CN103623403A

CN103623403A - 抗猪瘟病毒和猪圆环病毒感染的疫苗组合物及制备和应用

Info

Publication number: CN103623403A
Application number: CN201210307562.1A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2012-08-27
Filing date: 2012-08-27
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2032-08-27
Also published as: CN103623403B

Abstract

本发明涉及一种抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物及其制备和应用。该方法将猪圆环病毒2型亚单位抗原与猪瘟病毒抗原混合冻干制成抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染二联疫苗组合物，或以猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染二联疫苗组合物的方式制成二联疫苗组合物试剂盒。该二联苗疫苗组合物不产生免疫干扰，免疫后猪瘟病毒抗原产生免疫反应加快，其保护抗体比单苗免疫后抗体提前一周达到免疫保护剂量，二联疫苗中猪圆环病毒疫苗产生的抗体与单苗免疫效果相当。该方法制苗工艺简单，生产效率高。经动物实验证明，疫苗组合物效果优于单苗免疫效果，具有很大的应用价值。

Description

抗猪瘟病毒和猪圆环病毒感染的疫苗组合物及制备和应用

技术领域

本发明属于畜类生物制药技术领域，涉及一种猪用疫苗组合物，具体说来，涉及一种抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物及其制备和应用。

背景技术

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swinefever virus，CSFV)引起的一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。该病死亡率高达80％～90％，世界动物卫生组织(OIE)将其列为OIE疾病名录，我国也将其列为一类传染病。猪瘟的防制历来是全世界猪瘟存在国非常重视的课题，为此各国都投入了大量的人力、物力，并取得了很大的成绩。目前疫苗接种仍是控制猪瘟的重要手段。我国生产的猪瘟兔化弱毒疫苗有脾淋苗、乳兔组织苗、牛睾丸原代细胞苗及最近两年发展起来的猪睾丸传代细胞苗，这些工艺生产的猪瘟疫苗普遍存在生产工艺复杂、易受外源病毒污染、产毒滴度不高、批间差异大等缺点，给疫苗产量及质量的提高带来困难。

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，无囊膜，是目前发现的最小的动物病毒。猪圆环病毒现己成为全球广泛传播的猪病病毒，其具有流行范围广、各生长阶段猪感染严重、混合感染突出等特点，PCV2在我国的流行始于2000年，在我国该病毒的阳性率也呈逐年上升的趋势，目前在许多省份危害严重，给我国养猪业造成了巨大的损失，严重威胁了我国养猪业的发展。目前世界上研发的圆环病毒疫苗主要种类有：PCV2全病毒灭活疫苗CIRCOVAC；PCVI-PCV2嵌合病毒灭活疫苗SuvaxynPCV2；杆状病毒表达多联疫苗CircoFLEX和PorcilisPCV。

目前免疫接种仍是我国防治猪瘟和猪圆环病毒病的重要措施。但猪用疫苗品种很多，在实际操作中，多针次、多剂量、多种免疫程序难以合理安排，既繁琐、费时、费力、增加成本，且容易造成漏种，直接影响免疫效果。

专利CN 101277717A公开了一种对抗猪圆环病毒2型(PCV-2)的疫苗，该疫苗由至少20微克/剂量的猪圆环病毒2型(PCV-2)与ORF-2蛋白或重组ORF-2蛋白构成，其重组蛋白优选通过由杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达的方式产生。该疫苗可用于保护仔猪免受PCV-2感染(并因此对抗PMWS)。该疫苗只能防治一种病，且其亚单位抗原经乳化后保存时间短。

