CN103509182A

CN103509182A - 具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方法

Info

Publication number: CN103509182A
Application number: CN201210206856.5A
Authority: CN
Inventors: 张智军; 刘敏; 沈贺
Original assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2012-06-21
Publication date: 2014-01-15

Abstract

本发明所要解决的问题在于提供一种具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方法：通过迈克尔加成的方法，一步制备聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子基因载体。本发明的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体通过静电相互作用与带负电荷的DNA分子形成聚电解质复合物，复合物中的阳离子聚合物一方面包裹DNA使之不被核酸酶降解；另一方面其“质子海绵作用”可有效帮助复合物实现内涵体逃逸，释放的DNA进入细胞核表达相关蛋白质，实现基因治疗。

Description

具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基因治疗技术领域,特别涉及一种具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺阳离子高分子的基因载体及其制备方法,阳离子高分子与DNA结合后，有效实现内涵体逃逸，递送DNA进入细胞表达相关蛋白质，实现基因治疗。

背景技术

随着基因治疗研究的不断深入，尤其是基因治疗临床实验的广泛开展，人们越来越认识到选择恰当的载体，使目的基因靶向、可控并有效地表达，是基因治疗成功的关键。目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体（viralvector）和非病毒载体（non-viral vector）两种。病毒载体由于充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，转染效率高且对大多数细胞都有靶向作用，已被广泛而有效地得到了应用。但是其携带的DNA大小有限，而且病毒载体能引起免疫原性反应、致癌性以及能任意地整合到主体的基因组当中，存在着很大的安全隐患。而非病毒载体具有合成简单、可以携带大容量的遗传物质、无免疫原性等诸多优点，因此非病毒载体的研究倍受人们的重视（Mintzer MA,Simanek EE.Chem.Rev.2009,109,259-302;Morille M,Passirani C,Vonarbourg A,Clavreul A,Benoit JP.Biomaterials.2008,29,3477-3496）。

到目前为止，研究者们已设计了多种类型且各有特点的非病毒基因载体，其中，阳离子高分子由于具有安全性高，免疫原性低，易于对DNA进行操作，价格低，特别是其结构易于改造等优点，因此人们对阳离子聚合物作为基因载体的兴趣越来越高，基于阳离子聚合物载体的基因传递方式已经被广泛应用于人类遗传病和其他疾病的基因治疗研究。虽然这些阳离子载体具有极低的免疫原性，但是较低的转染效率和瞬时蛋白表达成为这类载体用于基因治疗中的最大障碍。因此如何提高阳离子聚合物基因传递体系的基因转染效率成为当前非病毒基因传递体系研究的热点问题之一。

众多的聚阳离子中，聚乙烯亚胺PEI由于极高的正电荷密度，可以和DNA形成紧密的络合体，因此引起了研究者极大的兴趣，使其成为近年来体内外细胞转染中研究最广、转染效率最高的合成载体。PEI较高的正电荷密度一方面赋予了其较高的转染效率，但同时赋予了其较大的细胞毒性，限制了其应用。为了降低PEI的细胞毒性，一些研究组从生物相容性考虑，设计合成了多种低毒性的PEI衍生物（Petersen H,Merdan T,Kunath K,Fischer D,Kissel T.Bioconjugate Chem.2002,13:812-821;Gosselin MA,Guo WJ,Lee RJ.Bioconjugate Chem.2001,12:989-994）。

发明内容

本发明所要解决的问题在于克服现有技术中聚乙烯亚胺的基因载体毒性较高的缺陷，提供一种具有高缓冲能力、高转染效率的基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法。

本发明的所要解决的又一问题，在于提供具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体。

本发明的所要解决的又一问题，在于提供上述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的应用。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明第一方面提供的技术方案是：具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

（1）取聚乙烯亚胺溶于无水甲醇，加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺,聚乙烯亚胺：N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为4：0.77，通往氩气保护，反应过夜；

