CN103204929A

CN103204929A - 一种白色念珠菌多克隆抗体的制备方法

Info

Publication number: CN103204929A
Application number: CN 201210011793
Authority: CN
Inventors: 王东东; 何永胜; 周泽奇; 李宁; 史东东; 粟艳; 刘春龙
Original assignee: TIANJIN BIO-ENOCHE BIO-ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: TIANJIN BIO-ENOCHE BIO-ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2012-01-16
Filing date: 2012-01-16
Publication date: 2013-07-17

Abstract

本发明涉及真菌的多克隆抗体制备领域。具体而言，本发明涉及制备针对白色念珠菌细胞壁抗原甘露聚糖的多克隆抗体。本发明主要包括以下步骤：1)提取白色念珠菌甘露聚糖抗原；2)将白色念珠菌甘露聚糖抗原免疫动物；3)从经免疫的动物中分离、纯化抗血清，得到针对白色念珠菌甘露聚糖的多克隆抗体。用本发明制备的白色念珠菌多克隆抗体具有特异性高，纯度及效价高，可长期保存的优点，制备工艺简单，利于多克隆抗体的工艺化生产。

Description

一种白色念珠菌多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及念珠菌的多克隆抗体制备领域。具体而言，本发明涉及制备针对白色念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗体。

背景技术

白色念珠菌是一种条件致病念珠菌，人体在正常情况下不会受到白色念珠菌的感染，只有机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调时，可能感染白色念珠菌，引起深部感染，甚至全身散播性感染。

近年来由于人口老龄化，免疫抑制剂及广谱抗生素的大量应用，艾滋病、恶性肿瘤发病率的增加，器官、骨髓移植及介入治疗的广泛开展，临床上侵袭性念珠菌感染的发病率呈逐年上升趋势。由于缺乏有效的诊断方法，侵袭性念珠菌感染后易造成漏诊、误诊而延误治疗，因此，发展早期、快速且特异的侵袭性念珠菌感染诊断学方法成为临床上迫切需要解决的问题。

目前临床对于侵袭性念珠菌感染常规的诊断方法主要包括以下几种：

(1)组织病理学诊断方法

在组织切片中找到病原念珠菌是确诊的“金标准”，有念珠菌侵袭和相应的炎症反应与组织损害或组织标本念珠菌培养阳性即可确定念珠菌感染的诊断。但组织病理学检查取材需要侵入性操作，重症患者难以耐受，可行性差。其敏感性受到取材的影响，一次切片未必能够找到念珠菌成分，且侵袭性念珠菌感染可引起各种各样的组织反应，给诊断带来较大困难。

(2)直接镜检和培养

直接镜检是念珠菌学检查最经典的方法，具有简便、快速、实用的优点，可以在显微镜下直接观察念珠菌形态。但直接镜检阳性率较低，阴性结果不能排除诊断，且同一菌属内的多种念珠菌镜下形态相似，对于菌种鉴定没特别的帮助。而培养检查需要结合菌落特征、生化试验等进行详细观察，培养过程耗时长，有时需要数周时间重复多次接种才能得出正确结果，且敏感性和阳性率较低，同时对操作人员的技术经验要求高，不利于早期诊断。

(3)影像学检查

动态影像学检查对提示诊断具有重要作用，胸部CT扫描，特别是高分辨率CT的临床应用对早期诊断价值较高。但影像学检测特异性较差，接合菌、镰孢菌、放线菌、奴卡菌、金黄色葡萄球菌等血管侵袭性感染在影像学上可能与侵袭性真菌相似，所以影像学检查通常只能作为辅助诊断手段。

甘露聚糖(mannan)是白色念珠菌细胞壁的主要抗原成分。对于白色念珠菌感染的诊断，除了传统的培养方法，测定血清中白色念珠菌甘露聚糖抗原，逐渐成为白色念珠菌早期诊断的简单、快捷的方法。

免疫检测技术是利用抗原抗体间能特异性结合反应，通过检测标记在反应物上的标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测的方法。根据标记物质的不同，分为酶联免疫分析技术(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay，ELISA)、免疫荧光检测技术、化学发光免疫分析技术、免疫微球技术、免疫胶体金技术等。其中ELISA技术具有操作简单，灵敏度高，检测时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。

而测定抗原作为白色念珠菌感染诊断方法的关键，便是得到针对白色念珠菌甘露聚糖抗原的抗体。所以，迫切需要一种方法能够制备针对白色念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗体。

本发明详细描述

本发明的目的在于提供一种制备针对白色念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗体的方法。

本发明所采用的白色念珠菌购买自中国医学微生物菌种保藏管理中心。

本发明技术方案如下：

步骤：

1.提取白色念珠菌甘露聚糖抗原。

2.将白色念珠菌甘露聚糖抗原免疫动物。

3.从经免疫的动物中分离、纯化抗血清，得到针对白色念珠菌甘露聚糖的多克隆抗体。

本发明中，步骤1所使用的抗原为天津贻诺琦生物工程有限公司专有技术提取(提取方法见专利201110240946.1)。

步骤2中，免疫方法的选择是多种多样的，如背部皮下多点注射法、腹腔注射法等，免疫剂量可为0.3-2mL/只，并且用于制备白色念珠菌多克隆抗体的动物可为兔、鸡、鼠、羊、马、猪或驴。

步骤3中，为了得到效价较高的抗体，还应每隔7-10天测定免疫动物抗血清的抗体效价，当抗体效价达到最大值时，可从经免疫的动物中分离、纯化抗血清；所述纯化抗血清的方法可为饱和硫酸铵盐析沉淀法和/或亲和层析法。

