CN103525954B - 一种以制革副废物为载体的固定化复合脱毛酶及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的了一种以制革副废物为载体的固定化复合脱毛酶的制备方法，其特征是先将制革副废物室温下于去离子水中浸泡后与戊二醛反应，过滤并用去离子水洗去制革副废物上残留的戊二醛；经戊二醛处理后的载体与复合脱毛酶反应，过滤并洗去载体上残留的复合酶，即得到以制革固体副废物为载体的固定化复合脱毛酶。其中复合脱毛酶的组分构成为，每100份复合脱毛酶包含55-80份的中性蛋白酶、10-25份的α淀粉酶和5-15份的胰酶。采用本发明方法制备得到的固定化复合脱毛酶中酶的固载量高、酶活收率高，且具有良好的稳定性和可重复使用性。将其用于生皮脱毛和分散胶原纤维，生产条件温和，对皮胶原水解过程和胶原纤维的分离松散程度的可控性提高，可以避免生产中产品质量的波动。

Description

一种以制革副废物为载体的固定化复合脱毛酶及制备方法

技术领域

本发明具体涉及一种以制革副废物为载体的固定化复合脱毛酶的制备方法，属于制革专用固定化酶制备的技术领域。

背景技术

浸灰脱毛作为一种古老的方法，在制革工艺过程中起着重要作用。常规灰碱法脱毛采用硫化物和石灰，并通过硫化物和石灰水解毛发、除去纤维间质等作用达到脱毛和分散皮胶原纤维的作用。由于该方法具有原料易得、成本低、操作简单、控制容易、成革质量稳定、使用范围广(猪、牛、羊皮均适用)等优点，目前国内外制革生产仍然以灰碱法脱毛为主。然而，灰碱法脱毛存在一些致命缺点，如硫化物污染、石灰污染以及因浸灰脱毛时大量的毛和表皮被降解所造成的有机物污染等问题。因此，制革工作者正努力寻求其它更为清洁的脱毛和胶原纤维的分散途径，以降低甚至消除浸灰脱毛工序的污染。

在过去的一个世纪里，人们已经发展了几种不使用硫化物和石灰的清洁化脱毛以及胶原纤维分散技术。生态脱毛技术方面，主要包括氧化脱毛法、生物酶脱毛法、有机硫化物脱毛法等。然而，用生态学的观点衡量，只有酶脱毛法才是真正意义上的保毛脱毛法，也是最清洁的脱毛方法。蛋白酶是最主要的脱毛酶，其脱毛效果好。但是蛋白酶脱毛的同时，不可避免会损伤真皮的结构，影响革制品的使用性能，这就严重限制了酶脱毛技术的应用。近些年来，随着制革清洁生产被提上议事日程，酶法脱毛的研究又再度成为研究热点。常规灰碱法浸灰脱毛，胶原纤维在得到分离松散的过程中，除去了多数纤维间质尤其是蛋白聚糖，并且通过石灰的作用以及在生皮基质中建立的渗透压产生规则的纤维和胶原小纤维的***。近些年，随着制革生态问题的日益严峻，针对常规灰碱法在浸灰过程中产生大量石灰淤泥的缺点，国内外研究者做了大量的工作，以找寻新的绿色皮革化学品替代石灰分离松散皮胶原纤维。基于上述原理，目前也有人通过采用液碱、硅酸盐以及生物酶等分散皮胶原纤维的方法。在传统的制革过程中，酶只是被作为对石灰分散皮纤维的一个补充，主要体现在软化工序中，如采用胰酶作用于脱灰裸皮的软化处理。近年，Thanikaivelan.P等人已经成功发展出使用α-淀粉酶的无石灰纤维开松方法(Thanikaivelan.P,Chandrasekara.B.Bharath.C.K,et al.Single step hair removal and fiber opening process:simultaneous andsuccessive addition of protease and α-amylase[J].J.Amer.Leather Chem,Ass.,2006,101:388-398.)。该方法已经应用于用商业蛋白酶和硫化钠进行脱毛处理的裸皮，是一个两步处理的方法。然而，本发明主要提供了一种固定化复合脱毛酶脱毛的方法，通过蛋白酶、胰酶、α淀粉酶结合使用，仅通过一步处理就可以同时保证除去毛和开松纤维。

