CN103505910A - 一种一次离心法制备富血小板血浆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于富血小板血浆制备技术领域，具体公开了一种以一次离心法制备富血小板血浆（PRP）的方法。所述方法仅利用一部高速自动离心机，采用一次离心法，整个过程仅需一次移液（吸取分界层血浆），以达到方便快捷、污染风险低的目的。而且，利用本发明所述方法制备得到的富血小板血浆中血小板细胞浓度均值达1029.875×10⁹/L；PRP中血红蛋白量为20.26g/L，可以很好的满足临床需要。

Description

一种一次离心法制备富血小板血浆的方法

技术领域

本发明涉及富血小板血浆的制备方法，具体地，涉及一种一次离心法制备富血小板血浆的方法。

背景技术

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是通过离心人或动物自身的全血而得到的含高体积分数血小板的血浆。自从上世纪80年代DAVID R. KNIGHTON等人发现血小板细胞能促进血管增生、胶原合成后，人们便致力于将富血小板血浆（PRP）应用于临床，渴望解决修复能力低下的器官组织的损伤修复问题。但由于当时PRP制备困难，限制了其在临床上的推广。

    经过几十年的研究，已探索出几种较为合适的富血小板血浆制备方法：手工法（一次离心法、二次离心法和三次离心法）及设备制备法。其中，二次离心法的PRP的提取率最高，在临床的应用也最广。利用二次离心法制备PRP的原理如下：（1）抽取静脉血液并将其注入含抗凝剂的试管内；（2）第1次离心可将血液分为3层，最底端的部分为约占血液总体积分数55%的红细胞；顶端部分为约占总体积分数40%的贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)，主要是纤维蛋白原等血浆成分；中间层为仅占总体积分数5%的血小板浓缩物(platelet concentrate，PC)，即俗称的黄衣层；（3）用移液器吸取PPP和PC以及紧邻PC的部分红细胞，并将其注入另一不含抗凝剂的试管中；（2）以一定的速度和时间再次将其离心并将血浆分为3层，最底端是少量剩余的红细胞，顶端是约占总体积分数80%的PPP，两层之间即富集的血小板；（5）用移液器抽取大部分的PPP，并留取足够的血清来容纳悬浮于其中的富集的血小板，得到PRP。另外，PRP中的血小板在体外较脆弱且容易激活，过高的离心速度会使血小板膜破裂降低其生物活性，而较低的离心速度可使血小板活性在制备过程中保持在最低水平，因此离心时速度不宜过快。而且，在不同的离心次数、离心力和离心时间所制备出的PRP中，血小板的体积分数以及各种生长因子的量和活性各不相同。

    目前虽能制备出成分较为单一、浓度达标的PRP，但其制备技术仍未完全成熟，大多数人推崇的二次离心法存在着操作复杂、过程漫长、产品污染的风险。我国威高公司即将上市的PRP设备存在着PRP中血小板浓度不高的缺陷，而在美国已经上市的PRP设备，其PRP中血红蛋白浓度未公开，因此可能存在着血小板细胞浓度高但纯度不高的缺陷，而且各个上市的PRP设备，其价格相当昂贵，在临床应用推广方面受到较大限制，尤其在发展中国家的应用。目前，解决PRP制备问题的方法仍值得进一步探究，以得到一种方便快捷、纯度及浓度高、价格低廉的制备方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题克服目前传统手工法制备富血小板血浆浓度或纯度不高、以及手工二次离心法制备过程复杂、采用上市设备套装制备成本高的缺陷，为临床研究提供一种能制备得到浓度及纯度均高的富血小板血浆的技术，其制备过程简便，成本低。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种一次离心法制备富血小板血浆的方法，包括如下步骤：将混有抗凝剂的全血以1400g的离心力离心15分钟，离心结束后，全血将分成3层，上层为贫血小板血浆层，中层为富血小板血浆层，下层为血红蛋白层，然后均匀吸取中层血浆即得富血小板血浆。