中国专利CN 101181637A公开了一种用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，该方法通过选择细胞系作为制苗用细胞，并对制苗用细胞的传代与培养，然后进行细胞毒种的繁殖及制苗毒液的繁殖，最后进行配苗、分装及冻干来生产猪瘟活疫苗。该方法种毒制备过程繁琐，可控性差，批间差异大，生产周期长，只能防治一种疾病。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种生产工艺简单，疫苗质量好，可以同时防治猪瘟、猪圆环病毒病两种传染病，并能避免多次接种造成免疫应激反应及免疫效果降低的疫苗及其制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物及其制备和应用。该二联疫苗组合物含有圆环病毒2型抗原和猪瘟病毒抗原，可以同时防治猪瘟、猪圆环病毒病两种传染病，与单苗相比，该二联疫苗组合物并没有产生免疫干扰现象，疫苗免疫效果没有下降，采用该二联疫苗组合物免疫后猪瘟病毒抗原产生的免疫反应加快了，且二联疫苗组合物中圆环病毒2型疫苗产生的抗体与单苗免疫效果相当。该二联疫苗组合物的制苗工艺简单，生产效率高。经动物实验证明，该疫苗组合物的免疫效果优于单苗免疫效果，具有很大的应用价值。

为此，本发明提供了一种抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物，其包含猪瘟病毒抗原和猪圆环病毒2型抗原。

在本发明的一个实施例中，在所述二联疫苗组合物中，猪瘟病毒抗原与猪圆环病毒2型抗原的体积比为1∶2。

根据本发明，所述猪瘟病毒抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪瘟病毒抗原中的一种或几种，并且，所述猪瘟抗原选自猪瘟全病毒、含有猪瘟病毒免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何至少含猪瘟病毒免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种；优选所述猪瘟病毒抗原为猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗原。

本发明中，所述猪瘟病毒抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪瘟病毒感染的免疫应答。所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份(2ml)含猪瘟病毒抗原为10^4.0TCID₅₀。

同样，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型抗原中的一种或几种，并且，所述猪圆环病毒2型抗原选自猪圆环病毒2型全病毒抗原，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何至少含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。优选所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成份。

本发明中，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份(2ml)含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量至少为10^5.5TCID₅₀。优选所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份(2ml)含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为4.5×10^5.0TCID₅₀～10^6.0TCID₅₀。进一步优选所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份(2ml)含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为9×10^5.0TCID₅₀。

在本发明的一个具体实施方式中，所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株、PCV2LG株、PCV2DBN-SX07-2的抗原或疫苗和/或PCV2亚单位抗原。优选所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株(保藏编号为CGMCC No.23890，公开于专利文献CN 101240264A)和/或PCV2ORF2蛋白。

也就是说，由于PCV2基因组大小为1767bp或1768bp，不同毒株之间核苷酸序列同源性较高，均在90％以上，因此PCV2SH株(GenBank登录号为AY686763)、PCV2LG株(GenBank登录号为HM038034)、PCV2DBN-SX07-2(GenBank登录号为HM641752)的抗原或疫苗均在本发明保护范围之内。

所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为序列表SEQ NO.1的DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO.2的氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75％以上的氨基酸序列的蛋白。优选所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为与序列表SEQ NO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白同源性在80％以上的氨基酸序列的蛋白。进一步优选所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为与序列表SEQ NO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白同源性在90％以上的氨基酸序列的蛋白。

本发明中，所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型ORF2蛋白的含量为0.5～20μg/头份。优选所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型ORF2蛋白的含量为5～10μg/头份。

本发明中，所述猪圆环病毒2型抗原还包含至少一种猪圆环病毒2型灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗。所述PCV2抗原还可以选自，例如，梅里亚公司(Merial)的Circovac-PCV2；辉瑞公司(Pfizer)的Suvaxyn-PCV2；哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)；福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亚单位疫苗，如勃林格殷格翰公司(Boehringer-Ingelheim)的猪圆环病毒疫苗(Ingelvac

)。

本发明还进一步提供了一种根据本发明所述二联疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤：将猪瘟病毒抗原与猪圆环病毒2型抗原混合后进行冻干制得二联疫苗组合物。

根据本发明方法，本发明还包括在配苗步骤之前的制备猪瘟病毒抗原的步骤及制备猪圆环病毒2型抗原的步骤。

在本发明的一个实施例中，所述二联疫苗组合物还包括疫苗佐剂和/或冻干保护剂，所述猪瘟病毒抗原与冻干保护剂的体积比为1∶1，所述冻干保护剂包括明胶和/或乳糖。所述乳糖的浓度为12wt％～30wt％，优选所述乳糖的浓度为15wt％。所述明胶的浓度为1wt％～5wt％，优选所述明胶的浓度为2wt％。

