CN103582486B

CN103582486B - 具有抗氧化活性的益生菌及其用途

Info

Publication number: CN103582486B
Application number: CN201180070870.0A
Authority: CN
Inventors: G·莫格纳; G·P·斯特罗兹; 卢卡·蒙加
Original assignee: Probiotical SpA
Current assignee: Probiotical SpA
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2031-03-17
Also published as: RU2013144267A; EP2685994A1; WO2012123770A1; BR112013023600A2; ES2561253T3; EP2685994B1; RU2572698C2; DK2685994T3; JP2014508186A; CN103582486A; US20140065116A1; PL2685994T3

Abstract

本发明涉及一种具有抗氧化活性的组合物。此外，本发明涉及具有抗氧化活性的益生菌及其用途。

Description

具有抗氧化活性的益生菌及其用途

技术领域

背景技术

众所周知，所有形式的生命在其细胞内都维持还原环境。由于过氧化物和自由基的产生和随后的积聚，氧化还原状态的任何改变都可引起毒性作用。仅仅是其过量，参与到与很多人类疾病(如：动脉硬化、高血压、帕金森病、阿尔兹海默病、糖尿病、结肠炎、风湿性关节炎)有关的氧化应激。

在生理条件下，正常细胞代谢期间产生的自由基的水平和能保护组织免受氧化损伤的内源性抗氧化剂的水平之间存在平衡。自由基的产生增加和抗氧化剂水平的降低导致的该平衡的打破，引起我们的细胞结构和功能开始改变。细胞生理上具有进行抗氧化的能力并因此由于酶的和非酶的性质的特定防御机制的存在而具有对抗自由基的保护作用。

尽管我们的细胞具有防御能力，但是我们日常生活的很多因素导致其减小。

例如，众所周知吸烟和摄入酒精和药物，以及过多的不可控的暴露于电离辐射能够导致细胞的防御能力减小。

此外，日常生活的节奏，连同包含很少的水果、蔬菜和鱼的不平衡饮食，必定不能使我们身体接受具有高抗氧化活性的维生素、矿物质和微量元素的充足补充。

因此，有必要去补充具有一定量的在人体内真正能表现抗氧化活性的特定抗氧化物质的饮食。

特别地，有必要提供一种组合物，一旦引入体内，其能够补充正常存在于体内的抗氧化物质的量，这样有助于减少氧化应激。

最后，有必要提供一种组合物，其能在氧化应激已经通过外部因素(例如服药后)诱发后，有效地维持高抗氧化防御。

发明内容

因此，本发明的主题是一种具有所附权利要求所述的特征的组合物。

如所附权利要求所述，本发明的主题进一步涉及所述组合物的用途。

在下面的说明书中描述本发明的其它优选实施方案，并在所附从属权利要求中要求其权益。

附图说明

图1是显示关于以下的总抗氧化活性(TAA)的值的柱状图：

-C(基准条件(baseline conditions)下的对照样品)，

-T2(基准条件下用本发明的益生菌以10⁸/天的剂量处理的对照样品)，

-C+DOX(用阿霉素处理的对照样品)，

-T1+DOX(用本发明的益生菌以10⁹/天的剂量和阿霉素处理的样品)，

-T2+DOX(用本发明的益生菌以10⁸/天的剂量和阿霉素处理的样品)，和

-T3+DOX(用本发明的益生菌以10⁷/天的剂量和阿霉素处理的样品)。

图2是显示关于以下的血浆谷胱甘肽(谷胱甘肽的抗氧化形式是指还原型谷胱甘肽，GSH)的浓度值的柱状图，该浓度值作为抗氧化能力的评价：

-C(基准条件下的对照样品)，

-C+DOX(用阿霉素处理的样品)，

具体实施方式

举例来说，表1表示一组在本发明的上下文中具有有效应用的微生物。

本申请人进行了深入的研究活动，其后发现属于选自包含嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)的组的种的菌株表现出显著的抗氧化活性，由此可在组合物中使用所选菌株以用作减少氧化应激的药物。

有利地，本发明的组合物可应用于正经受药物治疗的患者由于服用药物而诱发氧化应激的情况中。

在优选的实施方案中，本发明的组合物可包含菌株的混合物，其包含一种或多种属于嗜酸乳杆菌的种的菌株，例如两种或三种菌株；一种或多种属于短乳杆菌的种的菌株，例如两种或三种菌株；和一种或多种属于乳双歧杆菌的种的菌株，例如两种或三种菌株。

在优选的实施方案中，本发明的组合物包括含至少一种菌株的混合物，该至少一种菌株选自包含以下的组：

-乳双歧杆菌BS05(ID1666)，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司(Probiotical SpA)于2009年10月13日在位于德国的DSMZ保藏且保藏号为DSM23032，和/或

