CN103575716A - 磁场调控的超分辨荧光成像方法 - Google Patents

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张敏
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Abstract

本发明涉及一种磁场调控的超分辨荧光成像方法，涉及光学显微镜成像测量方法技术领域，克服了现有的应用于超分辨成像方法的荧光探针转换次数和发射光子数少的问题。外加磁场影响探针发光的超分辨荧光成像方法，在标记了荧光探针的待测样品附近施加一个外磁场，同时进行超分辨成像的数据采集；利用软件对采集到的数据进行分析。本发明的磁场调控的超分辨荧光成像方法增大了染料等荧光探针的发射光子数，提高了超分辨成像分辨率，并且使超分辨成像方法进一步发展。

Description

磁场调控的超分辨荧光成像方法
技术领域
本发明涉及光学显微镜成像测量方法技术领域，具体涉及一种外加磁场条件下，磁场调控的超分辨荧光成像方法。
背景技术
超分辨荧光显微技术的发明突破了衍射极限，使得分辨率可以达到几十纳米，因而可以很好地在单分子水平上观测和研究生物学过程。(G.Patterson,M.Davidson,S.Manley,and J.L.Schwartz,Superresolution Imaging usingSingle-Molecule Localization,Annual Review of Physical Chemistry,2010(61):345–367)。
现有技术中基于单分子定位的超分辨成像方法，如随机光学重建显微镜（STORM）、光激活定位显微镜（PALM）等，以其卓越的分辨能力、相对简单的装置等优越性在生物研究中发挥着越来越重要的作用。STORM和PALM的超分辨成像方法具有如下的步骤：首先用能够在荧光态/暗态转换的荧光染料或荧光蛋白标记样品，在任一时刻，成像过程中，大多数样品中的荧光探针保持在暗态，只有随机的一小部分转换为荧光态；之后发光的荧光探针被光转换或光漂白为暗态；随后另一小部分荧光探针被随机转换为荧光态；如此往复，使得被标记的分子单独成像；最后将所有的成像累积，最终重构成超分辨成像。
上述的STORM和PALM超分辨成像方法的分辨率与荧光探针的光化学/物理性质（如转换循环次数、每次转换发射的光子数、对比度等）关系密切。理想的荧光探针应该具有每次转换能够发出大量的光子数，荧光态/暗态的对比度很高等性质。但目前广泛应用于STORM等超分辨成像方法的荧光探针（如花菁类染料等）循环转换次数和每次转换发出的光子数有限，因而限制了成像分辨率，进而限制了超分辨成像方法的进一步发展。
发明内容
为了克服现有的应用于超分辨成像方法的荧光探针转换次数和发射光子数少的问题，本发明提供一种通过外加磁场调控荧光探针发光的，磁场调控的超分辨荧光成像方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
一种磁场调控的超分辨荧光成像方法，该方法具有如下步骤：
步骤一、用荧光探针标记待测样品，将它们铺在载玻片上，加入成像缓冲液，盖上盖玻片并封片；
步骤二、在待测样品附近施加一个外磁场，控制外磁场的大小和方向；
步骤三、对修饰了荧光探针的待测样品进行超分辨成像的数据采集；
步骤四、将采集到的数据进行分析。
在上述技术方案中，所述荧光探针为：有机小分子荧光染料或荧光蛋白。
在上述技术方案中，所述有机小分子荧光染料为：花菁类或罗丹明类或嗪类。
在上述技术方案中，所述有机小分子荧光染料为：Cy3、Cy5、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 532或ATTO 655。
在上述技术方案中，荧光蛋白为：mEOS2或GFP。
在上述技术方案中，成像缓冲液含有巯基乙醇、过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。
在上述技术方案中，待测样品为：蛋白、DNA或活细胞。
在上述技术方案中，步骤二中的外磁场由通电线圈产生，或由磁铁产生。
