CN103558328A

CN103558328A - 液相色谱串联质谱法测定香精香料中芝麻酚的方法

Info

Publication number: CN103558328A
Application number: CN201310601418.3A
Authority: CN
Inventors: 邓其馨; 黄朝章; 苏明亮; 刘江生; 刘秀彩; 黄惠贞; 蔡国华; 林艳; 梁晖; 谢卫; 刘泽春
Original assignee: China Tobacco Fujian Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Fujian Industrial Co Ltd
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2013-11-22
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-11-22
Also published as: CN103558328B

Abstract

本发明涉及一种香精香料中芝麻酚的检测方法，该方法采用液相色谱串联质谱法测定，采用外标法定量。该检测方法具有检测时间短、操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好等优点，该方法色谱条件使得芝麻酚的色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的线性范围，检测限为0.002μg/mL，回收率在90.8%～102.5%之间，相对标准偏差RSD<5%(n=6)。

Description

液相色谱串联质谱法测定香精香料中芝麻酚的方法

技术领域

本发明属于化学检测技术领域，涉及芝麻酚的测定方法，具体地说是一种通过液相色谱-串联质谱法快速测定香精香料中芝麻酚的方法。

背景技术

当今食品安全问题日益受到社会关注。烟用添加剂，尤其是香精香料的添加剂安全性问题也越来越受到关注。

芝麻酚，又名3,4-亚甲二氧基苯酚，具有非常强的抗氧化能力，是常用于食品、医药和香精香料领域的抗氧化剂。然而随着科技的进步，芝麻酚的致癌活性逐步被认知，毒理学试验发现，芝麻酚对动物腺胃有毒性，会引起腺胃刺瘤或癌变。2006年日本已将芝麻酚列为食品禁用添加剂。

目前，对芝麻酚的检测方法主要有显色法、紫外分光光度法、薄层色谱法(TLC)、气质联用法(GC-MS)及高效液相色谱法(HPLC)等。但这些方法均存在前处理步骤繁琐，检测时间较长等问题。例如，用气质联用法(GC-MS)存在检测时间较长的问题，检测一个样品的时间要40分钟以上，用高效液相色谱法(HPLC)灵敏度较差，检出限（LOD）≥80ng/mL，且需要的样品量较大（≥1g）。

近年来，随着液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）技术的发展，LC-MS/MS技术在化合物分析中得到广泛的应用。液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）分析技术无论在灵敏度上还是选择性上都具有明显的优势，且分析时间较短。为了在工业生产中，对大量香精香料样品的安全性指标进行有效的监控，急需一种能够快速、简单、灵敏、高效的液相色谱质谱方法检测香精香料中的芝麻酚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟用香精香料中芝麻酚含量的测定方法，以实现对烟用香精香料中芝麻酚含量的快速、准确测定。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种香精香料中芝麻酚的检测方法，该方法采用液相色谱串联质谱法测定，采用外标法定量。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法包括以下步骤：

（1）标准溶液的配制；称取芝麻酚标准品，用甲醇配制成具有浓度梯度的芝麻酚标准工作溶液；

（2）样品溶液的制备：使用甲醇萃取样品，然后过滤后制备样品溶液；

（3）液相色谱-串联质谱分析：利用液相色谱-串联质谱仪分别对标准溶液和样品溶液进行检测分析；

（4）烟用香精香料中芝麻酚含量的计算。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法，其中所述的香精香料为烟用香精香料，优选地，所述的香精香料样品使用甲醇萃取样品中的芝麻酚；优选地，萃取用的甲醇为浓度为8～12％（v/v）甲醇水溶液，更优选地，萃取用的甲醇为浓度为10％（v/v）甲醇水溶液。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法，其中萃取的方式为超声萃取。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法，其中所述的香精香料样品的制备过程如下：称取适量待测香精香料样品，加入适量甲醇水溶液,室温下超声萃取,过滤后，得到样品溶液。优选的过滤方式采用微孔滤膜过滤，例如0.22μm有机滤膜或0.45μm有机滤膜。

在一个具体的实施方案中，所述香精香料样品的制备方法具体为：称取0.1g左右试样,置于25mL锥形瓶中;加入10%甲醇水溶液10mL,室温下超声30min,用0.22μm有机滤膜过滤后直接进样。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法，其中色谱分析条件为以下（i）至（v）中的一项或多项：

