CN103614427B - 利用秸秆水解液发酵生产二十二碳六烯酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用秸秆水解液发酵生产二十二碳六烯酸的方法。该方法包括如下步骤：（1）利用氨气***法预处理秸秆粉，得到预处理后的秸秆粉；（2）用纤维素酶、β-半乳糖苷酶和果胶酶酶解所述预处理后的秸秆粉，得到秸秆水解液；（3）向所述秸秆水解液中加入培养基，然后接入裂殖壶菌（Aurantiochytrium）进行发酵培养，获得裂殖壶菌发酵液；（4）用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壶菌发酵液，得到提取液；所述提取液经干燥即得二十二碳六烯酸。本发明制备的DHA产量稳定，在不添加外源葡萄糖情况下，采用本发明获得的菌体干重可达58～66g/L，油脂占细胞干重的40.8～53.3%，DHA占油脂干重的42.1～45.3%，DHA产量为10.3～15.4g/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用秸秆水解液发酵生产二十二碳六烯酸的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，简称DHA）是人体必需的一种长链高度不饱和脂肪酸，具有显著的抗心血管疾病、降血脂、降血压、预防各种癌症、促进婴幼儿智力发育，改善成年人的大脑机能和防止老年痴呆等重要生理功能，已被开发成各种药品、保健品、高级化妆品、食品及饲料等，市场巨大。DHA的传统资源是深海鱼油，但是由于过度开发捕捞深海鱼类，鱼油资源难以满足人们对DHA日益增长的需求。近年来，利用微生物发酵法生产富含DHA的油脂成为热点。海洋真菌—裂殖壶菌不仅像细菌一样二***繁殖，生长速度快，而且其油脂含量高，提取简单，极具有产业开发前途。国内外许多机构正在或已经申请裂殖壶菌发酵生产DHA的相关专利：申请号为201010104774.0的专利公布了利用豆粕水解物生产裂殖壶菌菌体的工艺，其所使用的碳源为葡萄糖70～80g/L；申请号为200910130628.2的专利公布了利用高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA的工艺，所使用的培养基碳源为葡萄糖120～125g/L；申请号为201010150460.4的专利公布了全合成培养基用于培养裂殖壶菌的方法，所使用的培养基碳源为葡萄糖60～150g/L；申请号为201010237946.1的专利公布了以裂殖壶菌为生产菌株发酵生产多烯不饱和脂肪酸的方法，其特征是在发酵培养基中添加甘氨酸甜菜碱或海藻糖以提高油脂含量。上述申请并公开的专利，主要以裂殖壶菌利用葡萄糖或淀粉质原料发酵生产DHA，而利用廉价碳源，如木质纤维素水解物生产DHA的方法尚未见报道。
秸秆是农村常见的木质纤维素原料，目前我国农村对秸秆的常见处理方式有焚烧、堆肥、还田、制作简易材料等方式，利用率低且不利于工业化推广。此外，秸秆资源的综合利用方法还有直接发酵生产沼气、发酵生产燃料乙醇、乳酸等，但附加值较低，无法真正实现秸秆资源的高效综合利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用秸秆水解液发酵生产二十二碳六烯酸的方法，本发明利用廉价的秸秆木质纤维素为原料，经水解得到水溶性碳水化合物，经裂殖壶菌转化获取DHA，将显著降低DHA的生产成本，形成节约耕地、可连续生产DHA的工艺，并且还有利于环境保护和社会经济可持续发展。
本发明所提供的一种利用秸秆水解液发酵生产二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤：
（1）利用氨气***法预处理秸秆粉，得到预处理后的秸秆粉；
（2）用纤维素酶、β-半乳糖苷酶和果胶酶酶解所述预处理后的秸秆粉，得到秸秆水解液；
（3）向所述秸秆水解液中加入培养基，然后接入裂殖壶菌（Aurantiochytrium）进行发酵培养，获得裂殖壶菌发酵液；
（4）用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壶菌发酵液，得到提取液；所述提取液经干燥即得二十二碳六烯酸。
上述的方法中，步骤（1）中，所述秸秆粉由玉米秸秆、水稻秸秆、甘蔗秸秆、小麦秸秆、棉花秸秆和高粱秸秆中至少一种制成；
所述秸秆粉的粒径小于5mm；
在制备所述秸秆粉之前，最好将秸秆进行干燥，如可在鼓风烘箱中于80℃下干燥约2天。
上述的方法中，步骤（1）中，所述氨气***法包括如下步骤：
将所述秸秆粉调控至质量含水量为40%～60%，具体可为40%、45%、50%、55%或60%，然后加入高压反应器中；然后利用氨气在3.0～4.0MPa下处理所述秸秆粉，可采用夹套蒸汽加热的方式进行，具体可在3.0MPa、3.5MPa或4.0MPa下进行；
上述的方法中，步骤（1）中，所述处理的温度可为80℃～100℃，具体可为80℃、90℃、95℃或100℃，时间可为30～60分钟，具体可为30分钟、45分钟或60分钟；
