌细胞由恶性血液细胞组成。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述表达CXCR4的癌细胞由恶性血液细胞组成。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述表达CXCR4的癌细胞由恶性血液细胞组成。

更具体地，所述CXCR4恶性血液细胞选自淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述CXCR4恶性血液细胞选自淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述CXCR4恶性血液细胞选自淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。

在另一优选的实施方案中，所述恶性血液细胞由淋巴瘤细胞组成。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述恶性血液细胞由淋巴瘤细胞组成。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述恶性血液细胞由淋巴瘤细胞组成。

如上所述，效应细胞和/或补体成分是本发明特别感兴趣的。

在本发明方法的更优选的实施方案中，所述效应细胞包括NK细胞、巨嗜细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述效应细胞包括NK细胞、巨嗜细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于所述效应细胞包括NK细胞、巨嗜细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。

基于下列实例，描述用于本发明的抗体的特别令人关注的性能。

在本发明方法的优选的实施方案中，在4小时的孵育期后RAMOS淋巴瘤细胞上诱导的ADCC水平为至少40%。

换言之，根据本发明的用途特征在于，在4小时的孵育期后RAMOS淋巴瘤细胞上诱导的ADCC水平为至少40%。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于，在4小时的孵育期后RAMOS淋巴瘤细胞上诱导的ADCC水平为至少40%。

在本发明方法的优选实施方案中，在4小时的孵育期后DAUDI淋巴瘤细胞上诱导的ADCC水平为至少30%，优选至少40%。

换言之，根据本发明的用途特征在于在4小时的孵育期后DAUDI淋巴瘤细胞上诱导的ADCC水平为至少30%；优选至少40%。

又换言之，根据本发明的人或人源化抗体特征在于在4小时的孵育期后DAUDI淋巴瘤细胞上诱导的ADCC水平为至少30%，优选至少40%。

在本发明方法的优选实施方案中，在4小时的孵育期后HeLa***细胞上诱导的ADCC水平为至少30%，优选至少40%。

换言之，根据本发明的用途的特征在于在4小时的孵育期后，在HeLa***细胞上诱导的ADCC水平是至少30%，优选至少40%。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于在4小时的孵育期后，在HeLa***细胞上诱导的ADCC水平是至少30%，优选至少40%。

本发明另一个特别重要的方面是诱导ADCC和CDC的特异性。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，在NK细胞上没有诱导显著的ADCC。

换言之，根据本发明的用途的特征在于在NK细胞上没有诱导显著的ADCC。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于在NK细胞上没有诱导显著的ADCC。

补体成分至少包括C1q。

换言之，根据本发明的用途特征在于所述补体成分至少包括C1q。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于所述补体成分至少包括C1q。

在本发明方法的另一个优选的实施方案中，在1小时的孵育期后，在RAMOS淋巴瘤细胞上诱导的CDC水平是至少30%，优选至少50%，以及最优选至少70%。

换言之，根据本发明的用途的特征在于，在1小时的孵育期后，在RAMOS淋巴瘤细胞上诱导的CDC水平是至少30%，优选至少50%，以及最优选至少70%。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于，在1小时的孵育期后，在RAMOS淋巴瘤细胞上诱导的CDC水平是至少30%，优选至少50%，以及最优选至少70%。

仍然，在本发明方法的另一个优选的实施方案中，在1小时的孵育期后，在NIH3T3CXCR4细胞上诱导的CDC水平是至少30%，优选至少50%，以及最优选至少70%。

换言之，根据本发明的用途的特征在于，在1小时的孵育期后，在NIH3T3CXCR4细胞上诱导的CDC水平是至少30%，优选至少50%，以及最优选至少70%。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于，在1小时的孵育期后，在NIH3T3CXCR4细胞上诱导的CDC水平是至少30%，优选至少50%，以及最优选至少70%。

仍然，在本发明方法的另一个优选的实施方案中，在1小时的孵育期后，在DAUDI淋巴瘤细胞上诱导的CDC水平是至少30%，优选至少40%。

换言之，根据本发明的用途的特征在于，在1小时的孵育期后，在DAUDI淋巴瘤细胞上诱导的CDC水平是至少30%，优选至少40%。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于，在1小时的孵育期后，在DAUDI淋巴瘤细胞上诱导的CDC水平是至少30%，优选至少40%。

在本发明抗体的ADCC特性方面，产生了关于所述抗体与FcγR结合的结果。

本发明另一个特别的方面是本发明的抗体，或其含有CH2的结合片段之一，能够结合至少一个FcγR。

在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述至少一个FcγR是FcγRI。

换言之，根据本发明的用途的特征在于所述至少一个FcγR是FcγRI。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于所述至少一个FcγR是FcγRI。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，表征本发明抗体与人Fc[gamma]RI结合的解离常数（K_D），根据

模式是1至10nM之间。

换言之，根据本发明的用途的特征在于，表征本发明抗体与人FcγRI结合的解离常数（KD），根据

模式是1至10nM之间。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于，表征本发明抗体与人FcγRI结合的解离常数（KD），根据模式是1至10nM之间。

在本发明方法的另一个优选的实施方案中，所述至少一个FcγR是人FcγRIIIa。

换言之，根据本发明的用途的特征在于，所述至少一个FcγR是人FcγRIIIa。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于，所述至少一个FcγR是人FcγRIIIa。

在本发明方法的一个更优选的实施方案中，表征本发明抗体与人FcγRIIIa结合的解离常数（K_D），根据异质性配体模式是200至1000nM之间。

换言之，根据本发明的用途的特征在于，表征本发明抗体与人FcγRIIIa结合的解离常数（K_D），根据异质性配体模式是200至1000nM之间。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于，表征本发明抗体与人FcγRIIIa结合的解离常数（K_D），根据异质性配体模式是200至1000nM之间。

如文中使用的，术语“K_D”指特定抗体/抗原相互作用的解离常数。“结合亲和性”通常指一个分子（例如，抗体）和其结合伴侣（例如，抗原）的单一结合位点之间非共价相互作用的总和强度。除非另有指明，如文中所使用的，“结合亲和性”指反应结合对成员（例如，抗体和抗原）之间1：1相互作用的固有的结合亲和性。分子X对其伴侣Y的亲和性通常可由K_D代表。亲和性可通过本领域公知的方法测量，包括文中描述的那些。低亲和性抗体通常缓慢结合抗原，并倾向于容易解离，而高亲和性抗体通常较快地结合抗原，并倾向于保持较长时间的结合。测量结合亲和性的多种方法是本领域公知的，其中的任何方法可用于本发明的目的。

优选，根据

模式计算解离常数。

经典地，

模式如下所述：

其中，A是分析物，B是配体，AB是分析物和配体之间的非共价复合物，k_a和k_d分别是该相互作用的结合和解离率。

以相同的方式，在以下两个等式***中描述了异质性配体模式，其中配体被认为是两种成分的混合物：

其中，A是分析物，B1是配体的第一成分，AB1是分析物与配体的第一成分之间的非共价复合物，k_a1和k_d1分别是该相互作用的结合和解离率，B2是配体的第二成分，AB2是分析物与配体的第二成分之间的非共价复合物，k_a2和k_d2分别是该相互作用的结合和解离率。

使用BIAevaluation版本3.1(Biacore AB)处理BIACORE数据。

最后，本发明还涉及治疗或预防与表达CXCR4的癌细胞的存在相关的病理状态的方法，其包括施用有效量的人或人源化抗体、或其含有CH2的结合片段的步骤；所述人或人源化抗体包含具有三个CDR序列SEQ ID No.1、2和3的重链可变结构域和具有三个CDR序列SEQ ID No.4、5和6的轻链可变结构域；其中在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能。

