CN103616514A

CN103616514A - 奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条

Info

Publication number: CN103616514A
Application number: CN201310674116.9A
Authority: CN
Inventors: 刘平; 何宝祥; 黄云飞
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2014-03-05

Abstract

本发明公开了一种奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条，包括吸水纸、分析膜、金标抗体结合垫、样品垫和底板，分析膜含有用抗白色念珠菌单克隆抗体包被的检测线以及用羊抗兔IgG包被的质控线，金标抗体结合垫包被胶体金标记的白色念珠菌抗兔多克隆抗体。本发明应用于奶牛***炎病原的检测，具有特异、准确、快速、操作简单等特点，适于基层畜牧养殖、畜牧技术推广和畜牧动物检疫使用。因此，本发明对快速诊断奶牛***炎具有重要价值。

Description

奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条

技术领域

本发明属于奶牛***炎检测技术领域，尤其涉及一种奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条。

背景技术

白色念珠菌（Candida albicans）又称白假丝酵母菌，是人和动物真菌性疾病中最常见、最主要的共患条件致病真菌之一。此菌侵入乳腺并在乳腺内繁殖，使得奶牛乳腺炎频发，尤其会造成顽固性***炎的频发，不但制约奶牛乳业的发展，而且严重影响原料奶的品质，给奶牛养殖业造成很大的经济损失；同时，这也威胁着人类健康。虽然该菌诊断有传统的病原微生物学分离鉴定、PCR以及TCTA显色检测等方法，但这些方法对技术要求较高，而且费时、不经济。采取易于采样、便于检测疾病的手段对维护奶牛产后健康和奶牛场经济效益至关重要，而建立准确、及时的诊断技术是控制白色念珠菌危害的基本前提。

胶体金免疫层析技术因其具有快速、便捷，不需要特殊设备，结果判断直观等优势，越来越受到人们的重视。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异、准确、快速的奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条，包括吸水纸、分析膜、金标抗体结合垫、样品垫和底板，分析膜含有用抗白色念珠菌单克隆抗体包被的检测线（T）以及用羊抗兔IgG包被的质控线（C），金标抗体结合垫包被胶体金标记的白色念珠菌抗兔多克隆抗体。

抗白色念珠菌单克隆抗体是利用杂交融合技术筛选出白色念珠菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株而得；白色念珠菌抗兔多克隆抗体是应用白色念珠菌颗粒性抗原多次免疫新西兰大白兔而得。

分析膜为硝酸纤维膜，金标抗体结合垫为玻璃纤维膜。

上述奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备白色念珠菌抗体

抗白色念珠菌单克隆抗体是采用乳化的白色念珠菌作为抗原，分阶段多次免疫Balb/c小鼠，再进行细胞融合，筛选出阳性杂交细胞株后，制备腹水而得；白色念珠菌抗兔多克隆抗体是采用白色念珠菌作为抗原多次免疫新西兰大白兔制备而得的高效价抗白色念珠菌多克隆抗体；

（2）制备分析膜

将步骤（1）制备的白色念珠菌单克隆抗体在硝酸纤维膜包被形成检测线，羊抗兔IgG在硝酸纤维膜包被形成质控线，备用；

（3）制备金标抗体结合垫

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，并采用标记体系标记白色念珠菌抗兔多克隆抗体，将金标抗体在支持膜上固相化；

（4）组装试纸条

将步骤（2）的分析膜、步骤（3）的金标抗体结合垫、吸水纸、样品垫、底板组装成胶体金快速检测试纸条。

步骤（3）中的标记体系为：胶体金颗粒在20nm以下极其稳定，抗体蛋白与胶体金结合最适宜的pH值为8～9，最适结合胶体金的抗体蛋白量为20～40μg/mL，最佳稳定剂为10%PEG20000，最佳胶体金复合物缓冲液的组分为pH值为8～9的Tris–HCl缓冲液、1%BSA、0.5%PEG20000、10%蔗糖和2%Tween–20。

