CN103536586B - 一种防治水产动物水霉病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种防治水产动物水霉病的方法，所述的方法主要应用于防治鱼类、虾类等受精卵和成鱼的水霉病，其特征在于，所述的方法采用药物治疗水霉菌；所述的方法采用泼洒和浸泡两种方式用药分别在预防和治疗草鱼和鲫鱼伤口处的水霉菌，所述的水霉菌为寄生水霉菌。本发明的优点：用药简单，预防和治疗效果显著。
Description
【技术领域】
本发明涉及微生物技术领域，具体地说，是一种防治水产动物水霉病的方法。
【背景技术】
水霉菌广存于世界各地的淡水或半咸水水域及潮湿土壤中，于死亡的有机物上腐生，为一种常在的霉菌，主要有水霉目(Saprolegniales)、霜霉目(peronosporales)及水节霉目(Leptomitales)等，又以水霉菌(Saprolegnia)最为常见，于15~25℃时最适合生长，25℃以上时各中的游孢子(zoospore)繁殖力减弱，较不易感染。
水霉病的发生主要因为紧迫造成的二次性感染，鱼体因拥挤、移动或其他不良环境因素的影响，造成体表组织受伤，水中的水霉病游孢子即伺机附着，在坏死组织上开始发芽形成菌丝，菌丝除寄生于坏死组织外，尚可漫延侵入附近的正常组织，分泌消化酵素分解周围组织，更而贯穿真皮深入肌肉，使皮肤与肌肉坏死崩解。表层的菌丝则向外延伸，形成如棉絮状的覆盖物，并于末端形成孢子囊，放出游孢子到水中，经由水而传播各处。症状主要为感染部位形成灰白色棉絮状覆盖物；病变部位初期呈圆形，后期则呈不规则的斑块，严重时皮肤破损肌肉裸露；鳃组织亦会被侵犯感染，造成死亡。
中国专利文献CN102293831A公开了一种防治水产动物水霉病的复方粉剂及制备方法，由五倍子、大黄、溴硝醇、分散剂一定重量百分比的原料制成。中国专利文献CN101708187A公开了一种用于防治水产动物水霉病的干粉制剂及其制备方法，组分组成为：71~79％生化黄腐酸、10~15％偏重亚硫酸钠、10~15％溴硝醇。但是关于以“立达霉”为主要药物防治水产动物水霉病的专利目前还未见报道。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用药简单、治疗效果明显的防治水产动物水霉病的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种防治水产动物水霉病的方法，所述的方法主要应用于防治鱼类、虾类等受精卵和成鱼的水霉病，所述的方法采用药物治疗水霉菌；所述的方法采用泼洒和浸泡两种方式用药分别在预防和治疗草鱼和鲫鱼伤口处的水霉菌，所述的水霉菌为寄生水霉菌。
所述的药物为立达霉。
所述的药物为立达霉加工后的复方立达霉粉。
所述的复方立达霉粉为固体颗粒药物。
所述的复方立达霉粉由45%立达霉、10%的硅藻土、20%的无水硫酸钠、24.5%的硫酸亚铁和0.5%的抗结剂组成。
所述的药物采用泼洒和浸泡方式预防和治疗水霉菌效果的最佳浓度分别是8mg/L和20mg/L。
本发明的优点：
用药简单，预防和治疗效果显著。
【具体实施方式】
实施例1
复方立达霉粉药物的制备
采用以下重量配比：取45%的立达霉（又名甲霜灵，英文通用名称 metalaxyl，分子式 C15H21NO4，CAS号57837-19-1）、10%的硅藻土、20%的无水硫酸钠、24.5%的硫酸亚铁、0.5%的抗结剂（气相白炭黑）混合后制成抗水霉制剂“复方立达霉粉”。
生产工艺如下：
1抗水霉制剂“复方立达霉粉”各组分常温下混合：
1）先将硅藻土、硫酸亚铁和抗结剂投入混匀机中预混10 ~ 15 min，转速50 ~ 60 r/min；
2）再将无水硫酸钠投入混匀机与上述混合物一起混合10 ~ 15 min，转速50 ~ 60 r/min；
3）最后将立达霉投入混匀机与上述混合物一起混合30 ~ 40 min。转速50 ~ 60 r/min。
2抗水霉制剂“复方立达霉粉”常温下包装：
1）将上述混合物进行分装，准确称取200 g每份，装入可以封口的内包装带内，进行封口；
2）然后将内包装袋放入外包装袋中，并打印生产日期；
3）将上述生产好的复方立达霉粉每50包装成一箱。
实施例2
1材料与方法
1.1 试验药物和试剂
“复方立达霉粉”， 长沙拜特生物科技研究所有限公司
1.2 菌株来源
水霉菌株ATCC200013为上海海洋大学国家水生动物病原库提供。
1.3对水霉体外作用效果实验
1.3.1水霉孢子悬液制备
挑取保藏于试管的水霉菌丝转接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯块200～300g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL）平板上，在平板上滴加适量无菌水25℃培养48h，期间适量增添无菌水。待铺满整个培养皿后，倒出诱生有孢子的无菌水，再用无菌水轻轻冲洗平板1次合并，经8层纱布过滤，分别调整孢子浓度为102个/mL、103个/mL、104个/mL待实验用。
1.3.2待试药物母液配制及梯度稀释
将抗水霉制剂“复方立达霉粉”用蒸馏水配制成1000mg/L的药物母液。通过倍释法将该母液依次稀释十个梯度： 1000、500、250、125、62、31、16、8、4mg/L。
1.3.3水霉孢子抑制实验
以不同梯度浓度的药物倍释液2mL加至18mL经融化56℃的PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯块200～300g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL）使之均匀，迅速倾倒于培养皿中待凝固用于实验,即药物PDA平板浓度为原浓度的1/10。
取0.1mL水霉孢子菌悬液涂布于凝固的培养基上。设空白对照组，25℃培养5d。孵育期每24h观察一次，肉眼判定无菌落生长的最低药物培养皿的药物浓度为MIC。每个浓度设两个对照，同时设不加药液的空白PDA培养基为对照。
1.3.4水霉菌丝杀灭实验
将经马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯块200～300g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL），25℃培养48h后，铺满平板的水霉用无菌刀片切成约1、2、3 cm2的小块。将切好的水霉小块放入盛有上述各浓度的药物倍释液的离心管中分别浸泡0.17、0.5、1、2h.用无菌镊子取出浸泡过的水霉小块置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养观察5d。孵育期每24h观察一次，肉眼判定无水霉菌落生长的，表示此种药物在该浓度该作用时间下对水霉菌丝具有杀灭作用。每个浓度设两个对照，同时设经蒸馏水浸泡过的水霉块空白对照。
2结果
2.1抗水霉制剂“复方立达霉粉”对水霉孢子MIC影响（表1）
表1抗水霉制剂“复方立达霉粉”对水霉孢子的MIC
| 菌量（个/mL） | MIC（mg/L） |
| 102 | 3 |
| 103 | 3 |
| 104 | 3 |
表1实验结果表明：抗水霉制剂“复方立达霉粉”对同体积下不同菌丝个数的水霉菌的抑制效果一致，且不同菌量下MIC具有一致性，说明抗水霉制剂“复方立达霉粉”对水霉孢子具有较好的抑制效果。
2.2抗水霉制剂“复方立达霉粉”对水霉菌丝的杀灭作用（表2）
表2 对水霉菌丝的有效杀灭浓度及其作用时间
注：＋ 表示水霉生长；–表示水霉没生长
表2实验结果表明：抗水霉制剂“复方立达霉粉”对水霉菌丝在20mg/L浓度下作用1h开始有杀灭作用，随着浓度的增加，其有效杀灭时间也会缩短，在80mg/L浓度下仅须作用0.17h即开始对水霉菌丝有杀灭作用，且三种不同菌量结果具有一致性，说明抗水霉制剂“复方立达霉粉”对水霉菌丝具有较好的杀菌作用。
3讨论
由于丝状真菌药敏实验的最终菌量确定至今仍然无标准化的定量，参考其他真菌最终菌量，如：皮肤癣菌103个/mL、曲霉分生孢子数5×104个/mL。本实验对水霉的最终菌量分别设了三个对照浓度，即孢子数102个/mL、103个/mL、104个/mL，结果显示，三个菌量测得MIC具有一致性，并未因为菌量的变化而变化。说明，水霉孢子量在一定浓度内不直接影响实验MIC终点的确定。同样，在对水霉菌丝的抑制实验中，对于水霉菌丝的量设了三个对照组，即水霉菌丝面积：1、2、3 cm2。结果同样具有一致性。
一般认为水霉是腐生性的，对水产动物是一种继发感染。养殖动物受伤或因细菌、病毒感染，造成水霉孢子黏附于伤口，进而受到水霉菌丝的侵袭，是水霉感染的重要环节。因此，药物防治必须破坏这一环节，即对水霉游动孢子和菌丝均有良好的抑制或杀灭作用。实验结果显示抗水霉制剂“复方立达霉粉”对水霉的孢子和菌丝均具有较好的抑制或杀灭作用，对水霉孢子三个菌量的MIC均为3mg/L。对水霉菌丝的三个菌量在20mg/L浓度下作用1h即有杀灭作用，且随着浓度的升高，有效杀灭杀灭时间也随之降低，在80mg/L浓度下0.17h即有杀灭作用。因此，仅从对水霉孢子和菌丝的体外作用效果来看，其具有良好的抗水霉作用。
实施例3
1材料与方法
1.1 试验药物和试剂
“复方立达霉粉”， 长沙拜特生物科技研究所有限公司
1.2 实验用鱼
实验用草鱼、鲫购自江苏南通国营农场，规格为鲫：体重 24~29g/尾、体长 12~13cm；草鱼：体重 30~37g/尾、体长 14~16cm/尾。体表和解剖观察健康，暂养一周。
1.3 菌株来源
水霉菌株ATCC200013为上海海洋大学国家水生动物病原库提供。
1.4 饲养管理
用200 L容积塑料箱饲养，增氧器24 h增氧；水源为经曝气、消毒和去氯处理后的自来水，pH 6.5～ 6.8，平均水温26℃ ，溶氧9～12 mg/L，其他指标符合渔业水质标准。饲料配制参照NRC营养标准。
1.5 草鱼、鲫水霉病人工感染
挑取保藏于试管内的水霉菌丝转接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯块200～300g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL）培养皿上，25℃培养72h使其铺满整个培养皿。取适量培养好的水霉用研钵研碎倒入用于感染的玻璃缸（20L）水中。将若干事先用水煮开裂的玉米粒放入该玻璃缸水体内观察72h，观察到90%玉米粒有水霉生长，即判断玻璃缸水体中有水霉存在，待用于感染实验
用手术刀片将草鱼、鲫背鳍下方两侧鳞片去掉，在肌肉处刮开一厘米左右的小口，将刮伤后的草鱼和鲫鱼分别放入有水霉存在的用于感染的玻璃缸水中，每个感染缸放入10尾草鱼或鲫。养殖水温由26℃下降到18±1℃（暂养缸水温26℃，感染缸水温18℃±1），进行水霉病人工感染。
1.6 草鱼、鲫水霉病预防实验
1.6.1泼洒方式用药预防水霉病
上述草鱼、鲫进行人工感染前，对草鱼和鲫分别进行泼洒方式用药预防水霉病实验。根据体外实验结果设置3个泼洒药物浓度：2、4、8mg/L，每个药物浓度设三个平行对照缸，同时设置三个空白平行对照缸。每个对照缸放待用于感染的草鱼或鲫10尾。观察一周。
1.6.2浸泡方式用药预防水霉病
上述草鱼、鲫进行人工感染前，对草鱼和鲫分别进行浸泡方式用药预防水霉病实验。根据体外实验结果设置3个药物浸泡浓度：10、20、40mg/L，每次浸泡1h,每天浸泡两次。每个药物浓度设三个平行对照缸，同时设置三个空白平行对照缸，每个对照缸放待用于感染的草鱼或鲫10尾。观察一周。
1.7草鱼、鲫水霉病治疗实验
1.7.1泼洒方式用药治疗水霉病
选取感染成功的草鱼、鲫分别进行泼洒药物治疗实验。根据体外实验结果设置3个药物浓度分别为2、4、8mg/L。每个药物浓度设置三个平行对照缸，同时设置三个空白平行对照缸，每个对照缸放感染成功的草鱼或鲫10尾。观察1周。
1.7.2浸泡方式用药治疗水霉病
选取感染成功的草鱼、鲫分别进行药物浸泡治疗实验。根据体外实验结果设置3个药物浓度分别为10、20、40mg/L，每次浸泡1h,每天浸泡两次。每个药物浓度设三个平行对照缸，同时设置三个空白平行对照缸，每个对照缸放感染成功的草鱼或鲫10尾。观察1周。
1.8 数据统计分析
根据农业部《渔药临床实验技术规范》进行药效（保护率）评价。保护率公式如下：
2 结果
表3泼洒药物对草鱼、鲫水霉病的预防效果
表4 药物浸泡对草鱼、鲫水霉病的预防效果
表3和4的实验结果表明：在防治方面，抗水霉制剂“复方立达霉粉”的两种用药方式无论是泼洒还是浸泡对水霉病均有较好的预防作用且随着浓度的升高保护率也随之升高，泼洒方式用药浓度在8mg/L对草鱼、鲫的水霉病平均保护率分别为90%、96.7%；浸泡方式用药在20mg/L浓度时对草鱼、鲫水霉病的平均保护率均达到76.7%，说明在防治方面泼洒用药方式效果远好于浸渍用药方式效果（由于高浓度时对鱼的毒害增大不适宜使用）。
表5泼洒药物对草鱼、鲫水霉病的治疗效果
表6 药物浸泡对草鱼、鲫水霉病的治疗效果
表5和6的实验结果表明：抗水霉制剂“复方立达霉粉”在治疗方面实验结果显示，泼洒方式在8mg/L浓度时对草鱼和鲫鱼的平均保护率仅有6.67%和13.3%，而浸泡方式在20mg/L浓度时对草鱼和鲫鱼的平均保护率均可达到43.3%，说明在治疗方面浸泡用药方式效果远好于泼洒方式效果。
3 讨论
药物泼洒和药物浸泡是水产养殖动物病害防治的两种主要用药方法。两种方法无论是泼洒还是浸浴实验结果都表明，抗水霉制剂“复方立达霉粉”对于预防水霉病有很好的保护率，其中泼洒方式在药物浓度为8mg/L时对草鱼、鲫的平均保护率分别可达到90%、96.7%；浸泡方式在浓度为20mg/L时对草鱼、鲫的保护率均可达到76.7%。
体外作用效果实验显示，抗水霉制剂“复方立达霉粉”在20mg/L浓度下作用1h开始对水霉菌丝有杀灭作用，而泼洒的浓度设置最高浓度仅为8mg/L。不同用药方式表现的不同效果也说明在水产动物病害防治上，正确的用药方式对治疗效果的重要，而对于水霉病的防治显然药物浸泡效果要好于药物泼洒。
抗水霉制剂“复方立达霉粉”的临床药效实验表明，其对水霉病的预防效果是良好的，同时也具有一定的水霉病治疗效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.立达霉在制备预防和/或治疗水产动物水霉病药物中的应用，其特征在于，所述的药物采用泼洒和浸泡两种方式分别预防和/或治疗草鱼和鲫鱼伤口处的水霉菌；所述的水霉菌为寄生水霉菌；所述的药物为立达霉加工后的复方立达霉粉；所述的复方立达霉粉由45%的立达霉、10%的硅藻土、20%的无水硫酸钠、24.5%的硫酸亚铁、0.5%的抗结剂组成；所述的复方立达霉粉为固体颗粒药物；所述的药物采用泼洒和浸泡方式在预防和治疗草鱼和鲫鱼水霉菌效果的最佳浓度分别是8mg/L和20mg/L。
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