本发明中，在所述猪瘟病毒抗原、所述猪圆环病毒2型抗原以及所述疫苗组合物中，所述疫苗佐剂均选自氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Montanide^TM Gel、蜂胶、ISA206、ISA760VG、氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物中的一种或几种。

本发明还同时提供了一种根据本发明所述二联疫苗组合物在制备抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物试剂盒中的应用，其包括以猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物的方式来制备抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物试剂盒。

上述应用包括：将猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗和猪瘟病毒疫苗分装于分开的容器或者装于一个容器中制成二联疫苗组合物试剂盒；用猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物，然后施用。

本发明中，所述猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗是将猪圆环病毒2型全病毒抗原液与0.85％的生理盐水和疫苗佐剂混合后制得。

本发明中，所述制备猪瘟病毒疫苗是将猪瘟病毒抗原液与冻干保护剂混合后，冻干制得。其中，所述猪瘟病毒抗原与冻干保护剂的体积比为1∶1，所述冻干保护剂包括明胶和/或乳糖。所述乳糖的浓度为12wt％～30wt％，优选所述乳糖的浓度为15wt％。所述明胶的浓度为1wt％～5wt％，优选所述明胶的浓度为2wt％。

在本发明的一个具体的实施例中，将所述猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗和猪瘟病毒疫苗分装于分开的容器中；施用时，用猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物。

在本发明的另一个具体的实施例中，将所述猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗和猪瘟病毒疫苗装于一个容器中，作为稀释液的猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗与猪瘟病毒疫苗通过屏障分开，施用时，破坏或打开屏障，用猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物。所述屏障，例如，可以是隔板或隔膜。

本发明中所述用语“破坏或打开屏障”是指用锐器(如针头等)穿孔或破坏屏障，或者打开屏障上所设置的活动窗口。

本发明利用从ATCC(ATCC，American type culture collection，美国模式培养物集存库)购买的ST细胞系，用从中国兽医药品监察所购买的猪瘟兔化弱毒(冻干脾毒F481代)，经兔体复壮一代后进行传代细胞适应，制备了传代细胞适应的毒种，该毒种制备的疫苗免疫动物后抗体产生滴度较高，具有很好的免疫保护效果，与现有猪瘟疫苗生产工艺相比，采用本发明的方法生产猪瘟活疫苗将不再使用兔子来进行繁殖种毒，使猪瘟抗原的生产工艺简化。

本发明在现有猪圆环病毒疫苗制备的基础上，将猪圆环病毒2型亚单位抗原与猪瘟病毒抗原按照一定的比例混合后冻干制成抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物，或者以猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物的方式制成抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物试剂盒。上述二联疫苗组合物与单苗相比，并没有产生现有技术中一次防疫同时注射两种或两种以上的疫苗通常出现的疫苗之间的免疫干扰现象，疫苗免疫效果没有下降，联苗免疫后猪瘟病毒抗原产生的免疫反应反而加快了，其保护抗体比单苗免疫后抗体提前一周达到免疫保护剂量的抗体，二联疫苗组合物中圆环病毒疫苗产生的抗体与单苗免疫效果相当。该方法使制苗工艺简化，提高了生产效率。经动物实验证明，二联疫苗组合物效果优于单苗免疫效果。

与现有的猪圆环病毒2型或猪瘟的单价疫苗的效力相比，根据本发明方法所获得的抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物在对猪注射免疫过程中，减少了免疫次数，疫苗组合物安全性更佳，并可以避免多次接种免疫出现的不良反应。

此外，本发明的抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，采用本发明的疫苗组合物免疫接种猪只，可以达到免疫一针就能预防猪瘟、猪圆环病毒病两种传染病的目的，避免了多次接种造成免疫应激反应及免疫效果降低。这样，在降低了免疫成本的同时，节约了免疫程序，更加经济可靠并被用户接受，具有商业上成功的基础，具有很大的应用价值。

具体实施方式

本发明是通过两种技术方案来实现的，方案1是将猪瘟病毒与猪圆环病毒2型亚单位抗原按照一定的配比混合后进行冻干，制成抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物，其包括以下具体实施步骤：

