CN101596308B

CN101596308B - Itgb4bp及其衍生物用于预防和/或治疗增生性瘢痕及纤维化病变

Info

Publication number: CN101596308B
Application number: CN2009100840291A
Authority: CN
Inventors: 吴军; 谭江琳; 罗高兴; 贺伟峰; 彭旭
Original assignee: CHONGQING XI'NAN HOSPITAL
Current assignee: CHONGQING XI'NAN HOSPITAL
Priority date: 2009-05-13
Filing date: 2009-05-13
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2029-05-13
Also published as: CN101596308A; WO2010130073A1

Abstract

本发明涉及β4整合素结合蛋白(ITGB4BP)及其衍生物，或表达ITGB4BP及其衍生物的基因重组表达载体，在预防和/或治疗增生性瘢痕或纤维化病变中的新应用，其中ITGB4BP的氨基酸序列为SEQ ID NO 1，并且所述ITGB4BP衍生物是保留ITGB4BP(SEQ ID NO 1)的结合部位和功能部位的蛋白衍生物。所述应用通过向受试者施用治疗有效量的ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体、或本发明的药物组合物或试剂盒而实现。其中所述药物组合物或试剂盒包括治疗有效量的ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体，和药用赋形剂或载体等。优选地，所述受试者是人或动物。

Description

ITGB4BP及其衍生物用于预防和/或治疗增生性瘢痕及纤维化病变

技术领域

本发明涉及已知物质的新药用用途。具体地，本发明涉及β4整合素结合蛋白(Integrin beta 4binding protein，ITGB4BP)及其衍生物，表达ITGB4BP及其衍生物的基因重组表达载体，在预防和/或治疗增生性瘢痕及纤维化病变中的新应用。

背景技术

纤维化疾病是由于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)如胶原等过度沉积而导致组织增生、***及瘢痕形成的的一类病变。持续的感染、自身免疫性疾病、过敏反应、化学损伤、辐射和组织损伤等慢性炎症长期刺激导致成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，造成大量***沉积形成纤维化，从而导致器官功能丧失直至死亡(1-3)。增生性瘢痕是纤维化疾病的一种，是由于深部真皮受到热力或者其它形式创伤后，纤维增生紊乱导致，常常引起患者美观和功能上的严重损害(4)。在进行增生性瘢痕成纤维细胞分化的机制研究中我们发现P311基因(GenBank ID：hsu36189)与其有着密切的联系(5)，但其具体机制如何，文献却鲜有报道。

P311(又名PTZ17，pentylenetetrazol 17)的编码基因由Matthieu等于1993年首先在胚胎大鼠的脑组织中发现(6)。P311基因定位于5号染色体ORF13，其完整的基因全长约为2025bp，包含3个开放阅读框，但仅第一个阅读框编码含68个氨基酸的蛋白P311，分子量大小为8KD，该阅读框在人和小鼠之间高度保守。此外，在人、小鼠和鸡P311的N末端还存在一个高度保守的PEST结构域(富含Pro，Glu，Ser和Thr的区域)(7)。P311广泛表达于多种组织，其中在脑组织尤其是胚胎发育后期的大脑组织与成年期的小脑、海马和嗅球中高表达，同时也表达于肝、脾、肾、眼、心等器官与骨髓间充质、成纤维细胞、肌成纤维细胞等组织细胞(6)，而且Pan与Fujitani、Taylor等还分别证实该蛋白能表达于肌成纤维细胞、神经细胞的胞浆与胞核中。P311是机体的一种具有重要生物学作用的细胞因子，参与体内细胞分化、调节其它蛋白/基因转录、创伤修复、肿瘤发生等多种正常或异常的生物学活动(6-9)。

我们利用酵母双杂交技术筛选了成人肝cDNA文库(美国BD Clontech公司)中能与P311相互作用的蛋白的编码序列，经过生物信息学分析、回复性验证和激光共聚焦共定位检测后获得了一个目的基因，其编码的蛋白是：β4整合素结合蛋白(Integrin beta 4binding protein，ITGB4BP，SEQID NO 1)(10)。研究提示该蛋白在细胞骨架形成及细胞凋亡中起着重要的作用，并可能在增生性瘢痕成纤维细胞分化过程中发挥了重要作用。以下就国内外该蛋白相关功能研究进行综述。

1. ITGB4BP基本特征

1.1 ITGB4BP的编码基因：

Francesca Sanvito等于1998年通过荧光原位杂交技术发现ITGB4BP基因(SEQ ID NO 2，NCBI genebank登记号为NM-002212)定位于20号染色体的长臂20q11.2区，其mRNA全长1108bp，其开放读框含有735个核苷酸(11)。ITGB4BP基因有7个外显子和6个内含子，该基因的5’端缺少TATA启动子结合区，CpG岛(12)。ITGB4BP基因在真核细胞中序列保守，在哺乳动物和酵母中有72％同源性，其中有85％序列相似(13)。ITGB4BP基因除了在人、小鼠、大鼠、非洲爪蟾等脊椎动物中发现外，在果蝇、乌贼、软疣等非脊椎动物上也发现该基因的存在，并且该基因的结构域在哺乳动物及非脊椎动物之间高度保守(14)。

1.2 ITGB4BP编码蛋白：

ITGB4BP蛋白(SEQ ID NO 1，Swiss-Prot：P56537.1，[GI：3122258])也称EIF6、p27BBP、CAB、EIF3等，由Biffo等于1997年发现，Biffo等运用酵母双杂交技术研究整合素β4与半桥粒形成上的联系时，发现一个蛋白与β4有相互作用，故而命名为β4整合素结合蛋白(Integrin beta 4binding protein，ITGB4BP)。ITGB4BP蛋白含有245个氨基酸，分子量大小为27kd(15)。该蛋白在蛋白激酶C的作用下，通过磷酸化/去磷酸化介导信号的传导，但其具体机制尚不清楚(12、16)。现有的文献资料中对ITGB4BP的研究主要集中在ITGB4BP与细胞骨架形成、癌细胞分化、蛋白合成和迁移中。

1.3 ITGB4BP的表达和分布：

ITGB4BP蛋白分布广泛，可以表达在不同的组织，或者同一组织不同细胞，或者同一细胞不同周期。研究证实，在上皮细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、激活的T细胞、活化的肥大细胞及肌肉组织纤维中均有ITGB4BP蛋白的表达，也有研究证实只要表达α6β4整合素的细胞均表达ITGB4BP(17)。ITGB4BP蛋白表达在胞浆(中间丝附近)和胞核(主要位于核仁外周)(18)。在细胞增殖期，ITGB4BP的表达上调(19)。因此可以提示ITGB4BP蛋白与细胞骨架及细胞增殖有关。

2. ITGB4BP的生物学功能

2.1参与调控蛋白合成：

真核细胞在生长和分化过程中，基因组中的绝大多数基因不被转录，只有少数基因能表达，这些基因经过转录及转录后加工，变成成熟的mRNA，并在细胞质中的核糖体上翻译成多肽链，形成细胞所需的蛋白。mRNA的翻译存在多种水平的调控，其中对真核生物翻译起始阶段的调控是非常重要的一步。在真核生物翻译起始阶段，ITGB4BP从核糖体60s亚基解聚下来，促进40s亚基和60s亚基结合形成80s亚基，从而启动蛋白质的翻译(20-23)。有实验室敲除ITGB4BP基因后发现核糖体60s亚基丢失，从而证明其对核糖体60s的形成具有重要的作用(18)。并且对胞外信号的反应中ITGB4BP是作为最早的真核细胞翻译起始因子参与调节蛋白的翻译(24)。另一方面，ITGB4BP调控蛋白合成还与其对microRNA的调节相关。ITGB4BP与RISC(RNA诱导沉默复合体)结合，特异性地促进相应microRNA的作用，从转录水平上干扰mRNA形成，抑制其对应靶蛋白的表达，反之敲除ITB4BP后则会解除microRNA对靶蛋白的表达抑制作用而促进靶蛋白的表达(2526)。