目前在皮革工业中采用的酶处理方法主要存在以下缺点：(1)酶制剂的稳定性差，容易失活；(2)酶制剂通常与其它材料在同体系中使用，工序中使用的某些材料容易导致酶的失活；(3)酶的催化活性过高，工艺可控性差。因此，有必要研究固定化酶在制革领域中的应用，以形成保护和缓释之效果，增强制革专用酶制剂的耐用性和延长酶促反应时间。但在固定化酶技术中，载体的选择对固定化酶的活性及使用特性有着至关重要的作用。为了得到具有良好催化性能、载量高、成本低的固定化酶，现有技术利用了价格低廉，易得的天然高分子，如：活性炭、硅藻土、明矾、壳聚糖以及海藻酸钙等作为固定化载体。其中，壳聚糖、海藻酸钙作为固定化载体的研究比较广泛。但使用这些天然高分子作为固定化酶载体时，由于它们与酶的相容性及亲和性有限，得到的固定化酶中的酶的固载量及活力较低。在制革生产中，由原料皮加工成皮革所产生的无制革利用价值的固体废弃物产量很高，主要分为未鞣制和已鞣制的固体副废物。随着环境等全球性生态问题的日益严峻，如何充分高值利用制革固体废弃物，特别是经过鞣制的固体副废物，最大限度地减轻环境污染，成为制革固体副废物高值转化研究中的热点和重点内容。制革固体废弃物属于天然高分子物质，含有大量氨基和羧基，既易于与酶共价结合，又可结合金属离子，使酶对金属离子的抵抗力得到加强。同时，又容易接枝改性，是固定化酶的良好载体。

本发明研究了以制革过程中产生的经过鞣制处理的固体副废物为固定化酶用载体。利用制革副废物与酶分子之间存在的专一性亲和力、固载到副废物上的金属离子对酶分子具有一定程度的亲和力以及交联剂的共价连接等作用实现酶的固定化。鉴于目前环境保护的新形势，这也为制革行业所产生的大量固体副废物的资源化利用找到了新的途径。

因此，在提交本申请时，本发明对于本领域技术人员而言不是显而易见的，因此不会想到使用中性蛋白酶、α淀粉酶和胰酶来同时进行生皮酶脱毛和分散皮胶原纤维，更不会想到采用经过已鞣制的制革固体废弃物作为载体，对酶进行固定化负载处理。本发明的创造性在于使用以经过鞣制的制革固体副废物为载体制备得到的固定化复合脱毛酶同时进行生皮酶脱毛和分散胶原纤维。

本发明的新颖性和非显而易见性在于以制革固体副废物为载体固定化复合脱毛酶，使固定化复合脱毛酶在一步处理过程中同时实现脱毛和开松纤维，从而提供一种生态性良好的、安全的基于生物酶处理的新型脱毛和皮纤维分散技术体系。

发明内容

本发明的目的是针对现有生物酶的不足，提供一种改良的固定化复合脱毛酶及其制备方法，以解决当前酶脱毛和松散皮纤维时易造成成革质量问题(容易发生烂皮、烂面、松面及强度差等事故)、工艺控制性差等难题。

本发明提供的固定化复合脱毛酶及其制备方法如下：

1)先将100份制革固体副废物室温下浸泡于去离子水中1-4h，再加入10-30份戊二醛，并在15-35℃水浴中振荡反应1-3h，过滤并用去离子水洗去载体上残留的戊二醛；

2)准确称取一定量的复合脱毛酶溶于pH值为6.0-8.5的、离子强度为0.01-0.5mol/L的缓冲液中，配制成复合脱毛酶溶液，然后于5℃、8000r/min下离心10min，收集上层清液；