所述预处理后的秸秆粉的质量含水量可为60%～70%，具体可为60%、65%或70%；
所述处理结束后，即可打开放气阀，让高压反应器中的压力聚降；将所述预处理后的秸秆粉放置过夜，让残余的氨水蒸发，存于4℃保存，用于下一步的反应。
上述的方法中，步骤（2）中，所述纤维素酶、β-半乳糖苷酶和果胶酶酶解的用量可为：1Kg所述预处理后的秸秆粉需要加入125000～225000CMC U所述纤维素酶、32500～58500pNPG U所述β-半乳糖苷酶和1550～3100U所述果胶酶，如1Kg所述预处理后的秸秆粉加入125000CMC U所述纤维素酶、32500pNPG U所述β-半乳糖苷酶和1550U所述果胶酶、175000CMC U所述纤维素酶、45500pNPG U所述β-半乳糖苷酶和2325U所述果胶酶、225000CMC U所述纤维素酶、58500pNPG U所述β-半乳糖苷酶和2325U所述果胶酶、150000CMC U所述纤维素酶、39000pNPG U所述β-半乳糖苷酶和1550U所述果胶酶或150000CMC U所述纤维素酶、39000pNPG U所述β-半乳糖苷酶和3100U所述果胶酶；具体可采用加入Accellerase1500和Multifect pectinase的方式进行酶解；
酶活单位的定义：1CMC U纤维素酶活为在50℃、pH为4.8的条件下，1分钟水解羧甲基纤维素生成1μmol葡萄糖等量物所需的酶量；1pNPG Uβ-半乳糖苷酶活为在50℃、pH为4.8的条件下，1分钟水解对硝基酚-β-葡萄糖苷生成1μmol对硝基酚所需的酶量；1U果胶酶活为在50℃、pH为4.3的条件下，1分钟分解果胶产生1μmol葡萄糖等量物所需的酶量。
上述的方法中，所述酶解的条件如下：
在pH为4.0～5.5和温度为50℃～55℃的条件下处理6～7天，具体可在pH为4.0和温度为50℃的条件下处理7天、pH为4.5和温度为55℃的条件下处理6天、在pH为5.0和温度为50℃的条件下处理7天、在pH为5.0和温度为55℃的条件下处理6天、在pH为5.5和温度为55℃的条件下处理7天或在pH为5.0和温度为50℃的条件下处理6天。
上述的方法中，步骤（3）中，每100mL所述培养基的组成如下：
1.0～2.0g蛋白胨；1.0～2.0g酵母浸出粉；2.0～3.0g海水晶；0.04～0.06g KH2PO4；0.02～0.03g(NH4)2SO4；0.2～0.4g Na2SO4；和余量的水；
每100mL所述培养基的组成具体可为下述任一种：
1）1.0～1.8g蛋白胨；1.0～1.8g酵母浸出粉；2.0～2.5g海水晶；0.04～0.06gKH2PO4；0.02～0.03g(NH4)2SO4；0.2～0.4g Na2SO4；和余量的水；
2）1.0g蛋白胨；1.0g酵母浸出粉；2.0g海水晶；0.04g KH2PO4；0.02g(NH4)2SO4；0.2g Na2SO4；和余量的水；
3）1.5g蛋白胨；1.5g酵母浸出粉；2.0g海水晶；0.06g KH2PO4；0.03g(NH4)2SO4；0.4g Na2SO4；和余量的水；
4）2.0g蛋白胨；2.0g酵母浸出粉；3.0g海水晶；0.04g KH2PO4；0.03g(NH4)2SO4；0.3g Na2SO4；和余量的水；
5）1.0g蛋白胨；1.0g酵母浸出粉；2.0g海水晶；0.06g KH2PO4；0.03g(NH4)2SO4；0.4g Na2SO4；和余量的水；
6）1.8g蛋白胨；1.8g酵母浸出粉；2.5g海水晶；0.04g KH2PO4；0.03g(NH4)2SO4；0.4g Na2SO4；和余量的水。
上述的方法中，步骤（3）中，所述裂殖壶菌（Aurantiochytrium）接入的初始浓度为每100mL所述培养基接入10～12mL所述裂殖壶菌菌种。
上述的方法中，步骤（3）中，所述发酵培养的条件如下：
在所述发酵培养开始至75～85小时内，控制所述发酵培养的温度为27.5～28.5℃，继续发酵培养至85～95小时内，控制所述发酵培养的温度为24.5～25.5℃；继续培养至发酵结束，控制所述发酵培养的温度为19.5～20.5℃；
且在所述发酵培养开始至55～65小时内，通过补加氨水以维持体系pH为5.8～6.2，继续发酵培养至95～105小时内，通过补加所述秸秆水解液以维持体系中还原糖的浓度大于10g/L，之后，当检测到体系中还原糖的浓度低于1g/L时，停止发酵，即获得裂殖壶菌发酵液。
上述的方法中，步骤（4）中，所述乙醇与所述正已烷的体积比可为1：2～5，如1：2.6。
上述的方法中，步骤（4）中，在用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壶菌发酵液之前，所述方法还包括如下步骤：
将所述裂殖壶菌发酵液进行离心分离，得到上清液；用生理盐水洗涤所述上清液后再悬于盐酸溶液中。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
（1）原料易购，价格低廉。
秸秆是农业生产副产物，据统计我国年产量达亿吨，目前尚未得到充分利用，部分地区还造成了环境污染。秸秆易于收集，加工粉碎和水解相对容易，水解液主要是纤维素和半纤维素降解的糖，可作为裂殖壶菌生产高附加值DHA的碳源。
