CN103497974A - 一种提高纤维素酶解糖化得率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于木质纤维素酶解领域，公开了一种以木质素磺酸盐与直链醇的混合物为酶解助剂，提高纤维素酶解糖化得率的方法。方法具体步骤是：将纤维素分散于缓冲溶液中，加入木质素磺酸盐与直链醇混合物，再加入5～20FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在45～60℃温度下反应48～96h，获得糖类化合物水解液。本发明通过添加木质素磺酸盐与直链醇混合物，可使纤维素酶解糖化得率提高15.1%～24.6%。
Description
技术领域
本发明属于木质纤维素酶解领域，具体涉及一种以木质素磺酸盐与直链醇混合作为酶解助剂，提高纤维素酶解糖化得率的方法。
背景技术
随着世界人口的增长及经济的发展，人类对能源需求日益增大。而纤维素乙醇可有效解决能源短缺、资源匮乏以及缓解环境污染等问题，是代用燃油的第一选择，是生物燃油的主要发展方向。
目前的研究热点是利用酶解技术将木质纤维素水解生成生物乙醇，其工艺主要包括原料预处理、纤维素酶解、糖发酵以及蒸馏等工艺。但目前该工艺面临着众多的瓶颈问题，如预处理成本高、酶解效率低、纤维素酶利用效率低等，这几个方面的原因导致了纤维素的总生产成本高，制约生物乙醇的工业化生产。
目前针对如何提高纤维酶解效率、降低生产成本等问题，国内外众多研究学者已展开了研究。研究发现，非离子表面活性剂可以促进纤维素底物的酶解，提高纤维素底物的糖化得率。
针对非离子表面活性剂对纤维素酶解过程的影响，国内外学者已经展开了一系列的研究。Sipos等研究发现，通过添加PEG4000可以提高木质纤维素的糖化得率，作者认为PEG可与木质素分子上的酚羟基相结合，与纤维素酶产生竞争性吸附，从而减少纤维素酶在木质素上的无效吸附，提高水解液中纤维素酶的有效浓度，促进纤维素的酶水解反应（Comptes Rendus Biologies,2011,334:812-823.）。Yang等通过添加Tween80以提高玉米秸秆whatman1号滤纸的糖化得率，其认为Tween80可以有效防止纤维素酶在与纤维素底物相互作用的过程中失活，提高纤维素酶的利用效率，从而提高纤维素底物的糖化得率（BiochemicalEngineering Journal,2011,56(3):125-129.）。
但是PEG，Tween等非离子表面活性剂价格昂贵，不利于降低纤维素乙醇的生产成本。最近的研究发现，在酶解过程中添加木质素磺酸盐也可以有效提高木质纤维素的酶水解糖化得率。Zhu等研究发现来自SPORL处理的松木底物的木质素磺酸盐可以有效提高松木底物的酶解糖化得率，而且通过调节pH可以有效提高木质素磺酸盐对木质纤维素酶解的促进效果，实验结果显示，在pH为5，酶载量为13FPU/g葡聚糖时，经过SPORL预处理的松木底物的酶解糖化得率可达到91%（Biotechnology for Biofuels,2013,6:9.）。Zhou等研究发现通过添加不同分子量的木质素磺酸盐可有效提高不同种类的木质纤维素的糖化得率，其中对经过Kraft法预处理的松木底物的促进作用最大，其次是经过SPORL法预处理的松木底物。（Industrial&Engineering Chemistry Research,2013,52(25):8464-8470.）
由于木质素磺酸盐是木质纤维素亚硫酸法预处理液的主要成分，也可由纤维素乙醇副产的酶解残渣经过磺化反应所得到，因此，利用木质素磺酸盐为酶解助剂，不仅可以消除造纸废液对环境的污染，提高废弃物的利用价值，还可以有效利用纤维素乙醇生产过程中所产生的酶解残渣，提高副产品附加值，降低纤维素乙醇的生产成本，有助于推动纤维素乙醇的工业化。
但是利用木质素磺酸盐为酶解助剂还存在两个不足之处：其一，与非离子表面活性剂相比，木质素磺酸盐对木质纤维素酶解的促进效果比较低，所需掺量大；其二，木质素磺酸盐具有引气性，会在酶解过程引入气泡，不利于安全生产。
发明内容
针对目前酶解工艺所存在的纤维素酶解效率低、可发酵糖浓度低、生产成本高等问题，本发明的目的在于提供一种以来源丰富、价格低廉、可再生的木质素磺酸盐与直链醇的复配混合物为酶解助剂，提高纤维素酶解糖化得率的方法；
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）将100质量份的纤维素加入到500～5000质量份的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中；
（2）往步骤（1）的溶液中加入0.5～100质量份木质素磺酸盐与0.5～100质量份直链醇按比例混合的混合物；
（3）往步骤（2）的溶液中加入5～20FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在45～60℃温度下反应48-96h，获得糖类化合物水解液；
步骤（1）所述的纤维素为纯纤维素或木质纤维素。
步骤（1）所述的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。
步骤（1）所述的缓冲溶液pH=4.5～6.0，离子强度为25～100mmol/L。
步骤（2）所述的木质素磺酸盐的重均分子量为2500～50000Da。
步骤（2）所述的木质素磺酸盐为木质素磺酸钠、木质素磺酸钙和木质素磺酸镁中的一种以上，优选为木质素磺酸钠。
步骤（2）所述的直链醇为正辛醇、正癸醇、正十二醇、正十四醇、正十六醇和正十八醇中的一种以上，优选为正辛醇、正癸醇和正十二醇的一种以上。
步骤（2）所述木质素磺酸盐和直链醇的质量比为（0.5～50）:1。
步骤（3）所述温度优选为50℃。
步骤（3）所述反应时间优选为72小时。
本发明的原理：