在上述技术方案中，所述步骤三具体包括：
利用激光***产生的激光照射荧光探针，使其由基态跃迁到激发态，发出荧光；荧光染料闪烁产生的信号由CCD采集并传送到电脑。
在上述技术方案中，所述步骤二中的外磁场为小于0.1T。
本发明的有益效果是：通过在样品周围施加外磁场，可以对染料等荧光探针的转换次数、每次转换的发射光子数等光物理性质进行调变，进而影响超分辨重构图上定位点的数目。当施加一个很小的外磁场时（磁场强度小于0.1T），超分辨重构图上定位点的数目明显增多。这能够提高超分辨成像的分辨率，使超分辨成像方法的进一步发展。
本发明的磁场调控的超分辨荧光成像方法能用于改善荧光染料/荧光蛋白标记的蛋白、DNA及活细胞等的超分辨成像分辨率。
附图说明
图1为现有技术的STORM成像原理图。
图2为本发明的磁场调控的超分辨荧光成像方法的装置示意图。
图3为Alexa Fluor 647的分子结构图。
图4为Alexa Fluor 532的分子结构图。
图5为120G(12mT)，右手定则向上的外加磁场下的STORM超分辨成像图（单分散的Alexa Fluor 647的超分辨成像重构图）。
图6为与图5对应的定位点个数分布的柱状图。
图7为与图5对应的相同条件下，没有磁场时的STORM超分辨成像图（单分散的Alexa Fluor 647的超分辨成像重构图）。
图8为与图7对应的定位点个数分布的柱状图。
图9为900G(90mT)，右手定则向上的外加磁场下的STORM超分辨成像图（单分散的Alexa Fluor 647的超分辨成像重构图）。
图10为与图9对应的定位点个数分布的柱状图。
图11为与图9对应的相同条件下，没有磁场时的STORM超分辨成像图（单分散的Alexa Fluor 647的超分辨成像重构图）。
图12为与图11对应的定位点个数分布的柱状图。
图13为100G(10mT)，右手定则向上的外加磁场下的STORM超分辨成像图（单分散的Alexa Fluor 532的超分辨成像重构图）。
图14为与图13对应的定位点个数分布的柱状图。
图15为与图13对应的相同条件下，没有磁场时的STORM超分辨成像图（单分散的Alexa Fluor 532的超分辨成像重构图）。
图16为与图15对应的定位点个数分布的柱状图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
如图2所示，磁场调控的超分辨荧光成像方法，该方法具有如下步骤：
步骤一、首先，用荧光探针（如荧光染料或荧光蛋白）标记待测样品，将它们铺在载玻片上，加入成像缓冲液，盖上盖玻片并封片；
步骤二、在待测样品附近施加一个外磁场，例如可以缠若干圈线圈，线圈两端分别连接直流电源的正极和负极，接通直流电源，这时在样品周围就存在一个外磁场。通过改变线圈的匝数或电流的大小控制外磁场的大小，通过改变线圈缠绕方式控制外磁场的方向；
步骤三、设置实验参数，对修饰了荧光探针的待测样品进行超分辨成像的数据采集；
步骤四、将采集到的数据利用相关软件进行分析。
上述的步骤一中，成像缓冲液主要含有巯基乙醇、过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，它们的作用分别是延长荧光染料处于荧光态的时间和除去体系中的氧气。
上述的步骤一中，待测物质包括蛋白、DNA或细胞等可用超分辨荧光显微镜检测的单分子，荧光探针包括可用于超分辨荧光显微镜的有机小分子染料以及荧光蛋白等，如Cy3、Cy5、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 532和GFP等。AlexaFluor 647和Alexa Fluor 532的分子结构图如图3和4所示。
上述的步骤二中，外磁场既可以由缠绕在样品附近的导电线圈产生，也可以由样品附近的永磁铁产生。
上述的步骤三中，超分辨成像***主要由激光、显微镜、CCD等组成，激光照射荧光探针，使其由基态跃迁到激发态，发出荧光。荧光染料闪烁产生的信号由CCD采集并传送到电脑。
上述的步骤四中，相关软件分析指的是利用软件分析方法获得超分辨成像重构图，比较重构图上定位点的多少，确定成像分辨率。