换言之，本发明涉及人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段用于制备用于治疗与表达CXCR4的癌细胞的存在相关的病理状态的组合物的用途；其中所述人或人源化抗体包含含有分别包含序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变结构域；以及含有分别包含序列SEQ ID No.4，5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变结构域；其中在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能。

仍然，换言之，本发明涉及特异性地识别CXCR4的人或人源化抗体，含有CH2的结合片段，用于治疗与表达CXCR4的癌细胞的存在相关的病理状态；所述人或人源化抗体包含含有分别包含序列SEQ ID No.1、2和3的CDR区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变结构域；以及含有分别包含序列SEQ ID No.4，5和6的CDR区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变结构域；其中在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能。

优选地，本发明还涉及治疗或预防与表达CXCR4的癌细胞的存在相关的病理状态的方法，所述方法包括施用有效量的人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段的步骤；所述人或人源化抗体包含选自序列SEQ ID No.7至10的重链可变结构域和选自序列SEQ ID No.11至17的轻链可变结构域；其中在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能。

换言之，本发明涉及人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段用于制备治疗与表达CXCR4的癌细胞的存在相关的病理状态的组合物的用途；所述人或人源化抗体包含选自序列SEQ ID No.7至10的重链可变结构域和选自序列SEQ IDNo.11至17的轻链可变结构域；其中在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能。

仍然，换言之，本发明涉及特异性识别CXCR4的人或人源化抗体，含有CH2的结合片段用于治疗与表达CXCR4的癌细胞的存在相关的病理状态；所述人或人源化抗体包含选自序列SEQ ID No.7至10的重链可变结构域和选自序列SEQ IDNo.11至17的轻链可变结构域；其中在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能。

已知单克隆抗体是在每个重链的恒定区中N糖基化的。已经表明特定的糖基化变体影响ADCC。例如，IgG1的较低的岩藻糖糖基化与增加的ADCC有关（Shields等人.,J Biol Chem.,277(30):26733-2640,2002;Shinkawa等人.,J BiolChem.,278(5):3466-3473,2003）。

观察到半乳糖水平和CDC活性之间显著的关联。例如，利妥昔单抗的CDC活性随着半乳糖含量的降低而降低（Hodoniczky等人,Biotechnol Prog.,21(6):1644-1652,2005）。

在以下的表5中显示了用于ADCC和CDC实验的hz515H7单抗的代表性糖基化谱。

表5

令人惊奇地，根据本发明的Hz515H7单抗在表达CXCR4的细胞上诱导了高百分比的ADCC和CDC，尽管其糖链的大约92%包含岩藻糖残基。

因而，本发明还涉及通过杀死表达CXCR4的癌细胞治疗癌症的方法，其包括施用有效量的人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段的步骤；所述人或人源化抗体包含如下的聚糖谱：

其中，在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能。

本发明还涉及结合CXCR4的人源化抗体，或其含有CH2的结合片段，用于通过杀死表达CXCR4的癌细胞治疗癌症的方法中，所述人或人源化抗体包含如下的聚糖谱：

本发明还涉及结合CXCR4的人源化抗体，或其含有CH2的结合片段通过杀死表达CXCR4的癌细胞用于制备治疗癌症的药物的用途，所述人或人源化抗体包含如下的聚糖谱：

如文中的实施例所示，本发明的人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段，至少通过ADCC和/或CDC反应的诱导，具有抗肿瘤活性，因而其在治疗转移性肿瘤和如癌症的疾病中是有用的。

术语“治疗”或“治疗”指以这样一种量、方式、和/或模式施用或施用文中描述的组合物，使得足以有效地以统计学显著的程度或本领域技术人员可检测的程度改善与疾病相关的状态、症状或参数，或防止疾病的进展或加重（包括由疾病引起的继发损伤）。

本发明的另一个方面涉及人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段的药物组合物。

本发明的药物组合物可以包含除载体和人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段以外的各种稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂和本领域公知的其它物质。

如文中所用的，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、盐溶液、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、以及生理学相容的等等。可根据预期的施用途径选择载体的类型。在多种实施方案中，载体适合于静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部、经皮或口服施用。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或用于临时制备无菌注射溶液或分散剂的分散剂或无菌粉末。用于药学活性物质的介质和试剂的用途是本领域熟知的。如以下详述的，额外的活性化合物也能被并入组合物中，例如，抗癌和/或抗血管生成剂；尤其是额外的活性化合物可以是抗血管生成剂、化疗剂、或低分子量的试剂。用于静脉输注的典型的药物组合物可被配制成含有250ml无菌林格溶液、以及100mg的组合。用于制备胃肠外可施用化合物的实际的方法对本领域技术人员而言是公知的或显而易见的，更详细地描述于，例如，Remington's Pharmaceutical Science,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1985),以及其第18和第19版，在此并入作参考。

组合物中的人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段优选被配制成有效量。“有效量”指为实现所需结果（如诱导肿瘤细胞中的凋亡）所必要的剂量和时期的有效量。“治疗有效量”指足以影响特定疾病状态的治疗过程的量。治疗有效量也是这样一种量，其中试剂的治疗有益效果超过毒性或有害效果。

为了治疗的应用，本发明的人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段以如上讨论的药学上可接受的剂型（dosage）施用于哺乳动物，优选人，所述剂型包括可作为推注或通过连续输注一段时间静脉内、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入途径施用于人的那些。所述人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段也可以被适当地通过瘤内、瘤周、病灶内或病灶周围途径施用，以发挥局部以及全身治疗效果。预期腹膜内途径在治疗例如卵巢肿瘤中特别有用。

为了提供优化的反应，可调整给药（dosage）方案。例如，可施用单次推注、在一段时间施用几次分开的剂量、或剂量可以按比例地减少或增加。本发明的组合物可施用于受试者以影响受试者中的细胞生长活性。如文中使用的，术语“受试者”意图包括其中可诱导凋亡的活生物体，特别地包括哺乳动物、例如兔、狗、猫、小鼠、大鼠、猴、其转基因种属，优选人。

本发明的人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段，以及本发明的药物组合物在治疗或预防一些类型的癌症中特别有用，所述癌症包括（但不局限于）以下：癌和腺癌，包括膀胱、***、结肠、头和颈、***、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺癌和皮肤，并且包括鳞状细胞癌;淋巴谱系造血肿瘤，包括多发性骨髓瘤、白血病、急性和慢性淋巴细胞（或淋巴）白血病、急性和慢性成淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤（例如伯基特淋巴瘤）；髓系造血肿瘤，包括急性和慢性髓性（髓的或髓细胞的）白血病和早幼粒细胞白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤，骨肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经***的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；及其它肿瘤，包括黑色素瘤、畸胎瘤、着色性干皮症、角化棘皮瘤和***瘤，以及表达CXCR4的有待确定的其它癌症。通过具有CXCR4表达的癌症，文中指相对于正常成体细胞上CXCR4表达水平，展现高度CXCR4表达的癌症。

本发明的人或人源化抗体，或其含有CH2的结合片段，以及本发明的药物组合物主要地对于白血病、淋巴瘤和对通常使用的抗癌剂抵抗的癌症的治疗是有用的，因为本发明的抗CXCR4抗体具有独特的作用机制。

在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述与表达CXCR4的癌细胞的存在相关的病理状态由淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤组成，优选淋巴瘤。

换言之，根据本发明的用途的特征在于所述与表达CXCR4的癌细胞的存在相关的病理状态由淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤组成，优选淋巴瘤。