针对目前缺乏简便、快捷、有效的奶牛***炎白色念珠菌检测方法，发明人研制了奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条：首先通过免疫动物、细胞融合及ELISA检测等技术制备抗白色念珠菌的单克隆抗体；采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒，标记白色念珠菌抗兔多克隆抗体作为胶体金垫；将点涂有抗白色念珠菌单克隆抗体和羊抗兔IgG的硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫及吸收垫组装制成检测***炎真菌病原—白色念珠菌的快速诊断试纸条。本发明应用于奶牛***炎病原的检测，具有特导、准确、快速、操作简单等特点，适于基层畜牧养殖、畜牧技术推广和畜牧动物检疫使用，对奶牛业发展将有深远的影响。因此，本发明对快速诊断和有效治疗***炎有着十分重要的意义。

本发明奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条具有以下优点：

（1）检测快速，10-20min出结果。

（2）特异性好，该试纸条与大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌等病原菌均无交叉反应，与白色念珠菌的特异显色高。

（3）灵敏度高，检测灵敏度为10²cfu·mL^-1。

（4）稳定性好，4℃条件下保存30天后的试纸条稳定性依然较好。

（5）与PCR检测法对比实验中，试纸条的阳性符合率为86.67%（13/15），有2份未检出，阴性符合率为90%（9/10）。

附图说明

图1是本发明奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条的组装结构图，图中：1样品垫，2PVC底板，3测试线，4硝酸纤维素膜（NC膜），5吸水滤纸，6控制线，7胶体金垫。

具体实施方式

实施例1白色念珠菌多克隆抗体的制备

1材料与方法

1.1菌株：标准白色念珠菌，临床鉴定白色念珠菌，金黄色葡萄球菌标准株、大肠杆菌标准株。

1.2主要试剂和仪器：马丁肉汤、沙氏营养琼脂，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG，弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂，透析袋、电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像***，核酸蛋白分析仪，超高速冷冻离心机。

1.3实验动物：新西兰大白兔（广西大学动物实验基地）。

2实验方法

2.1白色念珠菌的抗原制备

将保存的分离鉴定好白色念珠菌在沙氏固体培养基上划线，37℃培养箱中培养18～48h，挑取单个菌落，在马丁肉汤液培养基中再培养12～18h后，再加入0.4%的甲醛灭活48小时后，涂板进行细菌活性检测，细菌完全死亡后，收菌置至4℃冰箱保存备用。2.2实验动物免疫

将制备好的白色念珠菌抗原免疫动物，选取2～3月龄，体重为2～3kg的新西兰大白兔2只作为免疫动物，一免：1mL108cfu·mL^-1灭活白色念珠菌与弗氏完全佐剂等比例混合后充分超声波乳化，在四肢内侧皮下分点注射。3周后，进行二免，0.5×10⁸cfu·mL^-1灭活白色念珠菌与弗氏不完全佐剂等比例混合，背部皮下多点注射，同时采血分离血清进行ELISA检测。每隔三周，分别进行三免和四免。加免在四免后一周，大量采血，分离血清，并ELISA检测抗体的特异性。

2.3血清抗体纯化

血清抗体通过正辛硫–硫酸铵沉淀法纯化，通过核酸分析仪测定，SDS–PAGE垂直电泳分析。

3.实验结果

获得了较高抗白色念珠菌的多克隆抗体，间接ELISA法检测效价可达1:140万以上，经提纯后其含量为10～30mg/mL，具有良好的敏感性；葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌各6株以及临床未分离出白色念珠菌其它菌株各6株，共24株菌均检测无交叉反应现象。

实施例2白色念珠菌单克隆抗体的制备

1材料与方法

1.1实验材料：Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，白色念珠菌，金黄色葡萄球菌标准株，大肠杆菌标准株，链球菌；细胞培养皿，50mL尖底离心管，96孔酶标板，透析袋等。

1.2实验动物：Balb/c小鼠。

2.实验方法

2.1试验动物免疫

选6～7周龄的Balb/c雌性小鼠6只进行免疫。初次免疫，0.25mL2×10⁷cfu·mL^-1灭活白色念珠菌与弗氏完全佐剂等比例混合，超声乳化，在腹部皮下多点注射。3周后，第2次免疫，0.25mL2×10⁷cfu·mL^-1灭活白色念珠菌与弗氏不完全佐剂等比例混合，背部皮下多点注射。每隔三周分别进行第3次和第4次免疫。最后一次免疫后一周收集血液，以ELISA检测抗体的特异性及SDS–PAEG电泳法。

