CN103619805A - 苄胺衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种对血癌、尤其是多发性骨髓瘤的治疗有效的新型化合物，其还是对导致癌复发的SP细胞（Side Population Cell）的抑制也有效的化合物。本发明的化合物是具有特定的苄胺结构的新型化合物。

Description

苄胺衍生物
技术领域
本发明涉及对血癌有效且新型的苄胺衍生物、包含该苄胺衍生物的医药、包含该苄胺衍生物的血癌治疗药、该苄胺衍生物在治疗血癌中的应用、以及使用该苄胺衍生物来治疗血癌的方法。
背景技术
血癌是指使血液中所含的细胞癌化的疾病，其根据经癌化的细胞的种类而进行分类。大致分为使骨髄中的造血干细胞癌化的白血病、使淋巴细胞癌化的恶性淋巴瘤、使骨髄中的浆细胞癌化的多发性骨髓瘤三种。
血癌曾被称作不治之症，随着医学的进步，治愈率越发提高，对于白血病、恶性淋巴瘤而言，通过早期进行适当的治疗，也能够长期生存。但是，还存在药剂耐性的问题等，不断地要求新型抗癌药。
此外，在血癌中，多发性骨髓瘤可以说是难以治愈的，而且多出现预后不良的情况，复发率高。一般而言，作为化学疗法而使用美法仑和强的松龙的并用疗法（MP疗法）、环磷酰胺和强的松龙的并用疗法（CP疗法），但是难以治愈，因此正在开发萨力多胺（thalidomide）等新型治疗药。
但是，以往，作为抗癌药，开发了各种化合物作为开发候补品。例如，作为具有苄胺结构的抗癌药，可以列举专利文献1中记载的抗癌药。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2007－515413号公报
发明内容
发明所要解决的课题
如上所述，以往，作为抗癌药，开发了各种化合物。但是，在血癌中，多发性骨髓瘤的治愈非常困难，需要更有效的治疗药。此外，即便症状暂且得到控制，在癌症中也常伴有复发的问题，因此需要对复发的抑制有效的化合物。
为此，本发明的目的在于提供对血癌、尤其是多发性骨髓瘤的治疗有效的新型化合物，其还是对导致癌复发的SP细胞（Side Population Cell，侧群细胞）的抑制也有效的化合物。
用于解决课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而反复进行了深入研究。结果发现具有特定的苄胺结构的新型化合物显示出对血癌细胞选择性的细胞毒性、并且尤其对SP细胞也是有效的，从而完成了本发明。
本发明的苄胺衍生物，其特征在于，其以下述式（I）来表示。
[化1]
Figure BDA0000423555620000021
［式中，
X表示羰基（－C（＝O）－）、氧基羰基（－C（＝O）O－）、亚砜基（－S（＝O）－）或磺酰基（－S（＝O）2－）；
Y表示羰基或－CH（OR5）－；
R1表示氢原子、C1-6烷基或苄基；
R2表示C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、或可以具有取代基α的苯基；
R3表示可以具有取代基β的C1-6烷基；
R4表示氢原子、氨基、羟基氨基、C1-6烷氧基氨基、羧基或（C1-6烷氧基）羰基；
R5表示氢原子、C1-7烷酰基或三（C1-6烷基）甲硅烷基；
取代基α表示选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素原子、氰基和硝基中的1种以上的基团；
取代基β表示选自卤素原子、羟基、C1-6烷氧基和苄基氧基中的1种以上的基团；
n表示1以上且5以下的整数］
本发明中，“C1-6烷基”是指碳原子数1～6的直链状或支链状的饱和脂肪族烃基。例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。优选为C1-4烷基、更优选为C1-2烷基、最优选为甲基。
“C2-6烯基”是指碳原子数2～6、且具有至少一个碳-碳双键的直链状或支链状的不饱和脂肪族烃基。例如为乙烯基、1－丙烯基、2－丙烯基（烯丙基）、异丙烯基、2－丁烯基、3－丁烯基、异丁烯基、戊烯基、己烯基等。优选为C2-4烯基、更优选为2－丙烯基（烯丙基）。
“C2-6炔基”是指碳原子数2～6、且具有至少一个碳－碳三键的直链状或支链状的不饱和脂肪族烃基。例如为乙炔基、1－丙炔基、2－丙炔基、2－丁炔基、3－丁炔基、戊炔基、己炔基等。优选为C2-4炔基、更优选为C2-3炔基。
