CN103589698B - 郁金香查尔酮合成酶TfCHS蛋白及其编码基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种郁金香查尔酮合成酶TfCHS蛋白及其编码基因，所述蛋白质为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮合成酶活性的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的如SEQ ID NO.3所示的核酸序列。将本发明中郁金香查尔酮合成酶TfCHS基因通过构建正反义表达载体转化到烟草中后，转基因烟草查尔酮合成酶基因表达均受到不同程度的抑制，与此同时，转基因烟草花朵的颜色出现不同程度的变浅，对应的花朵总花色苷含量下降了20%‑60%。

Description

郁金香查尔酮合成酶TfCHS蛋白及其编码基因
技术领域
本发明涉及郁金香花色苷合成途径中的关键酶及其编码基因，具体涉及一种郁金香查尔酮合成酶TfCHS蛋白及其编码基因，属于生物技术领域。
背景技术
花的颜色是决定花商品价值和观赏价值的重要因素之一。改变花色，创新花色，可以增加花卉的商品价值和观赏价值。花朵的颜色是花瓣细胞中花色素积累的结果，花色素主要包括类黄酮、类胡萝卜素以及甜菜碱类。类黄酮作为花色素的一大类，使花朵产生从黄到紫的颜色。类黄酮的生物合成途径为可分为三个阶段，第一阶段是由苯丙氨酸到香豆酰CoA，这是许多次生代谢共有的；第二阶段由香豆酰CoA到二氢黄酮醇，这是类黄酮代谢的关键反应，它合成花青素和其它黄酮物质。所有类黄酮合成的前体物都是4-香豆酰CoA和丙二酰CoA在查尔酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）的作用下产生查尔酮开始的。第三阶段是各种花色素苷的合成。
由于CHS是合成黄烷酮、黄酮、黄酮醇及花色苷所必需的酶，因此被认为是类黄酮生物合成途径的一个关键酶，为多基因家族编码。CHS是花色素合成过程中的一个关键酶，其活性对花色素的形成起着至关重要的作用，它在植物中的表达量会影响花色素的合成量，进而影响花的颜色。利用基因工程技术对CHS基因的表达进行调控是改变花朵颜色的途径之一。例如将cDNA反向连接于35S启动子上，再连接双元载体转化矮牵牛会使花色***变为粉红色，有些花朵完全呈白色；将反义CHS基因导入非洲菊中，使非洲菊的花瓣不能正常着色；将反义CHS基因导入洋桔梗发现转基因植株的花色变浅，甚至产生开白花的植株；将CHS基因正向导入开紫色花的矮牵牛中，得到开白花和紫白相间花的转基因植株；将菊花CHS基因正义导入菊花栽培品种之后产生了白色花和图案各异的彩瓣花等等。
目前，在很多植物中发现了CHS多基因家族，如矮牵牛、葡萄、甘薯、拟南芥、角堇等。但对于球根花卉郁金香（Tulipa fosteriana），CHS基因的克隆、表达模式及CHS蛋白编码序列目前尚不清楚。目前，未有任何与郁金香CHS蛋白及其编码基因相关的文献报道。
发明内容
本发明填补郁金香CHS基因家族成员的克隆、表达模式分析、转基因功能验证以及郁金香CHS蛋白及其编码基因的空白。本发明提供了一种郁金香CHS蛋白序列，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。本发明提供了郁金香TfCHS蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式，构建了TfCHS基因正反义表达载体并转化烟草，分析了TfCHS基因对转基因烟草CHS基因表达及花朵中花色苷合成的影响。利用本发明提供的郁金香查尔酮合成酶基因TfCHS，能为基因工程改变花色，获得创新花色提供一种有效的技术手段。
本发明的目的是提供了一种具有郁金香（Tulipa fosteriana）查尔酮合成酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQIDNO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮合成酶活性的由（a）衍生的蛋白质。该蛋白质在花朵的不同发育阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。
优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、***和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。
进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
另一方面，本发明还提供一种编码上述蛋白质的核酸序列。
优选的，所述核酸序列具体为：
（a）碱基序列如SEQ ID NO.3第1～1179位所示；
或（b）与SEQ ID NO.3第1～1179位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
或（c）能与SEQ ID NO.3第1～1179位所示的核酸进行杂交的序列。
优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.3第1～1179位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、***和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