2.2细胞杂交融合

（1）在融合操作前24小时，将两个70cm²细胞培养皿里的骨髓瘤细胞用胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液脱离传代一次。

（2）次日，抽掉骨髓瘤细胞培养皿里的培养液，分别加入5mL GENMED清理液（ReagentA），清洗生长中的细胞表面，吸掉5mL清洗液，分别加入3mL胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面置37℃培养箱3分钟。

（3）用手震动培养皿，使细胞脱落，然后分别加入10mL GENMED清理液（Reagent A），分别取两种细胞悬液（骨髓瘤细胞2～5×10⁷，再已备好小鼠脾脏细胞1×10⁸）的两个父代细胞合并到一个50mL锥形离心管，离心10分钟，弃上清。加入10mL GENMED清理液（Reagent A），混匀后，离心1000r·min^-110分钟，去上清，用手指轻轻弹击离心管外壁直至细胞颗粒群松散。

（4）加入1.5mL GENMED融合液（Reagent B），充分混匀，置于室温下1分钟。加入10mL GENMED清理液（Reagent A），轻轻混匀后，离心1000r·min^-110分钟，去上清。加入完全细胞培养液8mL，充分混匀。

（5）移入备有饲养层细胞96孔培养板中，2～4块，每孔加200μL细胞融合的悬液，放进37℃培养箱。

（6）72小时后开始细胞筛选，直至获得融合杂合子细胞克隆（10～14天）。

2.3阳性杂交瘤细胞的扩大培养

经吹打阳性的杂交瘤细胞悬浮移到含有饲养层细胞的24孔板里扩大培养，与原孔一起加新鲜的HT培养基（24孔加0.5mL，原孔加0.1mL），并在5%CO₂培养24～28小时，用ELISA检测，对分泌抗体稳定性较强的细胞株做重点培养及保存，做好编号并命名并及时冻存。

2.4有限稀释法单克隆化

在96孔板中进行有限稀释法单克隆化细胞培养，将前一天预先制备饲养层细胞，再进行细胞克隆化。待做克隆化的杂交瘤细胞用含20%胎牛血清细胞培养液稀释每毫升中5、10、50个细胞，分别加入己准备好的饲养细胞的96孔板中，每孔100μL。到第二次或第三次亚克隆时，只作一个稀释度，调整至每毫升5～10个细胞，将96孔板放在37℃、5%CO₂的培养箱中培养。定时观察，待细胞长到孔面积约一半时，吸半培养液检测，阳性孔中的细胞继续单克隆化，并扩大培养、冻存备用。

2.5腹水的制备

（1）腹水诱导：注射杂交瘤细胞之前一两周，将用于诱导腹水的每只小鼠腹腔注射IFA0.2mL/只，进行分笼并加强饲养管理。

（2）扩大培养杂交瘤细胞株：检测到强阳性的上清抗体杂交瘤细胞扩大培养至对数生长期，并用作于诱导腹水。

（3）注射杂交瘤细胞：收集对数生长期内的杂交瘤细胞于1000～1500r·min^-1离心5～10min，弃上清，用约0.5～1mL RPMI1640无血清培养液重悬细胞，每只小鼠i.p6～32×10⁵个杂交瘤细胞。

（4）收集腹水：约7～10天后观察Balb/c小鼠腹部，有明显腹部肿胀者，用12号注射器针头穿刺腹腔下侧收取腹水并测定其效价，存于–80℃备用。

2.6腹水效价和特异性检测

腹水样品用ELISA及SDS–PAEG进行检测分析。

2.7白色念珠菌单克隆抗体腹水交叉反应实验同白色念珠菌多克隆抗体的检测。

2.8白色念珠菌单克隆抗体（腹水）正辛硫-硫酸铵沉淀纯化

3.实验结果

本实验通过免疫Balb/c小鼠、杂交瘤细胞融合技术、阳性克隆细胞筛选、有限稀释法及SDS–PAGE、ELISA检测等技术，成功的制备了抗白色念珠菌的单克隆抗体。共获得了4株能稳定分泌抗白色念珠菌单克隆抗体的细胞株。用间接ELISA法检测，效价可达到1:102400以上。交叉反应实验，以葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌以及临床上未分离出白色念珠菌其它菌株样品代替抗原，检测交叉反应现象。纯化后单克隆抗体蛋白浓度的测定，纯化两次单克隆抗体蛋白过蛋白核酸分析仪测定，其含量分别达31.32mg/mL、27.65mg/mL。