（i）采用C18色谱柱，

优选地，所述的色谱柱的规格为50mm×2.1mm i.d.,2.6μm粒径。

（ii）色谱柱温度为28～32℃，优选为30℃，

（iii）进样量为8～12μL，优选为10μL，

（iv）流动相：乙腈-乙酸铵-乙酸-水溶液，

优选的流动相：A为乙腈，B为5mmoL/L乙酸铵溶液(含0.1%乙酸)，采用等度洗脱程序，体积比50：50，

（v）流速为0.1～0.3ml/min，优选为0.2ml/min，

（vi）洗脱时间约6min。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法，其中质谱分析条件为以下（i）至（iii）中的一项或多项：

（i）用电喷雾离子阱串联质谱测定芝麻酚，

（ii）离子源：电喷雾电离源（ESI）；

（iii）以选择离子对定性，优选的离子对为：子离子109.0(m/z)，母离子139.1(m/z)。

在一个具体的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法，其中色谱分析条件为：色谱柱采用菲罗门C₁₈液相色谱柱，色谱柱温度为30℃，进样量为10μL，流速为0.2ml/min；流动相：A为乙腈，B为5mmoL/L乙酸铵溶液(含0.1%乙酸)，采用等度洗脱程序，体积比50：50，洗脱时间总共约6min。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法，其中质谱分析条件为：扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5000V；离子源温度：350℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；去簇电压(DP)：40V；碰撞能(CE):20V。

在一个具体的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法，其中所述的质谱分析条件为离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5000V；离子源温度：350℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；去簇电压(DP)：40V；碰撞能(CE):20V；离子对选择为：定性离子对m/z139.1>109.0，139.1>81.1，定量离子对m/z139.1>109.0。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法，其中外标法所用的标准溶液的配制步骤如下：称取0.1g芝麻酚，精确至0.0001g，用甲醇溶解后转移至1000mL容量瓶中，并定容，定为标准储备液；分别移取0.01mL，0.05mL，0.1mL，0.5mL，1.0mL的标准储备液到100mL容量瓶中，用萃取剂定容，则芝麻酚的浓度为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL。

在一个优选的实施方案中，发明所述的香精香料中芝麻酚的检测方法，其中芝麻酚含量的计算方法为：首先以标准溶液所检测出的目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；然后将样品溶液检出的目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，即得到样品中的芝麻酚浓度，由此即可计算出烟用香精香料中芝麻酚的含量。

本发明的检测方法对样品的处理方法和色谱条件进行了优化，达到了以下效果：

（1）检测时间短：采用本发明测定烟用香精香料中芝麻酚含量周期仅需要6分钟左右；每天可以检测220多个样品。

（2）本发明具有操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好的优点：本发明方法的色谱条件使芝麻酚的色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的线性相关性，检测限为0.002μg/mL，平均回收率为90.8%～102.5%，平均相对标准偏差RSD<5%(n=6)。

附图说明

图1为本发明的检测方法的流程图；

图2为实施例1中浓度为0.5μg/mL的标准溶液中芝麻酚的色谱图；

图3为实施例1中样品溶液的色谱图；

图4为芝麻酚的质谱图；

图5为实施例1获得的标准曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例对烟用香精香料中芝麻酚含量进行检测，检测方法如下所述，所述检测方法的流程图如图1所示。

（1）称取0.1g芝麻酚(分析纯)，精确至0.0001g，用甲醇溶解后转移至1000mL容量瓶中，并定容，定为标准储备液；分别移取0.01mL，0.05mL，0.1mL，0.5mL，1.0mL的标准储备液到100mL容量瓶中，用10%（v/v）甲醇水溶液定容，则芝麻酚的浓度为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL。标液避光4℃保存，取用时放置于常温下，达到常温后方可使用。每周做一次标线；

（2）样品溶液的制备：称取0.1g左右的待测烟用香精香料样品,置于25mL锥形瓶中;准确加入10%甲醇水溶液10mL,室温下超声30min,用0.22μm有机滤膜过滤后，得到样品溶液，于4℃保存待分析；

（3）色谱分析条件为采用菲罗门C₁₈液相色谱柱，色谱柱温度为30℃，进样量为10μL，流速为0.2ml/min；流动相：A为乙腈，B为5mmoL/L乙酸铵溶液(含0.1%(v/v)乙酸)，采用等度洗脱程序，体积比50：50。洗脱时间总共6min。浓度为0.5μg/mL的标准溶液的色谱分析结果见图2；样品溶液的色谱分析结果见图3；

（4）质谱分析条件为离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5000V；离子源温度：350℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；去簇电压(DP)：40V；碰撞能(CE):20V。芝麻酚的质谱图见图4。依据碎片丰度高、选择性高的原则顺序，确定离子对选择为：定性离子对m/z139.1>109.0，139.1>81.1，定量离子对m/z139.1>109.0。