（2）将反应液置于RC膜透析袋中，其截留分子量为3500，超纯水透析5-8天，冻干得到黄色油状固体，即为制备的聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子（MBA-PEI），保存在干燥器中。

优选地，所述聚乙烯亚胺分子量为423Da-1800Da。

优选地，所述聚乙烯亚胺分子量为800Da。

优选地，所述步骤（1）中反应温度为25-100°C

优选地，所述步骤（1）中反应温度为50℃。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明第二方面提供的技术方案是：提供上述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体，如下化学式I：

其中，X为6-210；Y为6-210。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明第三方面提供的技术方案是：具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体在基因治疗中的应用。

本发明中，“基因治疗”是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。通过基因传递，能够将功能基因***病人细胞，使其产生校正或调节疾病的特异性蛋白从而达到基因治疗的目的。通过基因治疗的方法可以治疗多种严重疾病，包括：遗传病（如囊性纤维病等）、心血管疾病、恶性肿瘤、白血病、感染性疾病（如AIDS、类风湿等）。

基因治疗的关键技术是基因传递载体的选择。与病毒载体相比，非病毒载体由于其安全、低毒、低免疫原性等特点备受青睐；同时，能够有效利用内涵体和溶酶体中的酸性环境避免降解的载体往往表现出较好的转染效率。因为其自身潜在的质子海绵效应。本发明制备的基于聚乙烯亚胺的基因载体具有很高的缓冲能力，当复合物被细胞摄取，能够有效的结合内涵体中的质子，使得内涵体膨胀、破裂，将复合物释放到细胞质中。然后复合物再克服其它屏障进入宿主细胞的细胞核表达。

本发明的基于聚乙烯亚胺的高效低毒的水溶性阳离子高分子基因载体，能够有效地与DNA通过静电相互作用形成聚电解质复合物，由于该类型的阳离子高分子中富含伯胺、仲胺和叔胺，在pH5-7之间具有极强的缓冲能力，能够有效质子化，致使内涵体发生渗透性膨胀而破裂，释放聚电解质复合物，而复合物中的阳离子聚合物一方面包裹DNA使之不被溶酶体内的水解酶降解；另一方面其“质子海绵样吸附作用”可抑制内涵体内的酸化，可能从而抑制了水解酶，而酶的抑制可能到聚合复合物在水解酶发生作用前被释放出来，从而提高了转染效率。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

1．本发明的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的阳离子高分子基因载体，DNA可以通过静电相互作用与阳离子高分子形成聚电解质复合物，聚合物结构中含有的大量叔胺基团有助于提高聚合物的缓冲能力，有利于复合物实现内涵体逃逸，并表达相关蛋白。该阳离子具有良好的生物相容性，同时具有高的转染效率，在某些质量比条件下，其转染效率要高于枝化的聚乙烯亚胺（Mw=25KDa）。

2.本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法，通过迈克尔加成的方法，一步反应制备阳离子高分子，方法简便，成本低，利于量产。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1是制备本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的化学反应式。

图2是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的缓冲能力示意图。

图3是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体在293T细胞中的细胞毒性对比图。

图4是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体与DNA结合后的凝胶电泳图。

图5是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体与DNA结合后的电势图。

图6是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体与DNA结合后的扫描电镜图。

图7是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体介导pEGFP-N1转染293T细胞的荧光图片。