2.2参与调节细胞黏附及细胞骨架的形成：

整合素家族为黏附分子受体，参与介导细胞与细胞外基质、细胞与细胞间的相互作用。细胞间的黏附作用有接合作用、桥粒连接、半桥粒连接等，半桥粒连接的细胞外基质主要为层黏蛋白，β4整合素为层黏蛋白受体，故其与桥粒、半桥粒的形成有密切的联系。ITGB4BP为β4整合素结合蛋白，与中间丝和α6β4整合素的胞内结构域的功能区结合，作为两者的桥梁介导半桥粒的形成，介导细胞的黏附功能(15)。此外，ITGB4BP还存在于核基质中，通过与核基质、中间丝等细胞骨架结构的连接，参与了细胞骨架的形成。有实验已证明ITGB4BP在中间丝和核基质上高表达(17)。并且ITGB4BP还可以调节Wnt信号通路中的β-联蛋白的表达，从而影响细胞骨架(27)。

2.3与肿瘤发生和转移的关系：

肿瘤最明显的特点是细胞增殖异常，凋亡抑制，且容易转移。有实验证实ITGB4BP作为翻译调节因子参与了细胞的增殖。在对分化诱导前后的肝癌细胞核基质成分进行亚细胞蛋白组学分析发现，ITGB4BP在分化后的细胞中高表达，提示可能参与癌细胞分化(28)。ITGB4BP在正常粘膜细胞可以检测到，但是在癌细胞中过表达，如在结直肠癌中ITGB4BP的表达上调(19)，并且在***转移灶中尤为明显(29)，故而提示ITGB4BP的高表达可能参与了肿瘤的增殖和转移。

从上面可以看出，ITGB4BP在核糖体合成、细胞骨架以及肿瘤的增殖分化和转移中具有重要的作用，但是目前对于ITGB4BP蛋白的相关文献较少，对于其在纤维化相关疾病中的作用和功能还未见报道，故对其在纤维化中的功能和作用还需进一步深入研究。

发明内容

本发明人在进行增生性瘢痕成纤维细胞分化的机制研究中发现P311基因与其有着密切的联系。目前对于P311基因功能和机制的研究尚不清楚，本发明人利用酵母双杂交技术在成人肝cDNA文库(美国BD Clontech公司)中筛选得到一个能与P311相互作用的蛋白的编码序列，经过进一步鉴定确定该编码序列编码的蛋白为β4整合素结合蛋白(Integrin beta 4binding protein，ITGB4BP，SEQ ID NO 1，Swiss-Prot：P56537.1，[GI：3122258])。在此基础上，本发明人进行了一系列研究，首次证明ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞分化过程中发挥重要作用，进而完成了本发明。

特别地，本发明涉及β4整合素结合蛋白(ITGB4BP)及其衍生物，或表达ITGB4BP及其衍生物的基因重组表达载体，在预防和/或治疗增生性瘢痕或纤维化病变中的应用。

具体地，本发明提供以下各方面的内容：

在本发明的第一方面中，本发明在成人肝cDNA文库中筛选得到了携带ITGB4BP基因的重组载体pACT2-ITGB4BP，在此基础上，利用常规基因克隆技术，克隆了携带ITGB4BP编码基因和绿色荧光蛋白基因EGFP的重组穿梭质粒pShutlle-CMV-ITGB4BP-EGFP，然后利用基因同源重组，将ITGB4BP-EGFP重组到腺病毒载体pAdEasy-1中，获得重组腺病毒表达载体pAdEasy-ITGB4BP-EGFP，并包装成腺病毒颗粒，用于ITGB4BP蛋白功能和ITGB4BP基因功能的鉴定。并且，进一步克隆了关于ITGB4BP基因的慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi，进行RNA干扰实验，用于ITGB4BP蛋白功能和ITGB4BP基因功能的鉴定。

在本发明的第二方面中，本发明分离了正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞，建立了瘢痕细胞模型。并且，鉴定ITGB4BP在上述两种细胞中的表达水平，发现ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中低表达(参见图1)，表明ITGB4BP的低表达加重了增生性瘢痕的纤维化。

在本发明的第三方面中，本发明通过RNAi技术抑制ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达后检测纤维化相关的指标TGF-β1(转化生长因子β1)、MMP9(基质金属蛋白酶9)和I型胶原的表达量。结果表明，在mRNA水平上抑制ITGB4BP表达后，纤维化相关的指标TGF-β1、MMP9和I型胶原的表达量升高(参见图2)，明显加重了纤维化。

在本发明的第四方面中，本发明通过在正常皮肤成纤维细胞中增加ITGB4BP的表达后检测纤维化相关的指标TGF-β1、MMP9和I型胶原的表达量。结果表明，在mRNA水平上增加ITGB4BP表达后，纤维化相关的指标TGF-β1、MMP9和I型胶原的表达量显著降低(参见图3)，抑制纤维化。

在本发明的第五方面中，本发明通过在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达ITGB4BP后检测肌成纤维细胞表面标志物α-SMA和纤维化相关的指标TGF-β1和I型胶原的表达量，并利用成纤维细胞的三维培养***(FPCL)检测对肌成纤维细胞收缩的抑制作用。结果表明，与阴性对照相比，在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达ITGB4BP后，α-SMA表达量减少(参见图4)，抑制了增生性瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化；纤维化相关的指标TGF-β1、MMP9和I型胶原的表达均被明显抑制(参见图5和6)，并且肌成纤维细胞的收缩性下降(参见图7)。

因此，本发明首次证明ITGB4BP在体外细胞培养***中能抑制纤维细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞产生胶原蛋白(包括I型、III型等，本文显示了关于I型胶原蛋白的数据，未显示关于III型胶原蛋白的数据)；首次证明ITGB4BP能抑制肌成纤维细胞的收缩；发现ITGB4BP能下调TGF-β1、MMP9的表达。因此，本发明得出这样的结论：在纤维化疾病中，ITGB4BP的低表达可能是一个调控成纤维细胞表型转化和功能改变的重要始动因素，ITGB4BP可能是一个具有强烈作用的纤维化形成相关的负调信号。因此ITGB4BP的高表达则是具有明显的抗纤维化作用。因此，ITGB4BP及其基因表达载体可以用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变。

另一方面中，由于ITGB4BP基因在真核细胞中的序列高度保守，其以ITGB4BP的结合部位和功能部位发挥生物学作用的天然或基因工程蛋白质衍生物保留了保守功能结构域，具有类似的功能，也可以用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变。特别地，具有ITGB4BP的结合部位和功能部分，并且在高表达后能够抑制TGF-β1、MMP9或I型胶原等纤维化相关的指标的表达，或抑制成纤维细胞表面标志物α-SMA的表达的ITGB4BP衍生物都包括在本发明的范围内。

因此，在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供一种用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变的药物组合物或试剂盒，所述药物组合物或试剂盒包括治疗有效量的ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体，和药用赋形剂或载体等。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述药物组合物或试剂盒还包括目前已知用于的瘢痕或纤维化病变的抑制剂。

因此，本发明还提供一种预防和/或治疗增生性瘢痕及纤维化病变的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体、或上述药物组合物或试剂盒，优选地，所述受试者是人或动物。

本领域的技术人员应该理解，所述药物组合物或试剂盒可以局部给药到瘢痕处或纤维化处，也可以通过口服、静脉内注射、肌内注射等常规施用方式施用。本领域中技术人员通过常规试验能够分别确定ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体、以及药物组合物的剂量水平。应该理解，关于任何具体受试者的具体剂量水平依赖于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、施用时间、施用途径和***率、药物联合和经历治疗的具体疾病的严重性等。在施用所述药物组合物的情形中，ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体可以与其它瘢痕或纤维化病变抑制剂同时、或间隔一定时间进行施用。

本发明还提供ITGB4BP蛋白或其衍生物、表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体在制备用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变的药物或试剂盒中的应用。