（2）本发明制备的DHA产量稳定，在不添加外源葡萄糖情况下，采用本发明获得的菌体干重可达58～66g/L，油脂占细胞干重的40.8～53.3%，DHA占油脂干重的42.1～45.3%，DHA产量为10.3～15.4g/L。
（3）水解与发酵过程简单易行，操作简便，容易控制，适合工业化生产。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用到的裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum SR21)购自美国模式菌种收集中心（ATCC），菌株号为MYA-1381。
实施例1、玉米秸秆水解液生产DHA
（1）氨气***法预处理玉米秸秆
将玉米秸秆在80℃鼓风烘箱中干燥约2天，用秸秆粉碎机（河南鸿运机械制造厂）进行研磨，用5mm孔径的网筛进行过滤得到玉米秸秆粉。取100kg干秸秆粉，用蒸馏水调节含水量至40%，置于1m3高压反应器中。取100kg氨水于200L不锈钢压力罐中，加热使其压力达到3.0MPa后，通入装有玉米秸秆粉的1m3高压反应器。用夹套蒸汽加热至80℃，维持60min。接着打开放气阀，让高压反应器中的压力聚降。将氨水预处理过的秸秆粉放置过夜，让残余的氨水蒸发，存于4℃备用。
（2）酶法水解玉米秸秆
将步骤（1）氨水预处理过的玉米秸秆粉30kg（含水量约为60%），用1M pH4.0的磷酸盐缓冲液调节磷酸盐终浓度至50mM，加蒸馏水至100L，于121℃灭菌30min，降温至50℃后，用10mol/L HCl调节pH至4.0，再加入15g/L Accellerase1500（杰能科生物工程有限公司，纤维素酶含量2500CMC U/g；β-半乳糖苷酶含量约为650pNPG U/g，则1kg玉米秸秆粉需要加入125000CMC U纤维素酶和32500pNPG Uβ-半乳糖苷酶）和3g/L Multifect pectinase（杰能科生物工程有限公司，果胶酶含量约为155U/g，则1kg玉米秸秆粉需要加入1550U果胶酶），50℃处理7天。将水解液用管式离心机（上海天本管式离心机GQ145）进行离心，贮存于4℃。2个月内可使用。使用之前，用NaOH调pH至6.0。
（3）DHA发酵
在步骤（2）得到的玉米秸秆水解液中加入培养基，每100mL所述培养基的组成如下：
1.0g蛋白胨；1.0g酵母浸出粉；2.0g海水晶；0.04g KH2PO4；0.02g(NH4)2SO4；0.2g Na2SO4；和余量的水。
于121℃灭菌30min，冷却后按照每100mL培养基接入10mL裂殖壶菌液体菌种，培养约120小时。其中在发酵开始到80小时内，控制培养温度为28.0±0.5℃；80小时到90小时内，控制培养温度为25.0±0.5℃；90小时到发酵结束，控制培养温度为20.0±0.5℃。同时，在发酵培养开始至60小时内，通过补加氨水以维持体系pH为6.0±0.2，且在发酵培养开始至100小时内，通过补加秸秆水解液以维持体系中还原糖的浓度大于10g/L，之后，当检测到体系中还原糖的浓度低于1g/L时，停止发酵，获得富含DHA的裂殖壶菌发酵液。
（4）DHA的提取
取20mL步骤（3）中得到的裂殖壶菌发酵液于50mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，用去离子水重悬离心，重复2次后移至已知恒重的平板，于85℃烘箱烘干至恒重，测定发酵液体中细胞干重为62g/L。
取5mL裂殖壶菌发酵液于10mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，弃上清，用生理盐水离心洗涤，重复三次。得到湿菌体重悬于4mL10mol/L盐酸，80℃水浴1小时左右，冷却后加0.75mL无水乙醇与2mL正己烷，充分摇匀，1200r/min，2min离心取上清于恒重螺口管中，重复3次，真空抽干即得裂殖壶菌油脂，测得油脂占细胞干重的41.5%。
称取100mg所得裂殖壶菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH3OH62℃恒温回流酯化1小时，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS条件为：6890C-5975N气质联用仪（安捷伦），HP-INNOWAX极性毛细管柱，0.25μm×250μm×30m；载气：氦气；载气流量：1.0mL/min，恒定流量；上样模式：分流，分流比20:1；进样量1μL；进样口温度为280℃；检测器温度为280℃；升温程序：150℃下保持1min，10℃/min升温至200℃，2℃/min升温至220℃，保持5min。240℃后运行3min。
测得油脂中，十四烷酸含量为6.9%，十六烷酸（棕榈酸）含量为28.2%，二十碳五烯酸含量为15.2%，DHA含量为44.7%，其它杂酸（十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸）含量为5.0%，DHA产量为11.5g/L。
实施例2、水稻秸秆水解液生产DHA
（1）氨气***法预处理水稻秸秆
将水稻秸秆在80℃鼓风烘箱中干燥约2天，用秸秆粉碎机（河南鸿运机械制造厂）进行研磨，用5mm孔径的网筛进行过滤得到水稻秸秆粉。取100kg干秸秆粉，用蒸馏水调节含水量至45%，置于1m3高压反应器中。取100kg氨水于200L不锈钢压力罐中，加热使其压力达到3.5MPa后，通入装有水稻秸秆粉的1m3高压反应器。用夹套蒸汽加热至90℃，维持45min。接着打开放气阀，让高压反应器中的压力聚降。将氨水预处理过的秸秆粉放置过夜，让残余的氨水蒸发，存于4℃备用。
（2）酶法水解水稻秸秆
将步骤（1）氨水预处理过的玉米秸秆粉30kg（含水量约为60%），用1M pH4.5的磷酸盐缓冲液调节磷酸盐终浓度至50mM，加蒸馏水至100L，于121℃灭菌30min，降温至55℃后，用10mol/L HCl调节pH至4.5，加入21g/L Accellerase1500（杰能科生物工程有限公司，纤维素酶含量2500CMC U/g；β-半乳糖苷酶含量约为650pNPGU/g，则1kg玉米秸秆粉需要加入175000CMC U纤维素酶和45500pNPG Uβ-半乳糖苷酶）和4.5g/L Multifect pectinase（杰能科生物工程有限公司，果胶酶含量约为155U/g，则1kg玉米秸秆粉需要加入2325U果胶酶），55℃处理6天。将水解液用管式离心机（上海天本管式离心机GQ145）进行离心，贮存于4℃。2个月内可使用。使用之前，用NaOH调pH至6.0。
（3）DHA发酵
在步骤（2）得到的水稻秸秆水解液中加入培养基，每100mL所述培养基的组成如下：
1.5g蛋白胨；1.5g酵母浸出粉；2.5g海水晶；0.06g KH2PO4；0.03g(NH4)2SO4；0.4g Na2SO4；和余量的水。
于121℃灭菌30min，冷却后按照每100mL培养基接入12mL裂殖壶菌液体菌种，培养约120小时。其中在发酵开始到75小时内，控制培养温度为28.0±0.5℃；75小时到85小时内，控制培养温度为25.0±0.5℃；85小时到发酵结束，控制培养温度为20.0±0.5℃。在发酵培养开始至55小时内，通过补加氨水以维持体系pH为6.0±0.2，且在发酵培养开始至95小时内，通过补加秸秆水解液以维持体系中还原糖的浓度大于10g/L，之后，当检测到体系中还原糖的浓度低于1g/L时，停止发酵，获得富含DHA的裂殖壶菌发酵液。
（4）DHA的提取
取20mL步骤（3）中得到的裂殖壶菌发酵液于50mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，用去离子水重悬离心，重复2次后移至已知恒重的平板，于85℃烘箱烘干至恒重，测定发酵液体中细胞干重为66g/L。
取5mL裂殖壶菌发酵液于10mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，弃上清，用生理盐水离心洗涤，重复三次。得到湿菌体重悬于4mL10mol/L盐酸，70℃水浴1小时左右，冷却后加0.75mL无水乙醇与2mL正己烷，充分摇匀，1200r/min，2min离心取上清于恒重螺口管中，重复3次，真空抽干即得裂殖壶菌油脂，测得油脂占细胞干重的53.5%。
称取100mg所得裂殖壶菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH3OH62℃恒温回流酯化1小时，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS条件为：6890C-5975N气质联用仪（安捷伦），HP-INNOWAX极性毛细管柱，0.25μm×250μm×30m；载气：氦气；载气流量：1.0mL/min，恒定流量；上样模式：分流，分流比20:1；进样量1μL；进样口温度280℃；检测器温度280℃；升温程序：150℃下保持1min，10℃/min升温至200℃，2℃/min升温至220℃，保持5min。240℃后运行3min。
测得油脂中，十四烷酸含量为6.7%，十六烷酸（棕榈酸）含量为28.5%，二十碳五烯酸含量为14.9%，DHA含量为43.7%，其它杂酸（十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸）含量为6.2%，DHA产量为15.4g/L。
实施例3、甘蔗秸秆水解液生产DHA
（1）氨气***法预处理甘蔗秸秆
将甘蔗秸秆在80℃鼓风烘箱中干燥约2天，用秸秆粉碎机（河南鸿运机械制造厂）进行研磨，用5mm孔径的网筛进行过滤得到甘蔗秸秆粉。取100kg干秸秆粉，用蒸馏水调节含水量至50%，置于1m3高压反应器中。取100kg氨水于200L不锈钢压力罐中，加热使其压力达到4.0MPa后，通入装有甘蔗秸秆粉的1m3高压反应器。用夹套蒸汽加热至95℃，维持30min。接着打开放气阀，让高压反应器中的压力聚降。将氨水预处理过的秸秆粉放置过夜，让残余的氨水蒸发，存于4℃备用。
（2）酶法水解甘蔗秸秆