作为“氨基”，可举出－NH2基、单（C1-6烷基）氨基和二（C1-6烷基）氨基。更具体而言，作为单（C1-6烷基）氨基，可以列举例如甲基氨基、乙基氨基、异丙基氨基、叔丁基氨基、正戊基氨基、正己基氨基等。二（C1-6烷基）氨基中的2个C1-6烷基可以彼此相同或不同。作为二（C1-6烷基）氨基，可以举出例如二甲基氨基、二乙基氨基、二异丙基氨基、叔丁基甲基氨基、叔丁基乙基氨基、二（叔丁基）氨基、二（正戊基）氨基、二（正己基）氨基等。
作为“羟基氨基”可以举出－NHOH基和N－（C1-6烷基）羟基氨基。更具体而言，作为N－（C1-6烷基）羟基氨基，可以举出例如N－甲基羟基氨基、N－乙基羟基氨基、N－异丙基羟基氨基、N－叔丁基羟基氨基、N－正戊基羟基氨基、N－正己基羟基氨基等。
作为“C1-6烷氧基氨基”，可以举出－N（C1-6烷氧基）H基和（C1-6烷基）（C1-6烷氧基）氨基。更具体而言，作为－N（C1-6烷氧基）H基，可以举出例如甲氧基氨基、乙氧基氨基、异丙氧基氨基、叔丁氧基氨基等。作为（C1-6烷基）（C1-6烷氧基）氨基，可以举出例如甲氧基甲基氨基、甲氧基乙基氨基、乙氧基甲基氨基、乙氧基乙基氨基、异丙氧基甲基氨基、叔丁氧基甲基氨基等。
“C1-6烷氧基”是指C1-6烷基氧基。例如为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、正己氧基等。优选为C1-4烷氧基、更优选为C1-2烷氧基、进一步优选为甲氧基。
“（C1-6烷氧基）羰基”是指C1-6烷基氧基羰基。例如为甲氧基羰基、乙氧基羰基、正丙氧基羰基、异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、异丁氧基羰基、叔丁氧基羰基、正戊氧基羰基、正己氧基羰基等。优选为（C1-4烷氧基）羰基、更优选为（C1-2烷氧基）羰基、进一步优选为甲氧基羰基。
“C1-7烷酰基”是指甲酰基和C1-6烷基羰基。例如为甲酰基、乙酰基、丙酰基（乙基羰基）、丁酰基、异丁酰基（异丙基羰基）、三甲基乙酰基、戊酰基、异戊酰基、己酰基等。优选为C1-4烷酰基、更优选为C1-3烷酰基、进一步优选为乙酰基。
作为“三（C1-6烷基）甲硅烷基”，可以举出例如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基、二乙基异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基，优选为（C1-4烷基）甲硅烷基、更优选为三（C1-2烷基）甲硅烷基。
“卤素原子”包含氟原子、氯原子、溴原子和碘原子，优选为氯原子或溴原子。
在作为R2的苯基具有取代基α时，其取代数为1以上且5以下，优选为4以下、更优选为3以下、进一步优选为2以下。
在作为R3的烷基具有取代基β时，其取代数依赖于烷基的碳原子数、取代基β的种类等，通常为1以上且5以下，优选为4以下、更优选为3以下、进一步优选为2以下。作为R3，优选为苄基氧基（C1-6烷基）基、更优选为苄基氧基（C1-4烷基）基、进一步优选为苄基氧基（C1-2烷基）基。
在上述取代基数为2以上时，取代基可以彼此相同或不同。
本发明的苄胺衍生物（I）可以具有1个以上的手性中心，此时存在光学异构体。在本发明中为包含这些光学异构体的混合物和分离后的各同分异构体这两者的苄胺衍生物。
本发明的苄胺衍生物（I）可以利用常规方法制成盐。苄胺衍生物（I）的优选的盐为药学上允许的公知的非毒性盐，可以举出例如：盐酸盐、溴化氢盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；醋酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、蚁酸盐、甲苯磺酸盐、三氟醋酸盐等有机酸盐；海藻酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐等氨基酸盐；钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铵盐；三甲基胺盐、三乙基胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、二环己基胺盐等有机碱盐等。