在本发明中，术语“TfCHS蛋白编码序列”指编码具有郁金香TfCHS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示序列中第1～1179位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指：位于SEQ ID NO.3所示序列的第1～1179位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ IDNO.3所示序列中第1～1179位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3所示序列中从核苷酸第1～1179位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的郁金香TfCHS相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3所示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～90个核苷酸的缺失、***和/或取代，以及在5’和/或3’端添加为60个以内核苷酸。
在本发明中，术语“TfCHS蛋白”指具有郁金香TfCHS蛋白活性的SEQ ID NO.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香TfCHS相关相同功能的、SEQ ID NO.4所示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～50个氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香TfCHS蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的郁金香TfCHS蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香TfCHS相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香TfCHS蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“郁金香TfCHS保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro;Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe Leu
Leu(L) Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala Leu
本发明还包括郁金香查尔酮合成酶TfCHS蛋白或多肽的类似物。这些类似物与TfCHS相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。
修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析郁金香查尔酮合成酶基因产物的表达模式，即分析TfCHS基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，根据本发明的郁金香TfCHS核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选郁金香TfCHS相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与郁金香TfCHS相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选郁金香cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对郁金香TfCHS相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自郁金香的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与郁金香TfCHS相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的郁金香TfCHS相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
当获得有关序列后，可用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产（Stewart等人，（1969）固相多肽合成，WH Freeman Co.,San Francisco;Merrifield J.（1963）J.Am Chem.Soc85:2149-2154）。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪（Foster City，CA）来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
此外，本发明郁金香查尔酮合成酶基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根癌农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等。如pBin系列载体、pBI系列载体、GatewayTM系列载体、pCAMBIA系列载体或其它衍生植物表达载体，所述的出发载体还可以为在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体等。
使用本发明中郁金香查尔酮合成酶基因或其同源序列构建表达载体时，在其转录超始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。组成型启动子可为花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子等；组织特异性启动子可以为根、叶片、花、种子等特异性表达启动子；诱导型启动子可为受乙烯、书醇等诱导的启动子。上述启动子可以单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，利用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物基因、具抗性的抗生素标记物基因、或是抗化学试剂标记基因等。所述含新霉素磷酸转移酶（NPTII）基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物等进行筛选，含潮霉素转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。
本发明的一个具体实施方式是以pHB（pCambia1300切除GUS基因的改造载体）为植物表达载体，构建含有本发明郁金香查尔酮合成酶基因的正反义植物表达载体pHB-STfCHS和pHB-ATfCHS。携带有本发明郁金香查尔酮合成酶基因或其同源序列的植物表达载体可通过原生质体-化学介导法、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，培养花色苷合成变化的植物细胞系、组织或器官，并进一步培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果、愈伤组织、根、茎尖、叶片和种子等。
郁金香为世界十大切花之一，观赏价值极高，应用广泛，新花色品种的市场需求也越来越大。本发明首次克隆郁金香植物体内类黄酮生物合成途径第一个关键酶查尔酮合成酶TfCHS的基因，并利用根癌农杆菌介导的转化技术将正反义TfCHS基因转化到烟草中，改变了转基因烟草的花色和花朵中花色苷的含量。实验结果表明转基因烟草查尔酮合成酶基因表达均受到不同程度的抑制，与此同时，转基因烟草花朵的颜色出现不同程度的变浅，对应的花朵总花色苷含量下降了20%-60%。查尔酮合成酶为花色素合成途径的第一个关键酶，利用本发明提供的郁金香查尔酮合成酶基因TfCHS，能为利用基因工程改变花色，获得创新花色提供一种有效的技术手段。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的TfCHS基因与百合CHS基因mRNA的核苷酸序列的同源比较（GAP）结果。
图2为本发明的TfCHS与百合CHS基因mRNA的核苷酸序列的同源比较（GAP）结果。
图3为本发明的TfCHS与百合CHS的氨基酸序列的同源比较（FASTA）结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
图4为正反义植物表达载体pHB-STfCHS和pHB-ATfCHS构建示意图。
图5为野生型烟草花朵（A）与转正义表达载体pHB-STfCHS烟草花朵（B）及转反义表达载体pHB-ATfCHS烟草花朵(C)花色的比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、郁金香TfCHS基因的克隆
1.植物材料的获得
将健康、大小一致的郁金香球茎（Tulipa fosteriana‘Shangnongzaoxia’，已通过上海市农作物品种审定委员会审定。编号：沪农品认花卉2011第004号）按常规种植并进行田间管理，待花朵完全开放，花瓣完全着色时采集花瓣组织，用于提取RNA。
2.RNA的抽提
用“RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA（RNA prep pure PlantKit：天根生化科技（北京）有限公司）。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计（Thermo Scientific NANODROP1000Spectrophotometer）上测定RNA的纯度及浓度。
3.基因的全长克隆
根据CHS基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法（3’-Full RACE Core Set Ver.2.0：宝生物工程（大连）有限公司，SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit：Clontech Laboratories,Inc.）进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：
（1）RT-PCR获得基因中间片段
将提取的RNA进行反转录（Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit：宝生物工程（大连）有限公司），以第一链cDNA为模板，利用引物F1（SEQ ID NO.1）和R1（SEQ IDNO.2）进行PCR，扩增得到约840bp片段，回收并连接到pMD18-T Simplevector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer,USA）上进行测序。测序结果通过在NCBI网站进行BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对已有的数据库（GenBank），知其核酸序列及编码蛋白与已知的百合属查尔酮合成酶基因的同源性很高，故初步认为它是一个查尔酮合成酶基因。
（2）3’RACE
二轮巢式PCR完成3’末端序列的扩增。
第一轮：Outerprimer+CHS3-1(5’-TGTCGTCTGCTCTGAAATCACTGCC-3’)
第二轮：Innerprimer+CHS3-2(5’-AGCCAGACCATCCTCCCAGATTCGG-3’)
Outerprimer和Innerprimer为试剂盒提供。3’RACE得到TfCHS的3’末端序列（约590bp），回收，连接到pMD18-T Simple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye,Perkin-Elmer,USA）的方法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer,USA）上进行测序。测序结果通过在NCBI网站进行BLAST（http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对已有的数据库（GenBank），知其核酸序列及编码蛋白与已知的百合属查尔酮合成酶基因的同源性高。
（3）5’RACE
5’端的序列通过使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit获得，以5’RACEready cDNA为模板，通过引物UPM（试剂盒提供）与CHS5-1（5’-ATGAAGCGGTTGACGGAGGGGCGGA-3’）扩增获得TfCHS的5’末端序列（约510bp），回收连接后用同上面一样的方法进行测序。
将通过上述3种方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从郁金香中新得到的TfCHS基因确为一个与查尔酮合成酶相关的基因；将测序结果结合NCBI的ORF Finding（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf）预测，发现了TfCHS基因的起始密码子与终止密码子；根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物ORF-F（5’-ATGGCGAATGTCGATGAGATCCGGC-3’）和ORF-R（5’-TCAGTTGGAGGTGATTGGAAGGCTG-3’），以郁金香cDNA为模板进行PCR，扩增得到1179bp郁金香TfCHS蛋白的全长编码基因序列（如SEQ ID NO.3所示）。
实施例2、郁金香TfCHS基因的序列信息与同源性分析
郁金香TfCHS全长CDS开放阅读框序列为1179bp，详细序列见SEQ ID NO.3所示的序列，根据CDS开放阅读框序列推导出郁金香TfCHS的氨基酸序列，共392个氨基酸残基，分子量为42861.3道尔顿，等电点（pI）为5.90，详细序列见SEQ ID NO.4所示序列。
将郁金香TfCHS的CDS开放阅读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与百合CHS基因（GenBank登陆号HQ161731.1）在核苷酸水平上具有86%的相同性，如图1和图2所示；在氨基酸水平上，它与百合CHS基因（GenBank登陆号ACX31605.1）也有94%的一致性和99%的相似性，如图3所示。由此可见，郁金香TfCHS基因与百合CHS基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。
实施例3、郁金香TfCHS基因在花朵不同发育阶段及在郁金香不同组织中的表达差异
1.材料的获得
在郁金香花朵的4个不同发育阶段（花蕾，花瓣未着色；花蕾，花瓣开始着色；花朵部分开放，花瓣未完全着色；花朵完全开放，花瓣完全着色），于田间采取其花瓣，同时采取其叶片、地上茎、花部器官雄蕊、雌蕊、花瓣（各着色阶段花瓣的混合样），将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。
2.RNA的提取
利用RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒（RNA prep pure Plant Kit：天根生化科技（北京）有限公司）提取郁金香不同发育阶段花朵的花瓣以及不同组织中的RNA。
3.RNA的完整性、纯度、浓度的确定
用普通琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min）检测完整性，电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解，纯度较好的RNA，A260/A280以及A260/A230约为2.0左右；用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。
4.cDNA的获得
以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent KitPerfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。
5.实时荧光定量PCR分析基因在各器官与组织中的表达量：根据已经获得的郁金香TfCHS基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中TfCHS基因定量分析的特异性引物，CS-F（5’-AGCCAGACCATCCTCCCA-3’），CS-R（5’-GCCAGCTTCAACTCCACC-3’）；内参基因为Actin（GenBank登陆号AB456684），引物为Actin-F（5’-AGTCAGTCATACAGTGCCAATC-3’），Actin-R（5’-TCATAAGAGAGTCGGTCAAATCC-3’）。
6.制作目的基因及内参基因的标准曲线
用EASY Dilution（试剂盒提供）将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线，分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物，通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。
7.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析
以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在BIO-RAD Chromo4实时定量仪上进行，反应体系为20μl，反应采用三步法，94℃变性20s，接着41个循环：94℃15s；56℃15s；72℃25s；每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。
采用2-△△Ct法作相对定量分析，结果表明TfCHS基因的表达水平在花朵的发育过程中不断上升，花朵完全开放、花瓣完全着色时TfCHS的表达量显著高于其它着色阶段，为花瓣刚着色阶段表达量的4.8倍，说明该基因的表达与花瓣的着色过程有明显的相关性；TfCHS基因在叶、茎、雄蕊、雌蕊、花瓣中均有表达，表达量由多到少分别为茎＞花瓣＞叶＞雄蕊＞雌蕊。TfCHS基因在茎中的表达水平与在花瓣、叶中的无显著差异，但显著高于在雄蕊和雌蕊中的表达水平，分别为其5.8倍和6.3倍，这说明TfCHS基因的表达具有明显的空间差异性。
实施例4、郁金香TfCHS转基因功能验证
1.TfCHS基因正反义植物表达载体的构建
（1）克隆载体的构建
扩增用于构建正义表达载体的TfCHS基因时，在ORF-F和ORF-R引物5’端分别加入HindⅢ和PstⅠ酶切位点。
上、下游引物序列为5’-CCAAGCTTATGGCGAATGTCGATGAGAT-3’，5’-AACTGCAGTCAGTTGGAGGTGATTGGAA-3’。
扩增用于构建反义表达载体的TfCHS基因时，在在ORF-F和ORF-R引物5’端分别加含PstⅠ和HindⅢ酶切位点。
上、下游引物为5’-AACTGCAGATGGCGAATGTCGATGAGAT-3’，5’-CCAAGCTTTCAGTTGGAGGTGATTGGAA-3’。
通过PCR分别扩增TfCHS基因的正义和反义序列，分别命名为STfCHS和ATfCHS。电泳后在紫外灯下割取目的条带，用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司）回收STfCHS和ATfCHS，连接至pMD18-T vector，构建pMD18-STfCHS和pMD18-ATfCHS克隆载体，连接体系见说明书。冻融法转化大肠杆菌DH5α感受态，在含100mg·l-1氨苄的LB固体平板培养基上37℃培养过夜。LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g·l-1，酵母提取物5g·l-1，氯化钠10g·l-1。调节pH至7.0，灭菌。LB固体培养基配方为在LB液体培养基中，加入15g·l-1琼脂粉，灭菌。挑取单菌落PCR鉴定，送阳性菌落测序确定测序的正确性。将测序正确的含pMD18-STfCHS和pMD18-ATfCHS载体的DH5α菌落，加入2ml含100mg·l-1氨苄的LB液体培养基过夜培养到OD600值约为1.0。使用质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取pMD18-STfCHS和pMD18-ATfCHS载体，具体操作参照试剂盒说明书。
（2）正反义植物表达载体的构建
使用R的限制性内切酶HindⅢ和PstⅠ分别对克隆载体pMD18-STfCHS、pMD18-ATfCHS和植物表达载体pHB在37℃进行双酶切，时间15min。酶切体系参照酶切说明书。对酶切产物进行凝胶电泳，电泳后用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒分别回收目的酶切产物。
使用DNA Ligation Kit试剂盒（TaKaRa,China）对酶切后的目的片断和植物表达载体pHB进行连接，连接方法参见试剂盒说明书。将连接产物再次转化感受态DH5α菌株，在含100mg·l-1卡那霉素的LB固体平板培养基上37℃培养过夜，挑取单菌落，PCR鉴定筛选含pHB-STfCHS和pHB-ATfCHS重组质粒的DH5α菌落。挑取含重组质粒的DH5α菌落，加入2ml含100mg·l-1卡那霉素的LB液体培养基过夜培养至OD600值约为1.0。使用质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取pHB-STfCHS和pHB-ATfCHS重组质粒，具体操作参照试剂盒说明书。
2.正反义植物表达载体转化根癌农杆菌
将pHB-STfCHS和pHB-ATfCHS表达载体液氮冻融法转化感受态根癌农杆菌菌株GV3101。具体方法：向100μl GV3101感受态细胞中加入至少6μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃热击3min，迅速置于并上1-2min；加入800μl含50mg·l-1利福平和50mg·l-1庆大霉素的YEB培养基28℃，200rpm复苏3h；4000rpm离心5min，吸掉800μl YEB培养基；混匀剩余菌液，涂抹于含100mg·l-1卡那霉素，50mg·l-1利福平和50mg·l-1庆大霉素的YEB平板上；28℃倒置培养30-48h；挑选适量菌落以相应的引物进行PCR鉴定。YEB液体培养基配方：牛肉浸膏5g·l-1，胰蛋白胨5g·l-1，酵母提取物1g·l-1，蔗糖5.0g·l-1，MgSO4·7H2O0.5g·l-1，调节pH至7.0，灭菌。YEB固体培养基配方为在YEB液体培养基中加入15g·L-1琼脂粉。
3.农杆菌介导的烟草遗传转化
遗传转化的受体材料为烟草（Nicotiana tabacum）组培苗。需要的各种培养基配方如下：
MSO:MS粉+蔗糖30g·l-1,15g·l-1琼脂粉，pH5.8；
MS1(共培养培养基):MSO+6-BA l mg·l-1+NAA O.1mg·l-1,pH5.8；
MS2(筛选培养基):MS1+潮霉素50mg·l-1+头孢霉素300mg·l-1,pH5.8
MS3(生根培养基):1/2MSO+潮霉素25mg·l-1+头孢霉素300mg·l-1,pH5.8
（1）农杆菌的活化
从YEB培养平板上挑取含正反义植物表达载体的农杆菌单菌落，接种于10ml含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃,200rpm培养24h；再从中吸取1ml菌液转接于50ml含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃,200rpm培养至OD600值0.4-0.6。4℃，5000rpm离心10min收集菌体，用一定体积的MS0液体培养基悬浮菌体至OD600值为0.4左右用于浸染。
（2）烟草的遗传转化
将MS0基本培养基上的无菌烟草组培苗切去叶片边缘和主要叶脉，切成0.5cm×1.0cm大小的叶盘用作外植体。剪好的叶盘置于MS0培养平板上预培养2天，然后浸泡于上述OD600值为0.4左右农杆菌菌液中5min。用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，然后转移至MS1培养基中，叶片背面朝上黑暗中共培养两天。将经过共培养的烟草外植体转移到抗性筛选培养基MS2中进行培养，光照周期为16h光照/8h黑暗，2-3周后即可生芽。待抗性芽生长至1-2cm高时，切下小芽转入生根培养基MS3中诱导生根，1-2周后就会有不定根形成。等根系发达后,将烟草植株取出,用无菌水洗净掉固体培养基,再移入土壤中,刚开始几天用薄膜盖几天,待植株健壮后再取掉薄膜,置于温室中25℃培养。
4.转基因烟草的检测
（1）转基因烟草PCR检测
使用CTAB法提取转基因植株叶片的DNA。分别以pHB-STfCHS和pHB-ATfCHS质粒为阳性对照，以未转化的野生型烟草的总DNA为阴性对照，对正反义转基因烟草总DNA进行TfCHS基因的PCR扩增检测。检测引物分别为ORF-F和ORF-R。
选取对照（未转化植株）和PCR鉴定为阳性的转正反义表达载体烟草植株若干，分别采集花朵不同发育阶段（1：绿蕾，花朵长1-2cm；2：花蕾，花朵长3-4cm；3:花蕾，花瓣初显色；4：花瓣初展；5：花瓣完全展开），使用RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取其总RNA，然后使用Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，China）反转录合成第一链cDNA。以对照、转正反义表达载体烟草植株中RNA的反转录产物为模板，利用扩增烟草内源CHS基因特异性引物（上、下游引物分别为：5’-GTATCACTAATAGCGAGCATAAGGT-3’，5’-ACTAAACTATCCAAGTGGGTGTCAT-3’）进行半定量PCR。
以烟草的18S为内参基因，18s的扩增上、下游引物分别为（5’-ATGATAACTCGACGGATCGC-3’和5’-CTTGGATGTGGTAGCCGTTT-3’）。
（2）烟草花朵中总花色苷含量的测定
分别测定对照及正反义转基因烟草花朵完全开放时花瓣中总花色苷含量。总花色苷的提取方法如下：称取新鲜花瓣样品约0.5g,液氮急速冷却后直接研磨成粉末,用5ml提取液(V甲醇∶V水：V甲酸∶V三氟醋酸=70：27：2：1)浸提24小时，之后用中速滤纸过滤,再用过滤器(0.2μm)过滤待测,母液直接用于实验测定。总花色苷的测定采用美国Waters公司的超高效液相色谱–二极管阵列器（Ultra performance liquid chromatography with a photodiodearray detector，UPLC–PAD）检测，该***装备有高压二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、色谱工作站（MasslynxV4.1数据处理软件）。色谱柱为ACQUITYUPLC@BEH的C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm）。UPLC分析条件：柱温45℃，流速0.5ml·min-1，进样体积2μl。流动相A液为0.1%的甲酸溶液（V甲酸：V水=0.1：99.9）；B液为含0.1%甲酸的乙腈（V甲酸：V乙腈=0.1：99.9）。梯度洗脱程序：0min，93%A，7%B；1min，93%A，7%B；11min，82%A，18%B；11.5min，10%A，90%B；13min，10%A，90%B；13.1min，93%A，7%B；15min，93%A，7%B。在特征吸收波长520nm检测总花色苷含量。以标准品半定量法对花瓣中总花色苷含量进行定量，标准品为矢车菊素（Cyanidin chloride，Sigma）。总花色苷含量为每克新鲜花瓣中含有的相对于矢车菊素的含量。
结果显示，烟草CHS基因表达量在花朵发育过程中继续上升，与对照(未转化的野生型植株)相比,正反义转基因烟草中CHS基因的表达量在花朵开放的过程中显著低于对照。表示无论正义还是反义TfCHS基因转入烟草均显著抑制了其内源CHS基因的表达。正反义转基因烟草之间CHS基因的表达水平则无显著差异。与此同时，转基因烟草的花色呈现多样性。有的花瓣边缘颜色不变而其它部分很浅，有的花瓣整体颜色变浅，但花色普便变浅。如图5所示，A为未转化的烟草花朵，B为转正义TfCHS基因烟草的花朵，C为转反义TfCHS基因烟草的花朵，与A相比，B、C的花色均出现一定程度的变浅。与此对应的是，正反义转基因烟草花朵完全开放时花瓣中总花色苷的含量出现了不同程度的下调，下调幅度为20%-60%。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (3)

1.一种如下(a)的蛋白质：
(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
所述蛋白质的分子量为42861.3道尔顿，等电点为5.90；
所述的蛋白质为郁金香Tulipa fosteriana‘Shangnongzaoxia’查尔酮合成酶TfCHS蛋白。
2.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
3.如权利要求2所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为：
(a)碱基序列如SEQ ID NO.3第1～1179位所示。
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Tulipa fosteriana CHS1 mRNA,complete cds;Yuan Y.,et al;《GenBank：KC261503.1》;20130417;第1-2页 *
植物中查尔酮酶合成黄酮类化合物的研究进展;周小理 等;《食品工业》;20091231(第6期);第72-74页 *
百合ACC氧化酶基因全长cDAN的克隆及序列分析;刘鲜艳 等;《西北植物学报》;20081231;第28卷(第4期);第651页摘要，第654-655页2.3生物信息学的分析 *

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