CN103512983B - 一种咖啡及制品中咖啡因的高效液相色谱测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种咖啡及制品中咖啡因的高效液相色谱测定方法，包括以下步骤：称取一定量样品于锥形瓶中，先加超纯水，再加三氯甲烷，加盖摇匀;三氯甲烷进行第一次超声萃取，将萃取液移入另一锥形瓶中;使用三氯甲烷进行第二次超声萃取，弃去试样；合并二次萃取液，加入一定量饱和氯化钠溶液和少量无水硫酸钠，直至液面无水花，过滤至100mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100mL；吸取10mL滤液到50mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并定容至10mL,吸取1mL～2mL用0.22μm微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱检测仪分析。本发明的测定方法准确、快速、安全、操作简便，且耗材少，成本低。
Description
技术领域
本发明属于咖啡因检测领域，尤其涉及一种咖啡及制品中咖啡因的高效液相色谱测定方法。
背景技术
咖啡因，又名咖啡碱，其化学名称为1,3,7,-三甲基黄嘌呤，属生物碱类化合物。它具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。它对神经***、心脑血管***、消化***、肿瘤化疗的生化调节、神经官能症和偏头痛等均有一些积极作用。
目前测定咖啡因的方法有高效液相色谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法、碘量法、重量法和分子印迹毛细管整体柱液相色谱法等，国内外常用的方法有高效液相色谱法，但传统的前处理方法操作繁琐，且咖啡因提取率不高，导致重复性差、准确度低。
发明内容
本发明提供了一种咖啡及制品中咖啡因的高效液相色谱测定方法，旨在解决现有技术使用高效液相色谱法进行咖啡因测定时存在的前处理方法操作繁琐，咖啡因提取率不高的问题。本发明在现有相关标准基础上对提取测定方法进行了研究和优化，建立了一种快速测定咖啡及制品中咖啡因含量的方法，并进行了比较，目的是建立准确、快速、操作简便的咖啡因测定的前处理方法。
本发明的目的在于提供一种咖啡及制品中咖啡因的高效液相色谱测定方法，该测定方法包括以下步骤：
称取样品0.5g～1.0g于150mL的锥形瓶中，先加2mL～3mL超纯水，再加50mL三氯甲烷，加盖摇匀;
处理萃取8min，静置30min，分层,将萃取液移入另一250mL的锥形瓶中;
向盛放样品的锥形瓶中加入40mL三氯甲烷进行二次萃取，超声萃取5min，静置30min，分层，弃去试样；
合并二次萃取液，加入5mL饱和氯化钠溶液和少量无水硫酸钠，直至液面无水花，过滤至100mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100mL；
吸取10mL滤液到50mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并定容至10mL,吸取1mL～2mL用0.22μm微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱检测仪分析。
进一步，高效液相色谱分析条件如下：进行高效液相色谱所用色谱柱为SunFireC18柱，5μm，150mm×4.6mm；高效液相色谱检测的流动相为甲醇和水的混合溶液；流速：1mL/min；检测波长：272nm；柱温：35℃。
进一步，甲醇和水的体积比为3∶7。
进一步，超声萃取时温度55℃，功率99%，频率40KHz。
本发明提供的咖啡及制品中咖啡因的高效液相色谱测定方法，解决了现有技术使用高效液相色谱法进行咖啡因测定时存在的前处理方法操作繁琐，咖啡因提取率不高的问题。本发明在现有相关标准基础上对提取测定方法进行了研究和优化，采用三氯甲烷超声萃取高效液相色谱法，建立了一种快速测定咖啡及制品中咖啡因含量的方法，该测定方法准确、快速、安全、操作简便，且耗材少，成本低。
附图说明
图1是本发明实施例提供的咖啡及制品中咖啡因的高效液相色谱测定方法的流程图；
图2是标准样品的咖啡因色谱图；
图3是咖啡因含量的标准曲线；
图4是本发明的测定方法所获得的样品咖啡因色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。
图1示出了本发明实施例提供的咖啡及制品中咖啡因的高效液相色谱测定方法的实现流程。
该测定方法包括以下步骤：
在步骤S101中，称取样品0.5g～1.0g于150mL的锥形瓶中，先加2mL～3mL超纯水，再加50mL三氯甲烷，加盖摇匀;
在步骤S102中，超声萃取8min，静置30min，分层,将萃取液移入另一250mL的锥形瓶中;
在步骤S103中，向盛放样品的锥形瓶中加入40mL三氯甲烷进行二次萃取，超声萃取5min，静置30min，分层，弃去试样；
在步骤S104中，合并二次萃取液，加入5mL饱和氯化钠溶液和少量无水硫酸钠，直至液面无水花，过滤至100mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100mL；
在步骤S105中，吸取10mL滤液到50mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并定容至10mL,吸取1mL～2mL用0.22μm微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱检测仪分析。
在本发明实施例中，高效液相色谱分析条件如下：进行高效液相色谱所用色谱柱为SunFireC18柱，5μm，150mm×4.6mm；高效液相色谱检测的流动相为甲醇和水的混合溶液；流速：1mL/min；检测波长：272nm；柱温：35℃。
在本发明实施例中，甲醇和水的体积比为3∶7。
在本发明实施例中，超声萃取时温度55℃，功率99%，频率40KHz。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实验材料
试验样品：焙炒咖啡粉，由英国食品和环境研究机构分析实验室能力验证中心提供，咖啡因含量为399mg/kg。
主要试剂和仪器：咖啡因标准品（纯度大于99.9%）购自国药集团上海化学试剂公司；Waters高效液相色谱仪（Waterse2695,配有2489紫外检测器）。