作为本发明的苄胺衍生物（I），可以优选举出以下物质。
n为2以上的苄胺衍生物。
X为羰基的苄胺衍生物。
R2为C2-6烯基的苄胺衍生物。
R3为苄基氧基甲基的苄胺衍生物。
Y为羰基且R4为氢原子的苄胺衍生物。
本发明的药品和血癌治疗药，其特征在于，其包含上述苄胺衍生物（I）或其药学上允许的盐。
本发明的苄胺衍生物（I）是上述药品和血癌治疗药的有效成分，其用于治疗血癌。
此外，本发明的血癌的治疗方法，其特征在于，其包括施用上述苄胺衍生物（I）或其药学上允许的盐的工序。
发明效果
本发明的苄胺衍生物显示出对血癌细胞、尤其多发性骨髓瘤细胞选择性的细胞毒性。更详细而言，不仅对一般的上皮癌，而且对正常细胞也不显示细胞毒性。进而，本发明的苄胺衍生物对于导致癌复发的SP细胞（Side Population Cell）的抑制也是有效的。因此，本发明的苄胺衍生物与选择性低且对正常细胞也有害的以往的抗癌药不同，其作为更安全的药品、血癌治疗药非常有用。
附图说明
图1是表示本发明的苄胺衍生物和一般作为多发性骨髓瘤的治疗药使用的美法仑的、对人多发性骨髓瘤细胞的抗癌活性的图表。
图2是表示本发明的苄胺衍生物的、对各种癌细胞和正常细胞的细胞毒性的图表。
图3是（1）将被本发明的苄胺衍生物作用后的人多发性骨髓瘤细胞用核染色剂即Hoechst33258进行染色后的照片、（2）将被本发明的苄胺衍生物作用后的人多发性骨髓瘤细胞用作为细胞凋亡的标记的膜联蛋白V进行染色后的照片、以及（3）将被本发明的苄胺衍生物作用后的人多发性骨髓瘤细胞用流式细胞计进行分析后的结果。
图4是表示（1）对人多发性骨髓瘤细胞仅作用作为阴性对照的溶剂时的流式细胞计结果、（2）对人多发性骨髓瘤细胞作用作为阳性对照的美法仑时的流式细胞计结果、以及（3）对人多发性骨髓瘤细胞作用本发明的苄胺衍生物时的流式细胞计结果。
图5是表示（1）对人多发性骨髓瘤细胞仅作用作为阴性对照的溶剂时的甲基纤维素培养基中的菌落形成状况、以及（2）对人多发性骨髓瘤细胞作用本发明的苄胺衍生物时的甲基纤维素培养基中的菌落形成状况的照片。
图6是表示本发明的苄胺衍生物对人多发性骨髓瘤细胞、人急性髓细胞白血病细胞和人早幼粒细胞白血病细胞的抗癌活性的图表。
图7是表示一般作为多发性骨髓瘤的治疗药使用的美法仑对人多发性骨髓瘤细胞、人急性髓细胞白血病细胞和人早幼粒细胞白血病细胞的抗癌活性的图表。
具体实施方式
本发明的苄胺衍生物可以利用例如下述路线来合成。
[化2]
Figure BDA0000423555620000071
［上述路线中，各基团等与上述同义］
以下，按照每个工序进行说明。另外，对具有阻碍各反应的反应性基团的化合物可以适当进行保护、脱保护。该保护反应或脱保护工序中的保护基的种类和反应条件可以参照“PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS第二版”T.W.Green和P.G.M.Wuts，约翰·威利父子出版公司（为了参照而引入本申请）。
首先，通过使苯甲醛化合物（II）和胺化合物（III）反应来合成化合物（IV）。已知该反应为还原的氨基化反应。
在原料化合物中，苯甲醛化合物（II）具有简单的化学结构，因此若有市售的产品也可以将其利用，此外，还可以由本领域技术人员从公知化合物容易地进行合成。胺化合物（III）可以利用Hart,S.A.等,Org.Lett,第3卷,第1789～1791页（2001年）（为了参照而引入本申请）等中所述的方法或者基于该方法的方法而从丝氨酸衍生物等来合成。
例如，将胺化合物（III）溶解于溶剂后，在该溶液中添加苯甲醛化合物（II），从而制成希夫氏碱，再添加还原剂，由此进行上述反应。
上述反应中可以使用的溶剂只要是能够适度地溶解原料化合物并且不阻碍反应的溶剂，则并无特别限制，可以举出例如：二氯甲烷、1,2－二氯乙烷、氯仿等卤代烃类；甲醇、乙醇等醇类；二乙基醚、四氢呋喃等醚类；苯、甲苯等芳香族烃类；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等酰胺类。
对胺化合物（III）溶液的浓度进行适当调整即可，例如可以调整为1mg/mL以上且20mg/mL以下左右。