仍然，换言之，根据本发明的人或人源化抗体的特征在于所述与表达CXCR4的癌细胞的存在相关的病理状态由淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤组成，优选淋巴瘤。

作为非限制的实例，在体外检测受试者中表达CXCR4的肿瘤的存在和/或位置的方法，包括步骤：

（a）使来自受试者的样本与人源化抗体重链和/或人源化抗体轻链和/或人源化抗体，或其衍生化合物或功能片段接触，相应地能够特异性结合CXCR4；和

（b）检测所述抗体与样本的结合。

特别地，在来自受试者的表达CXCR4的肿瘤中体外或离体确定CXCR4表达水平的方法，包括步骤：

（a'）使来自受试者的样本与能够特异性结合CXCR4的人源化抗体重链和/或人源化抗体轻链和/或人源化抗体，或其衍生化合物或功能片段接触；和

（b'）定量所述样本中与CXCR4结合的抗体水平。

在一个优选的实施方案中，能够通过免疫组化（IHC）或FACS分析测量CXCR4表达水平。

如文中使用的，术语“与CXCR4表达相关的致癌疾病”或“表达CXCR4的癌细胞”意指包括疾病和其它疾病，其中已经表明或怀疑，在遭受疾病的受试者中高水平或异常低水平的CXCR4（异常）的存在负责该疾病的病理或是导致疾病恶化的原因。或者，这样的疾病可通过，例如，遭受疾病的受试者感染细胞或组织的细胞表面上CXCR4水平的增加而证实。CXCR4水平的增加可通过，例如，使用本发明的抗体515H7或hz515H7检测。而且，其指相对自主生长的细胞，因而其表现特征为细胞增殖显著失控的异常生长表型。或者，细胞可以表达正常水平的CXCR4，但显著异常的增殖。

本发明还描述了用于筛选结合CXCR4的人源化抗体、或其含有CH2的结合片段的方法，所述人源化抗体或其含有CH2的结合片段用于在效应细胞或补体成分存在时，通过诱导至少一种效应功能杀死表达CXCR4的癌细胞，其中所述方法包括至少一个选自以下的选择步骤：

-在4小时的孵育期后，选择诱导RAMOS淋巴瘤细胞上至少40%ADCC水平的抗体；

-在1小时的孵育期后，选择诱导RAMOS淋巴瘤细胞上至少30%、优选至少50%、以及最优选至少70%CDC水平的抗体；

-在1小时的孵育期后，选择诱导NIH3T3CXCR4细胞上至少30%、优选至少50%、以及最优选至少70%CDC水平的抗体；

-选择根据

模式以1至10nM之间的解离常数（KD）结合FcγRI的抗体；

-选择根据异质性配体模式以200至1000nM之间的解离常数（KD）结合FcγRIIIA的抗体。

除特别地指出外，本发明的实践采用传统的技术或蛋白化学、分子病毒学、微生物学、重组DNA技术、和药理学，其在本领域的范围内。这样的技术在文献中有全面的解释（参见Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Eds.,John Wiley&Sons,Inc.New York,1995;Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985;和Sambrook等人,Molecular cloning:Alaboratory manual第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harbor,NY,USA,1989;Introduction to Glycobiology,Maureen E.Taylor,Kurt Drickamer,Oxford Univ.Press(2003);Worthington Enzyme Manual,Worthington BiochemicalCorp.Freehold,NJ;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol I1976CRCPress;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol II1976CRC Press;Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)）。文中描述的与分子和细胞生物学、蛋白质生物化学、酶学和医学和药物化学相关的所用命名法和实验室步骤和技术是公知的，并且是本领域常规使用的。

除非另有说明，文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常理解的意义相同。

本发明的其它特征和优点在具有实施例和附图的说明中进一步呈现，其附图标记在以下表明。

附图说明

图1表示具有人种系IGHV3-49*04和IGHJ4*01的515H7重链可变结构域的氨基酸序列比对。515H7VH氨基酸序列与选择的人受体（acceptor）框架序列比对。VH1和VH2（VH3没有表示）序列对应实施的515H7VH结构域的人源化变体，以粗体表示回复突变（back mutated）残基。变体1VH1没有携带回复突变残基，代表完整的人变体。变体VH2具有8个回复突变，因而是最鼠（源）的变体。变体VH3携带5个回复突变（没有表示）。

图2表示具有人种系IGKV4-1*01和IGKJ1*01的515H7轻链氨基酸序列的比对。515H7VL氨基酸序列与选择的人受体框架序列比对。VL1至VL3序列对应实施的515H7VL结构域的人源化变体，以粗体表示回复突变残基。变体VL1没有携带回复突变残基，代表最人（源）的变体。变体VL2具有13个回复突变，是最鼠（源）的变体。变体VL3携带5个回复突变。

图3A-3F表示通过嵌合的515H7和人源化515H7的不同变体对生物素化鼠抗体515H7的交叉阻断使用CXCR4转染的NIH3T3细胞通过流式细胞术评估515H7(hz515H7)人源化变体交叉阻断母体鼠抗体515H7的活性。比较人源化变体与嵌合的515H7的活性。与嵌合的VL(cVL)组合的VH(VH1-VH3)的三种不同变体的交叉阻断活性非常相似（图3A-图3C）。当与VL的变体1和2组合时，没有测定到VH变体1（VH1，没有回复突变的变体）活性的降低。对于构建体hz515H7VH1VL3检测到显著降低的活性（图3D-3F）。

图4表示用于测试人源化抗体515H7变体VH1VL1活性的BRET分析。通过抑制SDF-1介导的信号传导的能力评估人源化变体515H7VH变体1VL变体1（hz515H7VH1VL1）的活性。如通过BRET测定的，该变体仅显示对SDF-1介导的信号传导的轻微抑制。使用100nM浓度的SDF-1。

图5A-5D表示具有单或双回复突变的不同VH1突变体和具有hz515H7VH1D76N的不同VL变体的组合的比较。在VH1中产生单和双回复突变，并与VL1组合。在BRET分析中评估这些构建体（图5A-5C）。在这些单回复突变体中，仅具有回复突变D76N的构建体表现出增加的SDF-1介导的信号传导的抑制。在VH中双回复突变体不具有强的抑制活性（图5C）。VH1的单回复突变体D76N与不同的VL变体组合。使用100nM浓度的SDF-1。

图6表示与构建体VH1D76N VL2比较，具有单或双回复突变的VH1和VL1不同突变体的排序。在VH1中产生单和双回复突变，并与VL1组合。在BRET分析中评估所有构建体，计算其抑制百分比。SDF-1浓度是100nM。

图7A-7B表示由人源化515H7不同的构建体抑制的SDF-1结合，以及通过FACS和BRET获得的结果间的相关性。在流式细胞术（FACS）中检测了在阻断β抑制蛋白募集中具有强活性的人源化515H7不同变体的抑制生物素化SDF-1结合的能力（A）。这些与VH1和VL1比较。来自基于FACS分析的结果与获得自BRET的结果关联（B）。

图8表示hz515H7VL2以及进一步的人源化版本515H7VL2.1、515H7VL2.2和515H7VL2.3的氨基酸序列比对。515H7VL氨基酸序列与选择的人受体框架系列比对。VL2.1、VL2.2和VL2.3序列对应实施的人源化515H7VL2的人源化变体，突变残基以粗体表示。VL2.1和VL2.2携带4个以上的人源化残基，而VL2.3包含5个以上人残基。

图9A-9C表示在NIH3T3-CXCR4(图9A)U937(图9B)和Ramos细胞上(图9C)特异性结合CXCR4的515H7人源化单抗(hz515H7VH1D76N VL2、hz515H7VH1D76N VL2.1、hz515H7VH1D76N VL2.2和hz515H7VH1D76N VL2.3)。