实施例3胶金体的制备

1.材料与方法

1.1主要试剂：HAuCl₄，兔抗白色念珠菌多克隆抗体，柠檬酸三钠，牛血清白蛋白（BSA），脱脂奶粉，PEG20000，K₂CO₃。

1.2主要仪器：高速冷冻离心机，电子台秤，气浴恒温振荡器，DK–SD型电热恒温水槽，紫外―可见分光分光度计。

1.3柠檬酸三钠还原法的胶体金制备

胶体金的制备采取柠檬酸三钠还原法，用500mL的烧杯，加入2.4mL1%的HAuCl₄于240mL蒸馏水中（终浓度为0.01%），分别分装于6个80mL烧杯中，各40mL。电磁炉加热至沸腾，加入1%的柠檬酸三钠，各为0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL、1.2mL（分别标记为：1、2、3、4、5、6号），继续加热并搅拌，用肉眼观察胶体金溶液颜色变化，等溶液由黄变黑、紫、酒红色后再加热5～10min。冷却至室温，各样品用超纯水补足至40mL，继续加热5min、冷却、补足超纯水，重复三次。

1.4胶体金紫外光扫描鉴定

用紫外-可见光分光光度仪对6种不同胶体金在400～700nm波长下进行扫描，获得胶体金吸收光谱，并测定出最大吸收峰波的吸光值。据光谱的胶体金颗粒直径及分布特征，制备不同直径胶体金颗粒，对胶体金进行扫描，获得胶体金最大吸收峰波长与粒径在10～90nm粒径范围内得出Y=0.427lX+514.56（r=0.874，Ρ<0.01）直线回归关方程（X为颗粒粒径，Y为最大吸收峰波长），按Y=0.427lX+514.56方程可算出各胶体金颗粒直径大小。再把6种不同的胶体金溶液静置于4℃一段时间，在不同的时间段检查胶体金溶液的颜色变化和颗粒沉淀情况，选出一种较稳定的胶体金标记抗体用。

1.5最适宜抗体蛋白结合量

通过Mey氏稳定化试验方：取20mL胶体金溶液用0.lmoL/L K₂CO₃调节pH值，用14个1.5mL EP管分别取1mL胶体金溶液，再用不同浓度的兔抗白色念珠菌多克隆抗体进行标记，每种浓度的做7个样，室温搅拌30min后加入0.1mL10%NaCI溶液，室温静置一两小时，观察胶体金一抗体溶液的颜色，再进紫外分光度扫描测定520nm/580nm的OD值，选出制备金标抗最佳的抗体量。

1.6抗体蛋白与胶体金结合最适宜pH值的选择

通过Mey氏稳定化试验：取8个1.5mL EP管，各加入lmL胶体金，分别用0.lmoL/LK₂CO₃调pH为5、6、7、8、9、10、11、12后，每个pH做7样，每管各加入浓度为30μg/m1的兔抗白色念珠菌多克隆抗体100μL，搅拌30min后各管分别加入0.1mL10%NaCl液体，室温下静置l～2h，观察其颜色变化，再用紫外分光光度计扫描测定各管520nm/580nm的OD值，选出最佳制备金标抗的pH值。

1.7抗体—胶体金复合物稳定剂的选择

为了防止金标抗体在长时间内发生聚沉，将标记好的金标抗体复合物分别选用BSA、PEG20000作稳定剂，并比较它们之间使用的效果，选择金标抗体发生沉淀最少的做为稳定剂。其方法：用3个1.5mL EP管，分别加入1mL已配制好金标抗体溶液，分别加入稳定剂10%BSA100μL；10%PEG20000100μL；10%BSA50μL+10%PEG2000050μL放置一段时间，颜色仍保持红色，不聚沉或聚沉较少的为最佳稳定剂。