1)猪瘟病毒抗原的制备；

2)猪圆环病毒2型亚单位抗原的制备；

3)猪瘟病毒抗原与猪圆环病毒2型亚单位抗原配比混合后冻干制备抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物；

4)抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物与两种单苗分别免疫动物后进行效力评价。

方案2是以制备好的猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物的方式来制备抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物试剂盒，其包括以下具体实施步骤：

1)猪瘟病毒抗原的制备；

2)猪瘟病毒活疫苗的制备；

3)猪圆环病毒2型全病毒抗原的制备；

4)猪圆环病毒2型全病毒灭活疫苗的制备；

5)将猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗和猪瘟病毒疫苗分装于分开的容器或者装于一个容器中制成二联疫苗组合物试剂盒；

6)以猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物；

7)抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物与两种单苗分别免疫动物后进行效力评价。

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实施例1：将猪瘟病毒与猪圆环病毒2型亚单位抗原混合后进行冻干，制备抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物

1.猪瘟病毒抗原液的制备

(1)将长成良好单层的对猪瘟病毒高敏感的ST细胞(购自ATCC)(American type culture collection，美国模式培养物集存库)用0.125wt％胰酶和0.03wt％EDTA(乙二胺四乙酸)的消化液进行消化分散，细胞计数，并以合适的密度接种后，加入含有3wt％～5wt％FBS(胎牛血清)(购自PAA公司，批号A15110-1462)的MEM(购自GIBCO公司，批号856833)，同时按照M.O.I.(感染复数)＝0.1～0.2接毒剂量加入种毒，置于34～37℃温箱中进行培养。

(2)培养三天后进行第一次收毒，收毒后补加1.5wt％～3wt％FBS的细胞维持液，以后每隔2天收毒一次，连续收毒5次。收毒后将抗原置于-20℃储藏。

(3)将5次收获的病毒液混合取样后进行TCID₅₀和RID测定，测定结果为病毒液混合样为10^6.5TCID₅₀/ml，50万RID/ml测定结果同时按照国家规定的检验标准进行检测，并将抗原液冻于-20℃保存。

2.猪圆环病毒2型亚单位抗原的制备

(1)将猪圆环病毒2型ORF2基因引入蜂毒素信号肽基因序列，转入pMD-18T载体，获得包含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组载体：首先设计引物Spe-ATG(5′-cgactagtatgacgtatccaaggaggcgt-3′)和引物Hind-TAA(5′-gcaagctttattcattaagggttaagttggg-3′)，以保藏编号为CGMCC No.2389的PCV2-SH株的基因组DNA为模板，扩增PCV2-0RF2基因，并将扩增的ORF2基因克隆入pMD-18T载体中，获得重组载体pT-ORF2。PCR产物大小约730bp。将PCR产物进行测序，由电泳及测序结果可知，重组载体pT-ORF2含序列表中的SEQ IDNO1序列。具体序列详见专利CN101884787A。

设计四条引物，以pT-ORF2为模板，通过融合PCR方法在ORF2基因序列5′端引入蜂毒素信号肽核苷酸序列和限制性酶SpeI和HindIII酶切位点，引物如下：

HBM-F 15′-tttcttacatctatgcgacgtatccaaggaggcgt-3′

HBM-R 15′-ggcaacgttgactaagaatttcatactagtatcgtccac-3′

HBM-F25′-ttatggtcgtatacatttcttacatctatgcg-3′

HBM-R25′-aaacaagggcaacgttgactaagaatttc-3′

通过SpeI和Hind III双酶切带有蜂毒素信号肽核苷酸序列的ORF2序列，并将其克隆入转移载体pFastBacTM1(Invitrogen)，构成包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的载体pFastBacP2。用PCR扩增并测序，由测序结果可知，重组转移载体pFastBacP2含蜂毒素信号肽核苷酸序列，即含序列表中的SEQ ID NO2序列。具体序列详见专利CN101884787A。

(2)包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的转移载体转化入含有穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒vBac-P2；将pFastBacP2转化含有病毒穿梭质粒Bacmid的大肠杆菌DH10Bac(购自Invitrogen公司)，获得重组质粒Bacmid-P2；经PCR筛选，提取阳性质粒，制备阳性重组质粒Bacmid-P2DNA。采用

Reagent转染Sf9细胞(购自Invitrogen公司)，待细胞出现病变后，进行重组病毒噬斑纯化和病毒扩增，然后通过通用引物M13F和M13R进行PCR验证目的重组ORF2基因。纯化获得重组杆状病毒，命名为vBac-P2。扩增重组杆状病毒vBac-P2作为种毒，通过噬斑法进行效价滴定后于4℃保存备用。

(3)重组杆状病毒vBac-P2感染昆虫细胞及昆虫细胞的培养，将vBac-P2重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM(购自Invitrogen公司)。在含有200～350ml的EXPRESS FIVE SFM培养基的500ml转瓶中无菌悬浮培养High Five^TM细胞，接种细胞密度为0.3～0.6×10⁶个细胞/ml，当细胞密度达到1×10⁶个细胞/ml时，用重组病毒vBac-P2接种各转瓶，接种到各转瓶中的重组杆状病毒具有不同的感染复数(M.O.I.)分别是0.01、0.1、10，接种重组杆状病毒后，以26～28℃培养，转速为100rpm，培养4天。

(4)重组杆状病毒的猪圆环病毒2型重组ORF2基因表达猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白，收获和纯化猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白。具体表达条件及鉴定方法参照专利CN101884787A。

(5)将培养物10000g离心20min，分离沉淀和上清液，上清液通过1μm滤膜进行过滤，然后通过超滤浓缩纯化，超滤膜孔径为10000(切割分子量)，纯化后的样品溶液经7mM二乙烯亚胺(BEl)灭活重组杆状病毒载体，36～48h，加入等量的硫代硫酸纳中和。然后通过紫外分光光度计进行蛋白抗原含量测定，测定结果为500μg/ml。4℃保存。

3.猪瘟病毒抗原与猪圆环病毒2型亚单位抗原的配比、冻干及检验

(1)将制备好的猪瘟病毒抗原缓慢解冻后，无菌去除细胞碎片。

(2)将制备好的猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白(稀释成含量为400μg/ml)与猪瘟病毒抗原按照体积比为1∶2的比列混合后，再按照1∶1的比列加入明胶、乳糖冻干保护剂，搅拌混合1h后进行分装。

(3)将分装好的疫苗瓶放入冷冻真空干燥箱内，按照设定好的冻干程序进行冻干，冻干成品为20dose免疫剂量。每头猪免疫剂量为1dose，包含猪瘟抗原含量为10^4.0TCID₅₀/dose，猪圆环病毒二型ORF-2亚单位抗原20μg/dose。

(4)按照国家标准进行冻干后成品的检验，均符合规定。

4.抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物与单苗免疫仔猪后保护性抗体产生情况

(1)疫苗免疫

选取猪瘟、猪圆环病毒抗体阴性的20日龄仔猪35头，随机分为4组，第一组10头，免疫市售商品化猪瘟疫苗(广东永顺生物制药，批号1004)1dose/头，第二组10头，免疫市售商品化猪圆环病毒疫苗(勃林格猪圆环病毒疫苗，生产批号309-526A)1dose/头，第三组10头，免疫猪瘟、猪圆环病毒亚单位二联疫苗1dose/头。第四组5头，为不免疫对照组。

(2)抗体监测

免疫后每周进行采血，分离血清后，采用IDEXX公司生产的阻断ILISA试剂盒检测猪瘟抗体，采用中和试验方法检测猪圆环病毒抗体。具体检测结果如下：

表1为猪瘟活疫苗免疫仔猪后抗体动态变化，表2为猪圆环病毒2型疫苗免疫仔猪后抗体动态变化，表3为抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物免疫仔猪后抗体动态变化。表4为空白对照组血清中猪瘟、猪圆环病毒2型抗体动态变化。根据抗体结果可知，二联疫苗组合物免疫仔猪后猪瘟抗体水平较单苗免疫上升速度快一周左右，抗体阻断率平均值比单苗免疫水平高。可以给免疫猪提供更快更好的保护，圆环病毒2型抗体水平与单苗免疫抗体水平基本持平。从该结果可以看出二联疫苗组合物对猪瘟抗原免疫效果有协同作用，但不影响圆环病毒抗原的免疫效果。