将步骤（1）氨水预处理过的玉米秸秆粉30kg（含水量约为65%），用1M pH5.0的磷酸盐缓冲液调节磷酸盐终浓度至50mM，加蒸馏水至100L，于121℃灭菌30min，降温至50℃后，用10mol/L HCl调节pH至5.0，加入27g/L Accellerase1500（杰能科生物工程有限公司，纤维素酶含量2500CMC U/g；β-半乳糖苷酶含量约为650pNPGU/g，则1kg甘蔗秸秆粉需要加入225000CMC U纤维素酶和58500pNPG Uβ-半乳糖苷酶）和4.5g/L Multifect pectinase（杰能科生物工程有限公司，果胶酶含量约为155U/g，则1kg甘蔗秸秆粉需要加入2325U果胶酶），50℃处理7天。将水解液用管式离心机（上海天本管式离心机GQ145）进行离心，贮存于4℃。2个月内可使用。使用之前，用NaOH调pH至6.0。
（3）DHA发酵
在步骤（2）得到的甘蔗秸秆水解液中加入培养基，每100mL所述培养基的组成如下：
2.0g蛋白胨；2.0g酵母浸出粉；3.0g海水晶；0.04g KH2PO4；0.03g(NH4)2SO4；0.3g Na2SO4；和余量的水。
于121℃灭菌30min，冷却后按照每100mL培养基接入11mL裂殖壶菌液体菌种，培养约120小时。其中在发酵开始到85小时内，控制培养温度为28.0±0.5℃；85小时到95小时内，控制培养温度为25.0±0.5℃；95小时到发酵结束，控制培养温度为20.0±0.5℃。且在发酵培养开始至65小时内，通过补加氨水以维持体系pH为6.0±0.2，且在发酵培养开始至105小时内，通过补加秸秆水解液以维持体系中还原糖的浓度大于10g/L，之后，当检测到体系中还原糖的浓度低于1g/L时，停止发酵，获得富含DHA的裂殖壶菌发酵液。
（4）DHA的提取
取20mL步骤（3）中得到的裂殖壶菌发酵液于50mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，用去离子水重悬离心，重复2次后移至已知恒重的平板，于85℃烘箱烘干至恒重，测定发酵液体中细胞干重为61g/L。
取5mL裂殖壶菌发酵液于10mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，弃上清，用生理盐水离心洗涤，重复三次。得到湿菌体重悬于4mL10mol/L盐酸，75℃水浴1小时左右，冷却后加0.75mL无水乙醇与2mL正己烷，充分摇匀，1200r/min，2min离心取上清于恒重螺口管中，重复3次，真空抽干即得裂殖壶菌油脂，测得油脂占细胞干重的51.6%。
称取100mg所得裂殖壶菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH3OH62℃恒温回流酯化1小时，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS条件为：6890C-5975N气质联用仪（安捷伦），HP-INNOWAX极性毛细管柱，0.25μm×250μm×30m；载气：氦气；载气流量：1.0mL/min，恒定流量；上样模式：分流，分流比20:1；进样量1μL；进样口温度280℃；检测器温度280℃；升温程序：150℃下保持1min，10℃/min升温至200℃，2℃/min升温至220℃，保持5min。240℃后运行3min。
测得油脂中，十四烷酸含量为7.2%，十六烷酸（棕榈酸）含量为28.6%，二十碳五烯酸含量为15.1%，DHA含量为45.3%，其它杂酸（十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸）含量为3.8%，DHA产量为14.3g/L。
实施例4、小麦秸秆水解液生产DHA
（1）氨气***法预处理小麦秸秆
将小麦秸秆在80℃鼓风烘箱中干燥约2天，用秸秆粉碎机（河南鸿运机械制造厂）进行研磨，用5mm孔径的网筛进行过滤得到小麦秸秆粉。取100kg干秸秆粉，用蒸馏水调节含水量至60%，置于1m3高压反应器中。取100kg氨水于200L不锈钢压力罐中，加热使其压力达到4.0MPa后，通入装有小麦秸秆粉的1m3高压反应器。用夹套蒸汽加热至100℃，维持30min。接着打开放气阀，让高压反应器中的压力聚降。将氨水预处理过的秸秆粉放置过夜，让残余的氨水蒸发，存于4℃备用。
（2）酶法水解小麦秸秆
将步骤（1）氨水预处理过的小麦秸秆粉30kg（含水量约为70%），用1M pH5.0的磷酸盐缓冲液调节磷酸盐终浓度至50mM，加蒸馏水至100L，于121℃灭菌30min，降温至55℃后，用10mol/L HCl调节pH至5.0，加入15g/L Accellerase1500（杰能科生物工程有限公司，纤维素酶含量2500CMC U/g；β-半乳糖苷酶含量约为650pNPGU/g，则1kg甘蔗秸秆粉需要加入125000CMC U纤维素酶和32500pNPG Uβ-半乳糖苷酶）和3.0g/L Multifect pectinase（杰能科生物工程有限公司，果胶酶含量约为155U/g，则1kg甘蔗秸秆粉需要加入1550U果胶酶），55℃处理6天。将水解液用管式离心机（上海天本管式离心机GQ145）进行离心，贮存于4℃。2个月内可使用。使用之前，用NaOH调pH至6.0。