-嗜酸乳杆菌LA06(ID1683)，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司于2009年10月13日在位于德国的DSMZ保藏且保藏号为DSM23033，和/或

-短乳杆菌LBR01(ID1685)，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司于2009年10月13日在位于德国的DSMZ保藏且保藏号为DSM23034。

有利地，菌株混合物由乳双歧杆菌BS05(ID1666)DSM23032、嗜酸乳杆菌LA06(ID1683)DSM23033和短乳杆菌LBR01(ID1685)DSM23034组成。

本发明的上下文中，菌株可以是活菌或死菌或其细胞组分，细胞提取物和/或灭活的、溶菌的或透性化细菌形式。

本发明的组合物可以是食品组合物，例如共生组合物，或者补充剂或药物组合物。

在优选的实施方案中，组合物可进一步包含表2中所列的一种或多种菌株。

优选地，组合物可以另外包含选自表2中所列的1至6种菌株，甚至更优选1至3种该菌株。

特别优选的菌株选自表2中所列的菌株，其用左侧列中的数字标示：No.5、No.20、No.42、No.49、No.80、No.81、No.92、No.93、No.99、No.100，和No.101。

菌株No.99、No.100，和No.101是特别优选的，这是由于它们被赋予显著的抗氧化活性。

其中，菌株No.5和No.20还被赋予抗炎性。

菌株No.42、No.80和No.81也能抗感染，例如肠道酵母感染，包含念珠菌感染。

菌株No.49也能在肠道中制造叶酸。

菌株No.5、No.92和No.93也能拮抗肠道大肠杆菌。

本专利申请中所述和/或所要求保护的所有菌株都已依照布达佩斯协议由具有资格的保藏机构保藏，且公众根据要求可获取。

有利地，本发明的组合物可包含具有抗氧化活性的元素或物质，例如，如硒，锌，镁，锰，谷胱甘肽，超氧化物歧化酶(SOD)，维生素C，维生素E，β-胡萝卜素，类胡萝卜素，核黄素，牛磺酸，L-肌肽，虾青素，番茄红素，番茄籽油，槲皮素，酪醇，白藜芦醇，羟基酪醇，橄榄苦苷，叶黄素，螺旋藻，辣椒素，蜂胶，人参，银杏，辅酶Q₁₀，α-硫辛酸，ω-3不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)，浆果(berry)提取物如越桔(bilberry)提取物、蔓越莓(cranberry)提取物、醋栗(currant)提取物和葡萄籽提取物，绿茶提取物，仙人掌提取物，菊芋(artichoke)提取物，木瓜(papaya)提取物，甜瓜(melon)提取物，苹果提取物，啤酒花(hop)提取物，山茶花(camellia)提取物，红三叶草(red clover)提取物，接骨木(elderberry)提取物，迷迭香提取物，可可提取物，橄榄叶提取物，松树皮提取物和牡蛎提取物以及多酚含量大于1重量%的其它植物提取物。

有利地，所述提取物可已预先经受至少一个发酵步骤。在本发明的优选实施方案中，使用经发酵的木瓜。从木瓜果实和从经酵母(优选酵母属)和细菌的发酵后的几种热带草本植物中产生和提取经发酵的木瓜。经发酵的木瓜提高了本发明的菌株活性，不仅在抗氧化活性方面，而且还在减少自由基、抑制脂肪过氧化、强化免疫***、碱化性，以及在体外和体内实验体系中螯合过渡金属而带来的对引起肠道感染的微生物的抗菌作用的方面。

如上所述具有抗氧化活性的所述元素或物质以相对于最终组合物重量为0.0001重量%至30重量%的量来加入，取决于具有抗氧化活性的物质的浓度和/或规定的推荐的日摄取量(RDA)。

硒可以以硒酸钠、***钠和***氢钠(sodium acid selenite)的形式存在，以及以微生物的形式(例如富硒酵母)存在，其量相对于最终组合物的重量为0.0005重量%至0.005重量%，该量在任何情况下足以提供优选为10μg至150μg的硒量。

在优选的实施方案中，本发明的组合物进一步包含一种或多种能够内化硒的菌株。

特别应用的菌株为与本发明的抗氧化活性菌株联合的BIOMAN S.r.l.公司(Via Alfieri18,10100都灵)保藏的菌株，即：布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)LB26BM，于2004年4月5日保藏于DSMZ且保藏号为DSM16341；费茵妥申乳杆菌(Lactobacillus ferintoshensis)Lb6BM，于2004年1月17日保藏于DSMZ且保藏号为DSM16144；罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Lb2BM，于2004年1月17日保藏于DSMZ且保藏号为DSM16143。

