CN103224610B - 一种具有支化结构的缓控释酸敏感阳离子聚合物基因载体的制备和应用 - Google Patents
一种具有支化结构的缓控释酸敏感阳离子聚合物基因载体的制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种以乙二醇二缩水甘油醚和一种二元胺原酸酯单体(4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)为骨架,按摩尔比1∶1-2的比例聚合而成,不同比例聚合可以获得不同支化程度的聚合物。此种聚合物具有支化结构,酸敏感、降解可控,细胞毒性低、转染效率高的特点。作为高效的基因载体在基因治疗中具有广泛的应用前景。通过比较不同支化程度的聚合物的性质(如DNA包裹能力和转染效果),为以后的基因载体研究提供了宝贵的经验。
Description
技术领域
本发明属于生物医药、高分子医用材料技术领域,具体涉及一类以乙二醇二缩水甘油醚及一种两端含氨基的原酸酯新单体为原料制备的具有支化结构的、酸敏感的阳离子聚合物的合成方法及应用。
背景技术
基因治疗是一种全新的疾病治疗模式,是通过一定方式将正常基因或具有治疗作用的基因导入人体靶细胞进行适当表达,以纠正或改善疾病基因所产生的缺陷,达到治疗疾病的目的。随着基因治疗研究的不断深入,缺乏安全、有效的基因传递***是制约基因治疗实施的一个主要瓶颈。所以,开发合适的载体,尤其是酸敏感的、具有胞内缓释性能的基因载体,使目的基因在靶细胞安全、可控及高效表达,是基因治疗能否成功的关键。
基因治疗载体主要分病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有较高的转染效率,但存在免疫原性高、毒性大、靶向特异性差等弊端,严重限制了它们在临床上的应用。非病毒载体主要是指带正电荷的阳离子基因载体,包括阳离子脂质体和阳离子聚合物,具有低毒、低免疫反应、无基因***片段大小限制等优点。
常见的阳离子聚合物如聚乙酰亚胺(PEI)、聚赖氨酸、壳聚糖、树装大分子等,通过静电作用与DNA形成聚电解质复合物,可有效缩合质粒DNA。但是,强烈的静电作用也限制了基因进入细胞液后从复合物中的释放,限制基因表达。细胞组件如细胞质、内涵体、溶酶体、内质网、高尔基体、线粒体、细胞核都维持独特的pH值(pH值从溶酶体的4.5到线粒体的8.0)。细胞内不同组分的pH值梯度及显著的理化性质的变化,具有酸敏感的基因转运体系将对基因的细胞内传递产生积极影响。因此,pH酸敏感聚合物载体,可以通过改变自身大分子构象、结构对外界微环境的刺激做出响应,可以有效解决常规聚合物载体对于DNA“包装易、拆解难”的弊端,应用前景良好。
目前,聚乙酰亚胺PEI具有良好的DNA装载能力,及可促进DNA从内涵体逃逸至细胞质中的“质子海绵”特性,且转染效率高,是目前被研究的阳离子聚合物基因载体,有研究表明,PEI支化程度增加可以增强其包裹DNA的能力,但其不可降解,转染效率越高,细胞毒性也越大。本研究中合成的具有支化结构的阳离子聚合物,具有较强的包裹DNA能力,且细胞毒性低,其具备的酸敏感性能又使其具备较好的释放DNA的能力,能够满足临床的使用要求。并且,通过比较不同支化程度的基因载体,综合考察其性质(如DNA包裹能力,转染效果,细胞毒性,降解程度)等,为探寻最佳的基因载体提供可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合成的、具有支化结构的、酸敏感的、细胞毒性低、转染效率高的阳离子聚合物基因载体。该阳离子聚合物基因载体具有制备方法简单、成本低、细胞毒性低、安全实用、生物相容性好、可控的降解性能、基因转染效率高等优点。
本发明的目的在于提供上述具有支化结构的、酸敏感的、细胞毒性低、转染效率高的阳离子聚合物基因载体的制备方法。该制备方法工艺简单,易于控制,成本低廉。
本发明的目的在于提供上述阳离子聚合物在基因治疗中作为基因载体的应用。
本发明的目的在于提供一种具有支化结构的、酸敏感的、细胞毒性低、转染效率高的阳离子聚合物基因载体,是以乙二醇二缩水甘油醚和一种二元胺原酸酯单体(4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)为骨架,按摩尔比1∶1-2的比例聚合而成。