1.8胶体金复合物缓冲液的选择

选用不同的缓冲液稀释已标记的抗体胶体金复合物，选出有利于保持胶体金复合物状态稳定的缓冲液，本实验选配制三种胶体金抗体缓冲液。比较这三种缓冲液的稳定性及胶体金颗粒聚沉情况，通过正交设计进行实验，选出最佳的胶体金–抗体复合物缓冲液。

2.实验结果

筛选出直径为20nm的胶体金颗粒较稳定，与抗体蛋白与胶体金结合最适宜_pH值应是8～9，最适结合抗体蛋量为20μg/mL。本实验选取了最佳稳定剂10%PEG20000。根据本实验中缓冲液对金标抗的影响最大，影响最小的因素是Tween–20浓度，选出最佳优化胶体金复合物缓冲液组分pH值为8～9的Tris–HCl缓冲液、1%BSA、0.5%PEG20000、10%蔗糖、2%Tween–20。

实施例4试纸条组成及临床应用

1.材料与方法

1.1菌株：白色念珠菌标准菌、金黄色葡萄球菌标准株、大肠杆菌标准株、链球菌。

1.2主要试剂及耗材：硝酸纤维素膜（NC膜）、玻璃纤维素膜、PVC板等耗材。

2.实验方法

2.1斑点金免疫渗滤试验

用斑点金免疫渗滤试验确定单克隆抗体及羊抗兔IgG包被量，用抗白色念珠菌单克隆抗体做检测线（T）以及羊抗兔IgG做为质控线（C），用PBS（0.0lmol/L pH7.4）缓冲液将抗体按1:0～1:128倍比数稀释，各取2μL点样于0.45微孔滤膜上，渗入滤膜后形成斑点。待抗体完全充分干燥。将滤膜浸泡于5%脱脂奶粉中，室温封闭l～2h后。用PBST洗膜2～3次，每次3～5min。然后将洗好的滤膜用吸水滤纸吸干水，再放置一段时间使膜完全干燥后，滴加白色念珠菌悬液（1×105cfu·mL-1）与金标抗体结合物，室温静置数分钟。待出现红色斑点为止。然后在室温下用PBST洗涤液振荡洗涤4次，每次3～5min。

2.2分析膜预处理

NC膜（分析膜）首先用0.4%的甘油浸泡半小时后，置于37℃烘干箱中脱水干燥2小时以固定蛋白。

2.3分析膜封闭液的优化

以0.0l mo1/L PBS缓冲体系配制2种不同的封闭液以不同的浓度（1%、2%、3%、4%、5%脱脂奶粉，1%、2%、3%、4%、5%BSA）分别对分析膜封闭l h，再滴加胶体金溶液，根据NC膜上背景显色情况选择封闭液。

2.4分析膜干燥方式选择

用抗白色念珠菌单克隆抗体和羊抗兔IgG分别作T线和C线包被在NC膜上作为分析膜，经过封闭和洗涤处理后的NC膜，在其他条件不变情况下，将它分别置37℃、室温和4℃干燥，观察显色变化。

2.3胶体金–抗体复合物结合垫的制备

将玻璃纤维膜剪成规格大小一样的小块（0.7×10.0cm）作为结合垫，然后浸泡于胶体金一抗体溶液中30min。室温自然干燥，观察结合垫上金标抗体状态。

2.4样品垫制备

将玻璃纤维素膜（样品垫）剪切成2×10cm规格大小的条带；玻璃纤维素膜浸入预处理液中（0.0lmol/L pH8.2硼酸，0.5%BSA，0.1%Tween–20）于4℃或37℃孵育1～2h后，将玻璃纤维素膜取出置于烘箱中37℃充分烘干，保存备用。

2.5分析膜的抗体包被

将NC膜做剪成规格大小一致的（2.5×10.0cm）条带；膜从下向上1cm处，用移液枪点上抗白色念珠菌的单克隆抗体1:2作为检测线（T）；离检测带0.7cm处点上羊抗鼠1:16作为质控线；然后将NC膜于烘箱中37℃充分烘干，5%脱脂奶粉中37℃封闭l～2h或4℃过夜，取出干燥保存备用。