3)将制备好的制革固体副废物加入到复合脱毛酶溶液中，使复合脱毛酶与制革固体副废物比例为0.2-0.4，于5-25℃水浴中振荡反应0.5-2h，过滤并用去离子水洗去载体上残留的复合脱毛酶，即得以制革固体副废物为载体的固定化复合脱毛酶；

4)以上各物料的份数均为重量份。

5)以上方法中所用制革固体副废物为采用锆、铝、钛、铁、锌、稀土、硅任一金属盐或任两种或两种以上的金属盐混合预鞣或主鞣，所得坯革经削匀、修边、粉碎处理得到的平均粒径为5-50μm的粒状物。

6)以上方法中所用复合脱毛酶，其特点在于每100份复合脱毛酶包含55-80份的中性蛋白酶、10-25份的α淀粉酶和5-15份的胰酶。

本发明具有如下优点：

1)采用蛋白酶、胰酶和α淀粉酶同步脱毛和分散皮胶原纤维，具有协同作用。可以降低蛋白酶的作用程度，减轻或避免皮的损伤。同时，利用α淀粉酶、胰酶对蛋白多糖、弹性纤维等的水解，起到松散纤维、软化皮张的作用，是一种集脱毛、分散纤维、软化皮张于一体的复合脱毛酶。

2)由于本发明采用的制革固体副废物不仅可通过与酶分子之间存在的专一性亲和力制备固定化酶，而且固载到制革固体副废物上的金属鞣剂对酶分子具有一定程度的亲和力导致固定化，再者经过戊二醛的交联作用制备酶载量和活力均较高的固定化酶。不仅为固定化酶寻找到了一种新的性质优良的载体，同时也为制革固体副废物的高值转化开辟了一条新的途径。

3)通过对复合脱毛酶的固定化负载处理，对复合脱毛酶形成保护和缓释之效果，增强制革专用复合脱毛酶的耐用性和延长酶促反应时间。能够针对实际生产中，皮坯的差异、原料皮存在的部位差、酶的催化活性过高等问题可能导致的酶处理事故的发生，保证酶在使用过程中缓慢释放出其活力，均匀、长效地作用于皮组织，大大提高酶的使用性能，从而提高对制革酶处理过程的可控性。

4)本发明采用的载体来自制革固体副废物，其不仅来源丰富，而且市场价格低廉，化学性质稳定。

5)本发明方法工艺简单，易于实施，便于推广。

附图说明

图1为本发明制备的固定化复合脱毛酶与自由酶的相对活力与环境pH变化关系对比曲线

图2为本发明制备的固定化复合脱毛酶与自由酶的相对活力与环境温度变化关系对比曲线

图3为本发明提供的固定化复合脱毛酶的脱毛效果

图4为本发明提供的固定化复合脱毛酶加工得到的黄牛鞋面革粒面SEM观察图

图5为本发明提供的固定化复合脱毛酶加工得到的黄牛鞋面革断面SEM观察图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

另外，值得说明的是，以下各实施例中物料的份数均为重量份。

实施例1

将含钛副废物100份于室温下浸泡于去离子水中2h，然后加入24份戊二醛，于25℃水浴中振荡反应2h，过滤并用去离子水洗去载体上残留的戊二醛；称取30份的复合脱毛酶(其中中性蛋白酶21份，α淀粉酶6份，胰酶3份)溶于pH值为6.5的、离子强度为0.1mol/L的缓冲液中，配制成浓度为6％的复合脱毛酶溶液，然后于5℃、8000r/min下离心10min，收集上层清夜；将制备好的含钛副废物加入到复合脱毛酶溶液中，使酶与含钛副废物比例为0.3，于5℃水浴中振荡反应1h，过滤并用去离子水洗去载体上残留的复合脱毛酶，即得以含钛副废物为载体的固定化复合脱毛酶。