图10表示在表达CXCR4的细胞、Ramos细胞(图10A)和自然杀伤细胞(NK)上(图10B)hz515H7VH1D76NVL2单抗的抗体依赖的细胞的细胞毒性（ADCC）作用。

图11表示在表达CXCR4的细胞、Ramos细胞(图11A)和自然杀伤细胞(NK)(图11B)上c515H7单抗的抗体依赖的细胞的细胞毒性（ADCC）作用。

图12表示在NIH3T3-CXCR4细胞系和表达CXCR4的Ramos细胞上hz515H7VH1D76NVL2单抗的补体依赖的细胞毒性（CDC）作用。

图13表示在表达CXCR4的Ramos细胞上c515H7单抗的补体依赖的细胞毒性（CDC）作用。

图14表示在表达CXCR4的Ramos细胞上hz515H7VH1D76NVL2(图14A)和c515H7(图14B)单抗的补体依赖的细胞毒性（CDC）剂量作用。

图15：重组人FcγRI与固定于CM4传感芯片上的hz515H7VH1D76NVL2单抗的结合。测试了6个不同浓度的h-FcγRI(200、100、50、25、12.5和6.25nM)。

图16：重组人FcγRIIIA与固定于CM4传感芯片上的hz515H7VH1D76NVL2单抗的结合。测试了5个不同浓度的h-FcγRIIIA(1000、500、250、125和62.5nM)。

图17：通过稳定状态分析，使用结合相（phase）末期的反应相对于人FcγRIIIA浓度(1000、500、250、125和62.5nM)的作图，确定h-FcγRIIIA/hz515H7VH1D76NVL2复合物的解离常数。

图18：重组小鼠FcγRI与固定于CM4传感芯片上的hz515H7VH1D76NVL2单抗的结合。测试了5个不同浓度的m-FcγRI(400、200、100、50和25nM)。

图19：通过稳定状态分析，使用结合相末期的反应相对于小鼠FcγRI浓度(400、200、100、50和25nM)的作图，确定m-FcγRI/hz515H7VH1D76NVL2复合物的解离常数。

图20：重组小鼠FcγRIII与固定于CM4传感芯片上的hz515H7VH1D76NVL2单抗的结合。测试了5个不同浓度的m-FcγRIII(400、200、100、50和25nM)。

图21：在解离常数（以纳摩尔）相对于hz515H7VH1D76NVL2单抗/Fc gamma受体复合物半衰期（以分钟）的函数的图上，与hz-515H7VH1D76NVL2单抗结合的四个Fc gamma受体(具有h-FcγRI和m-FcγRIII的一个成分和具有h-FcγRIIIA和m-FcγRI的两个成分)的排序。

图22：重组人FcγRI与固定于CM4传感芯片上的c515H7单抗的结合。测试了6个不同浓度的h-FcγRI(200、100、50、25、12.5和6.25nM)。

图23：重组人FcγRIIIA与固定于CM4传感芯片上的c515H7单抗的结合。测试了5个不同浓度的h-FcγRIIIA(1000、500、250、125和62.5nM)。

图24：通过稳定状态分析，使用结合相末期的反应相对于人FcγRIIIA浓度(1000、500、250、125和62.5nM)的作图，确定h-FcγRIIIA/c515H7复合物的解离常数。

图25：重组小鼠FcγRI与固定于CM4传感芯片上的c515H7单抗的结合。测试了5个不同浓度的m-FcγRI(400、200、100、50和25nM)。

图26：通过稳定状态分析，使用结合相末期的反应相对于小鼠FcγRI浓度(400、200、100、50和25nM)的作图，确定m-FcγRI/c515H7复合物的解离常数。

图27：重组小鼠FcγRIII与固定于CM4传感芯片上的c515H7单抗的结合。测试了5个不同浓度的m-FcγRIII(400、200、100、50和25nM)。

图28：在解离常数（以纳摩尔）相对于c515H7单抗/Fc gamma受体复合物半衰期（以分钟）的函数的图上，与c515H7单抗结合的四个Fc gamma受体(具有h-FcγRI和m-FcγRIII的一个成分和具有h-FcγRIIIA和m-FcγRI的两个成分)的排序。

图29表示在表达CXCR4的细胞：RAMOS、DAUDI和HeLa细胞上，hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)单抗的抗体依赖的细胞的细胞毒性（ADCC）作用。

图30表示在表达CXCR4的细胞：DAUDI和RAMOS细胞上，hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)单抗的补体依赖的细胞毒性（CDC）作用。

具体实施方式

实施例实施例1：针对人CXCR4的单克隆抗体（单抗）的产生

为了产生CXCR4的单克隆抗体，用重组NIH3T3-CXCR4细胞和/或对应于CXCR4细胞外N端和环的肽免疫接种Balb/c小鼠。在第一次免疫接种时，用完全弗氏佐剂中的抗原皮下（s.c.）免疫接种6-16周龄的小鼠一次，接着用不完全弗氏佐剂中的抗原皮下免疫接种2至6次。通过眶后放血监测免疫应答。通过ELISA（如下描述的）筛选血清，并且使用具有较高滴度的抗CXCR4抗体的小鼠进行融合。在处死并切除脾脏前两天，用抗原静脉内加强（boost）小鼠。

-ELISA

为了选择产生抗CXCR4抗体的小鼠，通过ELISA测试来自免疫接种的小鼠的血清。简而言之，用以5μg当量肽/mL缀合至BSA的纯化的[1-41]N端肽包被微量滴定板，在4℃下以100μl/孔孵育过夜，然后用250μl/孔的PBS中的0.5%明胶封闭。将来自CXCR4免疫接种的小鼠的血浆稀释液加入至每孔中，并在37℃下孵育2小时。用PBS洗涤板，然后，在37℃下，用缀合至HRP的山羊抗小鼠IgG抗体（Jackson Laboratories）孵育1小时。在洗涤之后，用TMB底物使板显影，5分钟之后，通过加入100μl/孔的1M H₂SO₄终止该反应。使用出现最高滴度的抗CXCR4抗体的小鼠进行抗体生产。

-产生CXCR4的单抗的杂交瘤的生成

用PEG将从出现最高滴度的抗CXCR4抗体的Balb/c小鼠中分离的小鼠脾细胞融合至小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/O。将细胞以约1×10⁵/孔涂布于微量滴定板，接着在包含超培养基+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+1x HAT的选择介质中孵育2周。然后，通过ELISA筛选各孔的抗CXCR4单克隆IgG抗体。然后，通过有限稀释，将分泌抗体的杂交瘤亚克隆至少两次，体外培养以产生抗体用于进一步的分析。

实施例2：通过FACS分析的抗CXCR4单抗515H7结合特异性和癌细胞系识别的鉴定

在该实验中，通过FACS分析检查了抗CXCR4单抗515H7的对人CXCR4的特异性结合。

用10μg/ml的单克隆抗体515H7孵育NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4转染的细胞、MDA-MB-231、Hela和U937癌细胞系。然后，用1%的BSA/PBS/0.01%NaN3洗涤细胞。接着，将Alexa标记的第二抗体加入至所述细胞中，并允许在4℃下孵育20min。然后，再次洗涤细胞两次。在第二次洗涤之后，进行FACS分析。将这些结合研究的结果提供在下表6中，其显示（通过FACS获得的平均荧光强度（MFI））抗CXCR4单抗515H7特异性结合人CXCR4-NIH3T3转染的细胞系，而在亲代NIH3T3细胞上无识别。这种单抗也能够识别人癌细胞系，例如MDA-MB-231乳癌细胞、U937早幼粒细胞性癌细胞和Hela***细胞。

抗CXCR4单抗515H7识别NIH3T3-hCXCR4转染子，而不能识别亲代NIH3T3野生型细胞。单抗515H7也能够识别癌细胞系。

表6

实施例3：515H7抗CXCR4鼠抗体的人源化

一般步骤

通过应用CDR嫁接的整体规则进行515H7抗CXCR4抗体的人源化。通过应用IMGT唯一编号方案及IMGT文库和工具（Lefranc,1997–www.imgt.org）进行CDR和框架（FR）区的免疫遗传分析和定义。

通过生物发光共振能量转移（BRET）分析测试工程化抗体抑制SDF-1介导的β抑制蛋白募集能力的功能活性评价人源化方法的功效。在该分析中，用荧光素酶标记CXCR4且用YFP标记β抑制蛋白。SDF-1介导的β抑制蛋白募集至CXCR4在CXCR4信号转导中是重要步骤。还在稳定转染人CXCR4的NIH3T3细胞系上确定515H7人源化变体的结合。以和生物素化小鼠抗体竞争的分析来评估结合活性。在第二次尝试中，评价人源化抗体抑制生物素化SDF-1与RAMOS细胞结合的能力。选择RAMOS细胞，因为其高表达CXCR4和低表达CXCR7和SDF-1。

用这些分析来鉴定抗CXCR4抗体的重组人源化版本。用人IgG1/k恒定结构域对可变结构域进行格式化，并克隆至哺乳动物表达载体pCEP。在HEK293细胞中瞬时表达重组IgG₁/κ-衍生的抗体。过滤表达培养物上清，并使用蛋白质A琼脂糖纯化抗体。在PBS中重新缓冲纯化的抗体并通过ELISA确定抗体浓度。

515H7可变结构域的人源化

为了选择用于CDR嫁接的合适人种系，鉴定和515H7VH鼠序列具有最高同源性的人种系基因。借助IMGT数据库和工具，人IGHV3-49*04种系基因和人IGHJ4*01J种系基因选作用于鼠515H7VH CDR的人受体序列。人V基因IGHV3-49*04具有同小鼠515H7重链的可变结构域V基因80.27%的同源性。对于人J基因IGHJ4*01的同源性是87.50%。所选的人种系基因和小鼠抗体515H7的VH结构域之间有19个残基是不同的。母体抗体的VH结构域和种系序列之间的比对描述于图1中。

关于轻链的可变结构域，选择人种系基因IGKV4-1*01和IGKJ1*01（图2）。同人V基因IGKV4-1*01的同源性是79.12%。轻链的515H7J基因具有同人J基因IGKJ1*01的84.85%同源性。

翻译的人种系基因IGHV3-49*04和IGKV4-1*01的氨基酸序列用于鉴定结晶的同源抗体。对于重链，在RCSB蛋白质数据库中登录号为1MAM的抗体选作模型，而对于轻链，选择抗体1SBS。两个结构域用计算机程序DS visual进行组装，并用作人源化抗体515H7的模型。

基于母体抗体和对应的人种系序列之间不同的各残基的位置，为人和小鼠序列之间不同的各残基给予优先排列顺序（图1和2）。这些优先用于产生各人源化可变结构域的三种不同变体，即分别为VH1、VH2和VH3。

在第一系列的实验中，我们构建并分析了三种第一人源化变体的抗CXCR4结合活性。VH变体1（VH1）结合鼠VL，并且评价这些构建体抑制生物素化鼠515H7母体抗体结合的能力。所有构建体显示竞争鼠抗体的相似能力（图3A-C）。这表明最人的VH变体具有与较少人变体相同的结合能力。因此，VH1结合VL的三种不同变体（图3D-F）。只有VH1和VL3的组合显示降低的竞争生物素化鼠抗体的能力，而在框架中不携带回复突变的最人的变体VH1VL1显示和嵌合抗体相同的交叉阻断活性。

还在BRET分析中测试这种变体VH1VL1抑制SDF-1介导的β抑制蛋白募集的能力（图4）。尽管通过母体抗体的交叉阻断所确定的期望的受体结合活性，构建体VH1VL1仅显示β抑制蛋白募集的微弱抑制。这种强烈抑制活性的缺失使得人框架残基被鼠残基置换成为必要。针对VH1构建单回复突变。置换如下残基：V48L、E61D、D76N和A81L（根据一级氨基酸序列编号）。变体VH1的这些单回复突变结合变体VL1。这些当中，正如BRET分析所评价的，只有回复突变D76N导致信号转导的抑制增加（图5B）。

为了增加这种构建体的活性并进一步评价其它残基的重要性，针对VH1构建不同的双回复突变。这些构建体的抑制活性稍改善（约45-50%的平均抑制），但是不令人满意（图5C）。然后单回复突变D76N和三种不同VL变体组合（图5D）。构建体hz515H7VH D76N VL2显示平均88.2%的活性，其和嵌合抗体的在相同范围内。

在变体VL1结构域中构建单和双回复突变，并和构建体hz515H7VH1D76NVL2的活性比较（图6）。测试的组合中没有与这种构建体相似或更好活性。

针对hz515H7VH1D76N VL2计算框架中人残基的百分比：180个残基中其含有14个非人残基，这等于92.2%的“发展性指数”（germinality index）。通过比较，人源化的和市售抗体贝伐单抗和曲妥珠单抗在其可变结构域中分别含有30和14个非人残基。

对显示出抑制SDF-1介导的β抑制蛋白募集的最强功效的四种最人源化的形式还进行测试，测试其抑制生物素化SDF-1结合的能力（图7A）。确定SDF-1结合抑制和β抑制蛋白募集的密切相关性。这种相关性表明SDF-1结合抑制是抑制信号转导最可能的主要机制。

为了进一步人源化hz515H7VL2变体，通过使用图6中评价的双和三突变体而获得的信息，设计三种其它变体。在变体VL2.1、VL2.2和VL2.3中分别人源化四种和五种其它残基（也称VL2-1、VL2-2和VL2-3）。它们对应着残基D9、P49、D66、S69、S83、L84；V89。这三种变体相较于VL2的比对显示于图8中。

评价这些VL2变体抑制SDF-1介导的β抑制蛋白的募集的能力。人源化hz515H7VH D76N VL2、VL2.1、VL2.2和VL2.3变体显示和嵌合抗体c515H7相似的活性（图6）。

实施例4：通过FACS分析对抗CXCR4人源化单抗515H7的结合特异性和癌细胞系识别的鉴定

在此实验中，通过FACS分析检查抗CXCR4人源化单抗515H7对人CXCR4的特异性结合。

NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4转染的细胞和Ramos、U937癌细胞系与0至10μg/ml的人源化单抗515H7（hz515H7VH1D76N VL2、hz515H7VH1D76N VL2.1、hz515H7VH1D76N VL2.2和hz515H7VH1D76N VL2.3）在4℃在黑暗中于100μlFacs缓冲液中孵育20min。以Facs缓冲液洗涤三次后，用二抗（羊抗人Alexa488（1/500稀释））在4℃在黑暗中孵育细胞20分钟。以Facs缓冲液洗涤三次后，在各孔中加入碘化丙啶，只有活细胞通过Facs分析。至少5000个活细胞进行了评估，以评价每个条件的荧光强度的平均值。

图9A-9C提供了这些结合研究的结果（通过FACS获得的平均荧光强度（MFI）），显示抗CXCR4人源化单抗hz515H7特异性结合人CXCR4-NIH3T3转染细胞系（图9A）（与NIH3T3亲代细胞，MFI=2.2），并且还识别人癌细胞系，例如U937（图9B）和Ramos（图9C）。