在本发明中，所述增生性瘢痕包括但不限于烧伤、烫伤、切割伤、化学损伤，冷冻伤等皮肤外伤。所述纤维化病变包括各种组织器官的病理性纤维化，例如，但不限于，皮肤组织纤维化、肺纤维化、肝脏纤维化、或肾脏纤维化等；还包括由各种纤维化引起的病理性收缩，例如，但不限于，体表及体内脏器、组织的病理性收缩等。

最后，本发明还提供一种获取ITGB4BP或其衍生物的方法，可以通过将编码ITGB4BP或其衍生物的核苷酸通过基因重组技术克隆到适当的原核表达载体、真核表达载体如酵母表达载体、或病毒表达载体中，构建合适的重组表达载体，转化或转染到相应宿主体内进行重组表达，最后进行蛋白质纯化步骤获得ITGB4BP或其衍生物。在本发明的一个优选实施方案中，所述方法将编码ITGB4BP的核苷酸克隆到病毒表达载体中，如腺病毒pAdEasy-1载体中，进行重组表达。

本领域技术人员应该注意，本发明所述的ITGB4BP或编码其的基因主要来源于人。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1：ITGB4BP在正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞中的表达。

图2：在增生性瘢痕成纤维细胞中抑制ITGB4BP表达后，培养上清内TGF-β1、MMP9和I型胶原的表达水平升高。2A：筛选ITGB4BP基因干扰用的有效慢病毒，1#，2#和3#分别表示慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi1#/2#/3#；2B：在增生性瘢痕成纤维细胞中抑制ITGB4BP表达后，培养上清内TGF-β1、MMP9和I型胶原的表达的检测，＊：P＝0.0001，＊＊：P＝0.005，＊＊＊：P＝0.03。

图3：正常皮肤成纤维细胞中ITGB4BP高表达后细胞培养上清内TGF-β1、MMP9和I型胶原的表达检测，＊：P＝0.038，＊＊：P＝0.0005，＊＊＊：P＝0.007。

图4：增生性瘢痕成纤维细胞中ITGB4BP表达升高后细胞内α-SMA的表达检测。4A：mRNA水平检测；4B：蛋白水平检测；4C：蛋白水平分析，1为EGFP，2为ITGB4BP-EGFP。

图5：增生性瘢痕成纤维细胞中ITGB4BP表达升高后细胞内TGF-β1的表达检测。5A：mRNA水平检测；5B：蛋白水平检测；5C：蛋白水平分析，1为EGFP，2为ITGB4BP-EGFP。

图6：在mRNA水平上，增生性瘢痕成纤维细胞中ITGB4BP表达升高后细胞内I型胶原的表达检测。

图7：增生性瘢痕成纤维细胞中ITGB4BP高表达后肌成纤维细胞收缩功能检测。7A，三维凝胶模型，左图为ITGB4BP-EGFP，右图为EGFP；7B，收缩指数分析，P＝0.008，1为ITGB4BP-EGFP，2为EGFP。

图8：质粒图谱。8A，pEGFP-N2；8B，p18MD-18；8C，pShuttle-CMV；8D，pAdEasy-1；8E，pFIV-H1/U6-copGFP。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

本发明所用的实验仪器和材料及其来源显示在下表1中。

表1.本发明所用的实验仪器和材料以及它们的来源

实施例1.穿梭载体的构建

1.1目的基因序列的获取

本实验使用pEGFP-N2和pITGB4BP-EGFP质粒进行，其中pEGFP-N2购于clontech公司(货号：6081-1)，pITGB4BP-EGFP为本实验室构建的质粒。pITGB4BP-EGFP的构建方法为：根据重组载体pACT2-ITGB4BP(肝cDNA文库，美国BD Clontech公司)的序列设计引物：

上游引物pITGB4BP-EGFP-EcoRI(***EcoRI酶切位点)：

5′-CAGAATTCATGGCGGTCCGAGCTTCGTT-3′；

下游引物pITGB4BP-EGFP-BamHI(***BamHI酶切位点)：

5′-CAGGATCCCGGTGAGGCTGTCAATGAGGGAAT-3′。

以pACT2-ITGB4BP为模板进行PCR反应，试剂为TaKaRa公司产品。反应体系如下：

pACT2-ITGB4BP 1μl(约为1μg)

10×PCR缓冲液 5μl

dNTP(2.5mmol/L) 4μl

MgCl₂(25mmol/L) 3μl

上游引物 0.5μl

下游引物 0.5μl

rTaq酶(5U/μl) 0.5μl

ddH₂O 35.5μl

终体积 50μl

反应条件：94℃变性4分钟后94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，共30个循环，然后72℃延伸10分钟，获得约750bp大小的目的片段ITGB4BP。首先根据pMD18-T载体连接试剂盒(TaKaRa公司)操作步骤，将PCR产物连接至pMD18-T载体中，得到pMD18-T-ITGB4BP重组体。然后利用EcoRI和BamHI双酶切ITGB4BP的PCR产物和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2，反应条件如下：

pEGFP-N2(或pMD18-T-ITGB4BP) 40μl(约为2μg)

10×H缓冲液 5μl

EcoRI 2.5μl

BamHI 2.5μl

终体积 50μl

反应条件：37℃反应2h。然后，使用0.6％琼脂糖凝胶进行电泳，对目的条带进行切胶与胶回收。胶回收采用DNA纯化回收试剂盒(购自美国Omega公司)，按供应商提供的说明书进行纯化回收。最终得到EcoRI和BamHI双酶切的ITGB4BP片段和pEGFP-N2线性质粒片段。然后利用T4DNA连接酶(大连Takara公司)分别连接胶回收产物，反应条件如下：

回收后的pEGFP-N2 3.5μl(约为0.5μg)

回收后的ITGB4BP 12μl(约为1μg)

10×T4DNA连接缓冲液 2μl

T4DNA接酶 2.5μl

终体积 20μl

反应条件：16℃过夜。构建后的重组载体命名为pITGB4BP-EGFP。转化连接产物至感受态大肠杆菌DH5α后，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，挑取单菌落进行扩增，提取质粒并用EcoRI+BamHI双酶切连接产物，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。至此pITGB4BP-EGFP载体构建完成。

然后利用BglII和NotI(均购自大连Takara公司)双酶切pEGFP-N2和pITGB4BP-EGFP从中获得目的片段EGFP(长度约796bp)和ITGB4BP-EGFP(长度约1512bp)，构建至经同样双酶切处理的pShuttle-CMV(美国Abiogene公司，长度约7.5kb)中。pEGFP-N2、pITGB4BP-EGFP和pShuttle-CMV各自的酶切体系如下：

pEGFP-N2(或pITGB4BP-EGFP或

28μl(约为2μg)

pShuttle-CMV)

10×H缓冲液 4μl

0.1％BSA 4μl

NotI、BglII 各2μl

终体积 40μl

反应条件：37℃反应2h，0.6％琼脂糖凝胶进行电泳，对目的条带进行切胶与胶回收。胶回收采用DNA纯化回收试剂盒(购自美国Omega公司)，方法按供应商提供的说明书进行。最终得到BglII和NotI双酶切的EGFP、ITGB4BP-EGFP片段和pShuttle-CMV线性质粒片段。

1.2穿梭载体的连接

将上一步回收后得到的目的片段EGFP和ITGB4BP-EGFP分别利用T4DNA连接酶连接至同样经酶切、回收后的质粒pShuttle-CMV中，从而获得含目的片段的穿梭质粒载体。二者各自的连接反应体系分别如下：

回收后的pShuttle-CMV 3.5μl(约为0.5μg)

回收后的EGFP或ITGB4BP-EGFP 12μl(约为1μg)

10×T4DNA连接缓冲液 2μl

T4DNA连接酶 2.5μl

终体积 20μl

反应条件：16℃过夜。

连接产物的转化与扩增：按照本领域公知的常规大肠杆菌转化方法，将连接产物转化利用氯化钙方法制备的感受态大肠杆菌DH5α细胞，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行质粒扩增、鉴定和提取重组质粒。

1.3穿梭载体构建后的鉴定

对上一步获得的连接产物用Xho I(购自大连Takara公司)进行酶切鉴定，将构建成功后的重组穿梭质粒载体分别命名为pShuttle-CMV-ITGB4BP-EGFP和pShuttle-CMV-EGFP。鉴定的酶切反应体系如下：

pShuttle-CMV-ITGB4BP-EGFP或pShuttle-CMV-EGFP 5μl(约为0.2μg)

10×H缓冲液 1μl

ddH₂O 3.5μl

Xho I 0.5μl

终体积 10μl

反应条件：37℃反应2h，0.6％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定构建是否成功。

实施例2.腺病毒的同源重组

对实施例1中构建成功的穿梭载体利用Pme I酶切后进行回收，同时将其分别转化至氯化钙法制备的含pAdEasy-1质粒(购自美国Qbiogene公司)的感受态大肠杆菌BJ5183中，完成腺病毒的同源重组。具体操作内容如下：

2.1穿梭质粒的线性化：

将成功构建的穿梭质粒pShuttle-CMV-ITGB4BP-EGFP和pShuttle-CMV-EGFP用Pme I(购自英国NEB公司)进行酶切、回收。二者各自的酶切体系分别如下：

pShuttle-CMV-ITGB4BP-EGFP或pShuttle-CMV-EGFP 18μl(约为0.5μg)

NEB缓冲液4 5μl

100×BSA 0.5μl

ddH₂O 25.5μl

Pme I 1μl

终体积 50μl

反应条件：37℃反应2h后，0.6％琼脂糖凝胶电泳，切胶及胶回收(方法同实施例1中1.1)。

2.2腺病毒的同源重组：

利用本领域公知的常规大肠杆菌转化方法，将线性化后的穿梭质粒分别转化至含腺病毒pAdEasy-1载体的氯化钙制备的大肠杆菌BJ5183中。在卡那霉素抗性的固体培养基中筛选阳性菌落。从长出的大、中、小三种菌落中挑取中小菌落，经扩增后提取质粒，利用Pac I(购自英国NEB公司)对其进行酶切鉴定，将重组成功的腺病毒载体分别命名为pAdEasy-ITGB4BP-EGFP和pAdEasy-EGFP。鉴定的酶切体系分别如下：

pAdEasy-ITGB4BP-EGFP或pAdEasy-EGFP 4μl(约为0.1μg)

NEB缓冲液1 2μl

100×BSA 0.2μl

ddH₂O 13.5μl

Pac I 0.3μl

终体积 20μl

反应条件：37℃反应1h后，0.6％琼脂糖凝胶电泳，Goldview核酸染料染色分别显现23kb和3.0kb或23kb和4.5kb的条带，表明腺病毒载体重组成功。

实施例3.腺病毒的包装与扩增

3.1腺病毒载体转染HEK293细胞包装腺病毒

3.1.1腺病毒载体的线性化：

用Pac I酶切重组腺病毒载体pAdEasy-ITGB4BP-EGFP和pAdEasy-EGFP并回收。酶切体系如下：

pAdEasy-ITGB4BP-EGFP或pAdEasy-EGFP 48μl(约为1.0μg)

NEB缓冲液1 8μl

100×BSA 0.8μl

ddH₂O 21.7μl

Pac I 1.5μl

终体积 80μl

反应条件：37℃反应1h后，0.6％琼脂糖凝胶电泳，Goldview核酸染料染色分别显现23kb和3.0kb或23kb和4.5kb的条带，对上述23kb的两条条带(分别主要包含重组目的基因pAdEasy-ITGB4BP-EGFP和pAdEasy-EGFP)进行胶回收(方法同实施例1中1.1)。

3.1.2腺病毒的包装：

将3×10⁵细胞HEK293细胞(购于中科院细胞库)接种至六孔板(美国Corning公司)中，待细胞达到80％融合时开始转染。转染方法如下：取8μg在3.1.1中线性化的腺病毒质粒分别与250μl无抗DMEM(即，不含抗生素的DMEM)(购自美国Hyclone公司)混合，室温，5min；取20μl脂质体与480μl无抗DMEM轻柔混合，室温，5min，分为2等份；将上两步混合液进行混合，室温静置20min；PBS清洗六孔板中的293细胞两遍后，加入质粒脂质体混合物；CO₂孵箱中37℃培养4hr后更换新鲜无抗DMEM(含10％小牛血清)，每孔2ml。继续培养24h后开始观察细胞内荧光表达情况。

3.2腺病毒的收集与扩增：

HEK293细胞转染后第六天，荧光比较强，且细胞已完全呈悬浮状态，用无菌吸头将细胞吹打下来，收集于EP管(购自美国Axygen公司)中，于-80℃和37℃中反复冻融3次，12,000rpm，4℃离心15min后获得的上清即为原代病毒液，分别命名为Ad-ITGB4BP-EGFP和Ad-EGFP。随后将病毒液继续感染293细胞，利用同样的方法收集其第3-4代病毒液备用。

实施例4.慢病毒干扰载体的构建与包装

本实施例中所需ITGB4BP基因的慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi购自重庆金麦生物技术有限公司公司(地址：重庆市沙坪坝区天星桥金地汇3-11)，作为阴性对照的干扰序列也购自该公司。将上述二者经转染293FT细胞包装后获得的慢病毒分别命名为：慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi1#/2#/3#和阴性对照。

RNA干扰筛选时选用的候选片段分别为：

ITGB4BP RNAi1#-1：AAAG GGGCTGGTGCATCCCAAGA

ITGB4BP RNAi1#-2：AAAA TCTTGGGATGCACCAGCCC

ITGB4BP RNAi2#-1：AAAG GGCTCAGAGAACTTCTACA

ITGB4BP RNAi2#-2：AAAA TGTAGAAGTTCTCTGAGCC

ITGB4BP RNAi3#-1：AAAG CAGCCTCCCAGACACAGTG

ITGB4BP RNAi3#-2：AAAA CACTGTGTCTGGGAGGCTG

阴性对照RNAi-1：AAAG TCGACTCAGTCGGGTGGCA

阴性对照RNAi-2：AAAA CTGCTATCGAGCCTGGCGA

慢病毒载体的构建按SBI公司pFIV--H1/U6-copGFP siRNA试剂盒(Cat：#SI111A-1)操作说明书进行。

4.1慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi的构建

将上述候选片段按照下述比例进行退火连接。反应体系如下：

上游片段 2.5μl(约为2.5μg)

下游片段 2.5μl(约为2.5μg)

2×退火缓冲液 25.0μl

ddH₂O 20.0μl

终体积 50.0μl

反应条件：95℃反应5分钟后冷却至室温。

然后将连接成功的片段和pFIV-H1/U6-copGFP连接。反应体系如下：

候选片段 1μl(约为0.01μg)

pFIV-H1/U6-copGFP 2.5μl(约为0.5μg)

10×T4DNA连接缓冲液 1μl

T4DNA连接酶 1μl

ddH₂O 4.5μl

终体积 10μl

反应条件如下：16℃过夜。

连接产物的转化与扩增：按照本领域公知的常规大肠杆菌转化方法，将连接产物转化利用氯化钙方法制备的感受态大肠杆菌DH5α细胞，利用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行质粒扩增、鉴定和提取重组质粒。

4.2慢病毒干扰载体pFIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi的包装

将4×10⁵细胞293FT细胞(购于中科院细胞库)接种至75cm²培养瓶(上海市万红玻璃仪器厂)中，待细胞达到70％融合时开始转染。转染方法如下：取2.5μg包膜蛋白质粒pVSV-G，7.5μg包装质粒pFIV34N和2μg上述构建成功的表达质粒在ddH2O(总体积1095μl)混匀，再加入155μl2M CaCl₂。然后再缓慢加入1250μl 2×PBS混匀。PBS清洗293FT细胞两遍后，加入上述混合物；CO₂孵箱中37℃培养7hr后更换新鲜无抗DMEM(10％小牛血清)，每瓶10ml。继续培养48h后细胞出现绿色荧光。收集细胞上清，3000rpm，4℃离心5min后，取上清用0.45μm的PVDF膜抽滤后即为我们所需要的慢病毒液。

实施例5.原代皮肤成纤维细胞的分离与培养

***正常成纤维细胞来自重庆西南医院泌尿外科(经患者书面同意)，增生性瘢痕成纤维细胞来自重庆西南医院烧伤科，采***伤后一年内的患者(经患者书面同意)。

原代皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞的分离与培养方法如下：将组织块放入无菌培养皿内，PBS冲洗三遍，用无菌剪刀除去表皮和皮下组织，剪碎真皮组织；将剪碎后的组织放入25ml锥形培养瓶内，加入0.5％胰蛋白酶(购自美国Hyclone公司)10ml，室温，轻微振荡2h；加入10ml含10％小牛血清(购自成都哈里公司)的DMEM(购自美国Hyclone公司)终止消化，将悬液通过无菌滤网过滤后弃去组织碎片；离心，800rpm 10min，弃上清，加入10ml含10％小牛血清的DMEM洗二遍，再次离心；弃上清后，重悬细胞于10ml含10％小牛血清的DMEM中，移至75cm²培养瓶(购自上海市万红玻璃仪器厂)中，37℃，5％CO₂培养箱内进行培养，24h后更换培养基，同时除去未贴壁细胞。待细胞完全长满后，即可进行传代培养。实验时选用第6-10代成纤维细胞。

5.1正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞RNA的提取

具体步骤为：取第8代成纤维细胞(六孔板培养)，弃去培养基；每孔加入200μl Tripure(购自瑞士罗氏(Roche)公司，目录号为：11667157001)，冰盒上放置5min后刮下所有细胞并收集；按1∶5(三氯甲烷∶Tripure，v/v)的体积比例加入40μl三氯甲烷，剧烈振荡15sec，冰盒上放置10min；然后每孔加入200μl Tripure，冰盒上放置5min；4℃，12000g，离心15min；转移上层水相，加入等体积的异丙醇，混匀，冰盒上放置10min；4℃，12000g，离心10min；弃上清，加入75％乙醇(1‰DEPC水稀释)500μl洗涤沉淀；4℃，7500g，离心5min；室温下待酒精挥发完后，加入10μl的1‰DEPC水溶解沉淀即为RNA；对RNA进行浓度测定，-80℃冻存。

5.2提取RNA后的反转录反应

利用上一步提取的RNA为模板进行反转录反应。反转录反应体系如下：

5.1中提取的RNA 约1μg

AMV反转录酶 1μl

RNA酶抑制剂 0.5μl

dNTP混合液 2μl

10×RT缓冲液 2μl

Oligo dT-连接物引物 1μl

MgCl₂ 4μl

RNA 1μg

ddH₂O 补全至20μl

终体积 20μl

反应条件：50℃30min，99℃5min，5℃5min，4℃保存；5.3实时荧光定量PCR检测(Real-time PCR)

实时PCR反应体系如下：

RT反应物 2μl

SYBR Green实时PCR Master Mix 10μl

正向引物(10nM) 0.4μl

反向引物(10nM) 0.4μl

ddH₂O 7.2μl

终体积 20μl

此处所用的引物序列为：

ITGB4BP：正向引物：5′-CCCAACAATACCACCGACCAGGA-3′

反向引物：5′-GCCCTCCCTGATTGCTGAAGACA-3′

GAPDH：正向引物：5′-GGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′

反向引物：5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGATG-3′

反应条件：95℃变性2min；95℃变性15秒，55℃退火35秒，72℃延伸31秒，共40个循环。

在72℃进行信号采集并利用7500***软件进行分析，结果显示在图1中。

实施例6.ITGB4BP基因干扰用有效慢病毒的筛选

因为所构建的慢病毒干扰载体并不是全都具有干扰作用，必须经过筛选，选出干扰最有效的组进行实验。

筛选使用24孔板(美国Corning公司)进行实验，每孔瘢痕成纤维细胞数约为5×10³个，每孔加入在实施例4中得到的慢病毒200μl，四天后对细胞利用实时荧光定量PCR技术检测感染慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi1#/2#/3#以及阴性对照感染组内ITGB4BP的mRNA表达情况。

所用的引物序列为(同实施例5)：

ITGB4BP：正向引物：5′-CCCAACAATACCACCGACCAGGA-3′

反向引物：5′-GCCCTCCCTGATTGCTGAAGACA-3′

GAPDH：正向引物：5′-GGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′

反向引物：5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGATG-3′

具体步骤为：观察瘢痕成纤维细胞感染慢病毒后荧光表达约50％，细胞形态呈长梭形，阴性对照组未见荧光，弃去培养基；使用Tripure，按实施例5中5.1的方法提取成纤维细胞的RNA，以提取的RNA作为模板进行反转录反应，反转录的引物、反应体系和反应条件均与实施例5中5.2的反转录反应相同。然后，利用所得到的反转录产物作为模板，按照实施例5中5.3的方法进行实时PCR检测，所用的引物与实施例5中5.3所用的引物相同，反应体系和反应条件也相同。

在72℃进行信号采集并利用7500***软件进行分析，结果显示在图2A中，最后筛选得到的干扰有效的慢病毒为慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi2#，用于后续实验。

实施例7.ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中低表达后纤维化相关指标的表达检测

根据先前的研究表明，细胞将在细胞培养上清中分泌纤维化相关蛋白如TGF-β1、I型胶原和MMP-9，通过检测这些蛋白的分泌表达，可以了解它们的表达变化。利用这些纤维化相关蛋白的表达水平的变化，可以推测瘢痕的形成情况。

采用ELISA法检测增生性瘢痕成纤维细胞中的ITGB4BP在mRNA水平上受到抑制后培养基上清中细胞外基质蛋白TGF-β1、I型胶原以及MMP-9的表达。

简言之，在实施例6中已经证明慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi2#能有效的抑制瘢痕成纤维细胞中的ITGB4BP mRNA的表达。将瘢痕成纤维细胞传代于24孔板(美国Corning公司)进行实验，每孔瘢痕成纤维细胞数约为5×10³个，每孔加入按照实施例4方法包装得到的慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi2#200μl，加入含10％小牛血清的DMEM 800μl，37℃，5％CO₂培养箱内进行培养，四天后收集培养的瘢痕成纤维细胞上清，利用ELISA检测上清中TGF-β1、I型胶原以及MMP-9的含量。

ELISA检测TGF-β1的实验步骤(参照美国RB公司的人TGF-β1ELISA检测试剂盒附上的说明书)：加入100μl倍比稀释(即，连续稀释，将2000ng/ml的高浓度标准品连续稀释成1000ng/ml，500ng/ml，250ng/ml，125ng/ml，62.5ng/ml，31.25ng/ml，15.6ng/ml，0ng/ml)的标准品于相应的反应板中，一式两份；依次加入100μl样品(即实验分组：瘢痕成纤维细胞+ITGBRBP RNAi，和瘢痕成纤维细胞+阴性对照)，共4个孔；轻轻混匀30秒，用保鲜膜封住板孔，37℃温育60min；洗板，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次；每孔加入100μl 1×生物素(试剂盒所带)。轻轻混匀30秒，封住板孔，37℃温育60min；洗板，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次；每孔加入100μl 1×HRP(试剂盒所带)。轻轻混匀30秒，封住板孔，37℃温育30min；洗板，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次；每孔加入100μl TMB显色液，轻轻混匀10秒，37℃暗处温育25分钟(15±10分钟)；每孔加入100μl终止液(试剂盒所带)。轻轻混匀30秒；30分钟内利用680型酶标仪在450nm处读出OD值。根据标准品确定TGF-β1的浓度。

这里需要注意，美国RB公司的人TGF-β1检测试剂盒、人I型胶原检测试剂盒和人MMP-9检测试剂盒可以用来检测同一样本中的不同指标，具体而言，在本实验中，将一份样本分成3等份a、b和c，a用于TGF-β1检测试剂盒检测TGF-β1，b用于I型胶原检测试剂盒检测I型胶原，和c用于MMP-9检测试剂盒检测MMP-9。三种检测所用的试剂均为试剂盒所带，检测的步骤与上述利用人TGF-β1检测试剂盒检测TGF-β1的步骤相同。

实施例8.正常成纤维细胞中ITGB4BP高表达后纤维化相关指标的表达测定

使用24孔板进行实验，每孔正常皮肤成纤维细胞数约为5×10³个，每孔加入在实施例3中获得的腺病毒Ad-EGFP和Ad-ITGB4BP-EGFP各200μl，加入含10％小牛血清的DMEM 800μl，37℃，5％CO₂培养箱内进行培养，五天后利用ELISA检测上清中TGF-β1、I型胶原以及MMP-9的含量(方法同实施例7，分别使用美国RB公司的人TGF-β1检测试剂盒、人I型胶原检测试剂盒和人MMP-9检测试剂盒进行)。

实施例9.增生性瘢痕成纤维细胞中ITGB4BP高表达后纤维化相关指标的表达测定

9.1mRNA水平检测α-SMA、TGF-β1和I型胶原的表达：

使用六孔板进行实验，每孔增生性瘢痕成纤维细胞数约为8×10⁴个，每孔加入在实施例3中获得的腺病毒Ad-EGFP和Ad-ITGB4BP-EGFP各600μl，加入含10％小牛血清的DMEM 2400μl，37℃，5％CO₂培养箱内进行培养，五天后利用实时荧光定量PCR检测细胞中α-SMA、TGF-β1和I型胶原的表达(RNA提取、逆转录反应和实时荧光定量PCR的实验方法同实施例5)。

所用的引物序列为：

TGF-β1：正向引物：5′-TGGAAACCCACAACGAAATCTATGA-3′

反向引物：5′-TGGAAACCCACAACGAAATCTATGA-3′

I型胶原：正向引物：5′-tcccaccaatcacctgcgtaca-3′

反向引物：5′-cgccggtggtttcttggtcg-3′

α-SMA：正向引物：5′-cggctttgctggggacgat-3′

反向引物：5′-caggggcaacacgaagctcat-3′

9.2蛋白水平检测TGF-β1、和α-SMA的表达：

使用六孔板进行实验，每孔细胞数约为8×10⁴个，每孔加入在实施例3中获得的腺病毒Ad-EGFP和Ad-ITGB4BP-EGFP各600μl，加入含10％小牛血清的DMEM 2400μl，37℃，5％CO₂培养箱内进行培养，五天后利用蛋白质印迹法检测细胞中TGF-β1和α-SMA的表达。

9.2.1增生性瘢痕成纤维细胞蛋白的提取(RIPA法)：

具体步骤为：冰上处理细胞，预冷的PBS洗涤细胞后，每孔加200μlRIPA细胞裂解(含1％PMSF)液，用细胞刮匙于冰上反复刮取细胞，移入一干净的1.5ml EP管，冰上放置30min；冰浴超声裂解，4℃14000rpm×30min，将离心后的上清移入新的1.5mlEP管中；BCA法测定蛋白浓度(参考美国Pierce公司BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书)。用ddH₂O调整样品的浓度至适当的浓度，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液；蛋白煮沸5min；上样20μl/孔；SDS-PAGE电泳，电泳结束了取下凝胶放入电转缓冲液中浸泡20min，同时浸泡6张滤纸，1张PVDF膜，安装“三明治”结构，从负极到正极：三层滤纸-凝胶-PVDF膜-三层滤纸，恒流0.8Ma/cm²，电转1.5小时。取出PVDF在含5％脱脂奶粉的TBST(1‰Tween20)封闭液中室温封闭2小时；加入一抗(小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体1∶400，小鼠抗人TGF-β1单克隆抗体4μg/ml，小鼠抗人α-SMA单克隆抗体1∶100)4℃过夜孵育；洗膜1‰TBST×10min×3次；加入二抗(过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，1∶2000)室温孵育1小时；洗膜1‰TBST×10min×3次；显影，加入美国Santa Cruz公司的化学发光液A液B液(均为试剂盒自带的)各500μl后闭光显影。

SDS-PAGE电泳胶体系：

分离胶(12％)，80V电泳总体积5ml 积层胶(5％)，150V电泳总体积2ml

30％丙烯酰胺 2ml 30％丙烯酰胺 0.33ml

1.5mol/L Tris-HCL 1.3ml 1.5mol/L Tris-HCL 1.3ml

10％SDS 0.05ml 10％SDS 0.02ml

10％过硫酸铵 0.05ml 10％过硫酸铵 0.02ml

TEMED 0.002ml TEMED 0.002ml

ddH₂O 1.6ml ddH₂O 1.4ml

9.3利用FPCL模型观察ITGB4BP对成纤维细胞生物学行为的影响

FPCL模型的制作：取已感染腺病毒Ad-EGFP和Ad-ITGB4BP-EGFP 5天后的增生性瘢痕成纤维细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后用无血清的DMEM重悬细胞，制备细胞悬液，并调整细胞密度为1×10⁶个细胞/ml。按细胞悬液∶5×DMEM∶鼠尾胶原＝1∶2∶7的体积比例混合上述各种成分，具体为先在冰上混合鼠尾胶原与5×DMEM，调节pH7.2，再加入细胞悬液；孵箱放置30min形成凝胶状后每孔加入3ml无血清DMEM培养。即获得成纤维细胞的三维培养***(fibroblast-populated collagen lattice，FPCL)。

每组各3个FPCL。第8天观察、记录FPCL的直径变化，计算收缩指数。FPCL收缩指数计算公式如下：

CI＝[1-(D/D₀)²]×100％

其中，CI：收缩指数；D：胶原蛋白凝胶块的直径；D₀：凝胶块初始直径(22mm)。

另外，应该注意，在本发明所有实施例中，如果需要进行统计学分析，则将数据采用SPSS 13.0软件进行独立样本t检验，P≤0.05被认为具有统计学意义。

结果与讨论

1.ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中低表达

实施例5的检测结果显示在图1中。图1显示了ITGB4BP能够在正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞中表达，其代表mRNA表达水平的原始相对定量(raw relative quantitation，以下简称原始RQ)值分别为1和0.704，说明ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中低表达。这表明，ITGB4BP的低表达可能与增生性瘢痕中过度纤维化有关，即ITGB4BP的低表达加重了增生性瘢痕的纤维化。

2.在增生性瘢痕成纤维细胞中，抑制ITGB4BP表达，能够加重瘢痕的纤维性

图2A 对应实施例6的结果，表明：慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi2#在mRNA水平对ITGB4BP的干扰效果最好。具体而言，mRNA水平上阴性对照组为1.00原始RQ，1#慢病毒载体对ITGB4BP表达量为2.068原始RQ，对ITGB4BP不具有干扰效果；2#载体对ITGB4BP表达量为0.025原始RQ，抑制率达到99％，即最有干扰效果；3#载体对ITGB4BP表达量为0.253原始RQ，抑制率约为75％。图2B对应实施例7的结果，表明，在增生性瘢痕成纤维细胞中，在mRNA水平上抑制ITGB4BP表达后，TGF-β1、MMP9和I型胶原在增生性瘢痕成纤维细胞中表达升高，纤维化加重。与阴性对照相比，TGF-β1表达量升高约5倍，MMP9升高约4.5倍，I型胶原升高约6倍，表明在mRNA水平上，ITGB4BP抑制后能明显升高纤维化相关指标如TGF-β1、MMP9和I型胶原的表达，明显加重纤维化。

3.在正常皮肤成纤维细胞中，增加ITGB4BP表达，能够抑制纤维性

实施例8的结果显示在图3中。结果表明，在正常皮肤成纤维细胞中，ITGB4BP mRNA表达升高后，TGF-β1、MMP9和I型胶原在正常皮肤成纤维细胞中表达降低。具体而言，TGF-β1降低约2倍，MMP9降低约4.5倍，I型胶原降低约6倍，即ITGB4BP高表达后能明显抑制纤维化相关指标如TGF-β1、MMP9和I型胶原的表达，抑制纤维化。

图2和图3对应的具体数据如下：

表2.1TGF-β1标准品浓度与对应的OD₄₅₀检测值

根据TGF-β1标准品浓度(x)和其相应的OD₄₅₀值(y)进行回归分析(表2.1)，选用二次曲线模型拟合得相关系数(R)值为1.000，方差分析中F值＝3464.810，显著性概率SignifF＝0.000＜0.05，说明这两个变量之间存在高度显著的二次函数关系，拟合的二次曲线方程式为y＝0.079+0.001x-0.00000066x²，并据此得TGF-β1浓度与OD₄₅₀值的标准曲线。

表2.2成纤维细胞在不同刺激条件下生成TGF-β1的OD₄₅₀检测值(人TGF-β1 ELISA检测试剂盒检测)

表3.1MMP-9的标准品浓度与对应的OD₄₅₀检测值

根据MMMP-9得到的标准品浓度(x)和对应的OD₄₅₀值(y)进行回归分析(表3)，选用三次曲线模型拟合得到的相关系数(R)值为0.996，方差分析中F值＝154.414，显著性概率SignifF＝0.000＜0.05，说明这两个变量之间存在高度显著的三次函数关系，其三次曲线回归方程式为y＝0.106+0.003x-0.0000067x²+0.00000000399x³，据此得MMP-9浓度与OD₄₅₀值的标准曲线。

表3.2成纤维细胞在不同刺激条件下生成MMP-9的OD₄₅₀检测值(人MMP-9ELISA检测试剂盒检测)

表4.1I型胶原标准品浓度与对应的OD₄₅₀检测值

根据I型胶原标准品浓度(x)和对应的OD₄₅₀值(y)进行回归分析(表4.1)，选用三次曲线模型拟合得到的相关系数(R)值为0.999，方差分析中F值＝577.326，显著性概率Signif F＝0.000＜0.05，拟合的三次曲线回归方程式为y＝0.086+0.002x-0.0000028x²+0.00000000139x³，并据此得I型胶原浓度与OD₄₅₀值的标准曲线。

表4.2成纤维细胞在不同刺激条件下生成I型胶原的OD₄₅₀检测值(人I型胶原蛋白ELISA检测试剂盒检测)

4.在增生性瘢痕成纤维细胞中，ITGB4BP的高表达具有明显的抗纤维化作用

实施例9的实验结果显示在图4-7中。图4的结果表明，在增生性瘢痕成纤维细胞中，ITGB4BP表达升高后抑制了肌成纤维细胞表面标志物α-SMA的表达，即，抑制了成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化。ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达后，α-SMA的mRNA水平上表达量为0.329原始RQ，低于对照组的1.00原始RQ，即α-SMA的抑制率为67％(图4A)。图4B的蛋白质印迹实验结果也清楚地表明ITGB4BP的高表达在蛋白水平上抑制α-SMA的表达，进一步量化显示ITGB4BP高表达组的α-SMA蛋白水平相对表达量为0.016，低于对照组0.023，其抑制率为30％(图4C)。

图5的结果表明，在增生性瘢痕成纤维细胞(或模型)中，ITGB4BP表达升高后抑制了TGF-β1在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达。ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达后，TGF-β1的mRNA水平上表达量为0.3979原始RQ，低于对照组的1.00原始RQ，即TGF-β1的抑制率为60％。图5B的蛋白质印迹实验结果也清楚地表明ITGB4BP的高表达在蛋白水平上抑制TGF-β1的表达，进一步量化显示ITGB4BP高表达组的TGF-β1蛋白水平相对表达量为0.008，低于对照组0.069，其抑制率为88％(图5C)。

图6的结果表明，在增生性瘢痕成纤维细胞(或模型)中，ITGB4BP表达升高后抑制了I型胶原在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达。ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达后，I型胶原的mRNA水平上表达量为0.480原始RQ，低于对照组的1.00原始RQ，即对I型胶原的抑制率为52％。

图7的结果表明，在增生性瘢痕成纤维细胞(或模型)中，ITGB4BP抑制肌成纤维细胞的收缩。ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达后，三维凝胶的收缩指数为0.23，对照组为0.90，即凝胶的收缩能力下降约74％。

从上述结果可以看出，在纤维化疾病中，ITGB4BP的低表达可能是一个调控成纤维细胞表型转化和功能改变的重要始动因素，ITGB4BP可能是一个具有强烈作用的纤维化形成相关的负调信号。因此ITGB4BP的高表达则是具有明显的抗纤维化作用。因此，ITGB4BP及其治疗性基因表达载体可以用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，可以在其中进行各种形式和细节的变化，而不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围。

参考文献：

1.Wynn TA，et al.Common and unique mechanisms regulate fbrosis invarious fibroproliferative diseases.J Clin Invest 2007；117(3)：524-529.

2.Tomasek JJ，Gabbiani G，Hinz B，et al.Myofibroblasts andmechano-regulation of connective tissue remodelling.Nat Rev Mol Cell Biol2002；3(5)：349-363.

3.Friedman SL，et al.Mechanisms of disease：mechanisms of hepatic fibrosisand therapeutic implications.Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol2004；1(2)：98-105.

4.Wang J，Jiao H，Stewart TL，et al.Improvement in postburn hypertrophicscar after treatment with IFN-alpha2b is associated with decreased fibrocytes.JInterferon Cytokine Res，2007，27(11)：921-930.

5.Wu J，Ma B，Yi S，et al.Gene expression of early hypertrophic scar tissuescreened by means of cDNA microarrays.J Trauma，2004，57(6)：1276-1286.

6.Studler JM，Glowinski J，Levi-Strauss M.An abundant mRNA of theembryonic brain persists at a high level in cerebellum，hippocampus andolfactory bulb during adulthood.Eur J Neurosci.1993；5(6)：614-23.

7.Pan D，Zhe X，Jakkaraju S，Taylor GA et al.P311 induces aTGF-beta1-independent，nonfibrogenic myofibroblast phenotype.J Clin Invest.2002；110(9)：1349-58.

8.Taylor GA，Hudson E，Resau JH et al.Regulation of P311 expression byMet-hepatocyte growth factor/scatter factor and the ubiquitin/proteasomesystem.J Biol Chem.2000；275(6)：4215-9.

9.Fujitani M，Yamagishi S，Che YH，et al.P311 accelerates nerve regenerationofthe axotomized facial nerve.J Neurochem.2004；91(3)：737-44.

10.袁顺宗，吴军，易绍萱等.以酵母双杂交***从成人肝cDNA文库中筛选与研究P311相互作用蛋白的基因序列.第三军医大学学报，2005，27(14)：1428-1431.

11.Sanvito F，Arrigo G，Zuffardi O，Agnelli M，Marchisio PC，Biffo S.Localization of p27 beta 4 binding protein gene(ITGB4BP)to humanchromosome region 20q11.2.Genomics 1998；52(1)：111.

12.Donadini A，Giodini A，Sanvito F，Marchisio PC，Biffo S.The humanITGB4BP gene is constitutively expressed in vitro，but highly modulated invivo.Gene 2001；266(1-2)：35.

13.Basu U，Si K，Deng H，Maitra U.Phosphorylation of mammalianeukaryotic translation initiation factor 6 and its Saccharomyces cerevisiaehomologue Tif6p：evidence that phosphorylation of Tif6p regulates itsnucleocytoplasmic distribution and is required for yeast cell growth.Mol CellBiol 2003；23(17)：6187.

14.Si K，Chaudhuri J，Chevesich J，Maitra U.Molecular cloning andfunctional expression of a human cDNA encoding translation initiation factor 6.Proc Natl Acad Sci U S A 1997；94(26)：14285.

15.Biffo S，Sanvito F，Costa S，et al.Isolation of a novel beta4integrin-binding protein(p27(BBP))highly expressed in epithelial cells.J BiolChem 1997；272(48)：30314.