实际上，如果在合适的硒源存在下在培养基中生长，所述菌株能够在细胞内积聚大量的硒，尤其是以有机形式的硒。

谷胱甘肽是强抗氧化剂，无疑是机体能够制造的最重要的抗氧化剂之一。其对自由基和分子如过氧化氢、亚硝酸盐、硝酸盐、苯甲酸盐等具有相当大的作用。其在红细胞中发挥重要作用，保护所述细胞免受危险的可引起溶血的氧化应激。此外，抗氧化形式是指还原型谷胱甘肽(或GSH)。

在优选的实施方案中，组合物以相对于最终组合物重量的0.5重量%至10重量%的量包含还原型的谷胱甘肽和硒。

有利地，由于如果口服，可部分灭活谷胱甘肽，该组合物可包含硫氨基酸半胱氨酸和/或N-乙酰半胱氨酸和/或其混合物。

在优选的实施方案中，使用的是与本发明的抗氧化菌株联合的番茄籽油，因为其尤其富含番茄红素，一种具有显著抗氧化活性的类胡萝卜素。

在本发明的组合物中，菌株混合物以相对于组合物总重量为0.5至20重量%，优选2.5至8重量%的量存在。

在优选的实施方案中，组合物可进一步包含至少一种益生元纤维和/或具有双歧作用的碳水化合物，例如，如菊粉、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖和反式低聚半乳糖(GOS和TOS)、低聚葡萄糖(GOSα)、低聚木糖(XOS)、低聚壳聚糖(COS)、大豆低聚糖(SOS)、低聚异麦芽糖(IMOS)、抗性淀粉、果胶、车前子、***半乳聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、木聚糖、乳果糖、乳酮糖、乳糖醇和各种其它类型的树胶、***纤维、角豆树纤维(carobfibre)、燕麦纤维或竹纤维、柑桔纤维，并且通常，包含可溶和不溶部分彼此不同比例的纤维。

在本发明的优选实施方案中，组合物包含至少一种选自上述益生元纤维的益生元纤维和/或其以任何相对百分比的合适的混合物。

如果存在于该组合物中，则益生元纤维和/或具有双歧作用的碳水化合物的量相对于该组合物的总重量为0至60重量%，优选5至45%且甚至更优选10至30%。在该情况下，组合物或补充剂具有共生活性和功能性。

此外，食品或补充剂的内部部分也能包含其它的活性成分和/或组分，如维生素，矿物质，生物活性肽，具有抗氧化性、低胆甾醇化、低血糖化、抗炎性的物质，抗甜味剂(anti-sweetening agent)，上述活性成分和/或组分的重量在任何情况下取决于活性组分的类型和其推荐的日摄取量(如果限定的话)，相对于组合物总重量通常为0.001重量%至20重量%，优选0.01重量%至5重量%。

本发明的食品组合物，例如共生组合物，或者补充剂或药物组合物，使用本领域技术人员已知的技术和设备来制备。

在优选的实施方案中，组合物包含浓度为1×10⁶至1×10¹¹CFU/g混合物的细菌，优选1×10⁸至1×10¹⁰CFU/g混合物的细菌。

在优选的实施方案中，组合物包含浓度为1×10⁶至1×10¹¹CFU/剂量，优选1×10⁸至1×10¹⁰CFU/剂量的细菌。

剂量可以为0.2至10g，例如0.25g、1g、3g、5g或7g。

本发明中使用的益生菌可以为固体形式，特别是粉末，脱水粉末或冻干形式。

在优选的实施方案中，菌株混合物包含微胶囊形式的至少一种菌株，所述至少一种菌株选自乳双歧杆菌BS05(ID1666)DSM23032、嗜酸乳杆菌LA06(ID1683)DSM23033和短乳杆菌LBR01(ID1685)DSM23034，即，用包含至少一种脂质优选植物源脂质的组合物覆盖所述至少一种菌株(或全部三种所述菌株)。然后使用本领域技术人员已知的操作方法，添加微胶囊化细菌至油系液体组合物中以得到油性混悬液。

上述添加至油系液体组合物中的细菌可以是微胶囊化细菌和/或“裸的”非微胶囊化细菌，或其混合物的形式。

优选微胶囊化形式的选自乳双歧杆菌BS05(ID1666)DSM23032、嗜酸乳杆菌LA06(ID1683)DSM23033和短乳杆菌LBR01(ID1685)DSM23034的细菌可以通过本领域技术人员已知的常规技术，例如，可以使用在其中可使用脂质性质的覆盖材料的流化床技术(例如顶喷或底喷)来微胶囊化。