实施例5：在表达CXCR4的细胞上hz515H7VH1D76NVL2单抗的抗体依赖的细胞的细胞毒性（ADCC）作用

使用细胞毒性检测试剂盒Cytotoxicity Detection Kit^PLUS(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA），根据制造商的说明书，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放分析测量ADCC。乳酸脱氢酶是可溶的胞质酶，在由于凋亡或坏死而失去膜完整性后乳酸脱氢酶释放到培养基中。因而，LDH活性可用作细胞膜完整性的指示，并用作评估细胞毒性（包括ADCC）的一般方法。

使用Ficoll密度梯度(Ficoll-Paque PLUS,GE Healthcare,Amersham,UK)从获自健康供体的人棕黄层分离外周血单核细胞（PBMC）。根据

人NK细胞富集试剂盒制造商的规程(StemCell Technologies)从PBMC部分（fraction）分离自然杀伤（NK）细胞。将NK细胞在每孔50μL中以50:1的效靶比在96孔平底板中铺板。将在室温下与抗体预孵育10分钟的10000个靶细胞(Ramos)加到50μL/孔中的效应细胞上。在37℃下孵育4小时后，通过测量LDH释放的量确定细胞毒性。如下计算细胞毒性百分比：%裂解=[实验的释放–效应物和靶的自主释放]/[靶的最大释放–靶的自主释放]X100。

图10表示在表达高水平的CXCR4的Ramos细胞和单独的NK细胞上的ADCC[CXCR4水平(MFI):Ramos>NK细胞]。黑色柱：Hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7VL2)(10μg/mL)，白色柱：同种型对照hIgG1(10μg/mL)。当细胞与hIgG1同种型对照孵育时没有观察到效果（图10A和10B）。相反地，hz515H7VH1D76NVL2单抗能够诱导Ramos细胞上的显著ADCC(47.9%+/-8.9)（图10A），而在表达低水平CXCR4的NK细胞上没有显著的ADCC(3%+/-3)（图10B）。

实施例6：表达CXCR4细胞上的c515H7单抗的抗体依赖的细胞的细胞毒性（ADCC）作用

使用细胞毒性检测试剂盒Cytotoxicity Detection KitPLUS(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA），根据制造商的说明书，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放分析测量ADCC。

人NK细胞富集试剂盒制造商的规程(StemCell Technologies)从PBMC部分分离自然杀伤（NK）细胞。将NK细胞在每孔50μL中以50:1的效靶比在96孔平底板中铺板。将在室温下与抗体预孵育10分钟的10000个靶细胞(Ramos)加到50μL/孔中的效应细胞上。在37℃下孵育4小时后，通过测量LDH释放的量确定细胞毒性。如下计算细胞毒性百分比：%裂解=[实验的释放–效应物和靶的自主释放]/[靶的最大释放–靶的自主释放]X100。

图11表示在表达高水平的CXCR4的Ramos细胞和单独的NK细胞上的ADCC[CXCR4水平(MFI):Ramos>NK细胞]。黑色柱：c515H7(10μg/mL)，白色柱：同种型对照hIgG1(10μg/mL)。当细胞与hIgG1同种型对照孵育时没有观察到效果（图11A和11B）。相反地，c515H7单抗能够诱导Ramos细胞上的显著ADCC(61.4%+/-8.1)（图11A），而在表达低水平CXCR4的NK细胞上没有显著的ADCC(5.4%+/-4.6)（图11B）。

实施例7：在表达CXCR4的细胞上hz515H7VH1D76NVL2单抗的补体依赖的细胞毒性（CDC）作用

CDC分析是使用CellTiter Glo试剂(Promega,Madison,WI,USA)基于ATP的测量。

简言之，在hz515H7VH1D76NVL2存在时，将10000个靶细胞铺板于96孔平底板上。在室温下孵育10分钟后，以最终浓度10%加入合并的来自健康供体的人血清。在37℃下1小时后，通过测量ATP量确定生存力。如下计算细胞毒性百分比：%细胞毒性=100-[[实验的/无抗体的靶细胞]X100]。

图12表示表达高水平CXCR4的Ramos和NIH3T3-CXCR4细胞系上的CDC。黑色柱：Hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7VL2)(10μg/mL)，白色柱：同种型对照hIgG1(10μg/mL)。当细胞与hIgG1同种型对照孵育时没有观察到效果（图12）。相反地，hz515H7VH1D76NVL2单抗能够诱导NIH/3T3CXCR4和RAMOS细胞系上的显著CDC(大约80%)（图12）。

实施例8：在表达高水平CXCR4的Ramos细胞上c515H7单抗的补体依赖的细胞毒性（CDC）作用

简言之，在单抗存在时，将10000个Ramos细胞铺板于96孔平底板上。在室温下孵育10分钟后，以最终浓度10%加入合并的来自健康供体的人血清。在37℃下1小时后，通过测量ATP的量确定生存力。如下计算细胞毒性百分比：%细胞毒性=100-[[实验的/无抗体的靶细胞]X100]。

图13表示表达高水平CXCR4的Ramos细胞系上的CDC。黑色柱：c515H7(10μg/mL)，白色柱：同种型对照hIgG1(10μg/mL)。当细胞与hIgG1同种型对照孵育时没有观察到效果（图13）。相反地，c515H7单抗能够诱导RAMOS细胞上的显著CDC(34%)（图13）。

实施例9：在表达高水平CXCR4的Ramos细胞上hz515H7VH1D76NVL2和c515H7单抗的补体依赖的细胞毒性（CDC）的剂量作用

简言之，在单抗存在时将10000个Ramos细胞铺板于96孔平底板上。在室温下孵育10分钟后，以最终浓度10%加入合并的来自健康供体的人血清。在37℃下1小时后，通过测量ATP的量确定生存力。如下计算细胞毒性百分比：%细胞毒性=100-[[实验的/无抗体的靶细胞]X100]。

图14表示表达高水平CXCR4的Ramos细胞系上的CDC。黑色柱：hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7VL2)(图14A)或c515H7(10μg/mL)（图14B），白色柱：同种型对照hIgG1(10μg/mL)。当细胞与hIgG1同种型对照孵育时没有观察到效果（图14A和14B）。相反地，hz515H7VH1D76NVL2(图14A)和c515H7（图14B）单抗能够诱导Ramos细胞上的显著CDC，CDC最大值分别为74%和34%，EC₅₀分别为0.033μg/mL和0.04μg/mL。

实施例10：通过实时表面等离子体共振对hz515H7VH1D76NVL2单抗和h-FcγRI、h-FcγRIIIA、m-FcγRI和m-FcγRIII之间相互作用的研究

使用Biacore X装置进行实验。用于本研究中的四种Fc□gamma受体的可溶形式购自R&D Systems:

1-重组人FcγRI[CD64]对应带有C端6-His标签的Gln16-Pro288片段（目录号:1257-FC）。用于本研究的50kDa分子量（供应商指定）对应还原条件中由SDS-PAGE定义的平均分子量。

2-重组人FcγRIIIA变体V[CD16a]对应带有C端6-His标签的Gln17-Gln208片段（目录号:4325-FC）。用于本研究的45kDa分子量（供应商指定）对应还原条件中由SDS-PAGE定义的平均分子量。

3-重组小鼠FcγRI[CD64]对应带有C端6-His标签的Gln25-Pro297片段（目录号:2074-FC）。用于本研究的55kDa分子量（供应商指定）对应还原条件中由SDS-PAGE定义的平均分子量。