本发明提供的阳离子聚合物基因载体的制备方法包括以下步骤:取乙二醇二缩水甘油醚置于双颈瓶中,加入适量DMF,搅拌溶解后,向其中加入二元胺型原酸酯单体(乙二醇二缩水甘油醚∶二元胺型原酸酯单体摩尔比=1-2∶1)搅拌均匀,无水无氧室温条件下反应48h;将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中,蒸馏水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h;精确量取1mL透析产品冷冻干燥,即得支化程度不同的系列聚合物。
本发明提供的阳离子聚合物由乙二醇二缩水甘油醚和二元胺原酸酯单体聚合物而成,在两者比例不同时,随着乙二醇二缩水甘油醚摩尔比的增大,聚合物由线性结构开始逐步交联(支化),最终形成三维立体网状结构。聚合物中所含氨基带有正电荷,能够压缩DNA,形成纳米级的复合物,使其可以将核酸递送到细胞中。此聚合物中包含多胺及pH敏感原酸酯结构,具有微酸响应和降解可控的特点,使该聚合物作为基因载体可以使包裹的基因药物易于从内涵体和溶酶体中释放,有利于提高转染效率;其可降解性还使此聚合物具有良好的生物相容性,细胞毒性较不能降解的PEI大大降低。本发明的聚合物既保留了和PEI相当的高转染效率,又大大降低了细胞毒性,且具备酸敏感和降解可控的特点。
本发明提供了不同支化程度的聚合物,通过比较其性质,得出结论:支化程度越高对DNA包裹能力就越大,但细胞毒性也相应增大,转染效率也会降低,因此选择合适支化程度的聚合物才能获得最高的转染效率。
附图说明
图1为乙二醇二缩水甘油醚和二元胺原酸酯单体按照摩尔比为1∶1、1.5∶1和2∶1的比例合成得到的聚合物1、2、3的示意图。
图2为MTT法测定聚合物1、2、3细胞毒性示意图;其中,图2-2为2-1的局部放大图;
图3为聚合物1、2、3和DNA以不同质量比形成的复合物的凝胶电泳图;
图4-1为聚合物1、2、3和DNA以不同质量比形成的复合物的粒径分析图;
图4-2为聚合物1、2、3和DNA以不同质量比形成的复合物的电位分析图;
图5为聚合物1、2、3和DNA以不同质量比形成的复合物的基因转染情况图;
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步说明。本发明不局限于如下实施例,在本发明权利要求所阐明的范围内,可对本发明进行各种改变和等同替换。
实施例1具有支化结构的酸敏感阳离子聚合物基因载体的制备方法
取乙二醇二缩水甘油醚0.283g置于双颈瓶中,加入1mL DMF,搅拌溶解后,向其中加入0.5g二元胺型酸敏感单体(即乙二醇二缩水甘油醚∶二元胺型酸敏感单体摩尔比=1∶1)搅拌均匀,无水无氧室温条件下反应48h;将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中,蒸馏水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h;精确量取1mL透析产品冷冻干燥,称取冻干后的质量,即得到1mL透析溶液中聚合物的浓度。剩余量以液体形式冷冻保存。此聚合产物为聚合物1。
取乙二醇二缩水甘油醚0.424g置于双颈瓶中,加入1mL DMF,搅拌溶解后,向其中加入0.5g二元胺型酸敏感单体(即乙二醇二缩水甘油醚∶二元胺型酸敏感单体摩尔比=1.5∶1)搅拌均匀,无水无氧室温条件下反应48h;将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中,蒸馏水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h;精确量取1mL透析产品冷冻干燥,称取冻干后的质量,即得到1mL透析溶液中聚合物的浓度。剩余量以液体形式冷冻保存。此聚合产物为聚合物2。
取乙二醇二缩水甘油醚0.565g置于双颈瓶中,加入1mL DMF,搅拌溶解后,向其中加入0.5g二元胺型酸敏感单体(即乙二醇二缩水甘油醚∶二元胺型酸敏感单体摩尔比=2∶1)搅拌均匀,无水无氧室温条件下反应48h;将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中,蒸馏水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h;精确量取1mL透析产品冷冻干燥,称取冻干后的质量,即得到1mL透析溶液中聚合物的浓度。剩余量以液体形式冷冻保存。此聚合产物为聚合物3。