实施例2

将含锆-铝副废物100份于室温下浸泡于去离子水中2h，然后加入20份戊二醛，于35℃水浴中振荡反应3h，过滤并用去离子水洗去载体上残留的戊二醛；称取40份的复合脱毛酶(其中，中性蛋白酶30份，α淀粉酶6份，胰酶4份)溶于pH值为7.0的、离子强度为0.05mol/L的缓冲液中，配制成浓度为6％的复合脱毛酶溶液，然后于5℃、8000r/min下离心10min，收集上层清夜；将制备好的含锆-铝副废物加入到复合脱毛酶溶液中，使酶与含锆-铝副废物比例为0.4，于15℃水浴中振荡反应0.5h，过滤并用去离子水洗去载体上残留的复合脱毛酶，即得以含锆-铝副废物为载体的固定化复合脱毛酶。

实施例3

将含锆-铝-钛副废物100份于室温下浸泡于去离子水中4h，然后加入15份戊二醛，于15℃水浴中振荡反应3h，过滤并用去离子水洗去载体上残留的戊二醛；称取20份的复合脱毛酶(其中，中性蛋白酶16份，α淀粉酶2份，胰酶2份)溶于pH值为6.5的，离子强度为0.05mol/L的缓冲液中，配制成浓度为6％的复合脱毛酶溶液，然后于5℃、8000r/min下离心10min，收集上层清夜；将制备好的含锆-铝-钛副废物加入到复合脱毛酶溶液中，使酶与含锆-铝-钛副废物比例为0.2，于25℃水浴中振荡反应0.5h，过滤并用去离子水洗去载体上残留的复合脱毛酶，即得以含锆-铝-钛副废物为载体的固定化复合脱毛酶。

应用实施例1

取按常规方法浸水、去肉后的黄牛皮100kg，在转鼓中加入水100kg，调节温度至约18-22℃，调节pH至约7.5，加入按实施例1制备得到的固定化复合脱毛酶(酶用量为150-200u/g皮)，转动60min，停30min，以后间歇转动，转动10min，停20min，总时间2-4小时，毛松动后随机械作用而脱落。

应用实施例2

取按常规方法浸水、脱脂、去肉后的猪皮100kg加入转鼓，加入水60kg，调节温度至约25-28℃，调节pH至约8.0，加入按实施例2制备得到的固定化复合脱毛酶(酶用量为150-200u/g皮)，转动60min，以后间歇转动，转动15min，停30min，总时间4-6小时，毛松动后出鼓、拔毛。

应用实施例3

取按常规方法浸水、去肉后的山羊皮100kg，在转鼓中加入水80kg，调节温度至约28-30℃，调节pH至约8.5，加入按实施例3制备得到的固定化复合脱毛酶(酶用量为150-200u/g皮)，转动60min，停30min，以后间歇转动，转动10min，停20min，总时间3-5小时，毛松动后随机械作用而脱落。

为了考察制备的固定化复合脱毛酶的酶固载量及活力保持的情况，本发明随机选取以上实施例制备的固定化复合脱毛酶，并分别依据考马斯亮蓝法(Bradford.M.M.Arapid and sensitive method for thequantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Anal Biochem,1976,72(1/2)：248-254.)、固定化酶活力的测定方法(库汉生，姚晓玲，张婷，等.固定化胰蛋白酶活力的测定方法探讨[J].氨基酸和生物资源，2007，29(2)：33-35.中国人民共和国轻工行业标准.QB/T1803-1993[S].工业酶制剂通用试验方法，1993.)进行了酶固载量和活力保持的测定，测定结果见表1。

其次，本发明还考察了pH、环境温度对制备的固定化复合脱毛酶活力的影响程度。于40℃条件下，将固定化复合脱毛酶与自由酶分别置于pH值为6.0-9.0的缓冲液中保温10min后测定其酶活力，继而得到了pH值对固定化复合脱毛酶和自由酶活力的影响，结果见图1。由图1可见，固定化复合脱毛酶在考察pH值范围内较自由酶均表现出了更高的相对活力。在pH值为6.0时，固定化复合脱毛酶的相对活力在90％左右，而自由酶在60％左右。由此可见，复合脱毛酶经本发明方法固定后对pH的敏感性降低，可在更宽的pH范围内发挥较高的催化活力。在考察环境温度对固定化复合脱毛酶活力的影响时，将固定化复合脱毛酶与自由酶置于5-75℃下，pH值为8.0的磷酸盐缓冲液中保温10min后测定其酶活力，继而得到了温度对固定化复合脱毛酶和自由酶活力的影响，结果见图2。由图2可见，固定化复合脱毛酶在所考察的温度范围内较自由酶均表现出更高的相对活力，当温度达到75℃时，固定化复合脱毛酶仍可保持原有活力的80％，而自由酶仅为35％。由此可见，复合脱毛酶经此法固定后对温度的敏感性降低，并可在更广泛的温度范围内发挥较高的催化活力。