用上述方法制备的白色念珠菌多克隆抗体是本发明所要保护的。

本发明的多克隆抗体可用于白色念珠菌抗原的免疫检测中。使用的技术可以为ELISA技术、免疫胶体金技术、化学发光免疫测定技术等免疫学检测技术。

本领域技术人员知晓，对于固相反应而言，可以将本发明的多克隆抗体固定于固相载体，也可以将待测样本固定于固相载体上。反应通常在37℃或室温进行，检测过程中需要洗涤不与本发明多克隆抗体结合的样品的步骤。

对于液相反应而言，通常可以向处在特定缓冲体系中的待检样本中直接加入本发明的多克隆抗体，然后在适于抗原抗体发生相互作用的温度下(如37℃或室温)发生反应。

本领域技术人员知晓如何根据多克隆抗体的来源选择合适的第二抗体，本领域技术人员知晓如何选择合适的检测试剂及标记物。

所述白色念珠菌抗原的ELISA检测方法，可包括如下步骤：

1)用待检测样品包被酶标板，洗板；

2)封闭经包被的酶标板，洗板；

3)加白色念珠菌多克隆抗体，洗板；

4)加酶标二抗，洗板；

5)加底物显色；

6)终止反应；

7)测定OD₄₅₀值。

上述检测方法中的反应条件及试剂均可按照常规方法进行选择。

步骤4)中的酶标二抗可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗体。

本发明提供了一种抗白色念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗体，及抗白色念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗体的制备方法。

实验证明，用本发明所属方法制得的多克隆抗体具有效价高，特异性好，可长期保存的特点，将其用于科研和临床检测领域中，具有灵敏度高，特异性好多的优势，有很强的应用前景。

附图描述：

图1显示了多克隆抗体的SDS-PAGE检测的结果。

图2显示了多克隆抗体的效价测定的结果。

实施例1，免疫动物

将白色念珠菌甘露聚糖抗原对3只成年雌性新西兰大白兔采用背部多点皮下注射法进行免疫，免疫前1周去兔耳缘静脉血，分离血清作为阴性对照，免疫剂量为1.0mL/次，每次免疫时加注1.0mL弗氏佐剂作为免疫佐剂，分别于初次免疫后第7、14、21和28天再加强免疫一次。

实施例2，多克隆抗体效价的测定

经过3次免疫后，从兔子耳缘静脉取血，采血量为1mL/只，分离血清，用间接ELISA法检测血清中的抗体效价。检测结果见图2。从结果可看出，该多克隆抗体效价很高，大于1∶1×10⁵。

实施例3，抗血清的纯化

当兔子效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血，取血后在室温下放置约2h，然后4℃放置过夜使其凝固，2500rpm离心15min，取上清。

1.饱和硫酸铵一次沉淀

取17ml上述血清放入烧杯中，并加入等体积的生理盐水(17ml)，在搅拌器上搅拌，缓慢滴加总体积50％的饱和硫酸铵(34ml)，搅拌3-5分钟，转到4℃冰箱内保存过夜。

2.饱和硫酸铵二次沉淀及透析

(1)将一次沉淀的同一种血清蛋白分装在2个50ml离心管中，5000rpm离心15min；

(2)去上清液，向离心管内放入总体积60％(10.27ml)的生理盐水，使之完全溶解，在溶解过程中进行吹打，在缓慢滴总体积40％加饱和硫酸铵(6.8ml)，不断震荡，转到4℃冰箱内保存，沉淀至少2.5小时。

(3)取2次沉淀后的血清溶液经离心机离心，5000rpm离心15min，去掉上清液。根据沉淀量加入2-3ml高压PBS，进行吹打使之完全溶解，取透析膜，将溶解好的血清放入透析膜中进行透析，转到4℃冰箱内保存。每隔2-3h换液一次，共换3-4次。

3.用亲和层析法进行纯化

(1)称取Protein A Sepharose干粉100mg，经PBS 4℃过夜充分溶胀，装柱后用PBS平衡。

(2)将透析后的多克隆抗体粗提物在4℃下反复过柱20次，过柱液保留。

(3)以0.01M PB 0.14M NaCl pH7.4充分淋洗柱子，至分光光度测定OD280约等于0或OD280值基本不再降低。

(4)换0.1M甘氨酸-HCl pH2.8洗脱，第一次500μl，洗脱产物立即以约20μl的1.0M Tris-HClpH9.0中和。洗脱液依次递减，收集洗脱产物。得到白色念珠菌多克隆抗体。

实施例4，抗体的检测

1.SDS-PAGE电泳检测

对步骤三制得的抗体进行SDS-PAGE电泳，对得到的凝胶进行考马斯亮蓝染色。实验结果见图1。由图中可看出，在25KD和50KD分子量区有清晰明显的条带，说明抗体纯度很高。

2.效价测定

用间接ELISA法对抗体效价进行测定。所用包被原为白色念珠菌甘露聚糖抗原，所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。检测结果见图2。从结果可看出，该多克隆抗体效价很高，大于1∶1×10⁵。

Claims

1.一种白色念珠菌多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(a)提取白色念珠菌细胞壁抗原；

(b)利用所提取抗原免疫动物；

(c)从经免疫的动物中分离、纯化抗血清，得到白色念珠菌多克隆抗体。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所用抗原通过本公司专有技术提取(提取方法见专利201110240946.1)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，采用皮下多点注射法或腹腔注射法将白色念珠菌抗原免疫动物。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(b)中，免疫动物的剂量为0.3-2mL/只。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(b)中，免疫的动物为兔、鸡、鼠、羊、马、猪或驴。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(c)中，所述对血清进行纯化的方法为饱和硫酸铵盐析沉淀法和/或亲和层析法。

7.用权利要求1-6任何一项所述的方法制备的白色念珠菌多克隆抗体。