2.6吸水垫制备

用滤纸当作吸水垫，将它剪成规格大小一致（3.0×10cm）的条带，置于干燥的环境中保存备用。

2.7试纸条组装

将已处理好的各种固相材料，依次粘附于PVC底板上，形成一个完整的试纸条，具体流程如下：

（1）将有粘性底板剪成0.75×14cm规格大小一致的条带。

（2）将分析膜黏于底板上4～10cm处位置，检测线在前，质控线在后。

（3）将金标结合垫贴于粘性底板上2cm处位置，上端压于分析膜的上端，重叠0.5cm。

（4）将样品垫膜粘于底板上，下端压于金标结合垫的上端，重叠1cm。

（5）吸水垫膜黏于底板上，上端压于分析膜的下端，重叠1cm.。

（6）装配成形的条带保存于干燥的环境中检测备用。

2.8试纸条检测阳性结果判定

以2×10⁵cfu·mL^-1标准白色念珠菌悬液作为阳性对照，0.01mol/L PBS缓冲液为阴性对照。临床鉴定的白色念珠菌样品悬液点加在试纸条的样品垫中，待样品层析完毕后观察检测结果。在检测应区中，T线及C线都显红色条带，则表示检测到目的菌株，则判为阳性；若只有T线处显红色条带，则未检测到目的菌株，则判为阴性；若T线不显红色条带，试纸条失效。

2.9试纸条灵敏度检测

将培养好的白色念珠菌培养物，用0.4%甲醛灭活后，稀释成2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10¹cfu·mL^-1不同浓度的菌液悬液。各取300μL点入上述试纸条，每个浓度重复5次，待样品层析完毕后观察检测结果。

2.10试纸条特异的性检测

以葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等其它菌株，调整各菌悬液浓度至2×l0⁵cfu·mL^-1后，用移液枪吸取300μL点入试纸条的样品垫上，每个标本重复3次，待样品层析完毕后观察。

3.实验结果

以上制备的白色念珠菌胶体金免疫层析快速检测试纸条与大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌等病原菌均无交叉反应，与白色念珠菌的特异显色高，检测灵敏度为10²cfu·mL^-1，显色时间小于10～20min。4℃条件下保存30天后的试纸条稳定性依然较好。与PCR检测法对比实验中，试纸条的阳性符合率为86.67%（13/15），有2份未检出，阴性符合率为90%（9/10）。

Claims

1.一种奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条，包括吸水纸、分析膜、金标抗体结合垫、样品垫和底板，其特征在于：所述分析膜含有用抗白色念珠菌单克隆抗体包被的检测线以及用羊抗兔IgG包被的质控线，所述金标抗体结合垫包被胶体金标记的白色念珠菌抗兔多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条，其特征在于：所述抗白色念珠菌单克隆抗体是利用杂交融合技术筛选出白色念珠菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株而得；所述白色念珠菌抗兔多克隆抗体是应用白色念珠菌颗粒性抗原多次免疫新西兰大白兔而得。

3.根据权利要求2所述的奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条，其特征在于：所述分析膜为硝酸纤维膜，金标抗体结合垫为玻璃纤维膜。

4.根据权利要求1所述奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备白色念珠菌抗体

抗白色念珠菌单克隆抗体是采用乳化的白色念珠菌作为抗原，分阶段多次免疫Balb/c小鼠，再进行细胞融合，筛选出阳性杂交细胞株后，制备腹水而得；白色念珠菌抗兔多克隆抗体是采用白色念珠菌作为抗原多次免疫新西兰大白兔制备而得；

（2）制备分析膜

（3）制备金标抗体结合垫

（4）组装试纸条

5.根据权利要求4所述的奶牛***炎白色念珠菌快速诊断试纸条的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的标记体系为：胶体金颗粒在20nm以下，抗体蛋白与胶体金结合的pH值为8～9，结合胶体金的抗体蛋白量为20～40μg/mL，稳定剂为10%PEG20000，胶体金复合物缓冲液的组分为pH值为8～9的Tris–HCl缓冲液、1%BSA、0.5%PEG20000、10%蔗糖和2%Tween–20。