苯甲醛化合物（II）和胺化合物（III）理论上以等摩尔使用即可，在一方比另一方廉价或者一方比另一方容易获得时，也可以使一方以相对于另一方为1.01倍摩尔以上且1.2倍摩尔以下左右过量地使用。
对希夫氏碱化反应的温度和时间进行适当调整即可，一般从迅速地进行反应的方面出发，可以在10℃以上且50℃以下左右、反应1分钟以上且1小时以下左右即可。
可以在希夫氏碱化反应后，将还原剂直接添加到反应溶液中。作为还原剂，可以使用例如硼氢化钠、氢化铝锂、二异丁基氢化铝、氰基硼氢化钠、硼氢化锂、三乙基硼氢化锂、硼烷络合物、三乙基硅烷、硼氢化镍、三乙酰氧基硼氢化钠。还原剂只要以与苯甲醛化合物（II）或胺化合物（III）中的摩尔数较少的一方为等摩尔以上且1.2倍摩尔以下左右的量使用即可。
在添加还原剂时，优选利用冰冷却等使反应溶液的温度先为5℃以下。在添加后，缓缓地升高温度并在10℃以上且50℃以下左右、反应5小时以上且50小时以下左右即可。
在反应结束后，进行一般的后处理即可。例如可以在除去溶剂后利用柱层析、重结晶等对化合物（IV）进行纯化。
接着，向化合物（IV）中导入－X－R2基团。作为用于导入－X－R2基团的试剂，可以使用对应的酸（HO－X－R2）的酰氯、酰溴、活性酯等。在该反应中，在碱的存在下使化合物（IV）和上述试剂反应即可。
在该反应中可以使用的溶剂并无特别的限制，可以使用与上述还原的氨基化反应中所用的溶剂相同的溶剂。
用于导入－X－R2基团的试剂优选以相对于化合物（IV）为过量的量使用。例如可以以相对于化合物（IV）为1.05倍摩尔以上且20倍摩尔以下左右的量使用。
由于在有机溶剂中进行反应，因此作为碱，优选使用有机碱。可以使用例如三乙基胺、吡啶、二氮杂双环十一碳烯、1,8－双（二甲基氨基）萘等。碱的使用量至少为与用于导入－X－R2基团的试剂等摩尔的量。
在该反应中，可以在溶剂中混合上述化合物等。但是，由于用于导入－X－R2基团的试剂的反应性高，因此优选在混合时利用冰冷却等将反应液的温度冷却至5℃以下。在混合后，缓缓升高温度且在10℃以上且50℃以下左右、反应1小时以上且10小时以下左右即可。
在反应结束后进行一般的后处理即可。例如可以在除去溶剂后利用柱层析、重结晶等对化合物（IV）进行纯化。
进而，除了利用反应性基团的脱保护反应以外，还可以利用本领域技术人员公知的官能团变换反应来合成目标苄胺衍生物。
为了治疗血癌，本发明的苄胺衍生物（I）和其药学上允许的盐，可以以包含作为活性成分的该化合物、和适于经口施用或非经口施用的药学上允许的有机或无机的固体或液体赋形剂的药品制剂的形式来使用。该药品制剂可以为胶囊剂、片剂、糖包衣片、颗粒、吸入剂、坐药、溶液、洗剂、分散液、乳剂等剂型。在需要时，也可以在这些制剂中配合辅助剂、稳定化剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、其它一般所使用的添加剂。
对治疗有效的本发明的苄胺衍生物（I）的施用量还由患者的重症度、年龄、性別、状态等来决定，以患者的体重为基准计为例如0.001mg/kg以上且500mg/kg以下左右的施用量可以对血癌的治疗尤为有效。一般而言，可以在1天中施用以患者的体重基准计为例如0.005mg/kg以上且1000mg/kg以下左右的量。
本申请要求在2011年5月27日申请的日本专利申请第2011－119668号的优先权。在2011年5月27日申请的日本专利申请第2011－119668号的说明书的全部内容作为参考援引于本申请中。
实施例
以下，列举实施例对本发明进行更具体地说明，但是本发明自然不受下述实施例的限制，当然可以在适合上下文的主旨的范围内进行适当变更后加以实施，其均包含在本发明的技术范围内。
实施例1
[化3]
Figure BDA0000423555620000101