16.Carotenuto R，De Marco N，Biffo S，et al.Phosphorylation ofp27(BBP)/eIF6 and its association with the cytoskeleton are developmentallyregulated in Xenopus oogenesis.Cell Mol Life Sci 2005；62(14)：1641.

17.Sanvito F，Piatti S，Villa A，et al.The beta4 integrin interactorp27(BBP/eIF6)is an essential nuclear matrix protein involved in 60Sribosomal subunit assembly.J Cell Biol 1999；144(5)：823.

18.Balbo A，Bozzaro S.Cloning of Dictyostelium eIF6(p27BBP)andmapping its nucle(ol)ar localization subdomains.Eur J Cell Biol 2006；85(9-10)：1069.

19.Sanvito F，Vivoli F，Gambini S，et al.Expression of a highly conservedprotein，p27BBP，during the progression of human colorectal cancer.CancerRes 2000；60(3)：510.

20.Si K，Maitra U.The Saccharomyces cerevisiae homologue of mammaliantranslation initiation factor 6 does not function as a translation initiation factor.Mol Cell Biol 1999；19(2)：1416.

21.Wood LC，Ashby MN，Grunfeld C，Feingold KR.Cloning of murinetranslation initiation factor 6 and functional analysis of the homologoussequence YPR016c in Saccharomyces cerevisiae.J Biol Chem 1999；274(17)：11653.

22.Basu U，Si K，Warner JR，Maitra U.The Saccharomyces cerevisiae TIF6gene encoding translation initiation factor 6 is required for 60S ribosomalsubunit biogenesis.Mol Cell Biol 2001；21(5)：1453.

23.Ceci M，Gaviraghi C，Gorrini C，et al.Release of eIF6(p27BBP)from the60S subunit allows 80S ribosome assembly.Nature 2003；426(6966)：579.

24.Gandin V，Miluzio A，Barbieri AM，et al.Eukaryotic initiation factor 6 israte-limiting in translation，growth and transformation.Nature 2008；455(7213)：684.

25.Chendrimada TP，Finn KJ，Ji X，et al.MicroRNA silencing through RISCrecruitment of eIF6.Nature 2007；447(7146)：823.

26.Flavin RJ，Smyth PC，Finn SP，et al.Altered eIF6 and Dicer expression isassociated with clinicopathological features in ovarian serous carcinomapatients.Mod Pathol 2008；21(6)：676.

27.Ji Y，Shah S，Soanes K，et al.Eukaryotic initiation factor 6 selectivelyregulates Wnt signaling and beta-catenin protein synthesis.Oncogene 2008；27(6)：755.

28.Tang J，Niu JW，Xu DH，Li ZX，Li QF，Chen JA.Alteration of nuclearmatrix-intermediate filament system and differential expression of nuclearmatrix proteins during human hepatocarcinoma cell differentiation.World JGastroenterol 2007；13(20)：2791.

29.Rosso P，Cortesina G，Sanvito F，et al.Overexpression of p27BBP in headand neck carcinomas and their lymph node metastases.Head Neck 2004；26(5)：408.

序列表

<110>重庆西南医院

<120>ITGB4BP及其衍生物用于预防和/或治疗增生性瘢痕及纤维化病变

<130>IB091679

<160>2

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>245

<212>PRT

<213>人

<400>1

Met Ala Val Arg Ala Ser Phe Glu Asn Asn Cys Glu Ile Gly Cys Phe

1 5 10 15

Ala Lys Leu Thr Asn Thr Tyr Cys Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Glu

20 25 30

Asn Phe Tyr Ser Val Phe Glu Gly Glu Leu Ser Asp Thr Ile Pro Val

35 40 45

Val His Ala Ser Ile Ala Gly Cys Arg Ile Ile Gly Arg Met Cys Val

50 55 60

Gly Asn Arg His Gly Leu Leu Val Pro Asn Asn Thr Thr Asp Gln Glu

65 70 75 80

Leu Gln His Ile Arg Asn Ser Leu Pro Asp Thr Val Gln Ile Arg Arg

85 90 95

Val Glu Glu Arg Leu Ser Ala Leu Gly Asn Val Thr Thr Cys Asn Asp

100 105 110

Tyr Val Ala Leu Val His Pro Asp Leu Asp Arg Glu Thr Glu Glu Ile

115 120 125

Leu Ala Asp Val Leu Lys Val Glu Val Phe Arg Gln Thr Val Ala Asp

130 135 140

Gln Val Leu Val Gly Ser Tyr Cys Val Phe Ser Asn Gln Gly Gly Leu

145 150 155 160

Val His Pro Lys Thr Ser Ile Glu Asp Gln Asp Glu Leu Ser Ser Leu

165 170 175

Leu Gln Val Pro Leu Val Ala Gly Thr Val Asn Arg Gly Ser Glu Val

180 185 190

Ile Ala Ala Gly Met Val Val Asn Asp Trp Cys Ala Phe Cys Gly Leu

195 200 205

Asp Thr Thr Ser Thr Glu Leu Ser Val Val Glu Ser Val Phe Lys Leu

210 215 220

Asn Glu Ala Gln Pro Ser Thr Ile Ala Thr Ser Met Arg Asp Ser Leu

225 230 235 240

Ile Asp Ser Leu Thr

245

<210>2

<211>738

<212>DNA

<213>人

<400>2

atggcggtcc gagcttcgtt cgagaacaac tgtgagatcg gctgctttgc caagctcacc 60

aacacctact gtctggtagc gatcggaggc tcagagaact tctacagtgt gttcgagggc 120

gagctctccg ataccatccc cgtggtgcac gcgtctatcg ccggctgccg catcatcggg 180

cgcatgtgtg tggggaacag gcacggtctc ctggtaccca acaataccac cgaccaggag 240

ctgcaacaca ttcgcaacag cctcccagac acagtgcaga ttaggcgggt ggaggagcgg 300

ctctcagcct tgggcaatgt caccacctgc aatgactacg tggccttggt ccacccagac 360

ttggacaggg agacagaaga aattctggca gatgtgctca aggtggaagt cttcagacag 420

acagtggccg accaggtgct agtaggaagc tactgtgtct tcagcaatca gggagggctg 480

gtgcatccca agacttcaat tgaagaccag gatgagctgt cctctcttct tcaagtcccc 540

cttgtggcgg ggactgtgaa ccgaggcagt gaggtgattg ctgctgggat ggtggtgaat 600

gactggtgtg ccttctgtgg cctggacaca accagcacag agctgtcagt ggtggagagt 660

gtcttcaagc tgaatgaagc ccagcctagc accattgcca ccagcatgcg ggattccctc 720

attgacagcc tcacctga 738

Claims

1.β4整合素结合蛋白ITGB4BP、或表达ITGB4BP的重组基因表达载体在制备用于预防和/或治疗增生性瘢痕或纤维化病变的药物组合物或试剂盒中的应用。

2.权利要求1的应用，其中所述增生性瘢痕包括皮肤损伤。

3.权利要求2的应用，其中所述皮肤损伤包括烧伤、烫伤、化学损伤、冷冻伤、或切割伤。

4.权利要求1的应用，其中所述纤维化病变包括各种组织器官的病理性纤维化。

5.权利要求4的应用，其中所述各种组织器官的病理性纤维化包括皮肤组织纤维化、肺纤维化、肝脏纤维化、或肾脏纤维化。

6.权利要求4的应用，其中所述纤维化病变还包括各种由纤维化引起的病理性收缩，包括体表及体内脏器、或组织的病理性收缩。

7.权利要求1的应用，其中在正常皮肤成纤维细胞中高表达所述ITGB4BP后，纤维化相关的指标TGF-β1、MMP9和I型胶原的表达量显著降低，抑制纤维化。

8.权利要求7的应用，其中在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达所述ITGB4BP后，肌成纤维细胞表面标志物α-SMA表达量减少，抑制增生性瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，并且抑制肌成纤维细胞的收缩性。