CN103554285A - 一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法,该方法包括以下步骤:⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基;⑵制备种子培养基;⑶制备发酵培养基;⑷鸡油菌菌丝接种至马铃薯葡萄糖斜面培养基,经恒温培养得斜面菌种;⑸1cm2斜面菌种接种至种子培养基,经振荡培养得菌种种子液;⑹菌种种子液接种至发酵培养基,经振荡培养得发酵液;发酵液离心、洗涤、烘干、磨粉后,得到菌丝体干粉末;⑺菌丝体干粉末先超声提取再浸提得到多糖浸提液;⑻多糖浸提液离心、过滤、浓缩后得到多糖浓缩液;⑼多糖浓缩液中加Sevag试剂,离心后得多糖提取液;⑽多糖提取液加乙醇静置,得到沉淀物;⑾沉淀物离心、洗涤、干燥,即得多糖干品。本发明操作简单,成本低,多糖得率高。
Description
技术领域
本发明涉及真菌多糖技术领域,尤其涉及一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法。
背景技术
真菌多糖是一类具有广泛的药理活性和保健作用的高分子聚合物,具有抗肿瘤、抗感染、抗凝血、抗病毒、降血糖、降血脂、修复损伤组织细胞等多种生理功能。常见的真菌多糖有香菇多糖、黑木耳多糖、猴头菌多糖、银耳多糖、灵芝多糖、冬虫夏草多糖、云芝多糖、茯苓多糖、灰树花多糖等。目前,已有多种真菌多糖应用于临床,使得多糖生物资源的研究和开发日益活跃,成为生物学、医学、药物学、食品科学等领域的研究热点。
陇南康县位于甘肃省东南部,陕、甘、川三省交界地带,是珍贵的天然植物宝库。境内气候属典型亚热带向暖温带过渡气候,温和湿润,雨量充沛,自然资源十分丰富。鸡油菌是陇南康县地区生长的一种具有生理活性的野生食用菌,别名黄丝菌、杏菌,属真菌界、担子菌门、同担子菌纲、鸡油菌目、鸡油菌科和鸡油菌属。在我国主要分布于云南、贵州、四川、湖南、甘肃、安徽、陕西、江苏等省。研究表明,鸡油菌富含胡萝卜素、VA、VC、多糖物质、钙、铁、磷等矿质元素和人体必需的8种氨基酸,其性平、味甘具有清肝、明目、利肺、减肥和抗衰老等多种功效。鸡油菌多糖具有多种生理活性,能够促进人体免疫功能,具有抗肿瘤、抗病毒、抗突变、抗辐射、降血压等功能。目前,鸡油菌的开发基本依靠野生资源,存在菌种污染率高、生长周期长、工艺复杂等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、成本低、多糖得率高的鸡油菌菌丝多糖的提取方法。
为解决上述问题,本发明所述的一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法,包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液A,该滤液A补足至1.0L依次加入5~10g葡萄糖和5~10g琼脂,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液B,该滤液B补足至1.0L加入5~10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液C,该滤液C补足至1.0L加入5~10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑷真菌的发酵培养:接一环鸡油菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上,于28℃恒温培养4~10天后,置于4℃冰箱中,得到斜面菌种;
⑸将1cm2所述斜面菌种接种至装有10mL所述种子培养基的试管中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100~200 r/min的速率进行振荡培养4~10天,制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液;
⑹将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100~200 r/min的速率进行振荡培养4~10天,即得发酵液;所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心10~30min,得到菌丝体;所述菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于50~80℃下烘干至恒重后磨成粉,得到菌丝体干粉末;所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10~30%;
⑺在所述菌丝体干粉末中按1 g:10 mL ~30mL的料液比加入去离子水,在功率为100~300W的条件下超声提取20~40 min后,在温度为70~90℃的条件下浸提次数2~4次,每次0.5~2h,合并提取液,得到多糖浸提液;
⑻将所述多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心10~20min过滤后,得到上清液A,该上清液A在温度为50℃、真空度为0.06~0.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5~1/3,得到多糖浓缩液;
⑼在所述多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂,充分混合搅拌10~30min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层,收集上清液B,反复多次直到所述上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止,视为蛋白质除尽,即得多糖提取液;
⑽所述多糖提取液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的乙醇,在4℃下静置24h,得到沉淀物A;
⑾将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r/min离心20 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内,经50℃真空干燥至恒重,即得多糖干品。
所述步骤⑷中鸡油菌菌丝是指采集于陇南康县的鸡油菌Cantharellus sp. KX560JY按常规方法经组织分离获得的鸡油菌菌丝;所述鸡油菌Cantharellus sp. KX560JY在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2012114(保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学;保藏日期:2012年4月13日),其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086387。
所述步骤⑼中Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL:1mL混合而成的混合液。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用超声波辅助热水浸提法取代以往的单独水提,利用其独特的热作用、机械作用及空化等物理化学效应,可以有效缩短提取时间,显著提高多糖得率,具有提取效率高、时间短、温度低、不易破坏多糖的立体结构等优点。
2、本发明整个过程中无需试剂和化学反应,不但设备简单,可操作性强,而且成本低。
3、本发明发酵菌丝体培养周期短、菌种纯、工艺简单,利于实现规模化、产业化生产,从其发酵液或固体培养物中得到菌丝体提取多糖,为鸡油菌资源的合理开发利用提供参考。
具体实施方式
实施例1 一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法,包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤,得到滤液A,该滤液A补足至1.0L依次加入5g葡萄糖和5g琼脂,使其pH值为6.0~8.0,在90℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤,得到滤液B,该滤液B补足至1.0L加入5g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤,得到滤液C,该滤液C补足至1.0L加入5g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养:接一环鸡油菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上,于28℃恒温培养4天后,置于4℃冰箱中,得到斜面菌种。
其中:鸡油菌菌丝是指采集于陇南康县的鸡油菌Cantharellus sp. KX560JY按常规方法经组织分离获得的鸡油菌菌丝;鸡油菌Cantharellus sp. KX560JY在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2012114(保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学;保藏日期:2012年4月13日),其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086387。
⑸将1cm2斜面菌种接种至装有10mL种子培养基的试管中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100 r/min的速率进行振荡培养4天,制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按5%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100 r/min的速率进行振荡培养4天,即得发酵液;发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心10min,得到菌丝体;菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于50℃下烘干至恒重后磨成粉,得到菌丝体干粉末。
其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为10%。
⑺在菌丝体干粉末中按1 g:10 mL的料液比加入去离子水,在功率为100W的条件下超声提取40 min后,在温度为70℃的条件下浸提次数2次,每次0.5h,合并提取液,得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心10min过滤后,得到上清液A,该上清液A在温度为50℃、真空度为0.06MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5,得到多糖浓缩液。
⑼在多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂,充分混合搅拌10min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层,收集上清液B,反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止,视为蛋白质除尽,即得多糖提取液。
其中:Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL:1mL混合而成的混合液。
⑽多糖提取液中按其体积的2倍加入质量浓度为95%的乙醇,在4℃下静置24h,得到沉淀物A。
⑾将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r/min离心20 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内,经50℃真空干燥至恒重,即得多糖干品。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量,并按下式计算:
粗多糖含量(mg/g菌丝干重)=粗多糖总质量(mg)/ 菌丝体干粉末质量(g) 。
实施例2 一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法,包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤,得到滤液A,该滤液A补足至1.0L依次加入10g葡萄糖和10g琼脂,使其pH值为6.0~8.0,在100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤,得到滤液B,该滤液B补足至1.0L加入10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤,得到滤液C,该滤液C补足至1.0L加入10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养:接一环鸡油菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上,于28℃恒温培养10天后,置于4℃冰箱中,得到斜面菌种。
其中:鸡油菌菌丝同实施例1。
⑸将1cm2斜面菌种接种至装有10mL种子培养基的试管中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以200 r/min的速率进行振荡培养10天,制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按20%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以200 r/min的速率进行振荡培养10天,即得发酵液;发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心30min,得到菌丝体;菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于80℃下烘干至恒重后磨成粉,得到菌丝体干粉末。
其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为30%。
⑺在菌丝体干粉末中按1 g:30mL的料液比加入去离子水,在功率为300W的条件下超声提取20 min后,在温度为90℃的条件下浸提次数4次,每次2h,合并提取液,得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心20min过滤后,得到上清液A,该上清液A在温度为50℃、真空度为0.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/3,得到多糖浓缩液。
⑼在多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂,充分混合搅拌30min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层,收集上清液B,反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止,视为蛋白质除尽,即得多糖提取液。
其中:Sevag试剂同实施例1。
⑽多糖提取液中按其体积的4倍加入质量浓度为95%的乙醇,在4℃下静置24h,得到沉淀物A。
⑾将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r/min离心20 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内,经50℃真空干燥至恒重,即得多糖干品。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量,并按实施例1中的公式计算 。