本发明的磁场调控的超分辨荧光成像方法对于荧光探针标记的各类单分子物质、各波长的激光均可适用。
实施例1120G(12mT)，右手定则向上的外磁场条件下单分散的AlexaFluor647在玻片上的分布情况研究。
将样片固定在载物台上，打开激光使其照射到样品上，调好焦距、曝光时间和照相张数。选定一个区域，进行图像采集。将采集到的数据利用相关软件进行分析。
如图5-8所示，实验结果表明本发明的优点是：（1）相同条件下，施加120G外磁场后，染料Alexa Fluor 647闪烁增多，从而使得到的超分辨重构图上定位点更多。（2）能够提高超分辨成像的分辨率，使超分辨成像方法进一步发展。
实施例2900G(90mT)，右手定则向上的外磁场条件下单分散的AlexaFluor 647在玻片上的分布情况研究。
将样片固定在载物台上，打开激光使其照射到样品上，调好焦距、曝光时间和照相张数。选定一个区域，进行图像采集。将采集到的数据利用相关软件进行分析。
如图9-12所示，实验结果表明本发明的优点是：（1）相同条件下，施加900G外磁场后，染料Alexa Fluor 647闪烁增多，从而使得到的超分辨重构图上定位点更多。（2）能够提高超分辨成像的分辨率，使超分辨成像方法进一步发展。
实施例3100G(10mT)，右手定则向上的外磁场条件下单分散的AlexaFluor 532在玻片上的分布情况研究。
将样片固定在载物台上，打开激光使其照射到样品上，调好焦距、曝光时间和照相张数。选定一个区域，进行图像采集。将采集到的数据利用相关软件进行分析。
如图13-16所示，实验结果表明本发明的优点是：（1）相同条件下，施加100G外磁场后，染料Alexa Fluor 532闪烁增多，从而使得到的超分辨重构图上定位点更多。（2）能够提高超分辨成像的分辨率，使超分辨成像方法进一步发展。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种磁场调控的超分辨荧光成像方法，其特征在于，该方法具有如下步骤：
步骤一、用荧光探针标记待测样品，将它们铺在载玻片上，加入成像缓冲液，盖上盖玻片并封片；
步骤二、在待测样品附近施加一个外磁场，控制外磁场的大小和方向；
步骤三、对修饰了荧光探针的待测样品进行超分辨成像的数据采集；
步骤四、将采集到的数据进行分析。
2.根据权利要求1所述的磁场调控的超分辨荧光成像方法，其特征在于，所述荧光探针为：有机小分子荧光染料或荧光蛋白。
3.根据权利要求2所述的磁场调控的超分辨荧光成像方法，其特征在于，所述有机小分子荧光染料为：花菁类或罗丹明类或嗪类。
4.根据权利要求3所述的磁场调控的超分辨荧光成像方法，其特征在于，所述有机小分子荧光染料为：Cy3、Cy5、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 532或ATTO655。
5.根据权利要求2所述的磁场调控的超分辨荧光成像方法，其特征在于，荧光蛋白为：mEOS2或GFP。
6.根据权利要求1所述的磁场调控的超分辨荧光成像方法，其特征在于，成像缓冲液含有巯基乙醇、过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。
7.根据权利要求1所述的磁场调控的超分辨荧光成像方法，其特征在于，待测样品为：蛋白、DNA或活细胞。
8.根据权利要求1至7中的任意一项所述的磁场调控的超分辨荧光成像方法，其特征在于，步骤二中的外磁场由通电线圈产生，或由磁铁产生。
9.根据权利要求1至7中的任意一项所述的磁场调控的超分辨荧光成像方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：
利用激光***产生的激光照射荧光探针，使其由基态跃迁到激发态，发出荧光；荧光染料闪烁产生的信号由CCD采集并传送到电脑。
10.根据权利要求1至7中的任意一项所述的磁场调控的超分辨荧光成像方法，其特征在于，所述步骤二中的外磁场为小于0.1T。
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