本发明提供的咖啡及制品中咖啡因的高效液相色谱测定方法，该测定方法按照如下步骤实施：
首先进行样品前处理：称取样品0.5g～1.0g（精确至0.0001g）于150mL的锥形瓶中，先加2mL～3mL超纯水，再加50mL三氯甲烷，加盖摇匀;在超声处理机上超声萃取8min，温度55℃，功率99%，频率40KHz，静置30min，分层,将萃取液移入另一250mL的锥形瓶中；向盛放样品的锥形瓶中加入40mL三氯甲烷进行二次萃取，在超声处理机上超声萃取5min，温度55℃，功率99%，频率40KHz，静置30min，分层，弃去试样；合并二次萃取液，加入5mL饱和氯化钠溶液和少量无水硫酸钠，直至液面无水花，过滤至100mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100mL；吸取10mL滤液到50mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入10mL容量瓶中定容至10mL,吸取1mL～2mL用0.22μm微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱检测仪分析，吸取时弃去最初3滴。
高效液相色谱分析条件如下：进行高效液相色谱所用色谱柱为SunFireC18柱，5μm，150mm×4.6mm；高效液相色谱检测的流动相为甲醇和水的混合溶液，甲醇和水的体积比为3∶7；流速：1mL/min；检测波长：272nm；柱温：35℃。
标准曲线绘制
在本试验条件下，通过Waters高效液相色谱仪分析建立标准样品的咖啡因色谱图，图2为标准样品的咖啡因色谱图，咖啡因的保留时间约为4.4分钟。以峰面积分值Y为纵坐标（微伏·秒），标准溶液浓度X（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，咖啡因含量的标准曲线如图3所示，并计算回归方程，咖啡因标准曲线方程为：Y=2.62678X+1.23313；相关系数R2=0.9999。通过该公式计算待测样品的上机含量。
本发明方法与国家标准方法进行准确度比较
方法1：按照GB/T19182-2003/ISO10095:1992试样处理方法处理。
方法2：按照GB/T5009.139-2003第二法高效液相色谱法试样处理。
方法3：本发明的三氯甲烷超声萃取高效液相色谱法。
参考物质测试
以参考物质样品1（对照样品）为试样，样品前处理分别按上述3种方法提取咖啡因，重复6次。结果表明：方法1和方法2所测定的咖啡因含量分别为132.68mg/kg、216.16mg/kg，低于对照样品（399mg/kg），相对误差分别为45.8%、66.7%；方法3所测定的咖啡因含量为395.47mg/kg，与对照样品（399mg/kg）相比，相对误差为0.9%，方法3的准确度最高。不同方法的准确度和精密度比较结果如表1所示。
表1不同方法的准确度和精密度比较
加标回收率测试
用对照样品做3种提取方法回收率，每种方法对照3个样品，然后分别准确加入一定量的咖啡因，按个方法提取咖啡因制备上机液并测定含量，计算加样回收率。通过加标回收试验，结果表明：3种方法的平均回收率依次为39.13%、69.27%、100.97%，RSD分别为1.84%、1.94%、0.60%，三种方法的加标回收率比较如表2所示，其中方法3的回收率最高，正常范围为80%～120%，准确度也最高。
表2三种方法的加标回收率比较
三种测定方法的综合比较
通过对三种方法的准确度、操作性、安全性、经济性和色谱图5个方面进行比较，三种方法的综合比较结果如表3所示，方法3最为准确、简单、快速、安全，峰型好、杂质峰少，方法3所获得的样品咖啡因色谱图如图3所示，适用于精密测定咖啡及其制品中的咖啡因的含量。
表3三种方法的综合比较
本发明通过对咖啡及其制品中咖啡因提取方法的研究，对HPLC测定咖啡因的含量的原有提取方法进行了优化和改进，建立了一种准确、简单、快速、安全的适合不同样品的咖啡因测定方法，该方法相比其他方法最为准确精密。实验结果表明，本发明测定方法使用的前处理方法使用三氯甲烷超声萃取，具有精密度好、重现性好、回收率高等特点，是测定咖啡及其制品中咖啡因含量的最佳前处理方法。
目前现行有效的国家标准GB/T19182-2003（方法1）和GB/T5009.139-2003（方法2），标龄已有10年，技术已不适用，不但操作繁琐，而且准确度和重复性也较差。特别是方法1，在溶液提纯过程中即难操作又不经济（纯化柱较贵），同时其与方法1、方法2比较，本发明的方法在超声萃取时间上进行了改进，第一次超声萃取8min，第二次超声萃取5min，超声条件为：温度55℃，功率99%，频率40KHz；同时省去了方法1溶液的提纯步骤，溶液过滤后直接上机测定；上机试样，用流动相甲醇溶液替换三氯甲烷。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种咖啡及制品中咖啡因的高效液相色谱测定方法，其特征在于，该测定方法包括以下步骤：
称取样品0.5g～1.0g于150mL的锥形瓶中，先加2mL～3mL超纯水，再加50mL三氯甲烷，加盖摇匀；
超声萃取8min，静置30min，分层,将萃取液移入另一250mL的锥形瓶中；
向盛放样品的锥形瓶中加入40mL三氯甲烷进行二次萃取，超声萃取5min，静置30min，分层，弃去试样；
合并二次萃取液，加入5mL饱和氯化钠溶液和少量无水硫酸钠，直至液面无水花，过滤至100mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至100mL；
吸取10mL滤液到50mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并定容至10mL,吸取1mL～2mL用0.22μm微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱检测仪分析；
高效液相色谱分析条件如下：进行高效液相色谱所用色谱柱为Sun Fire C18柱，5μm，150mm×4.6mm；高效液相色谱检测的流动相为甲醇和水的混合溶液；流速：1mL/min；检测波长：272nm；柱温：35℃；甲醇和水的体积比为3∶7；超声萃取时温度55℃，功率99％，频率40KHz。
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