图8是本发明具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体介导pEGFP-N1转染293T细胞的流式细胞仪分析。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，如《分子克隆实验手册》以及所用试剂和仪器的厂商说明书。聚乙烯亚胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺购自Sigma-Aldrich；甲醇购自国药集团化学试剂有限公司，细胞培养基、胰酶、胎牛血清购于GIBCO。293T细胞购自中国典型培养物保藏中心（武汉）。¹H NMR用Varian 400MHz型核磁共振波谱仪测定，以D₂O为溶剂，TMS为内标；WST细胞增殖毒性分析试剂盒（WST-1 cell proliferation assay kit）购于中国碧云天生物技术有限公司，用酶标仪（Biotek Elx 800 Microplate Reader，Biotek）检测；电势用马尔文粒度仪（ZEN3600-nanoZS，Malvern）检测；扫描电镜（SEM）用FEI Quanta400检测；GFP表达用激光共聚焦荧光显微镜（Nikon A1）和流式细胞仪（BDFACSAriaTM Ⅱ）检测。

本发明提供一种聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子基因载体，通过静电相互作用与带负电荷的DNA分子形成聚电解质复合物，复合物中的阳离子聚合物一方面包裹DNA使之不被核酸酶降解；另一方面其“质子海绵作用”可有效帮助复合物实现内涵体逃逸，释放的DNA进入细胞核表达相关蛋白质，实现基因治疗。

实施例1 基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体的制备方法

通过迈克尔加成的方法，一步制备聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子基因载体。

称取4g聚乙烯亚胺（Mw 800Da）溶于20mL无水甲醇中，然后加入0.77g的N,N-亚甲基双丙烯酰胺，通往氩气保护，50℃反应过夜。将反应液置于RC即用型透析袋（Mw 3500）中，用超纯水透析五天，冻干得到黄色油状固体，即为制备的聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子（MBA-PEI），保存在干燥器中。其合成示意图如图1所示。

实施例2 制备的聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子具有高的缓冲能力，能够帮助DNA实现内涵体逃逸，提高转染效率。

分子量为800Da和25KDa的PEI和MBA-PEI的缓冲能力通过酸碱滴定来检测。依据Benns报道的方法，分别称取6mg的分子量为800Da和25KDa的PEI和MBA-PEI溶于30mL 150mM NaCl，配制成0.2mg/mL溶液。首先将溶液用NaOH溶液(0.1M)调至pH为10，然后用0.1M盐酸滴定到pH值为3。以pH值对加入的盐酸的体积作图。如图2所示，该聚合物在pH 5-7之间出现了一个明显的缓冲平台，缓冲性能与PEI 25KDa相当，充分说明了他具有与PEI 25KDa类似的质子海绵效应，能够有效地帮助复合物实现内涵体逃逸。

实施例3 细胞毒性对比实验

用WST法来测定PEI 800Da、PEI 25KDa和MBA-PEI在293T细胞中的细胞毒性。在96孔板中以每孔8000细胞的密度种入293T细胞悬液100μL，将96孔板置于CO2培养箱中，在37°C中培养24h。将PEI 800Da、PEI 25KDa和MBA-PEI分别溶于完全培养基中，过滤除菌，用完全培养基将聚合物溶液稀释成不同的浓度。然后再将不同浓度的聚合物溶液加入到96孔板中，每孔加100μL，对照组加入100μL完全培养基，继续培养24h。最后移出培养基，每孔加入100μL新鲜培养基，然后每孔加入10μL WST，置于培养箱中培养2h，用酶标仪测定450nm处的吸收值OD450nm。每个高分子浓度及对照组做4个平行样。根据吸光值计算细胞的相对存活率。空白组即不加细胞及聚合物溶液，对照组即不加聚合物溶液。

细胞相对存活率(%)=100×(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)

如图3所示，所合成的聚合物与PEI 800Da相比，由于分子量的提高，其细胞毒性要明显高于PEI 800Da，但是要低于PEI 25KDa。说明制备的聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子具有较低的细胞毒性。

实施例4 聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子与DNA的相互作用能力测试。

聚合物能否有效的结合DNA，是基因传递过程中的一个重要因素。聚合物与DNA形成较为紧密的复合物，能够保护DNA不被细胞中的酶消化。具体分为三部分：包括凝胶电泳，zeta电位以及MBA-PEI与DNA形成复合物的扫描电镜检测。