最后，本发明还考察了制备的固定化复合脱毛酶的应用效果。将按应用实施例1加工得到的裸皮经1.0％的硫化钠和0.7％的液碱(质量分数为30％的氢氧化钠溶液)补充脱毛、分散纤维后，不经过复灰、软化操作，直接按常规工艺进行浸酸、鞣制、鞣后湿加工以及做软等后整理处理。在此过程中，采用数码相机对使用固定化复合脱毛酶脱毛后的裸皮进行拍照，结果见图3。同时，采用JEOLJSM-5900LV型扫描电子显微镜观察的方法对加工得到的黄牛鞋面革样品进行粒面和断面情况观察，结果见图4、图5。由图3可见，采用固定化复合脱毛酶脱毛后的黄牛皮几乎只存在少量短小绒毛和新生小毛。从粒面形态可以看到，采用固定化复合脱毛酶脱毛后的裸皮，皮面洁白，粒面毛孔清晰，柔软性良好，可见固定化复合脱毛酶具有理想的脱毛综合作用结果。由图4可见，采用固定化复合脱毛酶加工得到的黄牛鞋面革，粒面平整、光滑，毛孔较完整。表明，固定化复合脱毛酶不同于常规生物酶，它未对加工得到的皮革质量带来十分显著的负面影响，具有高度安全性，工艺及成革质量稳定性高，具有温和脱毛和分散皮胶原纤维的能力。由图5可见，采用固定化复合脱毛酶加工得到的黄牛鞋面革，其胶原纤维的分离松散程度及均匀性较好，较大纤维束纵向***成较小纤维，可清晰地看到个别松散了的细小胶原纤维束。此外，还可以看到，胶原纤维束间呈现出一定的空隙。该空隙主要是在样品加工处理过程中因纤维间质的除去形成的。可见，与常规生物酶相比，固定化复合脱毛酶能够更好地除去纤维间质，分散胶原纤维。

表1

Claims (2)

1.一种以制革副废物为载体固定化复合脱毛酶的制备方法，该方法的工艺步骤和条件如下：

(1)先将100份制革固体副废物室温下浸泡于去离子水中1-4h，再加入10-30份戊二醛，并在15-35℃水浴中振荡反应1-3h，过滤并用去离子水洗去载体上残留的戊二醛；

(2)准确称取一定量的复合脱毛酶溶于pH值为6.0-8.5的、离子强度为0.01-0.5mol/L的缓冲液中，配制成复合脱毛酶溶液，然后于5℃、8000r/min下离心10min，收集上层清液；

(3)将制备好的制革固体副废物加入到复合脱毛酶溶液中，使复合脱毛酶与制革固体副废物比例为0.2-0.4，于5-25℃水浴中振荡反应0.5-2h，过滤并用去离子水洗去载体上残留的复合脱毛酶，即制得以制革固体副废物为载体的固定化复合脱毛酶；

所述的复合脱毛酶为每100份复合脱毛酶中包含55-80份的中性蛋白酶、10-25份的α淀粉酶和5-15份的胰酶，以上各物料的份数均为重量份。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述制革固体副废物为采用锆、铝、钛、铁、锌、稀土、硅任一金属盐或任两种或两种以上金属盐混合经预鞣或主鞣，所得坯革经削匀、修边、粉碎处理后的平均粒径为5-50μm的粒状物。