在优选的实施方案中，可使用熔点低于75℃，优选45至65℃的饱和植物脂肪。

在优选的实施方案中，可使用具有一定程度亲水性的饱和植物脂肪；它们可选自饱和脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯，用饱和脂肪酸来酯化的聚甘油和游离的饱和脂肪酸。

例如，可使用二硬脂酸聚甘油酯(商品名：Plurol Stearique WL1009)、棕榈酸硬脂酸甘油酯(商品名：Precirol Ato5)、饱和脂肪酸(商品名：Revel C)或非月桂酸源的氢化植物脂肪。

在优选的实施方案中，冻干微生物和覆盖其的脂质覆盖材料的重量比为50:50或40:60。

在第一实施方案中，选自氢化棕榈脂肪(Tm=60℃)和二棕榈酸硬脂酸甘油酯(Tm=57-60℃)的两种脂质连续地喷射至冻干产物上，即，向冻干产物应用双层覆盖：具有氢化棕榈脂肪的第一层和具有二棕榈酸硬脂酸甘油酯的第二层之比为3:1。细胞的双层覆盖确保了细菌对环境的较好密封，产生没有与外界相通的孔的连续膜。然而，该包装材料必须在肠道水平打开以释放细菌并让它们定殖。所选的脂质实际上耐酸性pH，以使涂层在胃中保持完整，但是对甚至是微碱性的pH也敏感，以致在它们通过肠道时在涂层中形成孔。

在优选的实施方案中，本发明的组合物是包含如上所述覆盖的乳酸菌的油系组合物。

所述组合物根据本领域技术人员已知的技术来制备。

实际上，将给定量的油引入到设置有搅拌和加热装置的容器中。随后，在搅拌下逐渐添加固体形式的覆盖的益生菌以避免结块和成团。细菌的添加一旦结束，油性混悬液在搅拌下维持1至30分钟的时间，如有必要可稍微加热至25至40℃，优选30至35℃的温度。

这样获得的组合物近似油性混悬液。组合物包含相对于组合物总重量为30重量%以下，包括0.05至20重量%的量的细菌；优选相对于组合物总重量的含量为0.5至10%；甚至更优选含量为1.5至5重量%。

组合物包含至少一种适合给予儿科患者的食用油，其选自包含以下的组：橄榄油、玉米油、豆油、亚麻籽油、花生油、芝麻油、鱼油和米糠油以及其它籽油，其中，特别地，能使用番茄籽油。

所述油可单独，或以合适的混合物且以适当的重量比一起使用。

有利地，所述油是生物等级的且它们的制备可包含精制步骤和/或低温压榨步骤。

组合物以相对于混悬液的总重量为70重量%以上的量，优选以75至95重量%，有利地为至少90重量%的量包含至少一种油。

有利地，组合物仅包含橄榄油，或者与玉米油和/或豆油和/或亚麻籽油和/或番茄籽油混合的橄榄油。有利地，该橄榄油是特级初榨的且是生物等级的。

在优选的实施方案中，组合物进一步包含至少一种细分的食品复合物，其选自包含硅石、二氧化硅、硅胶、胶态硅石、沉淀硅石(precipitated silica)、滑石、硅酸镁、氧化镁、碳酸镁、硅酸钙、卵磷脂、甘油单酯或甘油二酯如硬脂酸甘油单酯、油酸甘油单酯、聚甘油油酸(plurol-oleic acid)、淀粉、改性淀粉、魔芋胶、黄原胶、结冷胶和角叉菜胶的组。

所述材料以相对于组合物总重量为0.1至15重量%，优选相对于组合物总重量为1至5重量%的量存在。

在该情况下，提供如下制备工艺：将细分的食品材料(例如二氧化硅)在搅拌下加入至给定量的油中。随后，在搅拌下在约60℃下加热包含所述材料的油直至完全溶解。

可选地，也可加入冷的二氧化硅；但是，溶解需要较长时间。

随后，将组合物从60℃冷却至室温。然后称量冻干产物并在搅拌下加入至混悬液中，直至完全和均匀分散。这样获得的组合物近似油性混悬液。

根据本发明，优选的组合物的实施例如表3所示(实施例1-4)。

实施例1-4仅以本发明的非限制性实施例的形式，并考虑到适合30天治疗期的油性混悬液体积而给出。因此，以数十亿活细胞显示、表示的活菌计数指的是30个剂量。生产时，单剂量能够提供15亿/株(实施例1和2)和25亿/株(实施例3和4)。