如图1所示,将二元胺型酸敏感单体与乙二醇二缩水甘油醚在不同的摩尔比的条件下,开环加成聚合,形成微观结构为线性、枝化或网状型高聚物。当两者摩尔比为1∶1时,聚合物主要以线性形式存在;随着单体2的增加,线性聚合物间开始交联(枝化),从而形成网状;当单体1∶单体2的摩尔比为1∶2,聚合物将形成三维立体网状结构(图1)。
实施例2以MTT法测定聚合物的细胞毒性
NIH/3T3细胞接种到96孔板中(1×104个/孔),每孔加入含10%胎牛血清DMEM培养基200μL37℃,5%CO2条件下培养24h。弃培养基,向各孔加入180μL新鲜DMEM培养基及以20μL以20mM HEPES溶液配置系列浓度的阳离子聚合物溶液,使聚合物终浓度为:1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、500mg/mL、1000mg/mL、5000mg/mL。37℃,5%CO2条件下再培养24h。每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,37℃继续培养4h。终止培养,弃去孔内培养上清液,加入100μL二甲基亚砜(DMSO),轻轻震荡10min。测定各孔于570nm的吸光值,计算细胞活性(见图2)。
如图得知,聚合物1、2、3的随着支化程度的提高,细胞毒性增加。但是聚合物1、2、3比PEI的细胞毒性小很多。PEI在浓度为25mg/mL的时候,细胞存活率为50%。而聚合物1、2、3分别在3500mg/mL、1000mg/mL和275mg/mL时,细胞存活率为50%。
实施例3复合物形成
以绿色荧光蛋白质粒pEG-N1为研究对象考察DNA和阳离子聚合物的结合情况。提取纯度>95%的pEG-N1溶解于20mM HEPES溶液中,配置成0.1μg/μL的DNA储液;用20mM HEPES溶液将聚合物1、2、3稀释到合适浓度梯度。取50μL DNA储液(即DNA量为5μg),向其中加入50μL复合物梯度浓度溶液,使最终体积为100μL,并使DNA∶聚合物(质量比)分别为8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16。将复合物涡旋振荡30s,室温放置20min即得。
实施例4复合物的琼脂糖凝胶阻滞实验和DNase I对复合物的酶解分析
按DNA∶聚合物(质量比)8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16配置复合物,每组中DNA量均为5μg,复合物终体积为100μL。涡旋振荡30s混匀复合物,室温下静止20min。取10μL复合物琼脂糖凝胶电泳检测复合物阻滞程度(见图3中(A))。
利用DNase I酶考察复合物对DNA的包裹情况,反应体系如下:
复合物 89μL
DNase I buffer 10μL
DNase I 1μL (0.1U/μL)
以上体系37℃保温10min,取10μL琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解程度(见图3中(B))。
随着聚合物质量比的增大,可以逐渐和DNA形成稳定的复合物。聚合物带有不同程度的正电荷,可以屏蔽DNA磷酸基团所带的正电荷,在电场中不能呈现由负极向正极的移动。即复合物在凝胶中的运动被阻滞。在稳定的复合物中,聚合物/DNA的质量比足够大,可以完全包裹DNA,从而阻断DNA降解酶DNase I对DNA的降解作用,使其不能被降解为<200bp的弥散条带。而未形成稳定复合物的梯度中,DNA均被降解为<200bp的弥散条带。
如图所示,polymer1:DNA ratio(W/W)>4∶1时,可以形成稳定的复合物。
Polymer2:DNA ratio(W/W)>2∶1时,可以形成稳定的复合物。
Polymer3:DNA ratio(W/W)>4∶1时,可以形成稳定的复合物。
实施例5复合物粒径的测定和Zeta电位的测定
按DNA∶聚合物(质量比)8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16配置复合物,每组中DNA量均为5μg,复合物终体积为100μL。涡旋振荡30s混匀复合物,室温下静止20min。利用马尔文粒径及电位分析仪测定各复合物的粒径(见图4-1)和电位(见图4-2)。
如图得知,当聚合物1、2、3与DNA的质量比为4∶1及更高时,聚合物均可以压缩DNA并形成稳定的、直径大小在150-250nm左右的复合物。并且随着聚合物的质量比的增大,复合物粒径变小,当质量比达到16∶1时,粒径可以达到150nm。在聚合物1、2、3形成的复合物中,聚合物2的粒径最小,说明聚合物1、2、3均可以和DNA形成稳定的复合物,其中聚合物2的对DNA的压缩最为有效。