表1猪瘟疫苗免疫仔猪后抗体动态变化

表2猪圆环病毒2型疫苗免疫仔猪后抗体动态变化

表3抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物免疫仔猪后抗体动态变化

表4空白对照组血清猪瘟、猪圆环病毒2型抗体动态变化

令人意外的是，二联疫苗组合物免疫仔猪后，不但没有出现两种免疫原干扰的现象，反而使二联疫苗组合物中猪瘟病毒的免疫能力加强了，猪瘟病毒单苗免疫后一般3周抗体转阳，但本试验中猪瘟病毒抗体提前一周(即免疫后两周)达到免疫保护剂量的水平。而免疫后三周的抗体较单苗免后高10％(阻断率)以上。以猪圆环病毒2型疫苗作为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗免疫猪后产生了相同的效果。

实施例2：以制备好的猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物的方式来制备抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物试剂盒。

1.猪瘟病毒抗原液的制备

(1)将长成良好单层的对猪瘟病毒高敏感的ST细胞(来源于ATCC)用0.125％胰酶和0.03％EDTA的消化液，进行消化分散，细胞计数后以合适的密度接种后，加入3wt％～5wt％FBS(购自PAA公司，批号A15110-1462)的MEM(购自GIBCO，批号856833)，同时按照M.O.I.＝0.1～0.2接毒剂量加入种毒，置于34～37℃温箱中进行培养。

(2)培养三天后进行第一次收毒，收毒后补加1.5wt％～3wt％FBS的细胞维持液，以后每隔2天收毒一次，可连续收毒5次。收毒后将抗原置于-20℃储藏。

(3)将5次收获的病毒液混合取样后进行TCID₅₀和RID测定，测定结果为病毒液混合样为10^6.5TCID₅₀/ml，50万RID/ml，同时按照国家规定的检验标准进行检测，并将抗原液冻于-20℃保存。

2.猪瘟病毒活疫苗的制备

猪瘟病毒抗原液(含10^6.5TID₅₀/ml) 50ml

2％明胶水溶液 25ml

15％乳糖水溶液 25ml

将各种液体按上述比例放入容器，搅拌混匀30～60min，无菌分装进行冻干，制备成猪瘟冻干活疫苗。

3.猪圆环病毒2型抗原的制备

猪圆环病毒2型(SH株)病毒液的制备：将长满单层的PK15细胞(购自ATCC)，倒去细胞培养液，将PCV2毒种按M.O.I.＝0.1～0.2的接种量接种于PK15细胞上，37℃吸附30min，加入细胞维持液，置36～37℃旋转培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，36～37℃培养4～7日后收获细胞培养物，冻融2～3次后，测定毒价结果为10^6.0TCID₅₀/ml，将抗原液置于-20℃以下保存。

4.猪圆环病毒2型抗原的灭活及灭活疫苗的制备

猪圆环病毒2型(SH株)病毒液的处理：

将病毒液用中空纤维(0.5～2μm)滤柱过滤，除去细胞碎片，再加入0.1％～0.2％(v/v)的甲醛溶液37℃灭活18h，加入0.1％～0.2％(v/v)中和剂来中和甲醛的毒性。

制备猪圆环病毒2型灭活疫苗：

灭活的PCV2病毒液(含10^6.0TCID₅₀/ml) 45ml

0.85wt％的生理盐水 45ml

Montanide^TM Gel 10ml

将各种液体按上述比例放入容器，再放入Montanide^TM Gel，然后用IKA数显欧洲之星搅拌器(500～800r/min)搅拌混匀5～10min即制成猪圆环病毒2型灭活疫苗。

5.制备抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物试剂盒

将所述猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗和猪瘟病毒疫苗装于一个容器中，作为稀释液的猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗与猪瘟病毒疫苗通过隔膜分开。