申请人已发现可使用不同体积的油性混悬液，例如5ml，适合用于短期治疗。

在优选的实施方案中，油性混悬液可进一步以相对于混悬液总重量为0.5至25重量%的量包含至少一种益生元纤维和/或至少一种选自以下的双歧碳水化合物：菊粉、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖和反式低聚半乳糖(GOS和TOS)、低聚葡萄糖(GOSα)、低聚木糖(XOS)、低聚壳聚糖(COS)、大豆低聚糖(SOS)、低聚异麦芽糖(IMOS)、麦芽糖糊精、抗性淀粉、果胶、车前子、***半乳聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、木聚糖、乳果糖、乳酮糖、乳糖醇、***纤维、角豆树纤维、燕麦纤维、竹纤维和柑桔纤维。

益生元纤维和碳水化合物具有双重效果。首先是发挥益生效果。其次是发挥作为增稠剂和稳定剂的技术效果。

有利地，所述至少一种纤维和至少一种碳水化合物选自低聚葡萄糖(GOSα)、低聚果糖(FOS)、菊粉和/或麦芽糖糊精。混悬液包含微胶囊化的微生物的菌株和至少一种熔点低于75℃，优选45至65℃的脂质。

指示混悬液适用于作为治疗肠道疾病的药物，例如，如儿科患者的绞痛。

在另一个优选实施方案中，将本发明的组合物配制为袋剂(sachets)。表4示出实施例5-8。

在实施例6中，菌株布氏乳杆菌LB26BM(DSM16341)包含50μg/g普遍以蛋氨酸硒和半胱氨酸硒形式在细胞内累积的硒；因此，1g能提供所述元素的90%的RDA。

在实施例7中，组合物包含3g与乳双歧杆菌BS05(DSM23032)菌株有协同作用的经发酵的木瓜。

下面是培养菌株乳双歧杆菌BS05(ID1666)DSM23032、嗜酸乳杆菌LA06(ID1683)DSM23033和短乳杆菌LBR01(ID1685)DSM23034的操作条件的描述。该条件对所有菌株都是有效的，除非另有说明。

i)所使用的培养基：对于DSM23032为TPY肉汤+Cys HCl0.5g/l，对于DSM23033和DSM23034为Difco MRS ref.288130。

ii)灭菌前培养基的pH值：对于DSM23032为7.10，对于DSM23033和DSM23034为7.00。

iii)灭菌：在121℃下15分钟。

iv)灭菌后培养基的pH值：对于DSM23032为6.60，对于DSM23033和DSM23034为6.50。

v)与氧的关系：对于DSM23032为专性厌氧种，而对于DSM23033和DSM23034为可选的厌氧或微需氧种。

vi)温育温度：37℃。

vii)温育时间：对于DSM23032为17小时，对于DSM23033和DSM23034为15小时。

viii)短期储存温度：5℃。

ix)转移时间(Transfer time)：2天。

x)长期储存温度：-25℃。

xi)活性测试条件：DSM23032为在37℃下TPY肉汤中生长过夜或直到达到足够浑浊，DSM23033和DSM23034为在37℃下MRS肉汤中生长过夜。

xii)描述：对于DSM23032的情况，为不同形状，革兰氏阳性的，酸度的非快速形成的，无孢子形成的，厌氧的，专门降解葡萄糖的和通过果糖-6-磷酸磷酸转酮酶途径的特有方式的杆菌；对于DSM23033为圆头的，单个或成链排列的，在37℃生长良好，且专性同型发酵代谢的杆菌，对于DSM23034为专性异型发酵的杆菌。

实验部分

为了鉴定一种或多种赋有抗氧化活性的微生物，申请人对大量益生菌进行了大规模筛选。

第一次活性筛选通过一系列体外试验进行。特别地，评价了全细胞和细胞提取物的总抗氧化活性(TAA)。

在全细胞的情况下，通过以下两种测试研究了潜在的抗氧化活性：

-抗坏血酸的自动氧化AA%

-亚麻酸的氧化LA%

两个测试量化了作为全细胞使用的菌株保护抗坏血酸或亚麻酸免受氧化的能力。

具体地，可通过分光光度法记录在265nm处的脱氢抗坏血酸的存在来测定抗坏血酸的自动氧化反应的动力学，因此提供了抗氧化力的量度，将其评价为抑制所述自动氧化反应的能力。

相反，硫代巴比妥酸试验是用来监控菌株抑制亚麻酸过氧化的能力。实际上，亚麻酸的氧化引起导致不同自由基种类形成的自动催化链。自由基种类分解的产物之一是丙二醛，其可在硫代巴比妥酸试验中用作氧化应激的指示剂，因为它能与所述酸反应形成可在534nm处分光光度测定的显红色的络合物。