4-重组小鼠FcγRIII[CD16]对应带有C端10-His标签的Ala31-Thr215片段（目录号:1960-FC）。用于本研究的37.5kDa分子量（供应商指定）对应还原条件中由SDS-PAGE定义的平均分子量。

其它试剂由Biacore(GE Healthcare)供应。

使用胺偶联的试剂盒化学（amine coupling kit chemistry）将1964RU的hz515H7VH1D76NVL2单抗固定于CM4传感芯片的第二流动池（flowcell）(FC2)上。第一流动池(FC1)被NHS和EDC混合物激活，并被作为参考表面的乙醇胺失活，以检查并减去分析物（Fc gamma受体）和传感芯片基质之间的非特异性相互作用。

在25°摄氏度以30μl/分钟的流速进行动力学实验。使用HBS-EP缓冲液作为运行缓冲液或用于制备分析物溶液。在90秒（结合相）和90秒延迟（解离相）期间，注入分析物溶液。注入作为分析物的运行缓冲液用作双参考。所有传感图（sensorgrams）用这种双参考传感图进行校正。

每次注入分析物后，通过在h-FcγRI和m-FcγRIII之后注入20mM NaOH溶液或在h-FcγRIIIA和m-FcγRI之后注入10mM NaOH再生传感芯片。

使用两种数学模式分析传感图：“

”和“异质性配体”模式。

用h-FcγRI获得的传感图（图15）并不被

模式完美地拟合（fit）(5%<Chi2/R_最大<20%)，但是“异质性配体”模式并不改善拟合的质量。使用

模式，解离常数在纳摩尔范围内(0.9±0.1nM)。

用h-FcγRIIIA获得的传感图（图16）明显不被

模式拟合(Chi2/R_最大>20%)。“异质性配体”模式显著地改善了拟合质量(Chi2/R_最大<5%)。根据该模式，hz515H7VH1D76NVL2单抗Fc结构域可被视为两种成分的混合物。代表总量79%的主要成分表现出300至350nM之间的解离常数，少数成分(21%)表现出27至32nM之间的解离常数。根据文献，用h-FcγRIIIA观察到的异质性可能与单抗Fc结构域上的糖基化异质性关联。

代表结合相末期平均反应（以RU表示）（接近Req）相对于h-FcγRIIIA浓度(C)的图可采用以下数学模式进行拟合：

Req=(K_A.C.R_最大)/K_A.C.n+1),n=1（图17）。对应于1/K_A的解离常数K_D等于176nM。

用m-FcγRI获得的传感图（图18）可被

模式拟合(5%<Chi2/R_最大<10%)，但是“异质性配体”模式显著改善拟合的质量(Chi2/R_最大<1%)。根据该模式，hz515H7VH1D76NVL2单抗Fc结构域可被视为两种成分的混合物。代表总量82%的主要成分表现出75至80nM之间的解离常数，少数成分(18%)表现出大约90nM的解离常数。即使解离常数接近，动力学速率显著不同（主要成分结合速率要好上5.7倍，但其解离速率快4.8倍）。

代表结合相末期平均反应（以RU表示）（接近Req）相对于m-FcγRI浓度(C)的图可采用以下数学模式拟合：

Req=(K_A.C.R_最大)/(K_A.C.n+1)，n=1（图19）。对应于1/K_A的解离常数K_D等于95nM。

用m-FcγRIII获得的传感图（图20）并不被

模式完美拟合(5%<Chi2/R_最大<20%)，但是“异质性配体”模式并不改善拟合的质量。使用

模式，解离常数在17至18nM附近。

在图21中表示了四种Fc gamma受体的排序，该图代表相对于复合物半衰期的函数的Kd图。根据文献，h-FcγRI以高亲和性结合人IgG1同种型抗体的Fc部分，h-FcγRIIIA以较低亲和性结合人IgG1同种型抗体的Fc部分。m-FcγRIII以hz-515H7VH1D76NVL2单抗主要成分对h-FcγRIIIA的亲和性和对h-FcγRI的亲和性之间的中间亲和性结合。hz515H7VH1D76NVL2单抗的两种成分均以介于hz515H7VH1D76NVL2的两种成分对h-FcγRIIIA的亲和性之间的中间亲和性与m-FcγRI相互作用。

这些实验清楚地表明hz515H7VH1D76NVL2单抗Fc结构域显著地与测试的四种FcγR相互作用。

实施例11：通过实时表面等离子体共振对c515H7单抗和h-FcγRI、h-FcγRIIIA、m-FcγRI和m-FcγRIII之间相互作用的研究

其它试剂由Biacore(GE Healthcare)供应。

使用胺偶联的试剂盒化学（amine coupling kit chemistry）将2017RU的c515H7单抗固定于CM4传感芯片的第二流动池(FC2)上。第一流动池(FC1)被NHS和EDC混合物激活，并被作为参考表面的乙醇胺失活，以检查并减去分析物（Fc gamma受体）和传感芯片基质之间的非特异性相互作用。

在25°摄氏度以30μl/分钟流速进行动力学实验。使用HBS-EP缓冲液作为运行缓冲液或用于制备分析物溶液。在90秒（结合相）和90秒延迟（解离相）期间注入分析物溶液。注入作为分析物的运行缓冲液用作双参考。所有传感图（sensorgrams）用这种双参考传感图进行校正。

每次注入分析物后，通过注入20mM NaOH,75mM NaCl溶液再生传感芯片。

使用两种数学模式分析传感图：“

”和“异质性配体”模式。

用h-FcγRI获得的传感图（图22）并不被

模式(Chi2/R_最大>10%)完美拟合，但是“异质性配体”模式并不改善拟合的质量。使用模式，解离常数接近纳摩尔范围(1.2±0.1nM)。

用h-FcγRIIIA获得的传感图（图23）明显不被模式(Chi2/R_最大>20%)拟合。“异质性模式”显著地改善了拟合质量(Chi2/R_最大<5%)。根据该模式，c515H7单抗Fc结构域可被视为两种成分的混合物。代表总量81%的主要成分表现出380至450nM之间的解离常数，少数成分(19%)表现出32至37nM之间的解离常数。根据文献，用h-FcγRIIIA观察到的异质性可能与单抗Fc结构域上的糖基化异质性关联。结合相末期接近达到稳定状态。代表结合相末期平均反应（以RU表示）（接近Req）相对于h-FcγRIIIA浓度(C)的图可采用以下数学模式进行拟合：

Req=(K_A.C.R_最大)/KA.C.n+1),n=1（图24）。对应于1/K_A的解离常数K_D等于160nM。

用m-FcγRI获得的传感图（图25）可被模式拟合(5%<Chi2/R_最大<10%)，但是“异质性配体”模式显著改善拟合的质量(Chi2/R_最大<2%)。根据该模式，c515H7单抗Fc结构域可被视为两种成分的混合物。代表总量81%的主要成分表现出大约380至450nM的解离常数，少数成分(19%)表现出32和37nM之间的解离常数。

结合相末期接近达到稳定状态。代表结合相末期平均反应（以RU表示）（接近Req）相对于m-FcγRI浓度(C)的图采用以下数学模式拟合：

Req=(K_A.C.R_最大)/K_A.C.n+1),n=1（图26）。对应于1/K_A的解离常数K_D等于107nM。

用m-FcγRIII获得的传感图（图27）并不被模式完美拟合(10%<Chi2/R_最大<20%)，但是“异质性配体”模式并不改善拟合的质量。使用

模式，解离常数大约为20nM。

在图28中表示了四种Fc gamma受体的排序，该图代表相对于复合物半衰期的函数的Kd图。根据文献，h-FcγRI以高亲和性结合人IgG1同种型抗体的Fc部分，h-FcγRIIIA以较低亲和性结合人IgG1同种型抗体的Fc部分。m-FcγRIII以介于c515H7单抗主要成分对h-FcγRIIIA的亲和性和对于h-FcγRI的亲和性之间的中间亲和性结合。c515H7单抗的两种成分均以与h-FcγRIIIA相似的方式与m-FcγRI相互作用。