按照Hart,S.A.等,Org.Lett,第3卷,第1789～1791页（2001年）（为了参照而引入本申请）中记载的方法来合成上述原料化合物。在0℃下向该原料化合物（2.00g，6.21mmol）中添加氯化氢/醋酸乙酯（4M，30.0mL），在该温度下搅拌2小时。接着，减压馏去溶剂等，在所得的残渣中添加1M氢氧化钠水溶液，然后用氯仿进行萃取。之后，将有机层用无水硫酸钠干燥后，进行过滤，减压馏去溶剂。将所得的残渣（1.35g，5.67mmol）溶解于1,2－二氯乙烷（182mL）后，在室温下添加2,4－二甲氧基苯甲醛（0.942g，5.67mmol），搅拌10分钟。将反应液冷却至0℃后，加入三乙酰氧基硼氢化钠（1.20g，5.67mmol），边缓缓地升温至室温边搅拌1天。向反应液中添加饱和碳酸氢钠水溶液，然后，使用氯仿进行萃取。将所得的有机层用饱和食盐水进行洗涤，利用无水硫酸钠进行干燥后，进行过滤，减压馏去溶剂。利用柱层析（洗脱液：己烷/醋酸乙酯＝1/4）对残渣进行纯化，以73％的收率得到作为合成中间体的黄色油状的胺化合物（1.77g，4.56mmol）。
另外，将3－丁烯酸（0.443g，5.15mmol）溶解于二氯甲烷（2.0mL）后，在0℃下添加亚硫酰氯（0.613g，5.15mmol），在室温下搅拌1小时。减压馏去溶剂等后，在0℃下向所得的残渣中添加上述胺化合物（0.200g，0.515mmol）的二氯甲烷溶液（2.0mL）和三乙基胺（0.718mL，5.15mmol）。边将反应液缓缓升温至室温边搅拌3小时。向反应液中加入饱和氯化铵水溶液后，利用醋酸乙酯进行萃取，依次用蒸馏水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水对所得的有机层进行洗涤。接着，用无水硫酸镁干燥后，进行过滤，利用柱层析（洗脱液：己烷/醋酸乙酯＝1/1）对所得的残渣进行纯化，以73％的收率得到无色油状的目标化合物（0.172g，0.377mmol）。
实施例2
[化4]
Figure BDA0000423555620000111
在－78℃下向实施例1中得到的化合物（40mg，88μmol）的四氢呋喃溶液（860μL）中添加氢化铝锂（6.6mg，170μmol），在该温度下搅拌4小时。然后，在该温度下添加醋酸乙酯和饱和氯化铵水溶液后，升温至室温，再添加饱和柠檬酸水溶液。利用醋酸乙酯对反应混合物进行萃取后，用饱和食盐水对所得的有机层进行洗涤，用无水硫酸钠干燥。在过滤后，减压下馏去溶剂，利用柱层析（洗脱液：己烷/醋酸乙酯＝2/1）对所得的残渣进行纯化，以20％的收率得到黄色油状的目标化合物（6.8g，17μmol）。
1H-NMR（CDCl3，400MHz）δ=3.30（1H，dd，J=16.8和6.8Hz），3.37（1H，dd，J=16.8和6.8Hz），3.78-3.90（1H，m），3.79（3H，s），3.81（3H，s），4.11（1H，dd，J=9.6和4.0Hz），4.42-4.60（2H，m），4.46（1H，d，J=12.4Hz），4.50（1H，d，J=12.4Hz），4.73（1H，d，J=16.0Hz），5.16（1H，dd，J=16.8和1.2Hz），5.19（1H，dd，J=8.8和1.2Hz），5.97（1H，ddt，J=16.8，8.8和6.8Hz），6.42-6.47（2H，m），7.12（H，d，J=8.8Hz），7.24-7.34（5H，m），9.29（1H，s）
实施例3对多发性骨髓瘤细胞的抗癌活性
在96孔板中以1×104细胞/孔的密度接种人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226，在5％二氧化碳气氛下，在37℃下温育过夜。另外，将实施例2的化合物溶解于二甲基亚砜，并按照使化合物的最终浓度达到0.5μM、1μM、2μM、3μM、12.5μM、25μM或50μM的方式向各孔添加该化合物。
此外，作为用于比较的阳性对照，按照使最终浓度达到10μM、20μM、30μM、40μM或50μM的量向各孔中添加多发性骨髓瘤治疗药即美法仑。进而，还设置不添加化合物而仅添加二甲基亚砜（最终浓度：0.5v/v％）的情况。
接着，在5％二氧化碳气氛下，在37℃培养3天后，使用细胞培养/细胞毒性测定用试剂（同仁化学公司制造，Cell Counting Kit－8），对从活细胞产生的橙色色素（甲
Figure BDA0000423555620000121
）的吸光度（420nm）进行测定。在图1中示出将不添加本发明化合物、美法仑时的吸光度设为100时的相对吸光度。此外，从所得的结果求得IC50值。
如图1所示，可知：与一般作为多发性骨髓瘤的治疗药使用的美法仑相比，本发明的化合物明显在更低浓度下对多发性骨髓瘤细胞显示出抗癌活性。此外，美法仑对多发性骨髓瘤细胞的IC50值为21.0μM，与此相对，本发明化合物的IC50值为1.12μM，其以约二十分之一的浓度显示出与美法仑同样的抗癌活性。