优选地，所述抗凝剂为肝素或水蛭素。更优选地，所述抗凝剂为肝素。

优选地，所述肝素在全血中的添加量按照肝素与全血的体积比为0.2：10来确定，所述肝素为12500单位/2mL的肝素。

    优选地，所述富血小板血浆的具体制备方法为：将混有1.0mL浓度为12500单位/2mL肝素的50mL全血以1400g离心力进行离心15min分钟；离心结束后，全血将分成3层，上层为贫血小板血浆层，中层为富血小板血浆层，下层为血红蛋白层，于中层均匀吸取4mL血浆即得富血小板血浆。

本发明仅利用一部高速自动离心机，采用一次离心法，整个过程仅需一次移液（吸取分界层血浆），以达到成本低、制备方便快捷、污染风险低的目的。经过广东省人民医院骨科的研究（结果见附表及图），本发明专利制备得到的PRP中其平均血小板浓度达1029.875×10⁹/L（为全血血小板浓度的3.8倍，标准差为259.92，标准误为91.89，95%可信区间为（812.58，1247.17）），平均血红蛋白浓度仅为20.26g/L（标准差为15.82，标准误为5.59，95%可信区间为（7.03，33.49）），这就达到纯度及浓度高的目的。本发明专利制备的PRP，仅利用一台高速离心机即可，制备消耗理所当然较采用上市的设备套装制备成本少，因此具有价格低廉的优点。

    本发明所述方法比传统的一次离心法（Anitua法）好：在1999年，西班牙Eduardo Anitua博士发明了Anitua法。他当时采集患者10至20mL静脉血，加入5mL的多个离心管内，以160g离心力离心6分钟，然后弃取上层（贫血小板血浆层）1ml，再吸取剩余上层血浆至下层（红细胞层）1～2mm，这样5mL的静脉血大约可以获取1.2mL的PRP。他当时分析（n=10），所弃去的上层血浆中血小板细胞数量仅仅少于全部血小板的15%，可见仍有较多血小板残存于上层而被弃掉，表明Anitua法所采取的的离心时间和离心力不足以使大部分血小板沉降于中层。本发明技术的离心时间及离心力均较Anitua法多，可使滞留于上层的血小板沉降至中层。

    与二次离心法（Landesberg法）相比：二次离心法制备的PRP时，初次离心采用低速离心，然后取交界面下3mm以上的血浆，这其中必然残存有大量的血红蛋白。而在第二次高速离心后，吸取全部下层血浆，即为PRP，这其中包含了初次离心后残留的血红蛋白。以Landesberg法制备得到的PRP中，血红蛋白量高。另外，二次离心法需多经一次移液，制备过程复杂，污染风险高。

与现有富血小板血浆制备方法、制备设备相比，本发明具有以下有益效果：

   （1）本发明所述富血小板血浆的制备方法与传统一次离心法相比，制备得到的PRP的浓度及纯度更高，与二次离心法相比则更加方便、快捷，大大降低手工法制备富血小板血浆的操作时间及污染风险。本发明专利的技术方法耗时15分钟，而二次离心法中最为推崇的Landesberg法耗时较多，需两次均为10分钟离心时间，加上额外1次的吸取移液的操作时间，而且，二次吸取移液过程不仅增加了操作的复杂性，更严重的是增大了污染机会。本发明专利的技术方法仅需1次离心，则避免了第二次吸取移液的过程，操作更为简便，更重要的是大大降低血浆直接暴露的时长。

   （2）本发明专利的技术方法制备的富血小板血浆中血小板细胞浓度均值达1029.875×10⁹/L。而在本研究单位利用Landesberg法制备得到的PRP中血小板细胞浓度为1204.8333×10⁹，两者比较没有明显差异；但在另一方面，利用本发明专利的技术方法制备得到的PRP中血红蛋白量为20.26g/L，Landesberg法制备得到的PRP中血红蛋白量为59.533g/L，两者相比有明显差异（P=0.023）。而我国威高公司的制备***制备的PRP中血小板细胞浓度均值为819.47×10⁹（李明、张长青、袁霆等：富血小板血浆制备套装的评估研究[J]. 中国修复重建外科杂志.2011,25(1) 112-116），因此利用本发给制备的血小板浓度明显较我国上市设备套装的高。