（4）烟用香精香料中芝麻酚含量的计算：首先以标准溶液所检测出的目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线（见图5）；与标准曲线相对应的回归方程、相关系数等数据如表1所示。

表1芝麻酚的标准曲线和检测限

然后将样品测得的检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，即得到样品中的芝麻酚浓度，由此计算烟用香精香料中芝麻酚的含量，计算公式如下

m=（A×S）/n

式中：

m—每克烟用香精香料中芝麻酚的含量，单位为微克每克（μg/g）；

A—样品中芝麻酚的浓度（μg/mL）；

S—溶液体积（mL）；

n—称取样品的质量（g）。

由表1和图4可知，所采用的色谱条件使芝麻酚的色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的相关性，检测限在0.002μg/mL。本实施例样品的芝麻酚的含量为5.1μg/g。

实施例2

本实施例对本发明方法的重复性和加标回收率进行检测，检测方法如下所述。

采用标准加入法测定本发明的方法的回收率。称取待测烟用香精香料样品（该样品与实施例1步骤（2）中所用的香精香料样品相同）0.1g，各三份，向其中分别加入0.001mL、0.005mL、0.01mL实施例1步骤（1）中配制的芝麻酚标准储备液，然后按照实施例1步骤（2）“样品溶液的制备”中的配制方法制备加标样品溶液，每个样品分别测定6次，色谱和质谱分析的条件同实施例1，根据分析结果计算本方法烟用香精香料中芝麻酚的加标回收率，结果如表2所示；

表2烟用香精香料中芝麻酚的回收率和重复性（n=6）

由表2可以看出，在3个加标水平上，利用此方法检测烟用香精香料中芝麻酚的回收率在90.8%～102.5%之间，样品测试结果的相对标准偏差小于5%，说明本法的回收率较高，重复性较好。

Claims

1.一种香精香料中芝麻酚的检测方法，该方法采用液相色谱串联质谱法测定，采用外标法定量。

2.权利要求1的检测方法，其中所述的香精香料为烟用香精香料，

优选地，所述的香精香料样品使用甲醇萃取样品中的芝麻酚；

优选地，萃取用的甲醇为浓度为8～12％（v/v）甲醇水溶液，更优选地，萃取用的甲醇为浓度为10％（v/v）甲醇水溶液。

3.权利要求2的检测方法，其中萃取的方式为超声萃取。

4.权利要求1的检测方法，其中所述的香精香料样品的制备过程如下：称取适量待测香精香料样品，加入适量甲醇水溶液,室温下超声萃取,过滤后，得到样品溶液。

5.权利要求1的检测方法，其中色谱分析条件为以下（i）至（v）中的一项或多项：

（i）采用C18色谱柱，

优选地，所述的色谱柱的规格为50mm×2.1mm i.d.,2.6μm粒径。

（ii）色谱柱温度为28～32℃，优选为30℃，

（iii）进样量为8～12μL，优选为10μL，

（iv）流动相：乙腈-乙酸铵-乙酸-水溶液，

（v）流速为0.1～0.3ml/min，优选为0.2ml/min，

（vi）洗脱时间约6min。

6.权利要求1的检测方法，其中质谱分析条件为以下（i）至（iii）中的一项或多项：

（i）用电喷雾离子阱串联质谱测定芝麻酚，

（ii）离子源：电喷雾电离源（ESI）；

（iii）以选择离子对定性，优选的离子对为：定性离子对m/z139.1>109.0，139.1>81.1，定量离子对m/z139.1>109.0。

7.权利要求6的检测方法，其中质谱分析条件为：扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5000V；离子源温度：350℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；去簇电压(DP)：40V；碰撞能(CE):20V。

8.权利要求1的检测方法，其中色谱分析条件为：色谱柱采用菲罗门C₁₈液相色谱柱，色谱柱温度为30℃，进样量为10μL，流速为0.2ml/min；流动相：A为乙腈，B为5mmoL/L乙酸铵溶液(含0.1%乙酸)，采用等度洗脱程序，体积比50：50，洗脱时间总共约6min。

9.权利要求1的检测方法，其中外标法所用的标准溶液的配制步骤如下：称取0.1g芝麻酚，精确至0.0001g，用甲醇溶解后转移至1000mL容量瓶中，并定容，定为标准储备液；分别移取0.01mL，0.05mL，0.1mL，0.5mL，1.0mL的标准储备液到100mL容量瓶中，用萃取剂定容，则芝麻酚的浓度为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL。