CN103547653A

CN103547653A - 基于生物质的油田化学品

Info

Publication number: CN103547653A
Application number: CN201280021912.6A
Authority: CN
Inventors: W·莱基特斯基; S·索萨; A·G·戴
Original assignee: Solazyme Inc
Current assignee: TerraVia Holdings Inc
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2014-01-29
Also published as: WO2012135756A2; EA201391445A1; AU2012236141B2; ZA201307260B; EP2694615A2; WO2012135756A3; US20120247763A1; CA2831939A1; AU2012236141A1; MX2013011324A; EP2694615A4; BR112013025200A2

Abstract

本发明涉及得自产油微生物的微生物生物质，所述微生物生物质提供用于井相关流体的具有成本效益的生物降解性添加剂。所述生物质可用作降滤失剂、粘度调节剂、乳化剂、润滑剂或密度调节剂。

Description

基于生物质的油田化学品

相关申请案

本申请要求2011年4月1日提交的美国临时申请号61／471,013和2012年3月9日提交的美国临时申请号61／609,214的权益，这些临时申请据此整体以引用方式并入本文。

背景技术

技术领域

本发明为降滤失剂、桥堵材料、粘度调节剂提供基于微生物生物质的成分，以及可用于钻井液、维修流体、完井液、固井液、储层流体和其他用于钻井应用的流体的其他用途。可用作降滤失剂、桥堵材料、粘度调节剂的基于微生物质的材料涉及石油和天然气勘探、地热井、水井和向地下钻孔的其他应用领域。

发明背景

钻井液(有时在本领域称为“钻井泥浆”)是结合钻孔而使用的流体。虽然通常用于钻取石油和天然气井，但是钻井液也用于其他应用，包括钻水井和地热井。钻井液的三大类别是水基泥浆(其可以是分散的和非分散的)、非水性泥浆(有时称为“油基泥浆”)和气态钻井流体。在钻井时，几个问题需要应付，包括：保持钻头冷却和干净，地层流体(即，诸如存在于所钻地层中的油的流体)进入井筒，以及悬浮和除去钻屑。由于这些问题，钻井液需要具有正确的粘度和流动性的组合。钻井液需要足够粘稠，以防止地层流体进入井筒以及以悬浮钻屑。某些钻井液也带出或除去悬浮的钻屑。

当钻取油井时，可迫使来自钻井液的滤液进入邻近的地下地层(“侵入”)。这会损坏地层；例如，一些地带含有粘土，这些粘土被钻井液水化时往往会阻挡油和气进入钻孔。为防止或减少这种损坏，降滤失剂用来控制水性钻井液的渗滤速率并通形成滤饼起到密封地层中的孔的作用。用于密封滤饼(或“壁饼”)孔的材料包括了诸如淀粉、改性淀粉、纤维素、改性纤维素、合成聚合物(诸如聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺)和褐煤的材料(参见以引用方式并入本文的美国专利号5,789,349)。

侵入由通常比地层压力大的静液柱的压差引起，特别是在低压力或枯竭的地带。侵入也因岩石中的开口和流体穿过岩石的能力、地带的孔隙率和渗透性所致。更近的技术利用通过向水或盐水中加入专门的聚合物而产生的低剪切速率粘度(LSRV)流体，以形成钻井液。这些聚合物在非常低的剪切速率下产生极高的粘度。LSRV通过产生进入地层开口的高阻力而有助于控制钻井液的侵入和渗滤。由于流体以非常慢的速率运动，因此粘度变得很高，并且钻井液以轻微的渗透包含在钻孔内。参见″Drill-In Fluids Improve High Angle Well Production″，Supplement to the Petroleum Engineer International，March，1995。

然而，循环液漏失仍然是一个问题。当静水柱的差压远大于地层压力时，就会发生循环液漏失。岩石的开口接纳并储存钻井液，使得较少回到表面发生再循环。流体在井下流失，并会导致孔洞不稳定、卡住钻杆和井控丧失。除了流体体积流失外，还需要昂贵的循环液漏失材料(LCM或“降滤失剂”)。这些材料通常为诸如甘蔗纤维、木纤维、棉籽壳、坚果壳、云母、玻璃纸和其他材料的纤维、颗粒状或薄片材料。将这些LCM材料加到流体体系中，使得它们可被带入漏失区并嵌入以形成架桥，其他材料则可以在架桥上开始聚集和密封(参见以引用方式并入本文的美国专利号6,770,601)。

除了用于钻井的流体外，各种流体也用于从井中采出诸如石油和天然气的自然资源。这些流体可起到抑制腐蚀、从水中分离烃、阻止形成抑制性固体(诸如石蜡、垢和金属氧化物)以及提高井产量的作用。流体还可以用于固井、水力压裂和酸化。

发明概要

本发明在某些实施方案中提供用于形成或维护钻孔或井或者从钻孔或井进行生产的流体，其中该流体包含来自产油微生物的生物质。在特定实施方案中，生物质起到桥堵剂、降滤失剂、粘度调节剂、乳化剂、润滑剂和／或密度调节剂的作用。在一些实施方案中，流体包含水性或非水性溶剂并任选地包含一种或多种另外的组分，使得流体可作为钻井液、钻开液、修井液、解卡液(spotting fluid)、固井液、储层流体、采出液、水力压裂流体或完井液。流体中的生物质可以来自产油微生物，诸如微藻、酵母、真菌或细菌。微生物生物质可以包括例如完整细胞、裂解细胞、完整细胞与裂解细胞的组合、从中去除了油的细胞和／或来自产油微生物的多糖。在某些实施方案中，微生物生物质经化学修饰。示例性化学修饰包括疏水、亲水、阴离子和阳离子部分的共价连接。在特定实施方案中，微生物生物质通过选自以下的一种或多种化学反应而化学修饰：酯交换、皂化、交联、阴离子化(例如羧甲基化)、乙酰化和水解。微生物生物质在某些实施方案中可占流体的约0.1重量％至约20重量％。

在多个实施方案中，流体包含一种或多种选自以下的另外添加剂：膨润土、黄原胶、瓜尔胶、淀粉、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚阴离子纤维素、杀生物剂、pH调节剂、除氧剂、起泡剂、破乳剂、腐蚀抑制剂、粘土控制剂、分散剂、絮凝剂、减摩剂、桥堵剂、润滑剂、增粘剂、盐、表面活性剂、酸、降滤失添加剂、气体、乳化剂、密度调节剂、柴油燃料和微泡沫(aphron)。例如，流体可包含浓度为流体约0.001质量％至5质量％的平均直径为5至50微米的微泡沫。

在特定实施方案中，生物质通过产油微生物的干燥、压榨和溶剂提取油的一者或多者而产生。生物质在某些实施方案中可由产油微生物的异养生长产生，包括例如专性异养生物诸如桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)的异养生长。

在某些实施方案中，与不含产油微生物生物质的流体相比，包含上述产油微生物生物质的流体具有降低的API滤失试验值。示例性的流体根据持续7.5或30分钟的API滤失试验相对于不含产油微生物生物质的对照流体而言可具有大于2、5或10倍的流体滤失降低。在特定实施方案中，包含产油微生物生物质的流体如使用Couette型粘度计测量相对于不含产油微生物生物质的对照流体而言可具有2倍、5倍、10倍或更大的屈服点增加。在一些实施方案中，包含产油微生物生物质的流体如根据通过陶瓷盘过滤器进行的静态滤失试验进行测量相对于不含产油微生物生物质的对照流体而言可具有至少2倍的初滤失量(spurt loss volume)降低。在特定实施方案中，包含产油微生物生物质的流体如根据通过陶瓷盘进行的静态滤失试验进行测量相对于不含产油微生物生物质的对照流体而言可具有至少2倍的总滤失量降低。在任一种情况下，示例性陶瓷盘可具有5微米、10微米或20微米的孔径。在某些实施方案中，在持续30分钟或60分钟后在静态滤失试验中测量到了初滤失量或总滤失量的降低。在某些实施方案中，包含产油微生物生物质的流体根据通过Couette型粘度计进行的凝胶强度试验相对于不含该生物质的对照流体而言可具有至少2倍的凝胶强度增加。在特定实施方案中，凝胶强度试验进行7.5分钟或30分钟的持续时间。在一些实施方案中，在0.01／秒与1000／秒之间的剪切速率下测量时，包含产油微生物生物质的流体在18℃与200℃之间的温度下老化至少16小时后可比老化前具有更高的粘度计算值。

本发明在某些实施方案中还提供形成井筒、或维护、或从井中产生采出液的方法，其中该方法需要引入任何上述流体。在特定实施方案中，该方法需要使用流体进行选自以下的井维修作业：完井作业、防砂作业、修井作业和水力压裂作业。有一些实施方案中，该方法需要通过操作钻具组合钻出井筒同时穿过井筒循环钻井液而穿过地层钻出井筒。在这些实施方案的变型形式中，生物质实现以下效果中的一种或多种：堵塞井筒或井中的孔、向钻具组合的钻头提供润滑和／或增加流体的粘度。

在某些实施方案中，本发明还提供促进井中的产甲烷微生物产生甲烷的方法。该方法需要向井中引入生物质，其中通过培养产油微生物而产生生物质。

在另外的方面，本发明提供基于微生物生物质的降滤失剂、桥堵材料和粘度调节剂。微生物生物质来自于已在导致高油含量的条件(诸如异养条件)下培养的产油微生物。在一些实施方案中，微生物生物质保持大量的油，或微生物生物质在除油之前使用(未提取的微生物生物质)。在一些实施方案中，微生物生物质是在除去一大部分油的加工后剩余的“废生物质”。在另外的实施方案中，微生物生物质是产油微生物产生的油或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，生物质是经过化学修饰的生物质，例如通过包括干燥、加热、制薄片、碾磨、乙酰化、阴离子化、交联或碳化的一种或多种工艺加工的生物质，以提供本发明的基于微生物生物质的降滤失剂。在多个实施方案中，产油微生物是产油细菌、微藻、酵母或者非酵母真菌。

在另外的方面，本发明提供包含本发明的降滤失剂的钻井液。在多个实施方案中，钻井液包含约0.1％至约20％(w／w或v／v)的所述降滤失剂。在一个实施方案中，钻井液是包含增粘剂的水性钻井液。在另一个实施方案中，钻井液是包含增粘剂的非水性钻井液。在多个实施方案中，增粘剂选自海藻酸盐聚合物、黄原胶、纤维素或纤维素衍生物、生物聚合物、膨润土。在一个实施方案中，钻井液是包含润滑剂的水性钻井液。在另一个实施方案中，钻井液是包含润滑剂的非水性钻井液。在多个实施方案中，在0.5rpm下通过布氏粘度计测量时，钻井液具有至少20,000厘泊的低剪切速率粘度。

在又一个方面，本发明提供制备本发明的降滤失剂和钻井液的方法，所述方法包括在导致蓄积至少10％(w／w)的油的条件下培养产油微生物。在一个实施方案中，通过向钻井液中加入基于微生物生物质的降滤失剂而制备本发明的钻井液。在多个实施方案中，钻井液是常规的钻井液，其中一种或多种降滤失剂部分地或全部地被本发明的基于微生物生物质的降滤失剂替代。

在再一方面，本发明提供钻井筒的方法，所述方法包括使用本发明的降滤失剂或钻井液的步骤。

具体实施方式

本发明提供降滤失剂和钻井液。为了帮助理解本发明以及本发明的制备和实践方式及其优点，将该“具体实施方式”分成多个章节。第I节提供有帮助的定义。第II节提供可用于本发明方法的产油微生物以及将它们在异养条件下培养的方法。第III节提供用作本发明的降滤失剂的废生物质的制备方法。第IV节提供本发明的钻井液以及在钻井中使用它们的方法的说明。在第IV节后，提供制备和使用本发明的多个方面和实施方案的示例性实施例。

I.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。以下参考文献为技术人员提供本发明中所用的许多术语的一般定义：Singleton et al.，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The CambridgeDictionary of Science and Technology(Walker ed.，1988)；The Glossaryof Genetics，5th Ed.，R.Rieger etal.(eds.)，Springer Verlag(1991)；和Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary ofBiology(1991)。如本文所用，以下术语具有归属于它们的含义，除非另外指明。

“微泡沫”是包含围绕气体或液体核心的一个或多个表面活性剂层的微泡。

“无异种生物混杂”是没有其他活生物体污染的生物体培养。

“生物柴油”是适于用作柴油机燃料的生物产生的脂肪酸烷基酯。

“生物质”是由细胞生长和／或繁殖产生的材料。生物质可以包含细胞和／或细胞内内容物及细胞外材料，包括但不限于细胞分泌的化合物。

“桥堵材料”是加到流体中防止或减少流体通过孔径大于1毫达西的地质地层漏失的材料。

“生物反应器”或“发酵罐”意指封装件或部分封装件，诸如发酵槽或容器，在其中通常悬浮培养细胞。

“纤维素材料”包括纤维素消化产物(包括葡萄糖和木糖)和任选另外的化合物，诸如二糖、寡糖、木质素、糠醛和其他化合物。纤维素材料来源的非限制性实例包括蔗渣、甜菜粕、玉米秸秆、木屑、锯末和柳枝稷。

“培养”及其变型(诸如“培育”和“发酵”)是指通过使用选定的和／或受控的条件对一种或多种细胞的生长(增加细胞大小、细胞内容物和／或细胞活性)和／或繁殖(通过有丝***增加细胞数量)的刻意培养。生长和繁殖两者的组合称为增殖。选定的和／或受控的条件的实例包括使用限定的培养基(具有已知的特性，诸如pH、离子强度和碳源)、规定的温度、氧分压(oxygen tension)、二氧化碳水平和生物反应器中的生长。培养不是指自然界中或无其他人工干预下的微生物的生长或繁殖；例如，最终石化产生地质原油的生物体自然生长并非培养。

“细胞裂解”是指细胞在低渗环境中的裂解。细胞裂解由过度渗透或水向细胞内运动(水化过多)引起。如果细胞无法承受内部水的渗透压，就会破裂。

“干重”和“细胞干重”意指在相对失水下测定的重量。例如，提及产油酵母生物质按干重计包含规定百分比的特定组分意指将基本上所有水分除去后基于生物质的重量计算百分比。

“外源基因”是指编码已引入(“转化进”)细胞的RNA和／或蛋白的表达的核酸。转化细胞可以称为重组细胞，另外的外源基因可以引入其中。相对于被转化的细胞，外源基因可来自不同的物种(并因此为异源的)，或来自于相同的物种(并因此为同源的)。因此，相对于基因的内源拷贝，外源基因可以包括在细胞基因组中占有不同位置或处于不同控制下的同源基因。外源基因可以在细胞中以不止一个拷贝存在。外源基因可以在细胞中作为基因组的***或作为游离体分子而保留。

“外源提供的”是指提供给细胞培养的培养基的分子。

“榨油机压榨”是用于从诸如大豆和油菜籽的原料中提取油的机械方法。螺旋榨油机是一种螺旋式机械，其通过类似笼桶的腔室压榨材料。原料进入榨油机的一侧，而废饼从另一侧退出，同时油从笼中的榨条间渗出并加以收集。机器使用摩擦和来自螺杆传动的持续压力来移动和压榨原料。油从固体无法通过的小口中渗出。随着原料被压榨，摩擦力通常引起原料升温。

“固定碳源”是含碳的分子，通常为有机分子，它在能被所培养的微生物利用的培养基中在环境温度和压力下以固体和液体形式存在。

“降滤失剂”是加到流体中防止或减少流体的液体组分通过孔径不到1毫达西的地质地层漏失的材料。

“生长”意指细胞大小、总细胞内容物和／或各个细胞的细胞质量或重量的增加，包括由于将固定碳源转化成细胞内油而引起的细胞重量的增加。

“匀浆”指已被物理破坏的生物质。

“烃”是仅含氢原子和碳原子的分子，其中碳原子共价连接形成直链、支链、环化或部分环化主链，而氢原子则连接到其上。烃化合物的分子结构从最简单的甲烷(CH₄)(天然气的成分)形式到非常重和非常复杂(例如某些分子，诸如存在于原油、石油和沥青中的沥青质)而各异。烃可以为气体、液体、或固体的形式，或这些形式的任何组合，并在主链中的相邻碳原子之间可以具有一个或多个双键或三键。因此，该术语包括直链、支链、环化或部分环化的烷烃、烯烃、脂质和石蜡。实例包括丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛烷和角鲨烯。

“限制浓度的营养物”是培养物中限制所培养的生物体的繁殖的化合物浓度。“非限制性浓度的营养物”是在给定的培养期内支持最大繁殖的浓度。因此，在给定培养期内，在存在限制浓度的营养物的情况下产生的细胞数量较之营养物为非限制性的时要少。当营养物以高于支持最大繁殖时的浓度存在时，将营养物称为在培养物中“过量”。

“脂质”是一类可溶于非极性溶剂(诸如***和氯仿)并相对或完全不溶于水的分子。脂质分子具有这些性质，因为它们主要由疏水性的长烃链构成。脂质的实例包括脂肪酸(饱和的和不饱和的)；甘油酯或甘油糖脂(诸如单甘油酯、双甘油酯、三甘油酯或中性脂肪，和磷酸甘油酯或甘油磷脂)；非甘油酯(鞘脂，包括胆固醇和类固醇激素的甾醇脂质，包括萜的异戊烯醇脂质，脂肪醇，蜡，和聚酮化合物)；以及复杂的脂质衍生物(糖连接的脂质、或糖脂和蛋白连接的脂质)。“脂肪”是脂质中被称为“三酰甘油酯”的亚组。

“裂解物”是包含裂解细胞的内容物的溶液。

“裂解”是足以释放至少一些细胞内内容物的生物有机体的质膜和任选细胞壁的破裂，通常通过破坏其完整性的机械、病毒或渗透机制。

“细胞溶解”是足以释放至少一些细胞内内容物的破坏生物有机体的细胞膜和任选细胞壁。

“微生物体”和“微生物”是微观的单细胞生物体。

“油”意指由包括产油酵母、植物和／或动物的生物体产生的任何三酰甘油酯(或三甘油酯油)。区别于“脂肪”的“油”除非另外指明否则是指在平常室温和压力下通常为液体的脂质。例如，“油”包括来源于植物的蔬菜或种子油，包括但不限于来源于大豆、油菜籽、低芥酸菜子、棕榈、棕榈仁、椰子、玉米、橄榄、向日葵、棉籽、萼距花属植物、花生、亚麻芥、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏花、***、咖啡、亚麻籽、榛子、大戟属植物、南瓜籽、芫荽、山茶、芝麻、红花、稻、桐油树、可可豆、椰子核、罂粟、蓖麻籽、美洲山核桃、荷荷巴、麻疯树、夏威夷果、巴西坚果和鳄梨以及它们的组合。

产油酵母”意指能够天然蓄积按其细胞干重计超过20％脂质的酵母，并属于真菌的双核(Dikarya)亚界。产油酵母包括诸如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)和斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)的生物体。

渗透休克”是渗透压急剧降低后溶液中的细胞破裂。有时引起渗透休克以将此类细胞的细胞组分释放进溶液。

“多糖”或“聚糖”是由通过糖苷键接合的单糖构成的碳水化合物。纤维素是构成某些植物细胞壁的多糖。纤维素可以通过酶解聚产生诸如木糖和葡萄糖的单糖以及较大的二糖和寡糖。

“明显包封的”意指超过50％并通常超过75％到90％的所提及组分(例如海藻油)滞留在一个或多个产油微生物细胞中。

“明显完整的细胞”和“明显完整的生物质”意指包含超过50％并通常超过75％、90％和98％的完整细胞的细胞群。在此背景下的“完整”意指封闭细胞的细胞内组分的细胞膜和／或细胞壁的物理连续性尚未通过以下方式破坏：将会释放出细胞的细胞内组分达到超过培养中的细胞膜渗透性的程度。

“明显裂解的”意指这样一种细胞群，其中超过50％并通常超过75％至90％的细胞已被破坏使得细胞的细胞内组分不再完全地封闭在细胞膜内。

“增殖”意指生长和繁殖两者的组合。

“繁殖”意指通过有丝***或其他细胞***引起细胞数量的增力。

“可再生柴油”是通过脂质的氢化和脱氧产生的烷烃(诸如C10：0、C12：0、C14：0、C16：0和C18：0)的混合物。

“废生物质”及其变型(诸如“去脂膳食”和“脱脂生物质”)是将油(包括脂质)和／或其他组分通过使用机械(即，通过螺旋榨油机施加)或溶剂提取法或这两种方式从生物质中提取或分离后的微生物生物质。相较于从微生物生物质中提取或分离油／脂质前，此类脱脂膳食的油／脂质的量减少，但通常含有一些残余的油／脂质。

“声波处理”是通过使用声波能量破坏生物材料(诸如细胞)的过程。

“粘度调节剂”是改变流体的流变性质的试剂。流体的粘度是流体流动阻力的度量。粘度调节剂用于在油田化学应用中增加或降低流体的粘度。

涉及体积比例的“V／V”或“v／v”意指组合物中一种物质的体积与组合物体积的比率。例如，提及包含5％v／v酵母油的组合物意指组合物体积的5％由油构成(例如，体积为100mm³的这样的组合物将包含5mm³的油)，而组合物的剩余体积(例如在本例中为95mm³)由其他成分构成。

涉及物质浓度的“W／V”或“w／v”意指每100mL流体中物质的克数。

涉及重量比例的“W／W”或“w／w”意指组合物中一种物质的重量与组合物重量的比率。例如，提及包含5％w／w产油酵母生物质的组合物意指组合物重量的5％由产油酵母生物质构成(例如，重量为100mg的这样的组合物将包含5mg产油酵母生物质)，而组合物的剩余重量(例如，在本例中为95mg)由其他成分构成。

II.产油微生物和异养培养条件

由某些产生油的微生物(产油微生物)制备的生物质可用于本发明的实施方案，包括作为降滤失剂。合适的微生物包括微藻、产油细菌和产油酵母。可用于本发明的产油微生物产生适于生产燃料或作为其他工业应用的原料的油(脂质或烃)。适于生产燃料的脂质包括含有长链脂肪酸分子的三酰甘油酯(TAG)。适于工业应用(诸如制造)的脂质或烃包括脂肪酸、醛、醇和烷烃。

产生脂质或烃的任何生物体物种均可用于本发明的方法和钻井液，然而天然产生高水平的合适脂质或烃的微生物是优选的。通过微生物产生烃在以引用方式并入本文的Metzger et al.，Appl MicrobiolBiotechnol(2005)66：486-496and A Look Back at the U.S.Departmentof Energy’s Aquatic Species Program：Biodiesel from Algae，NREL／TP-580-24190，John Sheehan，Terri Dunahay，John Benemann andPaul Roessler(1998)中给出了综述。

出于本发明的目的，影响选择用于产生微生物生物质的微生物的注意事项包括：(1)按细胞重量百分比计的高脂质含量；(2)容易生长；和(3)易于加工。在特定实施方案中，当收获用于提取油时，微生物产生含有至少约40％至60％或更多(包括超过70％)脂质的细胞。对于许多应用，异养生长(在不存在光的情况下基于糖或非二氧化碳的碳源)或可经工程改造成此的微生物可用于本发明的方法和钻井液。参见PCT公布号2010／063031、2010／063032、2008／151149，它们都整体以引用方式并入本文。

天然存在的和经基因工程改造的微藻是用于制备适用于本发明方法和结合到本发明钻井液中的微生物生物质的合适微生物。因此，在本发明的多个实施方案中，从中获取微生物生物质的微生物是微藻。可用于在本发明的方法中生成微生物生物质并结合到本发明的钻井液中的微藻属和种的实例包括但不限于以下属和种的微藻。

表1.微藻。

微生物可经基因工程改造以代谢替代的糖源(诸如蔗糖或木糖)和／或产生改变的脂肪酸谱。如果微生物可异养生长，则其可以为兼性或专性异养生物体。在一个具体的实施方案中，生物体为桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)，这是一种专性异养产油微藻。在又一个具体实施方案中，桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)经过基因工程改造以代谢蔗糖或木糖。

在本发明的多个实施方案中，从中获取生物质的微生物是小球藻(Chlorella)属的种的生物体。在多个优选的实施方案中，微藻为原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、极微小球藻(Chlorella minutissima)、Chlorella zofinienesi、Chlorellaluteoviridis、凯氏小球藻(Chlorella kessleri)、耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)、Chlorella fusca var.vacuolata Chlorella sP.、Chlorella cf.minutissima或浮水小球藻(Chlorella emersonii)。小球藻(Chlorella)是单细胞绿藻的一个属，属于绿藻(Chlorophyta)门。其为球形，直径约2至10μm，并且无鞭毛。小球藻(Chlorella)的一些种是天然异养的。小球藻(Chlorella)尤其是原壳小球藻(Chlorella protothecoides)由于其高脂质浓度及其异养生长的能力是用于为本发明生成生物质的优选微生物。

小球藻(Chlorella)例如原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、极微小球藻(Chlorella minutissima)或浮水小球藻(Chlorella emersonii)可经工程改造以表达一种或多种异源基因(“转基因”)。转基因在例如小球藻(Chlorella)中的表达的实例可见于文献中(参见例如PCT专利公布号2010／063031、2010／063032和2008／151149；Current MicrobiologyVol.35(1997)，pp.356-362；Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao.2000Jul；16(4)：443-6；Current Microbiology Vol.38(1999)，pp.335-341；ApplMicrobiol Biotechnol(2006)72：197-205；Marine Biotechnology4，63-73，2002；Current Genetics39：5，365-370(2001)；Plant Cell Reports18：9，778-780，(1999)；Biologia Plantarium42(2)：209-216，(1999)；PlantPathol.J21(1)：13-20，(2005))，并且此类参考文献教导了用于在此类生物体中引入和表达所关注基因的多种方法和材料。其他产脂质的微藻也可经过工程改造，包括原核微藻(参见Kalscheuer et al.，AppliedMicrobiology and Biotechnology，Volume52，Number4／October，1999)，其适用于根据本发明的实施方案在方法中生成生物质并结合到流体中。

无绿藻(Prototheca)是单细胞微藻的一个属，据信为小球藻(Chlorella)的非光合突变体。虽然小球藻(Chlorella)可通过光合作用获得其能量，但是无绿藻(Prototheca)属的种为专性异养生物。无绿藻(Prototheca)为球形，直径约2至15微米，并且没有鞭毛。在多个实施方案中，用于在本发明的方法中生成生物质并结合到本发明的钻井液中的微藻选自无绿藻(Prototheca)的以下种：淤滞型无绿藻(Prototheca stagnora)、波多黎各无绿藻(Prototheca portoricensis)、桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)、威氏无绿藻(Protothecawickerhamii)和饶氏无绿藻(Prototheca zopfii)。

除了无绿藻(Prototheca)和小球藻(Chlorella)外，其他微藻也可用于生成结合到本发明的钻井液中的生物质。在多个优选的实施方案中，微藻选自任何以下属和种：凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri)、拜氏拟小球藻(Parachlorella beijerinckii)、富油新绿藻(Neochlorisoleabundans)、Bracteacoccus grandis、Bracteacoccus cinnabarinas、Bracteococcus aerius、Bracteococcus sp.或Scenedesmus rebescens。微藻的其他非限制性实例(包括小球藻(Chlorella))在上表1中列出。

除了微藻外，产油酵母可按其细胞干重计蓄积超过20％的脂质并因此可用于生成结合到本发明钻井液中的生物质。在本发明的一个优选实施方案中，从中获取生物质的微生物是产油酵母。可用于本发明方法以生成适于结合到本发明钻井液中的生物质的产油酵母的实例包括但不限于表2中所列的产油酵母。培养产油酵母(解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides))以便实现高油含量并产生结合到本发明钻井液中的生物质的示例性方法在下文的实施例中提供。

表2.产油酵母。

在本发明的一个实施方案中，从中获取适于结合到本发明钻井液中的生物质的微生物是真菌。可用于本发明方法以生成适于结合到本发明钻井液中的生物质的真菌的实例包括但不限于表3中所列的真菌。

表3.产油真菌。

因此，在本发明的一个实施方案中，用于产生结合到本发明钻井液中的微生物生物质的微生物是真菌。合适的真菌的实例(例如高山被孢霉(Mortierella alpine)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和赭曲霉(Aspergillus ochraceus))包括已证实适于基因操纵的那些真菌，如在文献中所述(参见例如Microbiology，Jul；153(Pt.7)：2013-25(2007)；Mol Genet Genomics，Jun；271(5)：595-602(2004)；Curr Genet，Mar；21(3)：215-23(1992)；Current Microbiology，30(2)：83-86(1995)；Sakuradani，NISR Research Grant，″Studies of Metabolic Engineering ofUseful Lipid-producing Microorganisms″(2004)和PCT／JP2004／012021)。

在本发明的其他实施方案中，产生脂质的微生物或可从中获取适用于本发明钻井液的生物质的微生物是产油细菌。产油细菌是按其细胞干重计可蓄积超过20％脂质的细菌。用于本发明方法的产油细菌的种包括红球菌(Rhodococcus)属的种，诸如混浊红球菌(Rhodococcusopacus)和红球菌种(Rhodococcus sp.)。培养诸如混浊红球菌(Rhodococcus opacus)的产油细菌的方法是本领域已知的(参见Waltermann，et al.，(2000)Microbiology，146：1143-1149)。培养混浊红球菌(Rhodococcus opacus)以实现高油含量并生成适用于本发明方法和钻井液的示例性方法在下文的实例中提供。

为了产生适用于本发明方法和组合物的含有微生物生物质，对微生物进行培养以产生油(例如烃、脂质、脂肪酸、醛、醇和烷烃)。这种类型的培养通常首先以小规模并且最初至少在起始微生物可以生长的条件下进行。为了产生烃而进行的培养优选地以大规模并在异养条件下进行。优选地，诸如葡萄糖或蔗糖的固定碳源例如过量存在。培养物还可在需要或有益的情况下部分时间或整个时间暴露于光照。

微藻和大多数其他产油微生物可在液体培养基中培养。培养物可容纳在生物反应器内。任选地，生物反应器不允许光线进入。作为另外一种选择，微藻可在含有固定碳源和／或二氧化碳并允许光线照到细胞上的光生物反应器中培养。对于可利用光作为能源的微藻细胞，将这些细胞暴露于光甚至在不存在细胞转运和利用的固定碳源(即混合营养型生长)的情况下相较于在暗处培养那些细胞仍加速生长。培养条件参数可经操纵以优化总油产生，所产生的烃物质的组合和／或特定烃物质的产生。在一些情况下，优选的是在暗处培养细胞，诸如当使用不允许光线照到大比例的(或任何)培养物上的极大(40,000升及更大的)发酵罐时。

培养基通常含有诸如固定氮源、痕量元素、任选维持pH的缓冲剂以及磷酸盐的组分。除了固定氮源(诸如乙酸盐或葡萄糖)外的组分可包括盐，诸如氯化钠，尤其是对于海水微藻而言。痕量元素的实例包括锌、硼、钴、铜、锰和钼，例如分别以ZnCl₂、H₃BO₃、CoCl₂·6H₂O、CuCl₂·2H₂O、MnCl₂·4H₂O和(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O的形式。其他培养参数也可进行操纵，诸如培养基的pH、痕量元素以及其他培养基成分的种类和浓度。

对于能够在固定碳源上生长的生物体而言，固定碳源可以为例如葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰基葡糖胺、甘油、弗罗里多苷(floridoside)、葡糖醛酸和／或乙酸盐。可将一种或多种外源提供的固定碳源以至少约50μM到至少500mM以及该范围内的各种量(即100μM、500μM、5mM、50mM)的浓度提供给培养基。

一些微藻种可在不存在光的情况下通过利用固定碳源(诸如葡萄糖或乙酸盐)而生长。这种生长称为异养生长。对于例如原壳小球藻(Chlorella protothecoides)而言，异养生长可导致高产量的生物质并蓄积高脂质含量。因此，微生物的光合生长和繁殖的替代形式是在固定碳源为生长和脂质蓄积提供能量的条件下使用微生物的异养生长和繁殖。在一些实施方案中，固定碳能源包括纤维素材料，包括解聚的纤维素材料：5碳糖或6碳糖。

按干重量的百分比计，原壳小球藻(Chlorella protothecoides)生长和繁殖到高油含量的方法已有报道(参见例如Miao and Wu，J.Biotechnology，2004，11：85-93以及Miao and Wu，BiosourceTechnology(2006)97：841-846，其中报道了按细胞干重计获得55％油的方法)。

以引用方式并入本文的PCT公布WO2008／151149描述了诸如小球藻(Chlorella)的微藻的优选生长条件。小球藻(Chlorella)的多个种以及种内的多个株系可在存在甘油的情况下生长。前述专利申请描述了包括使用甘油发酵微藻的多个属的培养参数。多个小球藻(Chlorella)种和株系不仅在纯化的试剂级甘油上而且还在得自生物柴油酯交换的酸化和未酸化甘油副产物上均能非常好地增殖。在一些情况下，诸如小球藻(Chlorella)株系的微藻在存在甘油的情况下比在存在葡萄糖的情况下发生更快的细胞***。在这些情况下，其中首先向细胞饲养甘油以增加细胞密度然后饲养葡萄糖以蓄积脂质的两阶段生长过程可提高产生脂质的效率。

出于本发明的目的，在异养生长条件下培养微藻的其他原料包括甘油和葡萄糖的混合物、葡萄糖和木糖的混合物、果糖和葡萄糖的混合物、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、***糖、甘露糖、半乳糖、乙酸盐和糖蜜。其他合适的原料包括玉米秸秆、甜菜粕，和与解聚酶结合的柳枝稷。在本发明的多个实施方案中，将在异养培养条件下可利用蔗糖作为碳源的微生物用于生成微生物生物质。PCT公布号2010／063032、2010／063032和2008／151149描述了经基因工程改造以利用蔗糖作为碳源的重组生物体，包括但不限于无绿藻(Prototheca)和小球藻(Chlorella)微藻。在多个实施方案中，将能够在异养条件下利用蔗糖作为碳源的这些或其他生物体在其中蔗糖以粗制、含蔗糖材料的形式提供的培养基中培养，这些形式包括但不限于甘蔗汁(例如浓甘蔗汁)和甜菜汁。

对于脂质和油的产生，通常将包括重组细胞的细胞大量发酵。培养可在大液体体积中进行，诸如以悬浮培养的形式。其他实例包括以小规模细胞培养开始，其与细胞生长和繁殖以及脂质(油)产生相结合扩增成大量生物质。生物反应器或钢发酵罐可用于适应大培养体积。对于这些发酵，使用光合生长条件或许是不可能的或至少不切实际且效率低下的，因此异养生长条件可为优选的。

适于发酵罐中的异养生长条件培养的营养源包括诸如以下一者或多者的原材料：固定碳源，诸如葡萄糖、玉米淀粉、解聚纤维素材料、蔗糖、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清、糖蜜等；氮源，诸如蛋白、大豆粉、玉米浆、氨(纯的或盐形式)、硝酸酯或硝酸盐；以及磷源，诸如磷酸盐。另外，发酵罐或异养生长条件允许控制培养条件，诸如温度、pH、氧分压和二氧化碳水平。任选地，可通过液体培养物鼓入气态组分，如氧气或氮气。其他淀粉(葡萄糖)源包括小麦、马铃薯、稻和高粱。其他碳源包括诸如以下工艺物料流：技术级甘油，黑液，和诸如乙酸盐的有机酸，以及糖蜜。碳源还可作为混合物提供，诸如蔗糖和解聚甜菜粕的混合物。

异养生长条件的发酵罐可用于使得细胞经历其生理周期的多个阶段。例如，可将产脂质细胞的接种物引入培养基，然后为停滞期(迟滞期)，之后细胞开始繁殖。在停滞期后，繁殖速率开始稳定增加，并进入对数期或指数期。指数期后继而为由于诸如氮的营养物的减少、毒性物质的增加和群体感应机制使得繁殖减缓。在此减缓后，繁殖停止，细胞进入静止期或稳定生长状态，具体取决于提供给细胞的特定环境。

在可用于本发明目的的一种异养培养方法中，使用解聚的纤维素生物质作为原料对微生物进行培养。与可用于培养微生物的其他原料(诸如玉米淀粉或得自甘蔗或甜菜的蔗糖)相对，纤维素生物质(解聚的或其他形式的)不宜供人食用。纤维素生物质(例如秸秆，诸如玉米秸秆)廉价而易得。

合适的纤维素材料包括得自草本和木本能源作物以及农业作物的残余物，即植物部分，主要是通常不与主要的食物或纤维产物一起从农田移除的茎干和叶子。实例包括农业废料，诸如蔗渣、稻壳、玉米纤维(包括玉米杆、玉米叶、玉米壳和玉米芯)、小麦秸秆、稻秆、甜菜粕、柑橘渣、柑橘果皮；林业废料，诸如硬木和软木间伐材、以及得自木材作业的硬木和软木残余物)；木材废料，诸如锯木厂废料(木屑、锯末)和纸浆厂废料；城市废弃物，诸如城市固体废弃物的废纸、城市木材废料和城市绿色垃圾(诸如城市剪草)；以及木材建筑垃圾。另外的纤维素包括专用纤维素作物，诸如柳枝稷、杂交杨木和芒草、纤维质藤条和纤维质高粱。由此类材料产生的五碳糖包括木糖。

一些微生物能够加工纤维素材料并直接将纤维素材料用作碳源。然而，纤维素材料可能需要接受处理以增加可及表面积，或首先将纤维素分解成微生物用作碳源的制备物。以引用方式并入本文的PCT专利公布号2010／120939、2010／063032、2010／063031和PCT2008／151149描述了用于处理纤维素使其适于用作微生物发酵中的碳源的多种方法。

生物反应器可用于异养生长和繁殖方法。应当认识到，当在本文所述的异养生长和繁殖方法中使用固定碳源时，对在光合生长方法中使光可用于细胞所作出的规定不是必需的。

本文所述的工艺条件和异养生长及繁殖方法的具体实例可以任何合适的方式结合以提高微生物生长和脂质产生的效率。例如，具有更大的利用任何上述原料的能力以提高增殖和／或脂质产生的微生物均可用于本发明的方法。

在本发明的某些实施方案中，对产油微生物进行混合营养培养。混合营养生长涉及同时使用光线和固定碳源作为培养细胞的碳源。混合营养生长可在光生物反应器中进行。微藻可维持在由不同类型的透明或半透明材料制成的密闭光生物反应器中。这种材料可包括

罩壳、玻璃罩壳、由诸如聚乙烯的物质制成的袋子、透明或半透明管和其他材料。微藻可在打开的光生物反应器中生长和维持，诸如跑道池、沉淀池和其他非封闭的容器。可用于混合营养生长条件的光生物反应器的以下讨论也适用于光合生长条件。

可根据本发明的方法使用的微生物存在于世界中的各种位置和环境。作为它们与其他种分离以及它们所产生的进化趋异的结果，实现最佳生长以及从任何特定的微生物种产生油和／或脂质的最佳生长培养基可能需要经实验确定。在一些情况下，由于存在某些抑制性组分或不存在特定微生物株系所必需的某些营养需要，某些微生物株系可能无法在特定的生长培养基上生长。对于培养多种微藻种以按细胞干重的百分比计蓄积高水平的脂质，在本领域中存在多种已知的方法，而确定任何所关注种的最佳生长条件的方法也是本领域已知的。

固体和液体生长培养基通常可得自许多来源，并且适用于多种微生物株系的特定培养基的制备说明可例如在http:／／www.utex.org／在线获得，这是由位于Austin的University of Texas针对其藻类培养物保藏而维护的一家网站(UTEX)。例如，各种淡水和盐水培养基包括在表4中所示的那些。

表4.藻类培养基。

适于培养原壳小球藻(Chlorella protothecoides)的培养基包括朊间质培养基。该培养基适于无异种生物混杂的培养，而1L体积的培养基(pH～6.8)可通过向1升Bristol培养基加入1g蛋白胨而制备。Bristol培养基在水溶液中包含2.94mM NaNO₃、0.17mM CaCl₂·2H₂O、0.3mM MgSO₄·7H₂O、0.43mM、1.29mM KH₂PO₄和1.43mM NaCl。对于1.5％的琼脂培养基，可将15g琼脂加入1L溶液。将溶液盖上，并进行高压灭菌，然后在使用前储存在冷藏温度下。

其他适于与本发明的方法一起使用的培养基可容易地通过咨询上述URL或通过咨询维持微生物培养物的其他组织而确定，如SAG：University of

(

Germany)的藻类培养物保藏中心、CCAP：Scottish Association for Marine Science(Scotland，UnitedKingdom)管理的藻类与原生动物培养物保藏中心以及CCALA：Institute of Botany(

Czech Republic)的藻类实验室培养物保藏中心。

用于本发明方法的微生物生物质可在加工期间的一定时间点(例如当将从微生物回收油后剩下的废生物质用作降滤失剂时)或结合到本发明的钻井液中时具有高脂质含量(例如按干重计至少10％、至少20％、至少30％或更高的脂质)。可对工艺条件进行调整以增加脂质细胞的重量百分比。例如，在某些实施方案中，将微生物(例如微藻)在存在限制浓度的一种或多种营养物(诸如氮和／或磷和／或硫)的情况下同时提供过量的固定碳能源(诸如葡萄糖)而培养。氮源限制倾向于相比处于过量提供氮的培养中的微生物脂质产量而言提高微生物脂质产量。在特定实施方案中，脂质产量从至少约10％增至100％至高达500％或更高。微生物可在存在有限量的营养物的情况下培养总培养期的一部分或整个培养期。在特定实施方案中，在总培养期间，营养物浓度在限制浓度与非限制性浓度之间循环至少两次。在一个实施方案中，用在方法中的微生物生物质的C10-C14含量占生物质脂质含量的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％或至少70％。在另一方面，微生物生物质的饱和脂质含量为微生物生物质脂质的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。

为了增加按细胞干重的百分比计的脂质，可将乙酸盐用在产脂质微生物(例如微藻)的原料中。乙酸盐直接进入引发脂肪酸合成的代谢点(即乙酰辅酶A)；因而在培养中提供乙酸盐可增加脂肪酸的产生。一般来讲，将微生物在存在足量乙酸盐的情况下培养以增加微生物脂质产量和／或微生物脂肪酸产量，具体地讲，相对于不存在乙酸盐的微生物脂质(例如脂肪酸)产量。乙酸盐进料是本文提供用于生成按细胞干重计具有高百分比脂质的微藻生物质的方法的有用组分。

在稳定生长状态下，细胞蓄积油(脂质)但不发生细胞***。在本发明的一个实施方案中，生长状态通过向细胞原始生长培养基提供除固定氮源外的所有组分而维持。通过进料除固定氮源外最初提供给细胞的所有营养物而培养微藻细胞(诸如通过向细胞长时间进料)可导致按细胞干重计高百分比的脂质。在一些实施方案中，可按比最初在起始发酵中提供的低得多的浓度提供固定氮源之外的营养物(诸如金属、磷酸盐和其他组分)以避免细胞通过无法被细胞利用的营养物“过度喂食”，从而降低成本。

在其他实施方案中，高脂质(油)生物质可通过在消耗掉所有固定氮后向细胞长时间(诸如至少8至16天或更多天)进料固定碳源而生成。在一些实施方案中，让细胞在存在固定碳源并在不存在固定氮源的情况下蓄积30天以上的油。优选地，使用本文所述和本领域已知的条件生长的微生物按细胞干重计包含至少约10％至约75％范围内的脂质。这种富油生物质可在本发明的钻井液中直接用作降滤失剂，但通常的是，将从细菌中提取脂质后剩余的废生物质用作降滤失剂。

允许细胞按细胞干重计蓄积高百分比脂质的另一工具涉及原料选择。多个小球藻(Chlorella)种和小球藻(Chlorella)种内的多个株系当在存在生物柴油甘油副产物的情况下培养时比在存在相等浓度的纯试剂级甘油的情况下培养时按细胞干重计蓄积更高百分比的脂质。相似地，小球藻(Chlorella)可在存在相等浓度(重量百分比)的甘油和葡萄糖混合物的情况下培养时比在仅存在葡萄糖的情况下培养时按细胞干重计蓄积更高百分比的脂质。

允许细胞按细胞干重计蓄积高百分比脂质的另一工具涉及原料选择以及添加某些原料的时间。例如，小球藻(Chlorella)可在将甘油在第一段时间加入培养物然后在第二段时间将葡萄糖加入并继续培养时可比在发酵开始一起加入等量的甘油和葡萄糖时按细胞干重计蓄积更高百分比的脂质。参见以引用方式并入本文的PCT公布号2008／151149。

因此，通过以下方式在微生物脂质产生中脂质(油)占细胞干重的百分比可至少相对于某些细胞提高：使用某些原料并暂时分离碳源，以及将细胞保持在异养生长状态下，在该状态下它们蓄积油但不发生细胞***。以下实例示出了生长多种微生物，包括微藻的若干株系，以蓄积按DCW计的高水平脂质。

可对工艺条件进行调整以增加脂质的产量。还可调整工艺条件以降低生产成本。例如，在某些实施方案中，将微生物(例如微藻)在存在限制浓度的一种或多种营养物(诸如氮、磷和／或硫)的情况下培养。该条件倾向于相比处于过量提供营养物的培养中的微生物脂质产量而言提高微生物脂质产量。在特定实施方案中，脂质产量提高至少约10％20至500％。

限制营养物还可倾向于降低所产生的生物质的量。因此，有限的浓度通常是增加给定生物质的脂质百分比产率但不会不当地减少总生物质的浓度。在示例性实施方案中，生物质的减少不超过约5％至25％。微生物可在存在有限量的营养物的情况下培养总培养期的一部分或整个培养期。在特定实施方案中，在总培养期间，营养物浓度在限制浓度与非限制性浓度之间循环至少两次。

通过本文所述的培养方法生成的微生物生物质包含微藻油(脂质)以及通过微生物生成的或由微生物在发酵过程中从培养基带入的其他成分。

已使用本领域已知的不同培养方法生成了按干重量计具有高百分比油／脂质蓄积的微藻生物质。具有较高百分比油／脂质蓄积的微藻生物质可用于本发明的方法。Li等人描述了使用高铁(Fe)浓度在自养条件下生长的静置培养中按细胞干重(DCW)计具有高达56.6％脂质的普通小球藻(Chlorella vulgaris)培养物(Li et al.，BioresourceTechnology99(11)：4717-22(2008)。Rodolfi等人描述了在氮饥饿条件下在光生物反应器中生长的分别具有60％脂质DCW和39.8％脂质DCW的微拟球藻种(Nanochloropsis sp.)和钙质角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)培养物(Rodolfi et al.，Biotechnology & Bioengineering(2008)[6月18日刊载前的电子版])。Solovchenko等人描述了当向光并在低氮条件下生长时具有约30％脂质蓄积(DCW)的缺刻缘绿藻(Parietochloris incise)培养物(Solovchenko et al.，Journal of AppliedPhycology20：245-251(2008)。原壳小球藻(Chlorella protothecoides)在氮饥饿的某些异养条件下生长可产生高达55％的脂质(DCW)(Miaoand Wu，Bioresource Technology97：841-846(2006)。其他小球藻(Chlorella)种(包括浮水小球藻(Chlorella emersonii)、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)和极微小球藻(Chlorella minutissima))已有人描述到当在低氮培养基条件下在搅拌槽生物反应器中生长时蓄积了高达63％的油(DCW)(Illman et al.，Enzyme and Microbial Technology27：631-635(2000)。还报道了按细胞干重计更高百分比的脂质蓄积，包括在高NaCl条件下生长的盐生杜氏藻(Dumaliella tertiolecta)培养物中70％的脂质(DCW)蓄积(Takagi et al.，Journal of Bioscience andBioengineering101(3)：223-226(2006))和在布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)培养物中75％的脂质蓄积(Banerjee et al.，Critical Reviews inBiotechnology22(3)：245-279(2002))。

在通过发酵蓄积了所需量的产油微生物生物质后，收集并处理生物质，任选地包括脂质提取步骤以制备用作根据本发明多个实施方案的流体的生物质。

III.制备微生物生物质和废生物质

在发酵以蓄积生物质后，通常进行从微生物生物质中除去水(或其他液体)的一个或多个步骤。除去水的这些步骤可包括在本文称为脱水和干燥的不同步骤。

如本文所用的脱水是指从培养含油微生物的发酵液(液体)中分离含油微生物。如果进行，则脱水应通过不会导致生物质油含量损失或仅导致微量损失的方法进行。因此，通常应小心避免在任何脱水步骤中发生细胞裂解。脱水是固液分离并涉及从固体材料中除去液体。常见的脱水过程包括离心、过滤和／或使用机械压力。

可用于本发明的方法和组合物的微生物生物质可通过使用离心而从发酵液中脱水，以形成浓缩糊料。离心后，仍在微生物生物质中存在大量的表面水分或自由水分(例如超过70％)，因此，出于本发明的目的，离心不视为干燥步骤。任选地，离心后，可将生物质用洗涤溶液(例如去离子水)洗涤以除去剩余的发酵液和碎片。

在一些实施方案中，脱水涉及使用过量。适用于本发明的过滤的一个实例是切向流过滤(TFF)，也称为交叉流过滤。切向流过滤是使用膜***和流动力从液体中纯化固体的分离技术。对于优选的过滤方法，参见Geresh，Carb.Polym.50；183-189(2002)，其讨论了MaxCellA／G technologies0.45uM中空纤维过滤器的用途。另见例如与100kD、300kD、1000kD(目录号P2C01MC01)、0.1uM(目录号P2VVPPV01)、0.22uM(目录号P2GVPPV01)和0.45uM膜(目录号P2HVMPV01)一起使用的Millipore装置。渗余物不应以显著的水平通过过滤器。渗余物也不应大量粘附到过滤器材料上。TFF还可使用中空纤维过滤***进行。

切向流过滤的非限制性实例包括涉及使用孔径为至少约0.1微米、至少约0.12微米、至少约0.14微米、至少约0.16微米、至少约0.18微米、至少约0.2微米、至少约0.22微米、至少约0.45微米或至少约0.65微米的过滤器的那些。TFF的优选孔径允许发酵液中的溶质和碎片流过，但是不允许微生物细胞流过。

在其他实施方案中，脱水涉及使用直接施加到生物质的机械压力以从微生物生物质中分离液体发酵液。施加的机械压力的量不应导致大量百分比的微生物细胞破裂，否则会导致油损失，而是只应足够使生物质脱水到后续加工所需的水平。

使用机械压力从微生物生物质脱水的一个非限制性实例采用带式压滤机。带式压滤机是借助多根直径渐减的辊向通过两条张紧带之间的浆液(例如，直接来自发酵罐或生物反应器的微生物生物质)施加机械压力的脱水装置。带式压滤机实际上可分成三个区：重力区，在其中自由穿流水／液体在重力作用下通过多孔带排出；楔形区，在其中制备固体以施加压力；以及压力区，在其中向借助重力排水的固体施加可调压力。

以上脱水技术的一种或多种可单独或组合使用以使微生物生物质脱水以便用于本发明。微生物生物质(经调节的原料)的含水量可影响压榨步骤中获得的油产量(如果将在用作降滤失剂前如下所述从中提取油)，并且对于一些微藻株系在6％以下优选在2％以下的最佳水分含量可在生物体与生物体之间变化(参见以引用方式并入本文的PCT公布号2010／120939)。

如本文所提及的干燥是指除去微生物生物质的一些或全部自由水分或表面水分。与脱水类似，干燥工艺通常不会导致微生物生物质的油大量损失。因此，干燥步骤通常不应导致大量微生物细胞裂解，因为在大多数情况下，脂质位于微生物生物质的细胞内区室中。用于其他目的的本领域已知的若干干燥微生物生物质的方法适用于本发明的方法。在除去自由水分或表面水分后的微生物生物质称为干燥的微生物生物质。如果在调节中无进一步的水分去除，或者水分减少通过在加工步骤前添加干燥膨松剂而发生，则干燥的微生物生物质可包含例如但不限于6重量％以下的水分。适用于制备根据本发明方法的干燥微生物生物质的干燥方法的非限制性实例包括冻干以及使用干燥机，诸如转筒干燥机、喷雾干燥机和托盘干燥机，它们都将在下文加以描述。

也称为冷冻干燥的冻干是通常用于保存易腐坏材料的脱水工艺。冻干工艺涉及冷冻材料然后降低周围压力并添加足够的热以允许材料中的冷冻水从固相升华成气体。就冻干微生物生物质诸如来源于微藻的生物质而言，微藻的细胞壁起到冷冻保护剂的作用，其防止在冷冻干燥工艺期间细胞内脂质降解。

滚筒干燥机器是干燥大量微生物生物质最经济的方法之一。滚筒干燥机或转筒干燥机由两个大的相对旋转并从内部由蒸汽加热的钢质圆筒组成。在一些实施方案中，将微生物生物质以薄片施加到大圆筒的外部。通过蒸汽带来的热，微生物生物质随后得以干燥，通常在不到大圆筒的一转内，然后通过钢刀片从圆筒刮下所得的干燥微生物生物质。所得的干燥微生物生物质具有片状一致性。在多个实施方案中，首先使微生物生物质脱水，然后使用滚筒干燥机干燥。滚筒干燥机更详细的说明可见于公开了旋转干燥筒的美国专利号5,729,910。

喷雾干燥是使用热气体干燥液体进料的常用方法。喷雾干燥机获取液流(例如含有微生物生物质)并作为固体分离溶质而使液体变成蒸汽。液体输入蒸汽通过喷嘴喷入热蒸汽流并汽化。随着水分快速离开液滴，固体得以形成。喷雾干燥机的喷嘴可以调节，并通常调节为使液体尽可能小以使热传递和水蒸发速率最大化。所得的干燥固体可具有细小的粉状一致性，具体取决于所用喷嘴的大小。在其他实施方案中，喷雾干燥机可使用冻干工艺而不是蒸汽加热来干燥材料。

托盘干燥机通常用于实验室工作和小型中试干燥操作。托盘干燥机的工作原理基于对流加热和蒸发。含有微生物生物质的发酵液可使用热和除去蒸发水的排气口从大范围的细胞浓度有效干燥。

闪蒸干燥机通常用于干燥已经脱水或本身具有低含水量的固体。也称为“气动干燥机”，这些干燥机通常将潮湿的材料分散到将材料通过干燥管道输送的热空气(或气体)流中。来自空气流(或气体流)的热在材料通过干燥管道输送时将材料干燥。干燥的产物然后使用旋风分离器和／或袋式过滤器分离。升高的干燥温度可用于许多产物，因为表面水分的闪蒸立即冷却干燥气体／空气，而不会明显升高产物温度。闪蒸干燥机和气流干燥机的更详细说明可见于描述闪蒸干燥机的美国专利号4，214，375以及描述气流干燥机的美国专利号3,789,513和4,101,264。

如果要得到根据本发明使用的废生物质，则脱水和／或干燥的微生物生物质可在如下所述的压榨步骤前进行调节。微生物生物质的调节是指将生物质加热到70℃至150℃(160°F至300°F)范围内的温度并改变微生物生物质的物理或物理化学性质，并可用于提高后续油提取(压榨)步骤的油产量。调节微生物生物质导致产生“经调节的原料”。除了对生物质加热或“烹煮”外，调节的非限制性实例包括调整干燥微生物生物质内的含水量，使干燥微生物生物质接受低压力“预压”，使干燥微生物生物质接受加热和冷却循环，使干燥微生物生物质接受膨胀器，和／或调整干燥微生物生物质的粒度。

调节步骤可包括与用于干燥或压榨步骤的技术部分重叠的技术(例如加热或施加压力)。然而，这些步骤的主要目标不同：干燥步骤的主要目标是从微生物生物质除去一些或全部自由水分或表面水分。调节步骤的主要目标是加热生物质，其可任选地导致从微生物生物质除去细胞内水(即，调节细胞内含水量)和／或改变微生物生物质的物理或物理化学性质而不大量释放脂质以有利于在压榨步骤中释放油。压榨步骤的主要目标是从微生物生物质或经调节的原料中释放油，即提取油。

在多个实施方案中，调节涉及通过施加热改变或调节微生物生物质的含水量，即热调节。如本文所用的热调节是指微生物生物质的热处理(直接或间接的)。微生物生物质的含水量可通过使用热(直接或间接的)进行的调节而加以调节，该调节如果发生的话通常在干燥步骤后进行。虽然生物质可通过上述任何方法干燥，但是干燥后微生物生物质的含水量可在例如3重量％至15重量％或5-10重量％的范围内。这样的水分范围对于压榨步骤中的最大油回收可能不是最佳的。因此，在热调节经脱水的和／或干燥的微生物生物质时将水分含量调节到对于最大油回收而言最佳的水平(低于6％)可存在有益的效果。

用于油料种子加工的制热调节机适用于根据本发明方法调节微生物生物质，诸如垂直堆叠的调节机。这些调节机由一系列三至七个或更多个密闭的叠加圆柱形钢盘构成。每个盘带有独立的夹套以便在两面和底部进行蒸汽加热并配有靠近底部安装的扫动式搅拌机，并且通过延伸穿过整个系列的盘的共同轴操作。制热调节机的温度也可通过调控蒸汽加热而调节。除了最后一个盘外，在每个盘的底部都存在自动操作门，以从盘子的下面卸掉内容物。顶盘设有喷雾器以在需要时添加水分。虽然在许多工业油提取工艺中在调节期间将水分喷洒到种子上，但是对于调节微生物生物质而言这一常见过程是不可取的。烹煮器通常还具有排气管和风扇以除去水分。因此，可能的是不仅针对最终含水量而且还在操作的每个阶段控制微生物生物质的水分。就这一点来说，长时间(例如10-60分钟)加热微生物生物质的调节步骤提供不仅降低水分和增加生物质温度的效果，还超出可在后续压榨步骤中发生的任何热效应(即，只是来自于材料强制通过例如榨油机时材料的摩擦力)而改变微生物生物质的生物物理性质。

另外，带蒸气夹套的水平烹煮器是另一种类型的适于根据本发明方法使用的热调节机。在此设计中，与常规垂直堆叠的烹煮器相比，生物质在更深的床中在水平面上混合、加热和传递。在水平烹煮器中，专门设计的螺旋输送机的动作混合并输送生物质，而生物质通过来自蒸气夹套的间接蒸气同时地加热。水和蒸汽以及空气从烹煮器通过上管排出，而上管根据烹煮器的容量可以或可以不具有排气扇。对于以高流速烹煮生物质，可一起堆叠多个水平的烹煮器。在此构造中，将生物质进料到顶层烹煮器，加热并通过螺旋输送机输送，然后在重力作用下掉到下层烹煮器中，在其中工艺继续重复。可根据需要的流速和所需的调节时间／温度一起堆叠多层水平烹煮器。可针对每层烹煮器独立地监测水分和温度并进行控制。

对于微生物生物质尤其是微藻生物质的热调节，生物质在垂直堆叠的调节机中所处的最佳时间和温度可根据干燥后生物质的水分含量而变化。热调节(有时称为“烹煮”)不应导致在烹煮期间显著量的微生物生物质燃烧或烧焦。取决于热调节前微生物生物质的含水量，即，对于极低水平的水分，可能有益的或甚至必须的是在热调节前对生物质加湿以避免燃烧或烧焦。取决于将通过螺旋榨油机进料的微生物生物质的类型，热调节的最佳温度将有所不同。对于微藻的一些种，热调节的最佳温度在200-270°F之间。在一些实施方案中，将微藻生物质在210-250°F下进行热调节。在其他实施方案中，将微藻生物质在220-270°F下进行热调节。在另外其他实施方案中，将微藻生物质在240-260°F下进行热调节。

在压榨前对含油微生物生物质进行加热可有助于从细胞的含油室中释放油和／或获取油。含油微生物生物质在由诸如蛋白和磷脂的细胞组分构成的室中包含油。加热和冷却的反复循环可使蛋白变性并改变这些油室细胞组分的化学结构，从而在后续提取工艺中更容易获取油。因此，在本发明的多个实施方案中，对微生物生物质进行调节以制备用于压榨步骤的经调节的原料，并且调节步骤涉及加热和任选的一个或多个加热与冷却循环。

如果不进行进一步的改变含水量的热调节或其他调节，并且不加入将改变含水量的膨松剂，则得自热调节的经调节的原料可经过调整以包含低于某一重量百分比的水分。例如，可能有用的是，在本发明的钻井液中采用按重量计水分低于6％的微藻生物质。在多个实施方案中，微生物生物质具有0.1重量％至5重量％范围内的含水量。在多个实施方案中，微生物生物质具有低于4重量％的含水量。在多个实施方案中，微生物生物质具有0.5重量％至3.5重量％的含水量。在多个实施方案中，微生物生物质具有0.1重量％至3重量％的含水量。

除了对生物质加热外，调节可在一些实施方案中涉及对微生物生物质施加压力。为了将这种类型的调节与油提取期间施加的压力(压榨步骤，如果采用的话)相区别，将这种类型的调节称为“预压”。预压在低压力下进行，该压力低于用于压榨步骤中的油提取的压力。普通的高压力螺旋榨油机对于该预压调节步骤可在低压力下操作。在低压力下预压生物质可有助于破开细胞从而允许在后续高压力压榨期间油更好地流动；然而，预压不会导致大量(例如，超过5％)的油与微生物生物质分离。另外，在预压期间生成的摩擦和热还可有助于破开细胞中的油室。在低压力下预压生物质还改变生物质的纹理和粒度，因为生物质将以粒料状形式从榨油机中挤出。在一些实施方案中，挤出机(参见下文的讨论)用于实现与低压力预压调节步骤相同或相似的结果。在一些实施方案中，对经调节的生物质的粒料进行进一步的加工以针对后续全压力压榨实现最佳的粒度。

因此，与从微生物生物质中最佳地提取油相关的另一个参数是粒度。通常，螺旋榨油机的最佳粒度为约1／16英寸厚。可影响粒度范围的因素包括但不限于用于干燥微生物生物质的方法和／或向生物质添加膨松剂或压榨助剂。如果对生物质进行托盘干燥，例如，将水分喷到托盘上然后在烘箱中干燥，则所得的干燥微生物生物质可能需要分解成均匀的具有最佳粒度的片，以使得其对于在螺旋榨油机中压榨是最佳的。如果在干燥工艺前将膨松剂加到微生物生物质中，也同样如此。因此，调节可涉及导致改变微生物生物质的粒度或平均粒度的步骤。诸如锤式粉碎机或刨片机的机器可根据本发明的方法用于调节含油微生物生物质的厚度和粒度。

以相似的方式，改善的油提取可通过改变干燥微生物生物质的其他物理特性而实现。具体地讲，微生物生物质的孔隙度和／或密度可影响油提取产率。在本发明方法的多个实施方案中，进行了生物质的调节以改变其孔隙度和／或密度。膨胀器和挤出机增加生物质的孔隙度和体密度。膨胀器和挤出机可用于调节微生物生物质。膨胀器和挤出机均为低剪切机器，它们使含油材料加热、匀化和成型成环状物或粒料。膨胀器和挤出机相似地工作；两者在轴内均具有蜗杆／卡圈设置，使得当其在轴内移动材料时，机械压力和剪切破开细胞。膨胀器与挤出机之间的最大差异在于膨胀器使用水和／或蒸汽在轴的末端喷出材料。突然的高压力(以及压力的变化)导致材料中的水分蒸发，从而使用内部水分“喷出”或膨胀材料。挤出机改变材料的形状，从而形成环状物或粒料。挤出机还通过挤出机施加到生物质上的机械摩擦裂解细胞并使水从生物质中蒸发(减少水分)同时增加生物质的温度(加热生物质)。因此，挤出机和膨胀器可根据本发明的方法用于调节微生物生物质。挤出机／膨胀器可破开细胞，从而释放出细胞内脂质，并且还可以改变材料的孔隙度和体密度。原料物理特性的这些变化在后续油提取中或对可采用本发明钻井液的特定钻井应用可为有利的。

上述调节步骤可根据本发明的方法单独地或组合地使用以实现对于后续油提取和／或可采用本发明钻井液的特定钻井应用最佳的经调节的微生物生物质原料。因此，调节步骤涉及向生物质施加热和任选的压力。在多个实施方案中，调节步骤包括在70℃至150℃(160°F至300°F)范围内的温度下对生物质加热。在多个实施方案中，加热使用垂直堆叠的振动器进行。在多个实施方案中，调节步骤还包括用膨胀器或挤出机对干燥生物质进行处理以成形和／或匀化生物质。

在本发明的多个实施方案中，特别是其中将废生物质用作降滤失剂的那些实施方案，将膨松剂或压榨助剂加入微生物生物质，其可以是干燥的或水合的(即，尚未干燥或含有大量的即超过干重6％的水分的生物质，包括尚未接受任何除去或分离水的工艺的发酵液中的生物质)微生物生物质或经调节的原料。如果要采用废生物质，则通常在压榨步骤前将膨松剂加入。在多个实施方案中，膨松剂具有低于1.5mm的平均粒度。在一些实施方案中，膨松剂或压榨助剂具有50微米与1.5mm之间的粒度。在其他实施方案中，压榨助剂具有150微米与350微米之间的粒度。在一些实施方案中，膨松剂为助滤剂。在多个实施方案中，膨松剂选自纤维素、玉米秸秆、干燥的迷迭香、大豆皮、废生物质(相对于制备废生物质的生物质而言脂质含量降低的生物质)(包括废微生物生物质)、蔗渣和柳枝稷。在多个实施方案中，膨松剂为含有40重量％与90重量％之间的多糖(诸如纤维素、半纤维素、可溶性和不溶性纤维)和这些不同多糖的组合和／或低于10重量％的油的废微生物生物质。在多个实施方案中，用作膨松剂的废微生物生物质中的多糖包含20-30摩尔％的半乳糖、55-65摩尔％的葡萄糖和／或5-15摩尔％的甘露糖。

因此，添加压榨助剂或膨松剂在本发明的一些实施方案中可为有利的。如果在生物质中存在高油含量和低纤维，则通过榨油机进料生物质可产生乳液。这会导致低油产量，因为油被捕获在固体中。在此类情况下根据本发明的方法提高产量的一种方式是向生物质中添加膨松剂(也称为“压榨助剂”(press aid，pressing aid)”)形式的多糖。膨松剂通常是高纤维添加剂，其工作原理是将微生物生物质的总纤维含量调节到最佳范围。诸如微藻等微生物生物质通常具有非常低的粗纤维含量。通常，包括微藻生物质的微生物生物质可具有低于2％的粗纤维含量。添加高纤维添加剂(压榨助剂的形式)可有助于将微生物生物质的总纤维含量调节到对于使用螺旋榨油机提取油或对于特定钻井液应用最佳的范围。典型的油料种子的最佳纤维含量可在10-20％的范围内。根据本发明的方法，可能有帮助的是，针对最佳的油提取或针对特定的钻井液应用调整微生物生物质的纤维含量。生物质中纤维含量的范围可以为与典型的油料种子的最佳纤维含量相同或相似的范围，然而，每种微生物生物质的最佳纤维含量可低于或高于典型的油料种子的最佳纤维含量。合适的压榨助剂包括但不限于柳枝稷、稻秆、甜菜粕、蔗渣、大豆皮、干燥迷迭香、纤维素、玉米秸秆、得自大豆的去脂(压榨或溶剂提取的)饼、低芥酸菜子、棉籽、向日葵、麻风树种子、纸浆、废纸等。在一些实施方案中，将得自之前榨油机的脂质含量降低的废微生物生物质用作膨松剂。因此，膨松剂在结合到生物质中时改变生物质的生理化学性质，以便有利于向生物质中的细胞更均匀地施加压力。

在一些情况下，膨松剂可在干燥后但尚未经调节的情况下加到微生物生物质中。在此类情况下，如果要将废生物质用作降滤失剂，则可能有利的是将干燥微生物生物质与所需量的压榨助剂混合然后一起调节微生物生物质和压榨助剂，即在进料到螺旋榨油机前。在其他情况下，可在微生物生物质接受任何分离或脱水工艺、干燥或调节前将压榨助剂加到水合微生物生物质中。在此类情况下，可在任何脱水或其他步骤前将压榨助剂直接加到含有微生物生物质的发酵液中。

可用作降滤失剂的生物质可通过采用诸如上文所述的那些膨松剂的多种方法获得。在一种方法中，水合的微生物生物质通过以下方式制备：将膨松剂加到生物质中，然后干燥因而得到的混合物达到所需的含水量，即低于6重量％，从而形成干燥的膨松剂／生物质混合物。在另一种方法中，从微生物生物质中提取油，并通过以下方式获得废生物质：共同干燥含有至少20重量％的油(包括至少40重量％的油)的水合微生物生物质和膨松剂以形成干燥的膨松剂／生物质混合物；任选地通过干燥和／或调节降低混合物中的含水量，即降低到低于4重量％；以及压榨含水量降低的混合物以从中提取油，从而形成脂质含量降低的废生物质。

虽然如上所述制备而得的产油微生物生物质可直接用作根据本发明的降滤失剂，但是废微生物生物质也可用作降滤失剂。鉴于微生物油的价值，废微生物生物质可更常见地用作降滤失剂，制备此类废生物质的方法如下所述。

例如，使经调节的原料(任选地包含膨松剂)在压榨步骤中接受压力以提取油，从而产生从废生物质中分离的油。压榨步骤涉及接受足以从经调节的原料中提取油的压力。因此，在一些实施方案中，在压榨步骤中压榨的经调节的原料包含明显或完全包封在生物质细胞中的油。在其他实施方案中，生物质包含明显裂解的细胞，因此油大部分不包封在细胞中。

在本发明不同方面的多个实施方案中，压榨步骤将涉及使经调节的原料接受至少10,000psi的压力。在多个实施方案中，压榨步骤涉及施加压力持续第一段时间，然后施加更高的压力持续第二段时间。该过程可重复一次或多次(“波动压力”)。在多个实施方案中，对经调节的原料的含水量在压榨步骤中进行控制。在多个实施方案中，将水分控制在0.1重量％至3重量％的范围内。

在多个实施方案中，压榨步骤通过螺旋榨油机进行。在多个实施方案中，压榨步骤以连续流模式进行。在多个实施方案中，出油率为至少500g／min至不超过1000g／min。在多个连续流实施方案中，螺旋榨油机是在榨笼内包括连续旋转的蜗杆轴的设备，榨笼在一端具有进料器而在相对的一端具有阻气门，在榨笼内利用了开口。经调节的原料通过进料器进入榨笼，而蜗杆的旋转沿着榨笼推进原料并向位于榨笼与阻气门之间的原料施加压力，压力通过榨笼的开口释放出油并从榨笼的阻气门端挤出废生物质。

在一些螺旋榨油机上的榨笼可使用蒸汽加热或使用水冷却，具体取决于最大产量所需的最佳温度。最佳温度应当足够热以有助于压榨，但是不应过热以至于在生物质通过压榨机进料时燃烧。螺旋榨油机的榨笼的最佳温度可根据要压榨的微生物生物质而变化。在一些实施方案中，对于压榨微生物或微藻生物质，将榨笼预热并保持到200-270°F之间的温度。在其他实施方案中，微生物生物质或某些种的微藻生物质的最佳榨笼温度在210-230°F之间。在另外其他实施方案中，微生物生物质或某些种的微藻生物质的最佳榨笼温度在240-260°F之间。

在多个实施方案中，通过调节蜗杆轴的转速而控制压力。在多个实施方案中，包括其中不进行压力控制的那些实施方案，可以使用包括蜗杆轴和机筒的螺旋(螺杆)榨油机。

螺旋榨油机(螺杆榨油机)通常用于从大豆和油料种子中机械提取油。一般来讲，螺旋榨油机的主体段包括吸入口、旋转进料螺杆、榨笼或机筒、蜗杆轴和油盘。螺旋榨油机是一种连续式笼状榨油机，其中压力由连续旋转的蜗杆轴产生。通过蜗杆作用于可调阻气门而在榨笼或机筒内聚集起极高的压力(约10,000-20,000磅每平方英寸)，阻气门限制从机筒的末端排出榨饼(废生物质)。在多个实施方案中，得自以下制造商的螺杆榨油机是适用的：Anderson International Corp.(Cleveland，OH)、Alloco(Santa Fe，Argentina)、De Smet Rosedowns(Humberside，UK)、The Dupps Co.(Germantown，Ohio)、Grupo Tecnal(Sao Paulo，Brazil)、Insta Pro(Des Moines，Iowa)、French Oil Mill(Piqua，OH)、Harburg Freudenberger(以前称为Krupp Extraktionstechnik)(Hamburg，Germany)、Maschinenfabrik Reinartz(Neuss，Germany)、Shann Consulting(New South Wales，Australia)和SKET(Magdeburg，Germany)。

微生物生物质或经调节的原料通过吸入而提供给螺旋榨油机。旋转的进料器螺杆将从吸入口提供的材料推进机筒，在机筒中，材料随后通过蜗杆的旋转而压榨。从材料中提取出来的油然后收集在油盘中，再泵送到储罐。然后将剩余的废生物质作为榨饼从榨油机中挤出，并可加以收集以进行另外的加工。可将榨饼制成粒料。

蜗杆与卡圈设置相关，并分成多个段。每段内的蜗杆和卡圈设置可进行定制。蜗杆负责通过榨油机传输生物质(原料)。其可表征为具有一定的直径和螺距。改变轴直径和螺距可增加或降低原料通过榨油机时施加给原料的压力和剪切应力。卡圈的目的是增大对榨油机内的原料的压力，并且还向生物质施加剪切应力。

蜗杆轴优选地渐缩，使得其外径沿着纵向长度远离机筒入口而增加。这将增大蜗杆轴与机筒内部之间的间隙，从而在生物质经过机筒时形成更大的压力和剪切应力。另外，机筒的内部由通过隔条(也称为分隔片)分开的平坦钢条制成，这些隔条围绕机筒的周边在边缘设置，并通过重型摇篮式笼固定到位。调整钢条之间的分隔片控制钢条之间的间隙，这将有助于提取出的油排出，还有助于调控机筒压力。隔条通常为0.003”厚至0.030”厚并优选地为0.005”至0.020”厚，然而也可以采用其他厚度。另外，钢条可进行调整，从而在机筒内形成区段。

当进料受到压榨或顺着机筒移动时，通过摩擦产生大量的热。在一些情况下，使用围绕机筒的水夹套冷却***对热量进行控制。温度传感器可设置在围绕机筒的多个位置以监测并有助于温度控制。另外，压力传感器也可在多个位置连接到机筒以有助于监测和控制压力。

螺旋榨油机的各种操作特性可作为压缩比而表达或分析。压缩比是在机筒开始处蜗杆轴每转一圈排出的材料体积除以机筒末端处蜗杆轴每转一圈排出的材料体积的比率。例如，由于增加的压缩比，在机筒末端的压力可比机筒开始处的压力高10至18倍。内部机筒长度可为内部机筒直径的至少十倍或甚至三十倍。螺杆或螺旋榨油机的典型压缩比取决于进料在1至18的范围内。

进料在螺旋榨油机中的停留时间可影响油回收量。榨油机中的停留时间延长使原料更多地暴露于榨油机产生的剪切应力和压力，这可得到更高的油回收量。原料的停留时间取决于榨油机运行的速度和螺旋榨油机的长度与直径比(或L／D)。轴的长度与轴的直径的比率越大，则原料的停留时间越长(当旋转速度保持不变时)。在一些实施方案中，正通过螺旋榨油机压榨的生物质的停留时间不超过5至10分钟。

所得的压榨固体或饼(相对于提供给螺旋榨油机的原料而言油含量降低的废生物质)从螺旋榨油机中通过机筒／轴末端的卸料锥体排出。阻气门利用液压***控制螺旋榨油机上的出口孔。全面优化的榨油机可提取出含油材料中的大部分可用油。多种因素都会影响榨饼中的残余油含量。这些因素包括但不限于榨油机破裂含油细胞和细胞区室的能力以及含油材料本身的组成，其可具有对榨出的油的亲和力。在一些情况下，含油材料可具有对榨出的油的高亲和力并可将榨出的油吸回到材料中，从而俘获榨出的油。在该情况下，废生物质中剩余的油可如本文所述再次压榨或接受溶剂提取，以回收油。使用螺旋榨油机制备废生物质的方法在以引用方式并入本文的PCT公布号2010／120939中有所描述。

这些油提取方法导致产生相对于在压榨步骤中接受压力的调节原料而言油含量降低的微生物生物质(也称为榨饼或压榨生物质的废生物质)。在本发明的多个实施方案中，油含量降低的废生物质中的油含量比压榨步骤前微生物生物质的油含量低至少45％。在多个实施方案中，将压榨步骤后油含量降低的废生物质制粒或作为饼挤出。可接受另外的工艺(包括另外的调节和压榨或基于溶剂的提取方法以提取残余油)的废饼可用作降滤失剂。

在一些情况下，榨饼含有低于50重量％至低于1重量％范围内的油，包括例如低于40重量％的油、低于20重量％的油、低于10重量％的油、低于5重量％的油和低于2重量％的油。在所有情况下，榨饼中的油含量低于未压榨材料中的油含量。

在一些实施方案中，收集废生物质或榨饼，然后在用作降滤失剂前使之接受上述脱水、干燥、加热和调节方法中的一种或多种。此外，可在此应用前将废生物质压碎、磨成粉或研磨。

IV.钻井液、采出液和泵维修流体

本发明的流体包括水性和非水性钻井液以及其他与井相关的流体，包括用于生产油或天然气、完井作业、防砂作业、修井作业和泵维修(诸如固井、水力压裂和酸化)的那些。在本发明的一个实施方案中，流体包含为得自产油微生物的生物质的降滤失剂。在一个实施方案中，生物质包含油含量高于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的完整、裂解或部***解细胞。在另一个实施方案中，生物质是已从中除去了油的废生物质。例如，油可通过干燥和压榨工艺并任选地用己烷或其他合适的溶剂进行溶剂提取而除去。在一个具体的实施方案中，将生物质干燥到含水量低于6重量％，然后施加压力以释放超过25％的脂质。作为另外一种选择，细胞可以是完整的，当用于钻井液时，其可在某些情况中赋予改善的降滤失性。一般来讲，本发明的钻井液包含约0.1重量％至约20重量％的所述生物质，但是在多个实施方案中，该量可以在约0.1重量％至约10重量％所述生物质；约0.1重量％至约5重量％所述生物质；约0.5重量％至约4重量％所述生物质；和约1重量％至约4重量％所述生物质的范围内。

在多个实施方案中，流体包含不是来源于产油微生物生物质的降滤失剂。合适的降滤失剂可包括但不限于未改性的淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、未改性的纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和聚阴离子纤维素。

流体可包含水性或非水性溶剂。流体还可任选地包含一种或多种另外的组分，使得流体可作为钻井液、钻开液、修井液、解卡液、固井液、储层流体、采出液、压裂液或完井液。

在多个实施方案中，流体是钻井液并且所添加的来自产油微生物的生物质起到有助于运输钻屑、润滑和保护钻头、支持井筒的壁、向钻头下的地层传递液压能和／或在停止钻井时将钻屑悬浮在环面的作用。

当用于钻井液时，生物质可用于堵塞地层中的孔隙并形成或促进形成滤饼。

在多个实施方案中，流体是采出液并且生物质起到抑制腐蚀，将烃与水分离，抑制形成垢、石蜡或腐蚀(例如金属氧化物)或提高井的油或天燃气产量的作用。在一个实施方案中，将生物质用于刺激井中微生物的甲烷生成。生物质可提供营养物和／或结合抑制剂以便增加井中天然气的产生。在该实施方案中，井可以是具有甲烷生成能力的煤层。参见例如美国专利申请号2004／0033557、2012／0021495、2011／0284215、US2010／0248322、2010／0248321、2010／0035309和2007／0248531。

在多个实施方案中，流体包含增粘剂。合适的增粘剂包括但不限于选自以下的海藻酸盐(酯)聚合物：海藻酸钠、海藻酸钠钙、海藻酸铵钙、海藻酸铵、海藻酸钾、海藻酸丙二醇酯以及它们的混合物。其他合适的增粘剂包括亲有机粘土(organophillic clay)、聚丙烯酰胺、黄原胶以及黄原胶与纤维素衍生物的混合物，包括其中黄原胶与纤维素衍生物的重量比在约80：20至约20：80范围内的那些，并且其中纤维素衍生物选自羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素以及它们的混合物。其他合适的增粘剂包括通过细菌、真菌或其他微生物对合适底物的作用而产生的生物聚合物。

膨润土与添加剂的混合物也可用作增粘剂。用于此类混合物的添加剂可包括例如：(a)选自非离子水溶性纤维素衍生物和非离子水溶性瓜尔胶衍生物的非离子水溶性多糖；(b)选自羧甲基纤维素和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)多糖或它们的组合的阴离子水溶性多糖；(c)中等分子量聚二醇，即选自具有约600至约30,000分子量的聚乙二醇、聚丙二醇和聚(烷二醇)；以及(5)它们的相容混合物。混合物的组分可单独地加到流体中以提高其低剪切速率粘度。

微泡沫可用作用于形成或维护钻孔的钻井液和其他流体的添加剂。微泡沫可在流体前缘聚集并充当降滤失剂和／或桥堵剂以沿着钻孔的侧壁建立孔隙网络的内部密封。据信，微泡沫在密封过程中使钻井遇到的孔隙和间隙变形。可用于本发明的微泡沫通常为50-100μm、25-100μm、25-50μm、5-50μm、5-25μm、7-15μm或约10μm。

在一个实施方案中，本发明的钻井液包含微泡沫、其中未提取油的微生物生物质(未提取的微生物生物质)、废生物质或者微泡、未提取的微生物生物质和废生物质的组合。

如果使用微泡沫，则微泡沫可具有5至50微米的平均直径，并可占流体的约0.001质量％至5质量％。

在多个实施方案中，流体包含密度调节剂，也称为加重剂或加重添加剂。合适的密度调节剂包括但不限于重晶石、赤铁矿、氧化锰、碳酸钙、碳酸铁、氧化铁、硫化铅、陨铁和钛铁矿。

在多个实施方案中，流体包含乳化剂。合适的乳化剂可以为非离子的，包括乙氧基化烷基酚和乙氧基化直链醇；或阴离子的，包括磺酸烷芳基酯、磺酸醇醚、磺酸烷基胺、磺酸石油和磷酸酯。

在多个实施方案中，流体包含润滑剂。非限制性的合适润滑剂可包括脂肪酸、妥尔油、磺化洗涤剂、磷酸酯、烷醇酰胺、磺化沥青、石墨和玻璃珠。

流体可以是通过布氏粘度计在0.5rpm测量时具有至少20,000厘泊的低剪切速率粘度的钻井液。在一些实施方案中，低剪切速率粘度为至少约40,000厘泊。

本发明的钻井液包括任何已知的钻井液，其中该钻井液的一种或多种降滤失剂全部或部分地被产油微生物生物质或从其得到的废生物质替代。示例性的已知钻井液包括由M-I SWACO销售的那些，包括以商品名DRILPLEX、DURATHERM、ENVIROTHERM NT、GLYDRIL、K-MAG、KLA-SHIELD、POLY-PLUS、SAGDRIL、SILDRIL和ULTRADRIL销售的水基体系；以商品名MEGADRIL、VERSACLEAN、VERSADRIL和WARP Fluids Technology销售的油基体系；以商品名ECOGREEN、NOVAPLUS、PARADRIL、PARALAND、PARATHERM、RHELIANT和TRUDRIL销售的合成类体系。其他示例性的钻井液包括由Halliburton销售的那些，包括以商品名HYDRO-GUARD无粘土体系销售的水基体系；PERFORMADRIL水基钻井体系；和SHALEDRIL水基钻井体系；以及逆乳化钻井液体系ACCOLADE、ENCORE、INNOVERT、INTEGRADE、INVERMUL和ENVIROMUL。另外的示例性钻井液包括由MASI Technologies LLC销售的那些，包括以商品名APHRONICS和POLYPHRON ICS销售的体系，以及由ARC Fluid Technologies销售的钻井液添加剂。

加到流体中的生物质可在使用前进行化学修饰。化学修饰涉及共价键的形成或断裂。例如，生物质可通过酯交换、皂化、交联或水解而化学修饰。生物质可通过一种或多种反应性物质处理，以便连接所需的部分。所述部分可以是疏水的、亲水的、两亲的、离子的或两性离子的。例如，可使生物质阴离子化(例如羧甲基化)或乙酰化。包括产油微生物的生物质的羧甲基化和乙酰化的共价修饰方法在相关领域中以引用方式并入本文的2012年3月26日提交的美国临时专利申请号61／615,832“Algal Plastics and Absorbants”中有所公开。美国专利号3,795,670描述了可用于通过与乙酸酐反应而增加生物质疏水性的乙酰化工艺。生物质的羧甲基化可通过用一氯醋酸处理而进行。参见例如美国专利号3,284,441、美国专利号2,639,239、3,723，413、3,345,358、4,689,408、6,765,042和7,485,719，它们公开了用于阴离子化和／或交联的方法。

流体可包含一种或多种添加剂，诸如膨润土、黄原胶、瓜尔胶、淀粉、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚阴离子纤维素、杀生物剂、pH调节剂、聚丙烯酰胺、除氧剂、硫化氢清除剂、起泡剂、破乳剂、腐蚀抑制剂、粘土控制剂、分散剂、絮凝剂、减摩剂、桥堵剂、润滑剂、增粘剂、盐、表面活性剂、酸、降滤失添加剂、气体、乳化剂、密度调节剂、柴油燃料和微泡沫。

可将流体混合或剪切适合得到均匀混合物的次数。

流体可在测试或使用前接受老化。老化可在从静态到动态以及从环境温度(20-25℃)到高温(>250℃)变化的条件下进行。

优选地，通过产油微生物的生物质制备的流体是非牛顿流体。在一个更具体的实施方案中，流体的特征在于假塑性行为。据信，生物质导致从牛顿行为偏离。流体可根据它们对剪切的反应而称为牛顿或非牛顿的。牛顿流体的剪切应力与剪切速率成正比。对于非牛顿流体，粘度随着剪切速率的增加而降低。非牛顿流体行为的一个分类(假塑性行为)是指对钻井液可能所需的一般类型的剪切变稀。已开发了该领域已知的多种数学模型来描述非牛顿流体的剪切应力／剪切速率关系。包括Bingham塑性模型、幂律模型和Herschel-Buckley模型的这些模型在“The Drilling Fluids Processing Handbook，Shale ShakerCommittee of the American Society of Mechanical Engineers eds，GulfProfessional Publishing，2004”中有所描述。另外，参见参考手册，包括可得自Baker Hughes的“Drilling Fluids Reference Manual，2006”。

在一个实施方案中，方法包括将流体与生物质一起用于形成井筒、维护或产生采出液(例如石油、天然气或地热)。本发明的实施方案还提供包括将流体与生物质用于井维修作业的工艺，诸如完井作业、防砂作业、修井作业和水力压裂作业。在一个具体的实施方案中，方法包括钻取井筒，其中钻井液是本发明的钻井液并在钻井时连续再循环到井筒中。

本发明还提供在井筒内进行井维修作业的工艺，其中井维修流体是本发明的钻井液。井维修作业包括例如完井作业、防砂作业、修井作业和压裂充填作业。

测试：使用American Petroleum Institute’s Specification for OilWell Drilling-Fluid Materials，API Spec13A和API出版物“Recommended Practice：Standard Procedure for Field TestingWater-Based(Oil-Based)Drilling Fluids，”API RP13B-1、13B-2和增补物中所示的程序测定了在以下实施例中提及的流体的流变特性。另见API RP13I，Recommended Practice for Laboratory Testing of DrillingFluids。

在这些实施例中，将型号35的Couette型粘度计、

型号ix77的流变仪或Chandler3500LS粘度计用于测量粘度。其他粘度计类型(包括毛细管粘度计或锥板黏度计)适用于测量流体的粘度和流动参数。就通过

粘度计或流变仪进行的测量而言，记录了600、300、200、100、6和3rpm的刻度盘读数。计算了塑性粘度(Pv)和屈服点(YP)。Pv通过从600-rpm读数减去300-rpm读数而确定。YP通过从300-rpm读数减去Pv值而确定。使用粘度计根据标准API推荐实施规程以10秒(初始凝胶)和10分钟凝胶间隔记录了流体的凝胶强度测量值。

使用在API规范13A和API RP13I，Recommended Practice forLaboratory Testing of Drilling Fluids中所述的API静态过滤试验程序测定了在实施例9、10和12-15中提及的通过生物质样品制备的流体的滤失特性。测试在环境温度下进行。将样品置于单层滤纸(诸如Whatman50号或等同滤纸)顶部的压滤槽中。将100psi施加到压滤槽的顶部。对流过滤纸的滤液体积(以立方厘米表示)在7.5分钟的指定时间后和在30分钟时进行了测量。滤液体积越小，流体配方防止滤失就越有效。相似地，滤液体积越小，流体配方表现出的降滤失性就越大。

实施例17描述在120°F下进行的滤失试验的结果。在该实施例中，将样品置于已知质量和长度的陶瓷盘顶部的压滤槽中。将100psi施加到压滤槽的顶部。针对60分钟后发生的瞬时滤失(初滤失量)和总滤失测量了流过陶瓷盘的滤液的体积(以立方厘米表示)。

在某些实施方案中，包含本文所述的产油微生物生物质的流体与不含该生物质的流体相比具有降低的API滤失试验值。示例性的流体根据持续7.5或30分钟的API滤失试验相对于不含产油微生物生物质的对照流体而言可具有大于2、5或10倍的流体滤失降低。作为另外一种选择或除此之外，包含产油微生物生物质的流体如使用Couette型粘度计测量相对于不含该生物质的对照流体而言可具有2倍、5倍、10倍或更大的屈服点增加。作为另外一种选择或除了任何这些特性之外，包含产油微生物生物质的流体如根据通过陶瓷盘过滤器进行的静态滤失试验进行测量相对于不含该生物质的对照流体而言可具有至少2倍的初滤失量降低。作为另外一种选择或除了任何这些特性之外，包含产油微生物生物质的流体如根据通过陶瓷盘进行的静态滤失试验进行测量相对于不含该生物质的对照流体而言可具有至少2倍的总滤失量降低。静态滤失试验可使用具有例如5微米、10微米或20微米孔径的陶瓷盘进行。在某些实施方案中，在持续30分钟或60分钟后在静态滤失试验中测量到了初滤失量或总滤失量的降低。作为另外一种选择或除了任何这些特性之外，包含产油微生物生物质的流体根据通过Couette型粘度计进行的凝胶强度试验相对于不含该生物质的对照流体而言可具有至少2倍的凝胶强度增加。在特定实施方案中，凝胶强度试验进行7.5分钟或30分钟的持续时间。作为另外一种选择或除了任何这些特性之外，在0.01／秒与1000／秒之间的剪切速率下测量时，包含产油微生物生物质的流体在18℃与200℃之间的温度下老化至少16小时后可比老化前具有更高的粘度计算值。

本发明的某些方面和实施方案通过以下实施例阐述。

实施例1

微藻培养以实现高油含量

对微藻株系进行培养以实现按细胞干重计高百分比的油。将冻存细胞在室温下解冻，将500μl细胞加到4.5ml培养基(4.2g／Lk₂HPO₄、3.1g／L NaH₂PO₄、0.24g／L MgSO₄·7H₂O、0.25g／L一水合柠檬酸、0.025g／L CaCl₂2H₂O、2g／L酵母提取物)加2％葡萄糖中，在28℃和搅拌(200rpm)下在6孔板中生长7天。通过在预称重的Eppendorf管中将1ml培养物在14,000rpm下离心5分钟而测定了细胞干重。丢弃培养上清液，将所得的细胞沉淀用1ml去离子水洗涤。将培养物再次离心，丢弃上清液，将细胞沉淀置于-80℃下直至冻结。然后将样品经24小时冻干，并计算了细胞干重。对于培养物中总脂质的测定，取出3ml培养物，使用Ankom***(Ankom Inc.，Macedon，NY)根据制造商的方案进行分析。将样品通过Ankom XT10提取器根据制造商的方案进行溶剂提取。总脂质确定为酸解干燥样品与溶剂提取干燥样品之间的质量差。百分比油细胞干重测量值在下表5中示出。

表5.培养微藻以实现高油含量。

培养原壳小球藻(Chlorella protothecoides)以实现高油含量

通过三种不同的培养基配方以生成具有高油含量的藻类生物质为目标进行了三个发酵过程。第一配方(培养基1)基于Wu et al.(1994Science in China，vol.37，No.3，pp.326-335)所述的培养基并且每升包含：KH₂PO₄，0.7g；K₂HPO₄，0.3g；MgSO₄-7H₂O，0.3g；FeSO₄-7H₂O，3mg；盐酸硫胺素，10μg；葡萄糖，20g；甘氨酸，0.1g；H₃BO₃，2.9mg；MnCl₂-4H₂O，1.8mg；ZnSO₄-7H₂O，220μg；CuSO₄-5H₂O，80μg；和NaMoO₄-2H₂O，22.9mg。第二培养基(培养基2)来源于实施例1中所述的烧瓶培养基并且每升包含：K₂HPO₄，4.2g；NaH₂PO₄，3.1g；MgSO₄-7H₂O，0.24g；一水合柠檬酸，0.25g；脱水氯化钙，25mg；葡萄糖，20g；酵母提取物，2g。第三培养基(培养基3)为混合物并且每升包含：K₂HPO₄，4.2g；NaH₂PO₄，3.1g；MgSO₄-7H₂O，0.24g；一水合柠檬酸，0.25g；脱水氯化钙，25mg；葡萄糖，20g；酵母提取物，2g；H₃BO₃，2.9mg；MnCl₂-4H₂O，1.8mg；ZnSO₄-7H₂O，220μg；CuSO₄-5H₂O，80μg和NaMoO₄-2H₂O，22.9mg。制备了所有三种培养基配方，然后在实验室规模的发酵罐中在121℃下高压灭菌30分钟。在高压灭菌冷却后将无菌葡萄糖加到各容器中。

各发酵罐的接种物为原壳小球藻(Chlorella protothecoides)(UTEX250)，其使用接种发酵罐的培养基和温度条件分两个烧瓶阶段而制备。将各发酵罐用10％(v／v)的对数中期培养物接种。在实验的持续时间中，将三个实验室规模的发酵罐保持在28℃。还在23℃的温度下评价了培养基1中的微藻细胞生长。对于所有发酵罐评价，将pH保持在6.6-6.8，搅拌保持在500rpm，气流保持在1vvm。将发酵培养物培养了11天。生物质蓄积通过750nm的光密度和细胞干重测量。

脂质／油浓度使用直接酯交换通过标准气相色谱方法测定。简而言之，将发酵液与生物质的样品沾到吸墨纸上，然后转移到离心管，在真空炉中在65-70℃干燥1小时。当样品干燥后，将2mL5％H₂SO₄的甲醇溶液加到管中。然后将管子在65-70℃的加热块上加热3.5小时，同时间歇地进行涡旋和超声处理。然后将2ml庚烷加入，将管子用力振摇。将2Ml6％的K₂CO₃加入，将管子用力振荡以混合，然后在800rpm离心2分钟。然后将上清液转移到含有Na₂SO₄干燥剂的GC小瓶中，使用标准气相色谱法运行。油／脂质百分比以细胞干重计。使用以下条件生长的细胞的细胞干重分别为：培养基1，23℃；9.4g／L；培养基1，28℃；1.0g／L；培养基2，28℃；21.2g／L；以及培养基3，28℃；21.5g／L。使用以下条件生长的细胞的脂质／油浓度分别为：培养基1，23℃；3g／L；培养基1，28℃；0.4g／L；培养基2，28℃；18g／L；以及培养基3，28℃；19g／L。使用以下条件生长的细胞按细胞干重计的油百分比分别为：培养基1，23℃；32％；培养基1，28℃；40％；培养基2，28℃；85％；以及培养基3，28℃；88％。

实施例2

培养产油酵母以实现高油含量

酵母菌株粘红酵母(Rhodotorula glutinis)(DSMZ-DSM70398)得自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganism and Cell Culture，Inhoffenstraβe7B，38124Braunschweig，Germany)。将冻存细胞解冻，加到50mLYPD培养基(上述)与1x DAS维生素溶液(1000x：9g／L三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、0.67g／L盐酸硫胺素、0.01g／L d-生物素、0.008氰钴胺、0.02泛酸钙和0.04g／L对氨基苯甲酸)中，在30℃和200rpm搅拌下生长18-24小时，直到OD读数超过5OD(A600)。然后将培养物转移到7-L发酵罐，切换到YP1培养基(8.5g／L无氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮源基础，3g／L硫酸铵，4g／L酵母提取物)与1x DAS维生素溶液。对培养物每天取样两次，并测定了OD(A600)、细胞干重(DCW)和脂质浓度。当培养物达到50g／L以上的DCW时，收获培养物。基于细胞干重，酵母生物质含有大约50％的油。

用于该实施例中的产油酵母菌株得自位于Inhofienstrabe7B，38124Braunschweig，Germany的Deutsche Sammlung vonMikroorganismen un Zellkulturen GmbH(DSMZ)或位于P.O.Box85167，3508Utrecht，the Netherlands的Centraalbureau voorSchimmelscultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre。针对生长速率和脂质产生筛选了一百八十五个产油酵母菌株。

通过将单一集落划线接种到YPD琼脂(添加了2％琼脂的如下所述的YPD培养基)板上而使所有菌株无异种生物混杂。挑取各菌株的YPD板中的单一集落，在摇床中于200rpm和30℃下在YPD培养基(蒸馏水中每1L最终体积10g bacto-酵母提取物、20g bacto-蛋白胨和20g葡萄糖)中生长到对数后期。

对于脂质产量评估，将2mL YPD培养基加到50mL配衡生物反应器管(MidSci，Inc.)，通过各菌株的冷冻储液接种。然后将管子置于30℃的培养箱中，在200rpm振荡下生长24小时，以生成菌种培养物。24小时后，将含有0.1M邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.0)的8mL Y1培养基(无氨基酸的酵母氮源基础，Difco)加入，轻轻吹打混匀。将所得的培养物等分到第二配衡生物反应器管。然后将所得的各5mL的平行培养物置于30℃培养箱中，以200rpm搅拌培养5天。然后针对脂质产量和脂质谱收获细胞。将3mL培养物用于测定细胞干重和总脂质含量(脂质产量)，将1mL用于脂肪酸谱测定。在任一种情况下，将培养物置于管中，在3500rpm下离心10分钟以便沉淀细胞。倾析上清液后，将2mL去离子水加入各管中，并用于洗涤所得的细胞沉淀。将管子在3500rpm下再次离心10分钟以沉淀洗涤的细胞，然后倾析上清液，将细胞沉淀置于-70℃的冷冻机中持续30分钟。接着将管子转移到冻干机中过夜干燥。第二天，记录了锥形管加上得自3mL培养物的干燥生物质的重量，使用Ankom Acid水解***(根据制造商的说明)对所得的细胞沉淀进行了总脂质提取以测定总脂质含量。

在筛选的185个菌株中，基于生长速率和脂质产量选择了30个菌株。这30个菌株的脂质产量(以细胞干重的脂质百分比表示)在下表中汇总。

产油酵母菌株的脂质产量。

实施例3

培养混浊红球菌(Rhodococcus opacus)以实现高油含量

使用在250ml带挡板烧瓶中接种到含4％蔗糖的50ml MSM培养基(参见Schlegel，et a1.，(1961)Arch Mikrobiol38，209-22)的2ml冻存储液生成了混浊红球菌(Rhodococcus opacus)PD630(DSM44193，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuttwen GmbH)的菌种培养物。使菌种培养物在30℃和200rpm搅拌下生长，直到达到600nm下1.16的光密度。将10ml菌种烧瓶用于接种在两种不同氮条件下产生脂质的培养物：10mM NH₄Cl和18.7mM NH₄Cl(均一式两份)。使生长培养物在30℃和200rpm搅拌下生长6天。在10mMNH₄Cl条件中生长的细胞按DCW计在培养6天后达到57.2％(平均)的最高脂质量。在18.7mM NH₄Cl条件中生长的细胞按DCW计在培养5天后达到51.8％(平均)的最高脂质量。

实施例4

由微藻制备废生物质

使用油料种子榨油机从微藻提取油从而产生废生物质的方法在以引用方式并入的PCT申请号PCT／US10／031108中有所描述。简而言之，将含有约66％油(按细胞干重计)的桑椹型无绿藻(Protothecamoriformis)(UTEX1435)滚筒干燥到约2.7％的含水量。将干燥后的生物质随后在垂直堆叠的制热调节机中热调节。热调节后生物质的含水量为约0.6-1.4％。然后将藻类生物质进料到榨笼预热到195-220°F的3.5”油料种子螺旋榨油机(French Oil Mill Company，Piqua OH)。生物质出油良好，具有一定的沉淀物。然后收集废生物质，其适用于本发明的方法。

将含有约38％油(按细胞干重计)的原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)(UTEX250)滚筒干燥到约3％至5％的含水量。将干燥后的生物质随后在垂直堆叠的250°F制热调节机中热调节。然后将藻类生物质进料到榨笼预热到约200°F的3.5”油料种子螺旋榨油机(French Oil Mill Company，Piqua OH)。生物质出油良好，具有一定的沉淀物。然后收集废生物质，其适用于本发明的方法。

通过与5至20％压榨助剂(诸如柳枝稷和大豆皮)合并的干燥微藻生物质类似地生成了废生物质。使用滚筒干燥机以约3.5％的所得含水量(如通过水分分析仪测得)对按DCW计含有38％油的微藻生物质(原壳小球藻(Chlorella protothecoides)UTEX250)进行了干燥。将5％至20％(w／w)的干燥柳枝稷或大豆皮与滚筒干燥的微藻生物质合并。然后以如上所述的类似条件在垂直堆叠的制热调节机中对生物质进行热调节。将热调节后的生物质随后进料到主机筒(或榨笼)直径为3.5英寸的L-250(3.5”直径)French中试油料种子螺旋榨油机(French Oil Mill Machinery Company，Piqua，Ohio)。将榨笼和轴通过使用间接蒸汽预热到180°F与260°F之间。生物质出油良好，具有一定的沉淀物。收集废生物质(其含有添加的干燥柳枝稷或大豆皮)，其适用于本发明的方法。

实施例5

通过机械提取由产油酵母制备废生物质

酵母菌株粘红酵母(Rhodotorula glutinis)(DSMZ-DSM70398)得自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(German Collection of Microorganism and Cell Culture，Inhoffenstraβe7B，38124Braunschweig，Germany。将冻存细胞解冻，加到50mL YPD培养基(上述)与1x DAS维生素溶液(1000x：9g／L三(羟甲基)甲基甘氨酸、0.67g／L盐酸硫胺素、0.01g／L d-生物素、0.008氰钴胺、0.02泛酸钙和0.04g／L对氨基苯甲酸)中，在30℃和200rpm搅拌下生长18-24小时，直到OD读数超过5OD(A600)。然后将培养物转移到7-L发酵罐，切换到YP1培养基(8.5g／L无氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮源基础，3g／L硫酸铵，4g／L酵母提取物)与1x DAS维生素溶液。对培养物每天取样两次，并测定了OD(A600)、细胞干重(DCW)和脂质浓度。当培养物达到50g／L以上的DCW时，收获培养物。基于细胞干重，酵母生物质含有大约50％的油。

将收获的酵母培养液用三种不同的方法进行干燥以便进行比较：(1)在75℃的强制送风烘箱中托盘干燥过夜；(2)在滚筒干燥机上无浓缩干燥；以及(3)将酵母发酵液浓缩到22％的固体，然后将浆液在滚筒干燥机上干燥。将得自三种不同干燥条件每一种的材料进行热调节，然后进料到螺旋榨油机以提取油。榨油机温度为150°F，将经调节的干燥酵母生物质保持在约190°F，直到可以进料到榨油机。

托盘干燥酵母的含水量为1.45％，然后将干燥的酵母在90℃的烘箱中调节10分钟。调节后的含水量为0.9％。然后将调节过的托盘干燥材料进料到台式Taby螺杆榨油机(Taby Pressen70型榨油机，配2.2Hp电机和70mm直径螺杆)以提取油。该材料未产生大量的油，通过榨油机未观察到重沉淀物。

无浓缩滚筒干燥的酵母发酵液的含水量为5.4％，然后将滚筒干燥的酵母在90℃的烘箱中调节20分钟。调节后的含水量为1.4％。然后将经调节的滚筒干燥酵母进料到台式Taby螺杆榨油机以提取油。该材料出油良好，有微量沉淀物。

滚筒干燥的浓缩酵母发酵液的含水量为2.1％，然后将滚筒干燥的浓缩酵母在90℃的烘箱中调节20分钟。调节后的含水量为1.0％。然后将经调节的滚筒干燥浓缩酵母进料到台式Taby螺杆榨油机以提取油。该材料出油良好，有微量沉淀物，产生了适于用作降滤失剂的废生物质。

实施例6

干燥产油细菌并从中提取油

根据实施例1中的方法培养了产油细菌菌株混浊红球菌(Rhodococcus opacus)PD630(DSMZ-DSM44193)以产生按DCW计含有约32％脂质的产油细菌生物质。

将收获的混浊红球菌(Rhodococcus opacus)发酵液离心浓缩，然后用去离子水洗涤，再重悬在1.8L去离子水中。将50克经纯化的纤维素(PB20-Pre-co-Floc，EP Minerals，Nevada)加到重悬的生物质中，将总固体用去离子水调至20％。然后将红球菌(Rhodococcus)生物质在滚筒干燥机上干燥，滚筒干燥后红球菌(Rhodococcus)的含水量为约3％。

然后在130℃的烘箱中将滚筒干燥的材料热调节30分钟，所得的含水量为约1.2％。将热调节后的生物质随后进料到台式Taby榨油机(螺杆榨油机)以提取油。榨油机温度为209°F，将经调节的干燥酵母生物质保持在约240°F，直到可以进料到榨油机。油回收伴有重沉淀物，从而产生适用于本发明组合物的废生物质。

实施例7

废生物质分析

使用标准AOAC方法使根据上述方法生成的桑椹型无绿藻(Protothecd moriformis)(UTEX1435)的废生物质接受近似分析。结果为：4.21％水分、8.9％粗蛋白、9.01％脂肪(通过酸解)、7.11％灰分，无可检测水平的非蛋白氮。还使用标准方法使废生物质接受了氨基酸谱分析。归一化氨基酸分布如下：甲硫氨酸(3.19)、胱氨酸(2.64)、赖氨酸(1.81)、苯基丙氨酸(4.86)、亮氨酸(9.03)、异亮氨酸(4.31)、苏氨酸(6.25)、缬氨酸(5.97)、组氨酸(1.67)、精氨酸(5.00)、甘氨酸(5.83)、天冬氨酸(8.61)、丝氨酸(7.08)、谷氨酸(11.25)、脯氨酸(6.11)、羟脯氨酸(3.61)、丙氨酸(8.75)、酪氨酸(3.33)和色氨酸(0.69)。

使得自原壳小球藻(Chlorella protothecoides)(UTEX250)的干燥生物质接受了一系列解析分析。将通过HPLC测定80％乙醇可溶性提取物的水溶液的糖包括在解析分析中。分析了四批不同的干燥生物质，并与蔗糖、葡萄糖和果糖标准品进行了比较。在所有四个批次中，只检出了以下百分比的蔗糖：5.47％、4.72％、7.35％和4.86％。

使用AOAC方法985.29和911.43对含有30-40％脂质(按细胞干重计)或45-46％蛋白的干燥生物质进行了纤维含量分析。在含有30-40％脂质(按细胞干重计)的生物质中，检测到了4.70-6.51％不溶性纤维、20.68％-32.02％可溶性纤维和27.19-36.72％总膳食纤维。在含有45-46％蛋白的生物质中，检测到了22.73-23.44％不溶性纤维、6.82-9.85％可溶性纤维和30.26-32.57％总膳食纤维。然后使干燥的生物质接受了进一步的单糖分析。通过生物质气相色谱法测定糖的酸溶性水解产物以及通过对得自生物质的不溶性和可溶性膳食样品的气相色谱法测定糖的结果在下面汇总。对于生物质样品，糖作为多羟糖醇乙酸酯衍生物测定，在存在于提取材料中的碳水化合物聚合物中发现了单糖。除了下表7列出的单糖外，还检测到了大量未鉴定的非中性糖。

表7.糖的测定

使得自原壳小球藻(Chlorella protothecoides)(UTEX250)的脱脂藻类生物质接受了80％乙醇处理，然后分析了碳水化合物百分比。该分析的结果汇总如下：

实施例8：制备微藻生物质

根据实施例4、实施例7中给出的以及在PCT申请号PCT／US10／031108中详细描述的方法通过培养专性异养生物桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)(UTEX1435)制备了干燥的废微藻生物质。使含有2-10％油的干燥的废桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)(UTEX1435)生物质在包含在液体制备物中之前接受了多种物理操作。

通过首先用锤子敲碎然后在球磨机中研磨的生物质制备了实施例9-14中所述的废微藻生物质。所得的研磨材料经美国标准检验筛No.100筛(150微米)过筛。将小于150微米的研磨生物质粒子用于液体制备物。将大于150微米的生物质粒子再次研磨，直到达到小于150微米的粒度。

通过首先在Waring混碎机中研磨的废微藻生物质制备了含有实施例15和16中所述的微藻生物质的流体。所得的研磨材料经美国标准检验筛No.40筛(425微米)过筛。将小于425微米的研磨生物质粒子用于液体制备物。

实施例9：通过KCI和微藻生物质制备的流体的流变性和API滤失测量

在该实施例中，评价了含有实施例8的废桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)(UTEX1435)生物质的水基流体的流变性和滤失性。通过混合350mL水、2％KCl(w／v)、0.15％黄原胶(w／v)、如表9所示类型和百分比(w／v)的油田化学品以及如表8所示类型和百分比(w／v)的干燥废微藻生物质制备了样品流体组合物A-L。油田化学品包括羧甲基纤维素(CMC)、淀粉或膨润土。使样品达到8.0-9.0的最终pH。记录在表9中的流变性测量使用35型粘度计以指定的rpm进行。API滤失试验在环境温度下进行。对于各样品A-L，在7.5分钟和30分钟后流过过滤器的流体体积在表9中指出。

表8.水基流体中生物质的类型和量

表9.对含有微藻生物质的水基流体进行的API滤失和流变性测量

表9中所示的数据证实通过微藻生物质制备的水基流体样品的降滤失性随着微藻生物质浓度的升高而改善。将微藻生物质百分比从0.25％(样品A)增至3.0％(样品C)导致了滤失在7.5分钟时从180ml降至16ml并在30分钟时从189ml降至18ml，滤失降低量>10倍。与仅通过用大豆皮压榨的0.25％废微藻生物质制备的比较性流体样品相比，通过CMC以及用大豆皮压榨的3.0％废微藻生物质制备的水基流体样品展示出7.5分钟时>30倍的滤失降低和30分钟时>20倍的流体降低(对样品B与D进行比较)。这些数据证实添加废微藻生物质改善了降滤失性并使包含油田化学品的水基流体的滤失性降低。

实施例10：通过海水和微藻生物质制备的流体的流变性和API滤失测量

在该实施例中，评价了含有实施例8的废桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)生物质的海水基流体的流变性和滤失性。通过混合350mL海水、0.15％黄原胶(w／v)、如表11所示类型和百分比(w／v)的油田化学品以及如表10所示类型和百分比(w／v)的干燥废微藻生物质制备了样品A-L。油田化学品包括羧甲基纤维素(CMC)、淀粉或膨润土。使样品达到8.0-9.0的最终pH。记录在表11中的流变性测量使用

35型粘度计以指定的rpm进行。API滤失试验在环境温度(20-25℃)下进行。对于各样品A-L，在7.5分钟和30分钟后流过过滤器的流体体积在表11中指出。

表10.海水基流体中生物质的类型和浓度

表11.对含有微藻生物质的海水基流体进行的API滤失和流变性测量

表11中所示的数据证实通过微藻生物质制备的海水基流体样品的降滤失性随着微藻生物质浓度的升高而改善。将微藻生物质从0.25％(样品A)增至3.0％(样品C)导致了滤失在7.5分钟时从285ml降至13ml并在30分钟时从292ml降至17ml，滤失降低量>17倍。与仅通过用大豆皮压榨的0.25％废微藻生物质制备的比较性流体样品相比，通过CMC以及用大豆皮压榨的3.0％废微藻生物质制备的海水基流体样品展示出7.5分钟时>9倍的滤失降低和30分钟时>8倍的流体降低(对样品B与D进行比较)。这些数据证实添加废微藻生物质改善了降滤失性并使包含油田化学品的海水基流体的滤失降低。

实施例11.温度对通过KCl和微藻生物质制备的流体的流变性的作用

在该实施例中，研究了温度对含有实施例8的废桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)(UTEX1435)生物质的水基流体的流变特性的影响。流体通过混合350mL水、2％KCl(w／v)、0.15％黄原胶(w／v)和4％(w／v)干燥的废微藻生物质而制备。然后将样品从60℃加热至140℃，在140℃保持30分钟，然后冷却到60℃。使用

ix77型流变仪在表12所示的温度和rpm下进行的流变性测量沿着温度梯度以20℃的增量对样品进行。所得的数据在表12中示出。

表12.温度对含有微藻生物质的水基流体的流变性的影响。

加热制得的流体的结果是其流变值降低。塑性粘度和屈服点均随着温度的升高而降低。各温度的流变值在温度反转时更低，但是当流体从120℃冷却到60℃时显示出渐增的稳定性。

实施例12：通过KCl和微藻生物质制备的流体的流变性和API滤失测量

在该实施例中，评价了含有实施例8的废桑椹型无绿藻(Protothecd moriformis)(UTEX1435)生物质的水基流体的流变性和降滤失性。样品流体组合物A-F各自通过混合以下成分而制备：350mL水、2％KCl(w／v)、0.15％黄原胶(w／v)以及如表13所示百分比(w／v)的干燥废微藻生物质(范围从0.3％至4％)。使样品达到8.0-9.0的最终pH。

使用

35型粘度计以指定的每分钟转速对各样品进行的流变性测量在表13中给出。由粘度计读数确定了塑性粘度和屈服点计算值。表13中给出的各样品的凝胶强度在10秒和10分钟的孵育期后在3rpm下测得。还使各样品在环境温度下接受了API滤失试验。对于各样品，在7.5分钟和30分钟后流过过滤器的流体体积在表13中报告。

表13.对含有微藻生物质的水基流体进行的流变性测量、凝胶强度和滤失测量

制得的流体的塑性粘度和屈服点随着添加的微藻生物质量的增加而增大。

制得的流体的凝胶强度随着添加的微藻生物质百分比含量的增加而增大。含有3％或4％生物质的流体的10秒和10分钟凝胶强度读数均大于含有更低量生物质的流体。增加制得的流体中的生物质导致了10秒和10分钟孵育期后凝胶强度的增加，但是对于给定浓度的生物质，10秒和10分钟凝胶的凝胶强度相对无变化。

滤失显示出随着废微藻生物质的浓度升高而降低的趋势。当加到流体中的微藻生物质的量增加时，观察到了滤失的降低。表13中所示的数据证实废微藻生物质增加流体粘度和凝胶强度并改善降滤失性。

实施例13：通过微藻生物质和油田化学品制备的水基流体的流变性和API滤失研究

在该实施例中，研究了含有实施例8的废桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)(UTEX1435)生物质和不同的油田化学品的水基流体的粘度、凝胶强度和降滤失性。样品流体组合物A-N各自通过混合350mL水、2％KCl(w／v)、如表15所示类型和百分比浓度(w／v)的油田化学品以及如表14所示百分比浓度(w／v)的干燥废微藻生物质而制备。在该实施例中测试的油田化学品为羟乙基纤维素(HEC)、黄原胶(XG)、聚丙烯酰胺(PA)、瓜尔胶、低取代度羧甲基纤维素(CMC)(LDS-CMC)、高取代度CMC(HDS-CMC)和膨润土。使样品达到8.0-9.0的最终pH。

使用

35型粘度计以指定的每分钟转速对各样品测得的流变性测量值在表15中给出。由粘度计读数确定了塑性粘度和屈服点计算值。表15中所示的凝胶强度在10秒和10分钟孵育期后在3rpm下测得。还使各样品在环境温度(20-25℃)下接受了API滤失试验。对于各样品A-N，在7.5分钟和30分钟后流过过滤器的流体体积在下表15中指出。

表14.用于水基流体的微藻生物质的百分比(w／v)

表15.通过微藻生物质和油田化学品制备的水基流体的流变特性、凝胶强度和API滤失测量值

向水基流体中增添微藻生物质增加了含有所测试油田化学品的流体的塑性粘度。向水基流体增添微藻生物质增加了通过HEC、XG、瓜尔胶、LDS-CMC或HDS-CMC制备的水基流体的屈服点。随着微藻生物质浓度从0.4％增至4％，在含有HEC的水基流体中观察到了>10倍的Pv和YP增加。随着微藻生物质浓度从0.4％增至4％，在含有黄原胶的水基流体中观察到了>10倍的YP增加。随着微藻生物质浓度从0.4％增至4％，在含有瓜尔胶的水基流体中观察到了3倍的YP增加。随着微藻生物质浓度从0.4％增至4％，在含有PA或膨润土的水基流体中观察到了YP降低。微藻生物质的增加对含有LDS-CMC或HDS-CMC的水基流体的凝胶强度无影响。

向水基流体增添微藻生物质增加了通过HEC、XG和瓜尔胶制备的流体的凝胶强度。随着微藻生物质的浓度从0.4％增至4％，含有HEC或XG的水基流体表现出2倍或更高的凝胶强度增加。随着微藻生物质的浓度从0.4％增至4％，含有瓜尔胶的水基流体表现出33％的凝胶强度增加。在含有PA或膨润土的水基流体中微藻生物质浓度从0.4％增至4％的结果是凝胶强度的降低。

向水基流体增添微藻生物质增强了通过API滤失试验测试的含油田化学品的流体的降滤失性。随着微藻生物质的浓度从0.4％增至4％，30分钟后，在含有PA或HDS-CMC的水基流体中观察到了>10倍的滤失降低。微藻生物质的浓度从0.4％增至4％对含有瓜尔胶的水基流体的降滤失性的结果是几乎完全无滤失。对于包含瓜尔胶和0.4％废微藻生物质的样品G，所有测试的流体均在不到6分钟内流过了过滤器(如表15中通过(*)所示)。包含瓜尔胶和4.0％废微藻生物质的样品H在7.5分钟和30分钟后分别只表现出4.5ml和7.0ml的滤失。

这些数据证实，添加废微藻生物质改善了降滤失性并降低了含有油田化学品的水基流体的滤失。另外，这些数据表明使用微藻生物质适于作为钻井液中的降滤失添加剂。

实施例14：通过微藻生物质和油田化学品制备的水基流体的流变性和API滤失研究

在该实施例中，研究了含有实施例8的废桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)(UTEX1435)生物质和不同的油田化学品的水基流体的粘度、凝胶强度和降滤失性。样品流体组合物A-S各自通过混合350mL水、2％KCl(w／v)、如表16所示类型和百分比(w／v)的油田化学品以及如表16所示百分比(w／v)的干燥废微藻生物质而制备。在该实施例中测试的油田化学品为黄原胶(XG)、聚丙烯酰胺(PA)、聚阴离子纤维素(PAC)、淀粉和膨润土。使样品达到8.0-9.0的最终pH。

使用

35型粘度计以指定的每分钟转速对各样品测得的流变性测量值在表17中给出。由粘度计读数确定了塑性粘度和屈服点计算值。表17中所示的凝胶强度在10秒和10分钟孵育期后在3rpm下测得。还使各样品在环境温度(20-25℃)下接受了API滤失试验。对于各样品A-S，在7.5分钟和30分钟后流过过滤器的流体体积在下表17中指出。

表16.用于水基流体的微藻生物质和油田化学品的百分比(w／v)

表17.通过微藻生物质和油田化学品制备的水基流体的流变特性、凝胶强度和API滤失测量值

实施例15：温度对通过微藻生物质和除氧剂制备的水基流体的流变性和滤失的作用

在该实施例中，研究了温度对含有实施例8的废桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)(UTEX1435)生物质和除氧剂的水基流体的流变性和降滤失性特性的作用。流体通过混合350mL水、2％KCl(w／v)、0.15％黄原胶(w／v)、4％(w／v)干燥的废微藻生物质和75ppm的除氧剂而制备。将流体调至8.0-9.0的最终pH。在30分钟120℃热处理前后流体的环境温度流变特性、凝胶强度和滤失特性在表18中示出。

表18.热处理对通过废微藻生物质和除氧剂制备的水基流体的流变特性、凝胶强度和API滤失特性的影响

30分钟120℃热处理对流体流变特性的结果是粘度的略微降低。然而，流体的塑性粘度不受影响。热处理后的流体保持了其屈服点的89％。在热处理时，流体凝胶强度增加。滤失特性未因热处理而明显变化。这些数据表明通过4％废微藻生物质和75ppm除氧剂制备的流体的环境温度流变性、凝胶强度和滤失特性在120℃热暴露时是稳定的。

实施例16：包含各种量的废微藻生物质的水基流体的滤失特性

在该实施例中，研究了含有实施例8的废桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)生物质和黄原胶的水基流体在120°F(48.9℃)的降滤失特性。样品流体组合物A-H各自通过在水中混合如表19所示类型和百分比(w／v)的盐水盐、如表19所示百分比(w／v)的废微藻生物质和0.15％w／v的黄原胶而制备。将Kelco

黄原胶用于该实施例中所述流体的制备。在混合时，将流体在表19、20和21所示温度下老化16小时，然后接受静态滤失分析。静态滤失试验在孔径为5、10或20微米的陶瓷盘上进行。对陶瓷盘预称重，在使用前浸泡在盐水中。滤失试验在120°F和100-psi差压下进行1小时或直至达到最大滤失。初滤失(在最初施加流体时流过陶瓷盘的流体)以及总滤失(在1小时后流过陶瓷盘的流体)以毫升报告。滤饼重量、初滤失和总滤失的测量值在表20、表21和表22中示出。

表19.加到水基流体中的材料的类型和百分比(w／v)

表20.老化温度对包含KCl和各种百分比的废微藻生物质的水基流体的滤失特性的作用

于当接受静态过滤器测试时相对于不含产油微藻生物质的流体而言滤饼重量的增加和总滤失的降低。当在120°F老化时，样品B(其含有2％w／v的废微藻生物质)表现出相对于样品A(不含废微藻生物质)在5微米过滤器上>5倍的滤失降低以及在10微米过滤器上>3倍的滤失降低。

表21.包含NaCl和各种百分比的废微藻的水基流体的滤失特性

如表21所示，包含废产油微藻生物质的流体的特征在于当接受静态过滤器测试时相对于不含产油微藻生物质的流体而言滤饼重量的增加、初滤失的降低以及总滤失的降低。当在120°F老化时，样品E(其分别含有2％w／v的废微藻生物质)表现出相对于在120°F下老化的样品C(不含废微藻生物质)在5微米过滤器上>7倍的滤失降低以及在10微米过滤器上>3倍的滤失降低。含有1％(w／v)废产油微藻生物质的样品D在接受使用5微米和10微米孔径陶瓷过滤器的静态过滤器测试时表现出了中等初滤失和总滤失值。

表22.包含NaBr和各种百分比的废微藻生物质的水基流体的滤失特性

如表22所示，包含废产油微藻生物质的流体的特征在于当接受静态过滤器测试时相对于不含产油微藻生物质的流体而言滤饼重量的增加、初滤失的降低以及总滤失的降低。当在120°F老化时，样品H(其分别含有2％w／v的废微藻生物质)表现出相对于在120°F下老化的样品F(不含废微藻生物质)在5微米过滤器上>5倍的滤失降低以及在10微米过滤器上>4倍的滤失降低。含有1％(w／v)废产油微藻生物质的样品G在接受使用5微米孔径陶瓷过滤器的静态过滤器测试时表现出了中等初滤失和总滤失值。

这些数据证实添加废微生物生物质降低了含有油田化学品的流体的滤失和初滤失。

实施例17：包含各种百分比的废微藻生物质的水基流体的流变特性

在该实施例中，研究了含有实施例8的废桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)(UTEX1435)、黄原胶和盐的水基流体在120F(48.9C)的流变特性。样品流体组合物A-H各自通过在水中混合如表19所示类型和百分比(w／v)的盐水盐(参见实施例16)、如表19所示百分比(w／v)的废微藻生物质和0.15％的黄原胶而制备。将Kelco

黄原胶用于该实施例中所述流体的制备。在混合时，将流体加热到120°F，然后使用Chandler3500LS粘度计分析了流变特性。将流体在表23、24和25所示的温度下老化16小时，然后接受了流变测量。表23、24和25列出了这些流变测试的结果。

表23.老化温度对包含KCl和各种百分比的废微藻生物质的水基流体的流变特性的作用

如表23所示，含有2％w／v废产油微藻生物质的样品B相对于不含产油微藻生物质的样品A的特征在于当老化温度从120°F增至325°F在1秒^-1、10秒^-1和100秒^-1剪切速率下测得的粘度计算值增加。此外，样品B相对于样品A的特征在于当老化温度从120°F增至325°F时流性指数(n’)降低。

表24.包含NaCl和各种百分比的废微藻生物质的水基流体的流变特性

如表24所示，包含废产油微藻生物质的流体相对于不含产油微藻生物质的对照流体的特征在于在1秒^-1、10秒^-1和100秒^-1的剪切速率下测得的粘度计算值的增加。在120°F下老化时，包含2％w／v废产油微藻生物质的样品E的特征在于在1秒^-1、10秒^-1和100秒^-1的剪切速率下测得的粘度计算值增加，而样品C在120°F老化时表现出在测试的所有剪切速率下粘度计算值均降低。

表25.包含NaBr和各种百分比的废微藻生物质的水基流体的流变特性

如表25所示，包含废产油微藻生物质的流体相对于不含产油微藻生物质的对照流体的特征在于在1秒^-1、10秒^-1和100秒^-1的剪切速率下测得的粘度计算值的增加。在120°F下老化时，分别包含包1％和2％w／v废产油微藻生物质的样品G和H的特征在于在1秒^-1、10秒^-1和100秒^-1的剪切速率下测得的粘度计算值增加，而样品F在120°F老化时表现出在1秒^-1的剪切速率下粘度计算值降低。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于示例性目的，并且本领域的技术人员将想到对其作出各种修改或更改，而这些修改或更改将落在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。

Claims

1.一种用于形成或维护钻孔或井或者从钻孔或井进行生产的流体，所述流体包含来自产油微生物的生物质。

2.根据权利要求1所述的流体，其中所述生物质起到桥堵剂、降滤失剂、粘度调节剂、乳化剂、润滑剂或密度调节剂的作用。

3.根据权利要求1所述的流体，其中所述流体包含水性或非水性溶剂并任选地包含一种或多种另外的组分，使得所述流体可作为钻井液、钻开液、修井液、解卡液、固井液、储层流体、采出液、水力压裂流体或完井液。

4.根据权利要求1至3任一项所述的流体，其中所述产油微生物选自微藻、酵母、真菌和细菌。

5.根据权利要求1至4任一项所述的流体，其中所述微生物生物质包括完整细胞、裂解细胞、完整细胞与裂解细胞的组合、从中去除了油的细胞或来自所述产油微生物的多糖。

6.根据权利要求1至5任一项所述的流体，其中对所述微生物生物质进行化学修饰。

7.根据权利要求6所述的流体，其中所述化学修饰包括疏水、亲水、阴离子和阳离子部分的共价连接。

8.根据权利要求7所述的流体，其中所述微生物生物质通过选自以下的一种或多种化学反应而化学修饰：酯交换、皂化、交联、阴离子化、乙酰化和水解。

9.根据权利要求8所述的流体，其中所述阴离子化为羧甲基化。

10.根据权利要求1至9任一项所述的流体，其中所述微生物生物质为所述流体的约0.1重量％至约20重量％。

11.根据权利要求1至10任一项所述的流体，所述流体还包含选自以下的一种或多种添加剂：膨润土、黄原胶、瓜尔胶、淀粉、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚阴离子纤维素、杀生物剂、pH调节剂、除氧剂、起泡剂、破乳剂、腐蚀抑制剂、粘土控制剂、分散剂、絮凝剂、减摩剂、桥堵剂、润滑剂、增粘剂、盐、表面活性剂、酸、降滤失添加剂、气体、乳化剂、密度调节剂、柴油燃料和微泡沫。

12.根据权利要求11所述的流体，其中所述流体包含浓度为所述流体约0.001质量％至5质量％的平均直径为5至50微米的微泡沫。

13.根据权利要求1至12任一项所述的流体，其中所述生物质通过所述产油微生物的干燥、压榨和溶剂提取油的一者或多者而产生。

14.根据权利要求1至13任一项所述的流体，其中所述生物质通过所述产油微生物的异养生长产生。

15.根据权利要求14所述的流体，其中所述产油微生物为专性异养生物。

16.根据权利要求15所述的流体，其中所述产油微生物为桑椹型无绿藻(Prototheca moriformis)。

17.根据权利要求1至16任一项所述的流体，其中所述流体与不含所述生物质的流体相比具有API滤失试验降低。

18.根据以上权利要求任一项所述的流体，其中所述流体的特征在于根据持续7.5或30分钟的API滤失试验相对于不含产油微生物生物质的对照流体而言大于2、5或10倍的流体滤失降低。

19.根据以上权利要求任一项所述的流体，其中所述流体的特征在于如使用Couette型粘度计测量相对于不含产油微生物生物质的对照流体而言屈服点增加2倍、5倍、10倍或更大。

20.根据以上权利要求任一项所述的流体，其中所述流体的特征在于根据通过陶瓷盘式过滤机进行的静态滤失试验测量相对于不含产油微生物生物质的对照流体而言初滤失量减少至少2倍。

21.根据以上权利要求任一项所述的流体，其中所述流体的特征在于根据通过陶瓷盘进行的静态滤失试验测量相对于不含产油微生物生物质的对照流体而言总滤失量减少至少2倍。

22.根据权利要求20或21所述的流体，其中所述静态滤失试验通过具有选自5微米、10微米和20微米的孔径的陶瓷盘进行。

23.根据权利要求21或22所述的流体，其中所述总滤失在持续30分钟或60分钟后进行测量。

24.根据以上权利要求任一项所述的流体，其中所述流体的特征在于根据通过Couette型粘度计进行的凝胶强度试验相对于不含产油微生物生物质的对照流体而言凝胶强度增加至少2倍。

25.根据权利要求24所述的流体，其中所述凝胶强度试验进行选自7.5分钟和30分钟的持续时间之一。

26.根据以上权利要求任一项所述的流体，其中所述流体的特征在于当在0.01／秒与1000／秒之间的剪切速率下测量时，在18℃与200℃之间的温度下老化至少16小时后比老化前的粘度计算值更高。

27.一种形成井筒或维护井或由井产生采出液的方法，所述方法包括引入根据以上权利要求任一项所述的流体。

28.根据权利要求27所述的方法，包括使用所述流体进行井维修作业，所述井维修作业选自：完井作业、防砂作业、修井作业和水力压裂作业。

29.根据权利要求27所述的方法，包括通过操作钻具组合钻出井筒同时穿过所述井筒循环钻井液而穿过地层钻出井筒。

30.根据权利要求27至29任一项所述的方法，其中所述生物质堵住井筒或井中的孔。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述生物质为钻具组合的钻头提供润滑。

32.根据权利要求28所述的方法，其中所述生物质增加所述流体的粘度。

33.一种刺激从井中的产甲烷微生物产生甲烷的方法，包括将通过培养产油微生物而产生的生物质引入所述井中。