相反，对细胞提取物进行了包含以下测试的研究工作：

-等价抗氧化能力(Equivalence Antioxidant Capacity，TEAC)%

-谷胱甘肽(GSH)nmoles/mg

-超氧化物歧化酶(SOD)U/mg

第一测试基于抗氧化剂分子与阳离子自由基ABTS·+(2,2’-次偶氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯))的反应。

可由其清除能力可在734nm处分光光度测定的抗氧化剂来减少该自由基，由此降低吸光度。该试验在37℃下进行且通过与(合成的抗氧化剂，亲水的维生素E类似物)的比较获得结果，从而确定具有与1mM所分析(TEAC)物质的溶液的抗氧化能力相当的溶液的毫摩尔浓度。

第二和第三测试测定单一菌株能够产生的还原型谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的浓度。两种分子已知均具有抗氧化活性。

超氧化物歧化酶(SOD)的活性通过分光光度法，利用肾上腺素(4-[1-羟基-2-(甲氨基)-乙基-1,2-苯二酚])氧化的酶抑制原理来测定。O2的氧化发生在碱性pH下并伴随有过氧化物阴离子(O2-)的生成，该阴离子通过在溶液里累积而促进了肾上腺素向肾上腺素红(3-羟基-1-甲基-5,6-二酮-吲哚啉(3-hydroxy-1-methyl-5,6-indolindion))的转化，该肾上腺素红是根据吸光度的测量允许监测反应过程的有色化合物。

超氧化物歧化酶(SOD)的存在除掉了O2-离子并降低了肾上腺素红的形成速度和量。氧化的抑制率为SOD浓度的双曲线函数。

谷胱甘肽的定量分析可以使用依赖以下Ellman酶反应的分光光度法进行：谷胱甘肽的巯基与5,5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)反应，形成黄色化合物：5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)。同时，氧化型谷胱甘肽通过谷胱甘肽还原酶再次还原，导致TNB的进一步形成。TNB的形成速率与总GSH浓度成正比，表示为细胞提取物中存在的每mg蛋白质的纳摩尔。

结果示于表1。

从表1可以推测，从全细胞和细胞提取物观察到，菌株具有显著抗氧化活性。

随后，为证实本发明菌株的抗氧化活性也在体内模型中，申请人进行了动物研究。

特别地，该研究针对喂养标准饮食7天的48只健康成年维斯塔(Wistar)大鼠(哈伦(Harlan)，米兰，意大利)的样本群体进行。

随后，该48只大鼠分为以下组：

-组C：对照组，其包含仅喂标准饮食而无益生菌18天的20只大鼠。

-组T1：研究组，其包含喂以下饮食18天的7只大鼠，该饮食以1×10⁹CFU/天的浓度补充包含以下菌株的细菌混合物：以重量比为1:1:1(为了简便下文称作M)的乳双歧杆菌BS05(ID1666)DSM23032、嗜酸乳杆菌LA06(ID1683)DSM23033和短乳杆菌LBR01(ID1685)DSM23034。具体地，前述的益生菌菌株以一定浓度与大鼠饲料混合，以使单个动物日均消耗量中存在1×10⁹CFU的总量。

-组T2：研究组，其包含喂养用M混合物(如上所述)以1×10⁸CFU/天的浓度补充的饮食18天的14只大鼠。

-组T3：研究组，其包含喂养用M混合物(如上所述)以1×10⁷CFU/天的浓度补充的饮食18天的7只大鼠。

18天结束时，组C和组T2的大鼠分别分成各含10只和7只大鼠的两个亚组：一个亚组(Cf和T2f)注射生理盐水溶液，而另一亚组以体重的20μg/g的剂量注射阿霉素(缩写为DOX，具有能够诱发强氧化应激的促氧化活性的抗肿瘤药)溶液(CDOX和T2DOX)。组T1和T3的所有大鼠注射相同剂量的阿霉素(T1DOX和T3DOX)。

然后在注射生理盐水溶液或DOX后24小时内处死大鼠。然后采集血浆样品以量化体外的总抗氧化活性(TAA)和还原型谷胱甘肽(GSH)的水平(图1和2)。

相比于CDOX和T1DOX，T2DOX和T3DOX使我们能评价部分益生元混合物对抗阿霉素诱发的氧化应激的可能保护，还能根据投与的活细胞数量揭示可能的量效关系。

因此，在缺少阿霉素诱发的氧化应激的情况下，比较Cf和T2f有助于揭示在生理条件下益生菌菌株诱发的抗氧化活性的可能提高。

在图1和2(总抗氧化活性，分别为TAA和血浆谷胱甘肽)中，在氧化应激的情况下用益生菌处理的效果(对照组CDOX和组T1DOX、T2DOX和T3DOX的差异)通过ANOVA统计分析并比较所有接受DOX的大鼠来评价。投与阿霉素的效果通过ANOVA测试(使用图基事后检验(Tukey post test))和对所有使用DOX处理的组与基准对照组(Cf)比较来评价。对照组(Cf)与基准条件下用益生菌处理的组(T2f)的差异用学生的t检验(Student’s t test)来评价。