（3）DHA发酵
在步骤（2）得到的小麦秸秆水解液中加入培养基，每100mL所述培养基的组成如下：
1.0g蛋白胨；1.0g酵母浸出粉；2.0g海水晶；0.06g KH2PO4；0.03g(NH4)2SO4；0.4g Na2SO4；和余量的水。
于121℃灭菌30min，冷却后按照每100mL培养基接入12mL裂殖壶菌液体菌种，培养约120小时。其中在发酵开始到80小时内，控制培养温度为28.0±0.5℃；80小时到90小时内，控制培养温度为25.0±0.5℃；90小时到发酵结束，控制培养温度为20.0±0.5℃。在发酵培养开始至60小时内，通过补加氨水以维持体系pH为6.0±0.2，且在发酵培养开始至100小时内，通过补加秸秆水解液以维持体系中还原糖的浓度大于10g/L，之后，当检测到体系中还原糖的浓度低于1g/L，停止发酵，获得富含DHA的裂殖壶菌发酵液。
（4）DHA的提取
取20mL步骤（3）中得到的裂殖壶菌发酵液于50mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，用去离子水重悬离心，重复2次后移至已知恒重的平板，于85℃烘箱烘干至恒重，测定发酵液体中细胞干重为65g/L。
取5mL裂殖壶菌发酵液于10mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，弃上清，用生理盐水离心洗涤，重复三次。得到湿菌体重悬于4mL10mol/L盐酸，70～80℃水浴1小时左右，冷却后加0.75mL无水乙醇与2mL正己烷，充分摇匀，1200r/min，2min离心取上清于恒重螺口管中，重复3次，真空抽干即得裂殖壶菌油脂，测得油脂占细胞干重的50.7%。
称取100mg所得裂殖壶菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH3OH62℃恒温回流酯化1小时，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS条件：6890C-5975N气质联用仪(安捷伦)，HP-INNOWAX极性毛细管柱，0.25μm×250μm×30m；载气：氦气；载气流量：1.0mL/min，恒定流量；上样模式：分流，分流比20:1；进样量为1μL；进样口温度为280℃；检测器温度为280℃；升温程序：150℃下保持1min，10℃/min升温至200℃，2℃/min升温至220℃，保持5min。240℃后运行3min。
测得油脂中，十四烷酸含量为6.3%，十六烷酸（棕榈酸）含量为29.5%，二十碳五烯酸含量为14.8%，DHA含量为42.1%，其它杂酸（十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸）含量为7.3%，DHA产量为13.9g/L。
实施例5、棉花秸秆水解液生产DHA
（1）氨气***法预处理棉花秸秆
将棉花秸秆在80℃鼓风烘箱中干燥约2天，用秸秆粉碎机（河南鸿运机械制造厂）进行研磨，用5mm孔径的网筛进行过滤得到棉花秸秆粉。取100kg干秸秆粉，用蒸馏水调节含水量至55%，置于1m3高压反应器中。取100kg氨水于200L不锈钢压力罐中，加热使其压力达到3.5MPa后，通入装有棉花秸秆粉的1m3高压反应器。用夹套蒸汽加热至100℃，维持30min。接着打开放气阀，让高压反应器中的压力聚降。将氨水预处理过的秸秆粉放置过夜，让残余的氨水蒸发，存于4℃备用。
（2）酶法水解棉花秸秆
将步骤（1）氨水预处理过的棉花秸秆粉30kg（含水量约为65%），用1M pH5.5的磷酸盐缓冲液调节磷酸盐终浓度至50mM，加蒸馏水至100L，于121℃灭菌30min，降温至55℃后，用10mol/L HCl调节pH至5.5，加入18g/L Accellerase1500（杰能科生物工程有限公司，纤维素酶含量2500CMC U/g；β-半乳糖苷酶含量约为650pNPGU/g，则1kg甘蔗秸秆粉需要加入150000CMC U纤维素酶和39000pNPG Uβ-半乳糖苷酶）和3.0g/L Multifect pectinase(杰能科生物工程有限公司，果胶酶含量约为155U/g，则1kg甘蔗秸秆粉需要加入1550U果胶酶)，55℃处理7天。将水解液用管式离心机（上海天本管式离心机GQ145）进行离心，贮存于4℃。2个月内可使用。使用之前，用NaOH调pH至6.0。
（3）DHA发酵
在步骤（2）得到的棉花秸秆水解液中加入培养基，每100mL所述培养基的组成如下：
1.8g蛋白胨；1.8g酵母浸出粉；2.5g海水晶；0.04g KH2PO4；0.03g(NH4)2SO4；0.4g Na2SO4；和余量的水。