4.1 凝胶电泳检测：

制备不同重量比的MBA-PEI/DNA复合物，w/w为0.5/1，2/1，5/1，8/1，12/1，15/1。涡旋5s后室温放置30min，然后将制备好的复合物与Loading buffer以及SYB Green混合后，加入到0.7%(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳实验。电泳条件为80V下80min，然后在凝胶成像***中观察。如图4所示，在实验条件下，所有DNA均滞留在孔中，说明聚合物能够很好的结合DNA。

4.2 Zeta电位检测：

MBA-PEI/DNA复合物的粒径和电位使用Nano-ZS在25°C时测定。1μgDNA和适量的聚合物溶液制备不同w/w的MBA-PEI/pEGFP-N1复合物。混匀后，在室温放置30min，然后将复合物溶液用超纯水稀释到1mL来测定复合物的电势。如图5所示，MBA-PEI/DNA复合物在电位33mV左右达到平衡。

4.3 MBA-PEI与DNA形成复合物的扫描电镜检测：

用扫描电镜（FEI Quanta 400）来观察复合物的形态。1μg DNA和适量的聚合物溶液制备w/w=5的MBA-PEI/pEGFP-N1复合物，涡旋5s后室温静置30min，然后将溶液滴加到玻璃片上，放在干燥器中过夜，使其干燥用于扫描电镜分析。如图6所示，MBA-PEI/DNA复合物的粒径大小为20-30nm左右

实施例5 聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子介导pEGFP-N1转染293T细胞的能力检测。

具体分为二部分检测，包括共聚焦显微镜定性观察MBA-PEI介导pEGFP-N1转染293T细胞表达的绿色荧光蛋白和流式细胞仪定量分析MBA-PEI介导pEGFP-N1转染293T细胞的结果。

用293T细胞来检测聚合物MBA-PEI介导pEGFP-N1转染细胞过程。293T细胞使用含有10%FBS的培养基在5%CO2培养箱中37℃培养。将293T细胞以80000细胞/孔的密度接种至24孔细胞培养板中，当24孔板内细胞的覆盖率达到80%左右时即可开始转染实验。将1μg pEGFP-N1和聚合物溶液制备成不同w/w的复合物溶液100μL，混匀并静置30min。实验时，移去24孔板内的培养基，加入900μL的OPTI-MEM培养基，再将100μL复合物溶液加入到24孔板中，培养4h后移去培养基，换成1mL完全培养基。继续培养48h。用共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达。如图7所示，MBA-PEI能够有效介导pEGFP-N1转染293T细胞，在视野范围内可以看到大量的绿色荧光蛋白表达。

共聚焦观察结束后，用流式细胞仪定量分析绿色荧光蛋白表达。首先，移除24孔板中的培养基，加入200μL 0.25%胰蛋白酶消化，然后加入500μL完全培养基中止消化，用移液枪将细胞分散后转入Ep管中，2500rpm离心5min,弃上清，加入PBS重悬，再2500rpm离心5min,弃上清，如此重复三次后，加入800μL 0.5mM EDTA的PBS溶液重悬，准备上机检测。细胞的转染实验均做两个平行样本，且重复二次以上。如图8所示，PEI 25KDa的转染效率在20%左右，MBA-PEI在w/w=2时，具有最高的转染效率（22%），随着重量比的增加，其细胞毒性也有所增加，抑制了其转染。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

（2）将反应液置于RC膜透析袋中，其截留分子量为3500，超纯水透析5-8天，冻干得到黄色油状固体，即为制备的聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子，保存在干燥器中，反应式如下。

2.根据权利要求1所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺分子量为423Da-1800Da。

3.根据权利要求1所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺分子量为800Da。

4.根据权利要求1所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中反应温度为25-100°C

5.根据权利要求1所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中反应温度为50℃。

6.一种具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体，其化学式I为

7.如权利要求6所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体用于基因治疗。