从图1观察到，在基准条件下(C和T2)，用益生菌处理没有改变TAA(非显著性比较，n.s)。在没有用益生菌处理的大鼠中，投与DOX与基准值相比引起TAA的显著减少(t检验p<0.001)。此外，在用益生菌处理的大鼠中，投与DOX与基准值(Cf)相比引起TAA的降低，但在较高浓度益生菌的处理(T1和T2)中，该减少较小(t检验p<0.02)。在用低浓度益生菌处理的大鼠(T3)中，在投与DOX之后，TAA的减少较大(t检验p<0.001)。用DOX处理的组之间的差异是显著的(ANOVA p<0.05)。

在图2中，将GSH的浓度用作抗氧化能力的量度。在氧化应激下，削弱了GSH的水平。

C vs.T2：t检验p>0.05(不具统计学显著性，n.s.)比较C与所有用DOX处理的组的ANOVA测试：p<0.001。

事后检验(图基)：

C vs.C+DOX p<0.001

C vs.T1+DOX不显著

C vs.T2+DOX p<0.05

C vs.T3+DOX p<0.01

图2显示在基准条件下对照组和用M混合物处理的大鼠之间无差异。在对照组大鼠中，氧化应激引起GSH浓度的明显降低(p<0.001)。在用高浓度的M混合物处理的大鼠中(T1)，注射DOX不会引起GSH水平的显著降低(不显著)。在用中等剂量的M混合物处理的大鼠中，与基准对照组相比较，观察到降低，但统计学显著性较低(p<0.05)。在用最小剂量的益生菌处理的大鼠中，GSH水平的降低是更明显的(p<0.01)。用DOX处理的不同组之间的差异是显著的(ANOVA p<0.05)。

以上报道的所有数据显示投与三种益生菌菌株的混合物(M混合物)能降低由注射阿霉素(具有促氧化活性的抗肿瘤药物)诱发的氧化应激(见图1，C+DOX与T1+DOX之间的对比)。

按照血浆水平总抗氧化活性的降低和还原型谷胱甘肽(GSH)的降低来评价氧化应激。谷胱甘肽是能够抗氧化应激和中和存在于血浆中的自由基的重要分子。

最有趣的是组C+DOX(对照组，无益生菌处理而用阿霉素注射18天后)与组T1+DOX/T2+DOX(分别用量为10⁹和10⁸CFU/天的益生菌处理，注射阿霉素18天后的组)之间的比较。益生菌最低浓度，即，10⁷CFU/天(组T3)，在减少阿霉素诱发的氧化应激方面显示较有限的效用。

无论如何，我们相信大鼠中10⁸CFU/天的浓度可代表习惯用于人类的量(10¹⁰-10¹¹CFU/天)。

Claims

1.菌株用于制备治疗氧化应激的药物的用途，所述菌株属于选自包含乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和短乳杆菌的组的种并具有抗氧化性，其中所述菌株选自：

-乳双歧杆菌BS 05(ID 1666)，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司于2009年10月13日在位于德国的DSMZ保藏且保藏号为DSM 23032，

-嗜酸乳杆菌LA 06(ID 1683)，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司于2009年10月13日在位于德国的DSMZ保藏且保藏号为DSM 23033，和

-短乳杆菌LBR01(ID 1685)，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司于2009年10月13日在位于德国的DSMZ保藏且保藏号为DSM 23034。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述氧化应激由药物的服用而诱发。

3.组合物用于制备治疗氧化应激的药物的用途，所述组合物用作药物，所述组合物包括含至少一种菌株的混合物，所述至少一种菌株属于选自包含乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和短乳杆菌的组的种并具有抗氧化性，

其中所述菌株选自：

-嗜酸乳杆菌LA06(ID 1683)，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司于2009年10月13日在位于德国的DSMZ保藏且保藏号为DSM 23033，和

-短乳杆菌LBR01(ID 1685)，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司于2009年10月13日在位于德国的DSMZ保藏且保藏号为DSM 23034，

其中所述组合物包含浓度为1×10⁶至1×10¹¹CFU/g混合物的细菌。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述组合物用于由于服用药物已诱发氧化应激的情况。