   （3）本发明专利技术方法将要于我院骨科开展，初步拟定的患者整个治疗过程约花费3500元。而上市的PRP设备，单单是制备出PRP就需300～400美元，还未计算患者治疗过程的其他费用，如美国的GenesisCS设备***的套装价格为1550美元，我国威高公司即将上市的PRP设备***的套装价格为8000元。因此，以本发明专利的技术方法制备PRP，相对于其他设备***，更加实惠。

说明书附图

图1. 17种离心处理方法制备得到的PRP中血小板计数的均值。

图2. 17组的PRP及全血中血小板计数结果。

图3.本发明15-1400方法和Landesberg法获得的PRP中PLT和HGB均值。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

因为制备得到的富血小板血浆（PRP）最终要用回至人体，所以，制备PRP的全过程需严格无菌。

实施例1 

    S1. 材料与方法

    主要仪器设备及试剂：eppendorf 5702离心机，离心管，EDTA采血管，注射器，肝素钠，全自动血细胞分析仪。

S2. 实验对象：首先根据以下6点筛选出患者: 

1、拟自愿接受富血小板血浆注射治疗的患者。

2、患者静脉血血细胞分析结果三系在正常范围内：血小板计数在100～300×10⁹/L之间，血红蛋白女性在135～150g/L之间，男性在140～155g/L之间，白细胞数在4～10×10¹²/L之间。

3、红细胞沉降率、C反应蛋白在正常范围内。

4、全身及治疗局部无感染表现者。

5、基础情况好，无高脂血症、糖尿病等对血液成分影响巨大的血液***外疾病。

6、患者知情同意。

S3. 实验方法

S31. 分组方法： 首先将17种离心处理方法进行编号（1至17号），然后让志愿者选择一个号码，根据号码对应离心处理方法入组，如志愿者1选择了号码1，则将其分配至1组，其对应的离心处理方法为编号1的离心处理方法。17种离心处理方法如下：经上述条件筛选出实验志愿者后，用肝素湿润了的注射器于患者肘静脉采集血液50mL，注入离心管内，按其所在组的处理方案进行离心处理：

表1 17种离心处理方法

1～12组和14～17组中，肝素的加入量按照肝素与全血的体积比为0.2：10来确定，13组中肝素的加入量按照肝素与全血的体积比为0.25：10来确定。所述肝素的浓度均为12500单位/2mL。

S32. 离心方法及检验：

全血常规检查：用EDTA采血管于患者肘静脉采集2mL血液，作全血常规分析。

用预先用1.0mL12500单位/2mL的肝素湿润的60mL注射器1支，于患者肘静脉采集50mL血液，轻轻摇匀后，注入50mL离心管中。用另外一支离心管配平后，根据原先设计好的分组方案，进行离心。离心结束后，用长针头于中层均匀吸取4mL血浆（传统的Landesberg方法是于底层吸取4mL血浆），注入EDTA采血管中，作全血常规分析。

S4. 统计方法：以本发明一次离心法制备得到的富血小板血浆中血小板计数（PLT）与其全血血小板计数的3倍比较，采用配对t检验；在上述比较差异有统计学意义的组别间的比较，采用单因素方法分析或非参数检验；经以上两次检验后得出血小板最高的组别，将其与传统的 Landesberg法比较，两者的PRP中PLT和HGB的比较采用单因素方差分析或非参数检验。

S5. 结果

S51. 17种离心处理方法制备得到的富血小板血浆中的血小板计数，其统计描述见下表：各种一次离心方法的样本量、制备得到的富血小板血浆中血小板均值、均值的标准差、标准误、95%可信区间、极大值及极小值的统计量见下表2。

表2 17种离心处理方法制备得到的PRP中血小板计数统计结果

 