实施例12：表达CXCR4的细胞上hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)单抗的抗体依赖的细胞的细胞毒性（ADCC）作用

如上所述，用乳酸脱氢酶(LDH)释放分析测量ADCC（参见实施例5）。

简言之，使用Ficoll密度梯度从志愿者健康供体的血液分离人PBMC。根据人NK细胞富集试剂盒制造商的规程从PBMC部分纯化NK细胞。将用作效应细胞（E）的NK细胞与RAMOS(淋巴瘤)、DAUDI(淋巴瘤)或HeLa(***)肿瘤靶细胞(T)以50:1的E:T比混合，所述靶细胞与hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)抗体(10μg/ml)在室温下先预孵育10分钟。在37℃下孵育4小时后，使用CytotoxicityDetection Kit^PLUS根据制造商的说明书，通过测量LDH释放的量确定特异性细胞裂解。如下计算细胞毒性百分比：%裂解=[实验释放–效应物和靶的自主释放]/[靶的最大释放–靶的自主释放]x100。

图29表示表达CXCR4的细胞：RAMOS、DAUDI和HeLa细胞上的ADCC。当细胞与hIgG1同种型对照(10μg/ml)孵育时没有观察到效果。相反地，hz515H7单抗(10μg/ml)能够在RAMOS、DAUDI和HeLa细胞上诱导显著的ADCC（大约40%）。

实施例13：在表达CXCR4的细胞上hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)单抗的补体依赖的细胞毒性（CDC）作用

如实施例7所描述，CDC分析是使用CellTiter Glo试剂(Promega,Madison,WI,USA)基于ATP的测量。

简言之，在hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)单抗存在时，将10000个靶细胞铺板于96孔平底板上。在室温下孵育10分钟后，以最终浓度10%加入合并的来自健康供体的人血清。在37℃下1小时后，通过测量ATP量确定生存力。如下计算细胞毒性百分比：%细胞毒性=100-[[实验的/无抗体的靶细胞]X100]。

图30表示表达CXCR4的细胞系：RAMOS和DAUDI细胞上的CDC。当细胞与hIgG1同种型对照(10μg/mL)孵育时没有观察到效果。相反地，hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7-1)单抗(10μg/mL)能够诱导显著的CDC：对于RAMOS细胞大约58%，对于DAUDI细胞为36%。

Claims

1.一种结合CXCR4的人源化抗体、或其含有CH2的结合片段，所述人源化抗体包含选自序列SEQ ID No.7至10的重链可变结构域和选自序列SEQ ID No.11至17的轻链可变结构域；在效应细胞或补体成分存在时，通过诱导至少一种效应功能杀死表达CXCR4的癌细胞，用于治疗癌症的方法中。

2.根据权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性（ADCC）组成。

3.根据权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于所述效应功能由补体依赖的细胞毒性（CDC）组成。

4.根据权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于所述效应功能由抗体依赖的细胞细胞毒性（ADCC）和补体依赖的细胞毒性（CDC）组成。

5.根据权利要求1至4任一项所述的人源化抗体，其中所述人源化抗体选自：

包含序列SEQ ID No.8的重链可变结构域和选自序列SEQ ID No.11至17的轻链可变结构域的人源化抗体；

包含选自序列SEQ ID No.7至10的重链可变结构域和序列SEQ ID No.13的轻链可变结构域的人源化抗体；

包含序列SEQ ID No.8的重链可变结构域和序列SEQ ID No.13的轻链可变结构域的人源化抗体；

包含选自序列SEQ ID No.18至21的重链和/或选自序列SEQ ID No.22至28的轻链的人源化抗体；

包含序列SEQ ID No.19的重链和/或选自序列SEQ ID No.22至28的轻链的人源化抗体；

包含选自序列SEQ ID No.18至21的重链和/或序列SEQ ID No.24的轻链的人源化抗体；和

包含序列SEQ ID No.19的重链和/或序列SEQ ID No.24的轻链的人源化抗体。

6.根据权利要求1至7任一项所述的人源化抗体，其特征在于所述抗体是IgG1。

7.根据权利要求1至6任一项所述的人源化抗体，其特征在于所述表达CXCR4的癌细胞由恶性血液细胞组成。

8.根据权利要求7所述的人源化抗体，其特征在于所述CXCR4恶性血液细胞选自淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。

9.根据权利要求1至8任一项所述的人源化抗体，其特征在于所述效应细胞包含NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。

10.根据权利要求1至9任一项所述的人源化抗体，其特征在于在4小时的孵育期后，所述人源化抗体诱导RAMOS淋巴瘤细胞上至少40%的ADCC水平。

11.根据权利要求1至10任一项所述的人源化抗体，其特征在于在NK细胞上没有诱导显著的ADCC。

12.根据权利要求1至11任一项所述的人源化抗体，其特征在于所述补体成分至少包含C1q。

13.根据权利要求1至12任一项所述的人源化抗体，其特征在于在1小时的孵育期后，所述人源化抗体诱导RAMOS淋巴瘤细胞上至少30%、优选至少50%、以及最优选至少70%的CDC水平。

14.根据权利要求1至13任一项所述的人源化抗体，其特征在于在1小时的孵育期后，所述人源化抗体诱导NIH3T3CXCR4细胞上至少30%、优选至少50%、以及最优选至少70%的CDC水平。

15.根据权利要求1至14任一项所述的人源化抗体，其特征在于人源化抗体、或其含有CH2的结合片段结合至少一个人FcγR。

16.根据权利要求15所述的人源化抗体，其特征在于所述至少一个FcγR是人FcγRI。

17.根据权利要求16所述的人源化抗体，其特征在于所述人源化抗体根据

模式以1至10nM之间的解离常数（KD）结合所述FcγRI。

18.根据权利要求17所述的人源化抗体，其特征在于所述至少一个FcγR是人FcγRIIIA。

19.根据权利要求18所述的人源化抗体，其特征在于所述人源化抗体根据异质性配体模式以200至1000nM之间的解离常数（KD）结合所述FcγRIIIA。

20.一种结合CXCR4的人源化抗体、或其含有CH2的结合片段，通过杀死表达CXCR4的癌细胞用于治疗癌症的方法中；所述人或人源化抗体包含选自序列SEQ ID No.7至10的重链可变结构域和选自序列SEQ ID No.11至17的轻链可变结构域；其中在效应细胞或补体成分存在时，诱导所述人或人源化抗体的至少一种效应功能。

21.根据权利要求20所述的人源化抗体，其特征在于所述癌症由淋巴瘤组成。

22.一种用于筛选结合CXCR4的人源化抗体、或其含有CH2的结合片段的方法，所述人源化抗体或其含有CH2的结合片段在效应细胞或补体成分存在时，通过诱导至少一种效应功能用于杀死表达CXCR4的癌细胞，其中所述方法包括至少一个选自以下的选择步骤：

-在1小时的孵育期后，选择诱导RAMOS淋巴瘤细胞上至少30%、优选至少50%以及最优选至少70%CDC水平的抗体；

-在1小时的孵育期后，选择诱导NIH3T3CXCR4细胞上至少30%、优选至少50%以及最优选至少70%CDC水平的抗体；

-选择根据

模式以1至10nM之间的解离常数（KD）结合FcγRI的抗体；