于121℃灭菌30min，冷却后按照每100mL培养基接入10mL裂殖壶菌液体菌种，培养约120小时。其中在发酵开始到75小时内，控制培养温度为28.0±0.5℃；75小时到85小时内，控制培养温度为25.0±0.5℃；85小时到发酵结束，控制培养温度为20.0±0.5℃。且在发酵培养开始至55小时内，通过补加氨水以维持体系pH为6.0±0.2，且在发酵培养开始至95小时内，通过补加秸秆水解液以维持体系中还原糖的浓度大于10g/L，之后，当检测到体系中还原糖的浓度低于1g/L时，停止发酵，获得富含DHA的裂殖壶菌发酵液。
（4）DHA的提取
取20mL步骤（3）中得到的裂殖壶菌发酵液于50mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，用去离子水重悬离心，重复2次后移至已知恒重的平板，于85℃烘箱烘干至恒重，测定发酵液体中细胞干重为58g/L。
取5mL裂殖壶菌发酵液于10mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，弃上清，用生理盐水离心洗涤，重复三次。得到湿菌体重悬于4mL10mol/L盐酸，80℃水浴1小时左右，冷却后加0.75mL无水乙醇与2mL正己烷，充分摇匀，1200r/min，2min离心取上清于恒重螺口管中，重复3次，真空抽干即得裂殖壶菌油脂，测得油脂占细胞干重的48.5%。
称取100mg所得裂殖壶菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH3OH62℃恒温回流酯化1小时，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS条件为：6890C-5975N气质联用仪(安捷伦)，HP-INNOWAX极性毛细管柱，0.25μm×250μm×30m；载气：氦气；载气流量：1.0mL/min，恒定流量；上样模式：分流，分流比为20:1；进样量为1μL；进样口温度为280℃；检测器温度为280℃；升温程序：150℃下保持1min，10℃/min升温至200℃，2℃/min升温至220℃，保持5min。240℃后运行3min。
测得油脂中，十四烷酸含量为6.2%，十六烷酸（棕榈酸）含量为28.5%，二十碳五烯酸含量为13.8%，DHA含量为43.6%，其它杂酸（十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸）含量为7.9%，DHA产量为12.3g/L。
实施例6、高粱秸秆水解液生产DHA
（1）氨气***法预处理高粱秸秆
将高粱秸秆在80℃鼓风烘箱中干燥约2天，用秸秆粉碎机（河南鸿运机械制造厂）进行研磨，用5mm孔径的网筛进行过滤得到高粱秸秆粉。取100kg干秸秆粉，用蒸馏水调节含水量至50%，置于1m3高压反应器中。取100kg氨水于200L不锈钢压力罐中，加热使其压力达到4.0MPa后，通入装有高粱秸秆粉的1m3高压反应器。用夹套蒸汽加热至95℃，维持45min。接着打开放气阀，让高压反应器中的压力聚降。将氨水预处理过的秸秆粉放置过夜，让残余的氨水蒸发，存于4℃备用。
（2）酶法水解高粱秸秆
将步骤（1）氨水预处理过的高粱秸秆粉30kg（含水量约为60%），用1M pH5.0的磷酸盐缓冲液调节磷酸盐终浓度至50mM，加蒸馏水至100L，于121℃灭菌30min，降温至50℃后，用10mol/L HCl调节pH至5.0，加入18g/L Accellerase1500（杰能科生物工程有限公司，纤维素酶含量2500CMC U/g；β-半乳糖苷酶含量约为650pNPGU/g，则1kg甘蔗秸秆粉需要加入150000CMC U纤维素酶和39000pNPG Uβ-半乳糖苷酶）和6.0g/L Multifect pectinase(杰能科生物工程有限公司，果胶酶含量约为155U/g，则1kg甘蔗秸秆粉需要加入3100U果胶酶)，50℃处理6天。将水解液用管式离心机（上海天本管式离心机GQ145）进行离心，贮存于4℃。2个月内可使用。使用之前，用NaOH调pH至6.0。
（3）DHA发酵
在步骤（2）得到的高粱秸秆水解液中加入培养基，每100mL所述培养基的组成如下：
2.0g蛋白胨；2.0g酵母浸出粉；2.5g海水晶；0.06g KH2PO4；0.03g(NH4)2SO4；0.4g Na2SO4；和余量的水。
于121℃灭菌30min，冷却后按照每100mL培养基接入10mL裂殖壶菌液体菌种，培养约120小时。其中在发酵开始到85小时内，控制培养温度为28.0±0.5℃；85小时到95小时内，控制培养温度为25.0±0.5℃；95小时到发酵结束，控制培养温度为20.0±0.5℃。且在发酵培养开始至65小时内，通过补加氨水以维持体系pH在6.0±0.2，且在发酵培养开始至105小时内，通过补加秸秆水解液以维持体系中还原糖的浓度大于10g/L，之后，当检测到体系中还原糖的浓度低于1g/L时，停止发酵，获得富含DHA的裂殖壶菌发酵液。
（4）DHA的提取
取20mL步骤（3）中得到的裂殖壶菌发酵液于50mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，用去离子水重悬离心，重复2次后移至已知恒重的平板，于85℃烘箱烘干至恒重，测定发酵液体中细胞干重为60g/L。