实施例4选择性试验
在实施例3中，作为被检细胞，使用作为人多发性骨髓瘤细胞株的RPMI8226和U266、作为人胃癌细胞株的AZ521、作为人大肠癌细胞株的HCT116、作为人肺癌细胞株的A549、以及作为正常细胞的来自小鼠脑的星形胶质细胞和来自人皮肤的成纤维细胞，并且将各孔中的本发明化合物的最终浓度固定为5μM，除此以外，与实施例3同样地试验了对各细胞的细胞毒性。将结果以相对于将不添加化合物时的吸光度设为100的情况的相对吸光度的形式示于图2中。
如图2所述，本发明化合物不仅对正常细胞不显示细胞毒性，而且对胃癌细胞、大肠癌细胞、肺癌细胞等一般的癌细胞也不显示细胞毒性，但是对作为血癌细胞的一种的多发性骨髓瘤细胞显示明确的细胞毒性。如此，本发明化合物显示选择性的细胞毒性，由此证明，本发明的化合物作为血癌的治疗药非常有用。
实施例5细胞凋亡活性试验
对本发明化合物所致的细胞死亡是否基于细胞凋亡进行了确认。
详细而言，在将实施例3中，将本发明化合物的最终浓度固定为5μM，除此以外，与实施例3同样地温育人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226。接着，在24小时后回收细胞，用作为核染色剂的Hoechst33258进行染色，使用荧光显微镜（蔡司公司制）拍摄了荧光照片。此外，另使用膜联蛋白V染色试剂盒（罗氏公司（roche公司）制）用作为细胞凋亡标记的膜联蛋白V和碘化丙啶进行染色后，同样地拍摄了荧光照片，并且使用流式细胞计（贝克曼库尔特公司（ベックマンコールター社）制，制品名“EPICSALTRA”）进行了分析。将利用Hoechst33258进行染色后的细胞的显微镜照片示于图3（1），将利用膜联蛋白V和碘化丙啶进行染色后的细胞的显微镜照片示于图3（2），将利用膜联蛋白V和碘化丙啶进行染色后的细胞的流式细胞计分析结果示于图3（3）。
如图3（1）所示，在使本发明化合物作用于人多发性骨髓瘤细胞时，在细胞内明显进入Hoechst33258而发出荧光。认为该结果是由于：在引起细胞凋亡的细胞的核内发生染色质的凝集，在凝集后的染色质上结合了Hoechst33258。此外，如图3（2）所示，被本发明化合物作用后的人多发性骨髓瘤细胞对作为细胞凋亡的标记的膜联蛋白V也为阳性。进而，如图3（3）所示，在被本发明化合物作用后的人多发性骨髓瘤细胞中，发生了以碘化丙啶阴性且膜联蛋白V阳性所示的初期细胞凋亡、和以碘化丙啶阳性且膜联蛋白V阳性所示的初期细胞凋亡所表示的后期细胞凋亡。如以上的结果所示，以实验证明了本发明化合物可在多发性骨髓瘤细胞中引发细胞凋亡。
实施例6对SP细胞的抗癌活性试验
造血干细胞等能够分化为各种组织、细胞的干细胞具有将Hoechst33342等荧光化学物质排出到细胞外的性质，因此如果在用该荧光化学物质对细胞染色后进行流式细胞计分析，并将结果以波长450nm和675nm进行二维展开，则分布在染色性低的区域。具有此种性质的细胞被称作SP细胞（Side Population Cell）。已知SP细胞也包含在癌细胞群中而显示药剂耐性、或者成为复发的原因。为此，试验了对癌性SP细胞的本发明化合物的效果。
具体而言，与实施例4同样地在本发明化合物的存在下温育人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226。将该细胞以1×106细胞/mL的浓度悬浮于3％FBS DMEM中，加热到37℃后，以浓度达到5μg/mL的方式添加Hoechst33342。每20分钟，边搅拌边在遮光下在37℃温育60分钟。接着，在800g下离心3分钟，除去上清。再添加冷却后的2％FBS PBS，之后进行离心，除去上清，将这样的洗涤操作重复进行2次。另外，将碘化丙啶溶解于PBS，制备200μg/mL溶液，将洗净细胞以5×106细胞/mL左右的浓度再度悬浮。使用流式细胞计（贝克曼库尔特公司，制品名“EPICS ALTRA”），对细胞照射365nm的激光，将放出的荧光通过450nm的带通滤波器和675nm的带通滤波器而展开，得到二维点图。此外，对于作为阴性对照不添加化合物而仅添加二甲基亚砜（最终浓度：0.5v/v%）的情况、和作为阳性对照以相同最终浓度（5μM）添加美法仑的情况同样地进行了试验。将阴性对照的结果示于图4（1），将阳性对照的结果示于图4（2），将使用本发明化合物的结果示于图4（3）。此外，将由流式细胞计的结果求得的、SP区域中的染色细胞和非SP区域中的染色细胞相对于全部细胞的比例归纳示于表1。