6.制取抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物

用针头在隔膜上穿孔，使作为稀释液的猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗与猪瘟病毒疫苗接触并将其稀释后获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物。

7.抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物(试剂盒)与两种单苗分别免疫动物后进行效力评价

(1)疫苗免疫

选取猪瘟、猪圆环病毒抗体阴性的20日龄仔猪35头，随机分为4组，第一组10头，免疫市售商品化猪瘟疫苗(广东永顺生物制药，批号1004)1dose/头，第二组10头，免疫市售商品化猪圆环病毒全病毒灭活疫苗(哈尔滨维科生物技术开发公司生产批号2011021)1dose/头，第3组为免疫抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物(试剂盒)，免疫1dose/头，第4组为不免疫对照组。

(2)抗体监测

猪瘟病毒活疫苗单苗免疫结果见表5，猪圆环病毒2型疫苗单苗免疫结果见表6，以猪圆环病毒2型疫苗作为稀释液，稀释猪瘟病毒活疫苗后(试剂盒)免疫动物，其产生抗体的情况见表7，空白对照组结果见表8。

表5猪瘟病毒活疫苗免疫仔猪后抗体动态变化

表6猪圆环病毒2型疫苗免疫仔猪后抗体动态变化

表7抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物(试剂盒)免疫仔猪后抗体动态变化

表8空白对照组血清猪瘟、猪圆环病毒2型抗体动态变化

令人意外的是，二联苗组合物(试剂盒)免疫仔猪后，也没有出现两种免疫原干扰的现象，同样使猪瘟病毒的免疫能力加强了，本试验中猪瘟抗体提前一周(即免疫后两周)达到免疫保护剂量的水平。而免疫后三周的抗体较单苗免后高10％(阻断率)以上。猪圆环病毒2型疫苗免疫后与单苗效果相当。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物，其包含猪瘟病毒抗原和猪圆环病毒2型抗原。

2.根据权利要求1所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述猪瘟病毒抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪瘟病毒抗原中的一种或几种，并且，所述猪瘟抗原选自猪瘟全病毒、含有猪瘟病毒免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何至少含猪瘟病毒免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种；

所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型抗原中的一种或几种，并且，所述猪圆环病毒2型抗原选自猪圆环病毒2型全病毒抗原，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何至少含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。

3.根据权利要求2所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份含猪瘟病毒抗原为10^4.0TCID₅₀；

所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量至少为10^5.5TCID₅₀；

所述猪瘟病毒抗原为猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗原；

所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成份。

4.根据权利要求3所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为4.5×10^5.0TCID₅₀～10^6.0TCID₅₀；

所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株、PCV2LG株、PCV2DBN-SX07-2的抗原或疫苗和/或PCV2亚单位抗原。

5.根据权利要求4所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述二联疫苗组合物中每剂量或每头份含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量为9×10^5.0TCID₅₀；

所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株和/或PCV2ORF2蛋白。

6.根据权利要求5所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为序列表SEQ NO.1的DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO.2的氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75％以上的氨基酸序列的蛋白；

所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型ORF2蛋白的含量为0.5～20μg/头份。

7.根据权利要求6所述的二联疫苗组合物，其特征在于：

所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为与序列表SEQ NO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白同源性在80％以上的氨基酸序列的蛋白；

所述二联疫苗组合物中猪圆环病毒2型ORF2蛋白的含量为5～10μg/头份。

8.根据权利要求7所述的二联疫苗组合物，其特征在于：所述猪圆环病毒2型ORF2蛋白为与序列表SEQ NO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白同源性在90％以上的氨基酸序列的蛋白。

9.一种根据权利要求1～8中任意一项所述二联疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤：将猪瘟病毒抗原与猪圆环病毒2型抗原混合后进行冻干制得二联疫苗组合物。

10.一种根据权利要求1～8中任意一项所述二联疫苗组合物在制备抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物试剂盒中的应用，其包括以猪圆环病毒2型全病毒抗原灭活苗为稀释液，稀释猪瘟病毒疫苗获得抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物的方式来制备抗猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染的二联疫苗组合物试剂盒。