取5mL裂殖壶菌发酵液于10mL离心管中，8000r/min，4℃冷冻离心10min，弃上清，用生理盐水离心洗涤，重复三次。得到湿菌体重悬于4mL10mol/L盐酸，70～80℃水浴1小时左右，冷却后加0.75mL无水乙醇与2mL正己烷，充分摇匀，1200r/min，2min离心取上清于恒重螺口管中，重复3次，真空抽干即得裂殖壶菌油脂，测得油脂占细胞干重的40.8%。
称取100mg所得裂殖壶菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH3OH62℃恒温回流酯化1小时，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS条件：6890C-5975N气质联用仪（安捷伦），HP-INNOWAX极性毛细管柱，0.25μm×250μm×30m；载气：氦气；载气流量为：1.0mL/min，恒定流量；上样模式：分流，分流比为20:1；进样量为1μL；进样口温度280℃；检测器温度为280℃；升温程序：150℃下保持1min，10℃/min升温至200℃，2℃/min升温至220℃，保持5min。240℃后运行3min。
测得油脂中，十四烷酸含量为7.2%，十六烷酸（棕榈酸）含量为29.5%，二十碳五烯酸含量为13.2%，DHA含量为42.1%，其它杂酸（十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸）含量为8.0%，DHA产量为10.3g/L。
Claims (1)
1.一种利用秸秆水解液发酵生产二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤：
（1）利用氨气***法预处理秸秆粉，得到预处理后的秸秆粉；所述秸秆粉的粒径小于5 mm；
所述氨气***法包括如下步骤：
将所述秸秆粉调控至质量含水量为40%~60%，然后加入高压反应器中；然后利用氨气在3.0~4.0 MPa下处理所述秸秆粉；
所述处理的温度为80 ℃~100 ℃，时间为30~60分钟；
所述预处理后的秸秆粉的质量含水量为60%~70%；
（2）用纤维素酶、β-半乳糖苷酶和果胶酶酶解所述预处理后的秸秆粉，得到秸秆水解液；
所述纤维素酶、所述β-半乳糖苷酶和所述果胶酶的用量为：1 Kg所述预处理后的秸秆粉需要加入125 000~225 000 CMC U所述纤维素酶、32 500~ 58 500 pNPG U所述β-半乳糖苷酶和1550~3100 U所述果胶酶；
所述酶解的条件如下：
在pH为4.0~5.5和温度为50 ℃~55 ℃的条件下处理6~7天；
（3）向所述秸秆水解液中加入培养基，然后接入裂殖壶菌（Aurantiochytrium）进行发酵培养，获得裂殖壶菌发酵液；
（4）用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壶菌发酵液，得到提取液；所述提取液经干燥即得二十二碳六烯酸。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述秸秆粉由玉米秸秆、水稻秸秆、甘蔗秸秆、小麦秸秆、棉花秸秆和高粱秸秆中至少一种制成。
3、根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，每100 mL所述培养基的组成如下：
1.0~2.0 g 蛋白胨；1.0~2.0 g 酵母浸出粉；2.0~ 3.0 g 海水晶；0.04~0.06 g KH2PO4；0.02~0.03 g (NH4)2SO4；0.2~0.4 g Na2SO4；和余量的水。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述裂殖壶菌（Aurantiochytrium）接入的初始浓度为每100 mL培养基接入10~12 mL所述裂殖壶菌。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述发酵培养的条件如下：
在所述发酵培养开始至75~85小时内，控制所述发酵培养的温度为27.5~28.5 ℃，继续发酵培养至85~95小时内，控制所述发酵培养的温度为24.5~25.5 ℃；继续培养至发酵结束，控制所述发酵培养的温度为19.5~20.5 ℃；
且在所述发酵培养开始至55~65小时内，通过补加氨水以维持体系pH为5.8~6.2，继续发酵培养至95~105小时内，通过补加所述秸秆水解液以维持体系中还原糖的浓度大于10 g/L，之后，当检测到体系中还原糖的浓度低于1 g/L时，停止发酵，即获得裂殖壶菌发酵液。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，在用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壶菌发酵液之前，所述方法还包括如下步骤：
将所述裂殖壶菌发酵液进行离心分离，得到上清液；用生理盐水洗涤所述上清液后再悬于盐酸溶液中。
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