[表1]
SP区域 非SP区域
对照(仅0.5%DMSO) 0.680±0.0173% 19.2±0.295%
5μM美法仑 0.563±0.0777% 5.05±0.414%
5μM本发明化合物 0.163±0.0503% 5.36±0.235%
如上述结果所示，在仅使二甲基亚砜作用于人多发性骨髓瘤细胞时，在两个波长下的发光均低的区域可以确认到SP细胞的存在。此外，在被美法仑作用时，与对照相比，其比例被略微降低，但存在充分的SP细胞。美法仑被用于多发性骨髓瘤的治疗，难以治愈，预后不优选。作为其理由，认为是：在利用美法仑的治疗中，此种SP细胞残留，残留的癌化SP细胞会再增殖或者转移。与此相对，在被本发明化合物作用的情况下，在SP区域中的染色细胞相对于全部细胞的比例相比于对照的0.680±0.0173％而被控制至0.163±0.0503％。因此认为：根据本发明化合物，不仅对多发性骨髓瘤细胞引发细胞凋亡，而且抑制其SP细胞，结果可以抑制复发。
实施例7
作为与使用了小鼠等的肿瘤形成实验相关性高的实验，进行了使用甲基纤维素培养基的菌落形成分析。
详细而言，除了在实施例3中将本发明化合物的最终浓度固定为5μM以外，与实施例3同样地温育人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226。在24小时后回收细胞，在计数细胞数后将1×105个的细胞和甲基纤维素培养基（干细胞科技公司（ステムセルテクノロジー社）制）1mL混合，使用旋转器（rotator），在37℃混合1小时后，将全部量添加到6孔板中。在5％二氧化碳气氛下，在37℃温育14天后，使用显微镜（蔡司公司制）拍摄照片。此外，为了进行比较，作为对照，对添加有0.5％二甲基亚砜的培养基也进行了同样的实验。将对照的结果示于图5（1），将使用本发明化合物的结果示于图5（2）。
如图5所示，在对照中形成多发性骨髓瘤细胞的菌落，另一方面在包含本发明化合物的培养基中均未观察到菌落的形成，显著地阻碍了菌落的形成。因此认为：利用本发明化合物，即便多发性骨髓瘤细胞进行浸润等，也难以形成肿瘤，结果也难以引起复发。
实施例8
此外，试验了本发明化合物对人多发性骨髓瘤细胞以外的血癌细胞的效果。
在包含10％FBS的高营养培养基（RPMI1640，100μL）中除了添加人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226外，还以1×103细胞/孔的密度接种人急性髓细胞白血病细胞株KG1和人早幼粒细胞白血病细胞株HL60，在5％二氧化碳气氛下，在37℃温育过夜。另外，将实施例2的化合物溶解于DMSO，用该培养基稀释所得的溶液，并按照使化合物的最终浓度达到0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM或50μM的方式向各孔添加该化合物。
此外，作为用于比较的阳性对照，按照同样的最终浓度向各孔中添加多发性骨髓瘤治疗药即美法仑。进而，还设置了不添加化合物而仅添加二甲基亚砜（最终浓度：0.2～0.8v/v%）的情况。
接着，在5％二氧化碳气氛下，在37℃培养72小时后，除去培养基，向各孔中添加加入有作为细胞数测定试剂的WST－8的培养基（上述培养基100μL和WST－810μL的混合物）。在5％二氧化碳气氛下，在37℃培养2小时后，测定450nm的吸光度。计算出将仅DMSO处理时的吸光度设为100％时本发明化合物或美法仑的各浓度下的吸光度的比作为各血癌细胞的存活率。此外，由所得的结果计算出各化合物对各血癌细胞的50％效果浓度（EC50）。将本发明化合物的存活率的结果示于图6，将美法仑的存活率的结果示于图7。此外，将50％效果浓度（EC50）的结果示于表2。
[表2]
Figure BDA0000423555620000161
如图6～7所示，证实：与一般作为多发性骨髓瘤的治疗药使用的美法仑相比，本发明的化合物明显以更低浓度对不仅多发性骨髓瘤细胞而且还对急性髓细胞白血病细胞和早幼粒细胞白血病细胞显示出抗癌活性。