S52. 各种一次离心方法制备得到的富血小板血浆中血小板与其全血中的血小板的直方图见图1。由上表2和图1的结果分析可知：在一次离心法的17组中，富血小板血浆均值最高的组别是15min－1400g组，其均值为1029.875×10⁹/L，标准差为259.916，标准误为91.894， 95%置信区间为（812.5796，1247.1704）。在增加肝素用量的情况下，15min－1400g组富血小板血浆中的血小板均值为726.55，表明增加肝素会引起富血小板血浆中的血小板下降。在确定15分钟的离心时间条件下，最佳的离心力为1400g，增加或减少离心力均导致富血小板血浆中血小板下降。

S53. 17组内全血及富血小板血浆中血小板计数的比较(SPSS17.0，配对t检验)结果见表3和图2。

由表3和图2的结果分析可知：制备得到的富血小板血浆中血小板计数为全血中血小板计数3倍以上的组别有6分钟200g组，6分钟1000g组，6分钟1400g组，6分钟1800g组，10分钟1900g组，15分钟1200g组，15分钟1300g组，15分钟1400g组，15分钟3000g且增加肝素用量组。其中血小板血浆中血小板计数与全血中血小板计数的3倍比较有统计学意义的组别为15分钟1400g组，P<0.01。因此，可以认为，以一次离心法制备PRP时，采用1400g离心力进行离心15分钟就能制备出高质量的PRP，这即为本发明专利的技术方法。

表3 17组内全血及富血小板血浆中血小板计数的比较结果

S55.利用本发明所述方法（15min－1400g离心力）制备得到的PRP中PLT及血红蛋白量的均值与本研究单位采用的传统的二次离心法－Landesberg法制备的PRP进行比较，结果见下表4和表5。

表4

 

表5

 

    由上表4和表5可知，一次离心制备PRP时，以本发明专利的技术方法制备得到的PRP中血小板计数为1029.875×10⁹/L，与Landesberg法的1204.833×10⁹/L相比，采用两独立样本的t检验，t=－0.919，P=0.382，差异没有统计学意义，可以认为本发明专利的技术方法能制备出与二次离心法Landesberg法一样高浓度血小板的PRP。

S56. 采用本发明所述技术方案（15分钟－1400g离心力）与Landesberg法制备PRP中的血红细胞（HGB）比较结果见下表6、表7和图3。

表6

 

表7

 

    由表6和表7可知：本专利发明的技术方案与Landesberg法制备得到的PRP中HGB均值分别为20.2625g/L和59.533/L，两者比较，差异有统计学意义，可以认为以本发明专利制备得到的PRP中血红蛋白含量较Landesberg法低。（两独立样本t检验，t=－4.092，P=0.003）

由图3可知，以一次离心法制备PRP时，本发明专利的技术方法（15min-1400g）是一种最好的制备方法。其与Landesberg法相比，制备得到的PRP中血小板计数没有差异，但是以本发明专利的技术方案制备得到的PRP中血红蛋白量却比Landesberg法（HGB为59.533g/L）低，因此可以认为，本发明专利的技术方案可制备得打比Landesberg法更优质的PRP。

Claims (5)

1.一种一次离心法制备富血小板血浆的方法，其特征在于，将混有抗凝剂的全血以1400g的离心力离心15分钟，离心结束后，全血将分成3层，上层为贫血小板血浆层，中层为富血小板血浆层，下层为血红蛋白层，然后均匀吸取中层血浆即得富血小板血浆。

2.根据权利要求1所述制备富血小板血浆的方法，其特征在于，所述抗凝剂为肝素或水蛭素。

3.根据权利要求1所述制备富血小板血浆的方法，其特征在于，所述抗凝剂为肝素。

4.根据权利要求3所述制备富血小板血浆的方法，其特征在于，所述肝素在全血中的添加量按照肝素与全血的体积比为0.2：10来确定，所述肝素为12500单位/2mL的肝素。

5.根据权利要求1所述制备富血小板血浆的方法，其特征在于，所述富血小板血浆的具体制备方法为：将混有1.0mL浓度为12500单位/2mL肝素的50mL全血以1400g离心力进行离心15min分钟；离心结束后，全血将分成3层，上层为贫血小板血浆层，中层为富血小板血浆层，下层为血红蛋白层，于中层均匀吸取4mL血浆即得富血小板血浆。

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