实施例3 一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法,包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤,得到滤液A,该滤液A补足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g琼脂,使其pH值为6.0~8.0,在95℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤,得到滤液B,该滤液B补足至1.0L加入8g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在95℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤,得到滤液C,该滤液C补足至1.0L加入8g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在95℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养:接一环鸡油菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上,于28℃恒温培养7天后,置于4℃冰箱中,得到斜面菌种。
其中:鸡油菌菌丝同实施例1。
⑸将1cm2斜面菌种接种至装有10mL种子培养基的试管中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以150 r/min的速率进行振荡培养7天,制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按12%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以150 r/min的速率进行振荡培养7天,即得发酵液;发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体;菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于65℃下烘干至恒重后磨成粉,得到菌丝体干粉末。
其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为20%。
⑺在菌丝体干粉末中按1 g:20mL的料液比加入去离子水,在功率为200W的条件下超声提取30 min后,在温度为80℃的条件下浸提次数3次,每次1h,合并提取液,得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心15min过滤后,得到上清液A,该上清液A在温度为50℃、真空度为0.07MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/4,得到多糖浓缩液。
⑼在多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂,充分混合搅拌20min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层,收集上清液B,反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止,视为蛋白质除尽,即得多糖提取液。
其中:Sevag试剂同实施例1。
⑽多糖提取液中按其体积的3倍加入质量浓度为95%的乙醇,在4℃下静置24h,得到沉淀物A。
⑾将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r/min离心20 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内,经50℃真空干燥至恒重,即得多糖干品。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量,并按实施例1中的公式计算。
Claims (3)
1.一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法,包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液A,该滤液A补足至1.0L依次加入5~10g葡萄糖和5~10g琼脂,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液B,该滤液B补足至1.0L加入5~10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液C,该滤液C补足至1.0L加入5~10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑷真菌的发酵培养:接一环鸡油菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上,于28℃恒温培养4~10天后,置于4℃冰箱中,得到斜面菌种;
⑸将1cm2所述斜面菌种接种至装有10mL所述种子培养基的试管中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100~200 r/min的速率进行振荡培养4~10天,制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液;
⑹将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100~200 r/min的速率进行振荡培养4~10天,即得发酵液;所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心10~30min,得到菌丝体;所述菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于50~80℃下烘干至恒重后磨成粉,得到菌丝体干粉末;所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10~30%;
⑺在所述菌丝体干粉末中按1 g:10 mL ~30mL的料液比加入去离子水,在功率为100~300W的条件下超声提取20~40 min后,在温度为70~90℃的条件下浸提次数2~4次,每次0.5~2h,合并提取液,得到多糖浸提液;
⑻将所述多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心10~20min过滤后,得到上清液A,该上清液A在温度为50℃、真空度为0.06~0.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5~1/3,得到多糖浓缩液;
⑼在所述多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂,充分混合搅拌10~30min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层,收集上清液B,反复多次直到所述上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止,视为蛋白质除尽,即得多糖提取液;
⑽所述多糖提取液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的乙醇,在4℃下静置24h,得到沉淀物A;
⑾将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r/min离心20 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内,经50℃真空干燥至恒重,即得多糖干品。
2.如权利要求1所述的一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法,其特征在于:所述步骤⑷中鸡油菌菌丝是指采集于陇南康县的鸡油菌 Cantharellus sp. KX560JY按常规方法经组织分离获得的鸡油菌菌丝;所述鸡油菌Cantharellus sp. KX560JY在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2012114,其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086387。
3.如权利要求1所述的一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法,其特征在于:所述步骤⑼中Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL:1mL混合而成的混合液。
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