Claims (11)

1.一种苄胺衍生物或其药学上允许的盐，其特征在于，其以下述式（I）来表示，
Figure FDA0000423555610000011
式中，
X表示羰基、氧基羰基、亚砜基或磺酰基；
Y表示羰基或－CH（OR5）－；
R1表示氢原子、C1-6烷基或苄基；
R2表示C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、或可以具有取代基α的苯基；
R3表示可以具有取代基β的C1-6烷基；
R4表示氢原子、氨基、羟基氨基、C1-6烷氧基氨基、羧基或（C1-6烷氧基）羰基；
R5表示氢原子、C1-7烷酰基或三（C1-6烷基）甲硅烷基；
取代基α表示选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素原子、氰基和硝基中的1种以上的基团；
取代基β表示选自卤素原子、羟基、C1-6烷氧基和苄基氧基中的1种以上的基团；
n表示1以上且5以下的整数。
2.根据权利要求1所述的苄胺衍生物，其中，R1为C1-6烷基。
3.根据权利要求1或2所述的苄胺衍生物，其中，n为2以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的苄胺衍生物，其中，X为羰基。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的苄胺衍生物，其中，R2为C2-6烯基。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的苄胺衍生物，其中，R3为苄基氧基甲基。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的苄胺衍生物，其中，Y为羰基且R4为氢原子。
8.一种药品，其包含权利要求1～7中任一项所述的苄胺衍生物或其药学上允许的盐。
9.一种血癌治疗药，其包含权利要求1～7中任一项所述的苄胺衍生物或其药学上允许的盐。
10.下述式（I）所示的苄胺衍生物或其药学上允许的盐，其用于血癌的治疗，
Figure FDA0000423555610000021
式中，
X表示羰基、氧基羰基、亚砜基或磺酰基；
Y表示羰基或－CH（OR5）－；
R1表示氢原子、C1-6烷基或苄基；
R2表示C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、或可以具有取代基α的苯基；
R3表示可以具有取代基β的C1-6烷基；
R4表示氢原子、氨基、羟基氨基、C1-6烷氧基氨基、羧基或（C1-6烷氧基）羰基；
R5表示氢原子、C1-7烷酰基或三（C1-6烷基）甲硅烷基；
取代基α表示选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素原子、氰基和硝基中的1种以上的基团；
取代基β表示选自卤素原子、羟基、C1-6烷氧基和苄基氧基中的1种以上的基团；
n表示1以上且5以下的整数。
11.一种用于治疗血癌的方法，其特征在于，其包括施用下述式（I）所示的苄胺衍生物或其药学上允许的盐的工序，
Figure FDA0000423555610000022
式中，
X表示羰基、氧基羰基、亚砜基或磺酰基；
Y表示羰基或－CH（OR5）－；
R1表示氢原子、C1-6烷基或苄基；
R2表示C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、或可以具有取代基α的苯基；
R3表示可以具有取代基β的C1-6烷基；
R4表示氢原子、氨基、羟基氨基、C1-6烷氧基氨基、羧基或（C1-6烷氧基）羰基；
R5表示氢原子、C1-7烷酰基或三（C1-6烷基）甲硅烷基；
取代基α表示选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素原子、氰基和硝基中的1种以上的基团；
取代基β表示选自卤素原子、羟基、C1-6烷氧基和苄基氧基中的1种以上的基团；
n表示1以上且5以下的整数。
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