5.根据权利要求3或4所述的用途，其中所述组合物包含浓度为1×10⁸至1×10¹⁰CFU/g混合物的细菌。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述组合物包含浓度为1×10⁶至1×10¹¹CFU/剂量的细菌。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述组合物包含浓度为1×10⁸至1×10¹⁰CFU/剂量的细菌。

8.根据权利要求3、4、6、7任一项所述的用途，其中所述混合物包含覆盖有至少一种饱和植物脂肪的细菌，所述至少一种饱和植物脂肪具有低于75℃的熔点，并选自饱和脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯、用饱和脂肪酸来酯化的聚甘油和游离的饱和脂肪酸。

9.根据权利要求5所述的用途，其中所述混合物包含覆盖有至少一种饱和植物脂肪的细菌，所述至少一种饱和植物脂肪具有低于75℃的熔点，并选自饱和脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯、用饱和脂肪酸来酯化的聚甘油和游离的饱和脂肪酸。

10.根据权利要求8所述的用途，其中所述至少一种饱和植物脂肪具有45℃至65℃的熔点。

11.根据权利要求9所述的用途，其中所述至少一种饱和植物脂肪具有45℃至65℃的熔点。

12.根据权利要求8所述的用途，其中将所述覆盖的细菌加入至植物来源的油，所述植物来源的油选自包含橄榄油、玉米油、豆油、亚麻籽油、花生油、芝麻油、鱼油和米糠油以及其它籽油的组。

13.根据权利要求9所述的用途，其中将所述覆盖的细菌加入至植物来源的油，所述植物来源的油选自包含橄榄油、玉米油、豆油、亚麻籽油、花生油、芝麻油、鱼油和米糠油以及其它籽油的组。

14.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述其它籽油为番茄籽油。

15.根据权利要求3、4、6、7、9至13任一项所述的用途，其中所述组合物进一步包含具有抗氧化活性的元素或物质。

16.根据权利要求5所述的用途，其中所述组合物进一步包含具有抗氧化活性的元素或物质。

17.根据权利要求8所述的用途，其中所述组合物进一步包含具有抗氧化活性的元素或物质。

18.根据权利要求14所述的用途，其中所述组合物进一步包含具有抗氧化活性的元素或物质。

19.根据权利要求15所述的用途，其中所述具有抗氧化活性的元素或物质为硒，锌，镁，锰，谷胱甘肽，超氧化物歧化酶(SOD)，维生素C，维生素E，β-胡萝卜素，番茄红素，番茄籽油，槲皮素，酪醇，白藜芦醇，羟基酪醇，橄榄苦苷，叶黄素，螺旋藻，α-硫辛酸，ω-3不饱和脂肪酸，浆果提取物，绿茶提取物，仙人掌提取物，菊芋提取物，木瓜提取物，甜瓜提取物，苹果提取物，啤酒花提取物，山茶花提取物，红三叶草提取物，接骨木提取物，迷迭香提取物，可可提取物，橄榄叶提取物，松树皮提取物和牡蛎提取物以及多酚含量大于1重量％的其它植物提取物。

20.根据权利要求16至18任一项所述的用途，其中所述具有抗氧化活性的元素或物质为硒，锌，镁，锰，谷胱甘肽，超氧化物歧化酶(SOD)，维生素C，维生素E，β-胡萝卜素，番茄红素，番茄籽油，槲皮素，酪醇，白藜芦醇，羟基酪醇，橄榄苦苷，叶黄素，螺旋藻，α-硫辛酸，ω-3不饱和脂肪酸，浆果提取物，绿茶提取物，仙人掌提取物，菊芋提取物，木瓜提取物，甜瓜提取物，苹果提取物，啤酒花提取物，山茶花提取物，红三叶草提取物，接骨木提取物，迷迭香提取物，可可提取物，橄榄叶提取物，松树皮提取物和牡蛎提取物以及多酚含量大于1重量％的其它植物提取物。

21.根据权利要求19所述的用途，其中所述ω-3不饱和脂肪酸选自由十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)组成的组。

22.根据权利要求20所述的用途，其中所述ω-3不饱和脂肪酸选自由十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)组成的组。

23.根据权利要求19所述的用途，其中所述浆果提取物选自由越桔提取物、蔓越莓提取物、醋栗提取物和葡萄籽提取物组成的组。

24.根据权利要求20所述的用途，其中所述浆果提取物选自由越桔提取物、蔓越莓提取物、醋栗提取物和葡萄籽提取物组成的组。

25.根据权利要求19所述的用途，其中所述提取物预先已经过发酵。

26.根据权利要求20所述的用途，其中所述提取物预先已经过发酵。