实施例6体外转染实验
12孔板每孔接种50000个小鼠成纤维细胞NIH/3T3,37℃5%CO2培养24h。将质粒DNA稀释到合适浓度,使25μL的DNA溶液中含有2μgDNA。将聚合物稀释到一定浓度,按DNA∶聚合物(质量比)1∶4、1∶8、1∶16、1∶32为梯度加入不同量的聚合物,使最终加入的聚合物体积为25μL;将25μL聚合物加入到25μLDNA里面,吹打10次,以保证混合均匀;静置30min。得到转染复合物。取培养了24h的细胞,吸除细胞培养上清,用PBS润洗两遍,换上1mL无血清DMEM培养基;把复合物50μL加进去,轻微晃动,使复合物分散均匀;培养4个小时;吸除上清;用PBS润洗两遍,然后换上全培养基培养24h。使用荧光显微镜观察各孔的转染效果。图5中选取了PEI、聚合物1、2、3较好转染梯度:PEI/DNA=16∶1(w/w)时,聚合物1/DNA=192∶1(w/w)时,聚合物2/DNA=128∶1(w/w)时,聚合物3/DNA=64∶1(w/w)时的转染效果图。有图可知,PEI的毒性较大,在16∶1时转染效率最高,将PEI浓度再提高时,毒性过大,转染效率下降。聚合物1、2、3的毒性较PEI小得多,图中列出了聚合物1、2、3和DNA的质量比达到192∶1、28∶1、64∶1时的转染效果,较PEI最佳的转染效果好很多。说明本发明中聚合物在基因治疗领域具有很好的应用前景。另外,聚合物2的转染效率最佳。说明聚合物2的结构和支化程度最合适,既可以有效包裹DNA,又能有效释放DNA,且细胞毒性也较低,是一个极具应用的前景的聚合物。
Claims (7)
1.一种具有支化结构的酸敏感阳离子聚合物基因载体,其特征是该阳离子聚合物基因载体以乙二醇二缩水甘油醚和一种二元胺原酸酯单体4,4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)聚合而成,这种二元胺原酸酯单体的结构为
2.如权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体,其特征在于其由乙二醇二缩水甘油醚和一种二元胺原酸酯单体聚合而成,包含多胺及pH敏感原酸酯的结构,具有微酸响应和降解可控的特点。
3.如权利要求1所述的具有支化结构的酸敏感阳离子聚合物基因载体的制备方法,其特征在于包括以下步骤:取乙二醇二缩水甘油醚溶于DMF中,向其中按二元胺原酸酯单体∶乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比1∶1-2投入二元胺原酸酯单体,搅拌均匀,无水无氧室温条件下反应48h;将反应产物装入截止分子量为3000-4000的透析袋中,在加入0.01%三乙胺的蒸馏水中透析24-48h;产物冷冻干燥后即得。
4.如权利要求3所述的具有支化结构的酸敏感阳离子聚合物基因载体的制备方法,其特征在于以乙二醇二缩水甘油醚和一种二元胺原酸酯单体聚合而成,并且乙二醇二缩水甘油醚和二元胺原酸酯单体在聚合时的比例不同,获得的阳离子聚合物的结构和支化程度便不同,当二元胺原酸酯单体与乙二醇二缩水甘油醚摩尔比为1∶1时,聚合物主要以线性形式存在;随着乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比增加,线性聚合物间开始交联支化,从而形成网状;当二元胺原酸酯单体和乙二醇二缩水甘油醚的摩尔比为1∶2,聚合物将形成三维立体网状结构。
5.权利要求1所述的具有支化结构的酸敏感阳离子聚合物基因载体,其特征为用于非病毒基因载体的用途;该载体为纳米级,可以和基因药物形成纳米复合物,基因药物包括DNA或RNA。
6.根据权利要求5中所述的纳米级复合物的制备方法,其特征为:将权利要求1所述的阳离子聚合物和基因药物DNA/RNA用去离子水溶解,混合,涡旋振荡30s,室温静止30min,阳离子聚合物和DNA/RNA通过静电结合自组装成纳米复合物。
7.如权利要求6所述的纳米复合物,其特征在于用于将基因药物有效递送至细胞并有效释放基因药物,因为其具有不同程度的支化结构,便于寻找不同基因药物在传递和释放两方面的平衡点,从而满足不同基因药物的要求。
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