木质素磺酸盐是一种阴离子表面活性剂，可通过静电作用及疏水作用吸附在纤维素分子上，而且可通过静电作用及π-π作用吸附在木质素分子上，因此木质素磺酸盐可以有效减少纤维素酶在纤维素分子及木质素分子上的无效吸附，提高酶解液中纤维素酶的有效浓度。而且木质素磺酸钠吸附在纤维素分子上，有利于破坏纤维素分子的晶体结构，降低纤维素分子的结晶度，提高纤维素的可及性，增大纤维素酶与纤维素分子之间的接触面积。
而直链醇具有疏水性，可以有效降低木质素磺酸盐溶液的表面张力，使其物理化学性质发生明显变化，提高木质素磺酸盐的表面活性，因此，与木质素磺酸盐单一组分相比，木质素磺酸盐与直链醇复配作为酶解助剂，其对纤维素酶水解反应的促进效果更加明显，可有效的提高纤维素酶解的糖化得率，降低纤维素酶的用量，进一步降低纤维素乙醇的生产成本。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明首次提出了利用木质素磺酸盐与直链醇复配提高纤维素酶解糖化得率，其中木质素磺酸盐来源丰富、价格低廉且可再生，是一种绿色环保的添加剂；而直链醇具有掺量低、不易起泡的优点，而且直链醇可从植物中提取得到，具有可再生性，是一种有利于安全生产的添加剂。
（2）本发明所述的方法，可使纤维素的糖化得率提高15.1%～24.6%。
（3）本发明方法有利于降低纤维素乙醇的生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
取100质量份Whatman1号滤纸，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为2500～10000Da的木质素磺酸钠与0.5质量份正十二醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为24.6%。统计结果如表1所示。
实施例2
取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为10000～50000Da的木质素磺酸钠与50质量份正辛醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为17.0%。统计结果如表1所示。
实施例3
取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入50质量份分子量为10000～50000Da的木质素磺酸钠与1质量份正辛醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为15.1%。统计结果如表1所示。
实施例4
取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为10000～50000Da的木质素磺酸钠与1.0质量份正辛醇，再加入5FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为18.9%。统计结果如表1所示。
实施例5
取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.5，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为10000～50000Da的木质素磺酸钠与1.0质量份正辛醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为19.8%。统计结果如表1所示。
实施例6
取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为5.5，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为10000～50000Da的木质素磺酸钠与1.0质量份正辛醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为18.0%。统计结果如表1所示。
实施例7
取100质量份微晶纤维素，加入到500质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为10000～50000Da的木质素磺酸钠与0.5质量份正十二醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为16.9%。统计结果如表1所示。
实施例8
取100质量份微晶纤维素，加入到2500质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为2500～10000Da的木质素磺酸钠与0.5质量份正癸醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为19.0%。统计结果如表1所示。
实施例9
取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为100mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为10000～50000Da的木质素磺酸钠与0.5质量份正十二醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为19.3%。统计结果如表1所示。
实施例10
取100质量份微晶纤维素与木质素的混合物，其中微晶纤维素所占比例为70%，木质素所占比例为30%，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为10000～50000Da木质素磺酸钠与1.0质量份正辛醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为22.6%。统计结果如表1所示。
以下试验例为采用单独添加木质磺酸盐或直链醇的方法，与采用本发明方法的实施例进行糖化得率的比较：
试验例1
取100质量份Whatman1号滤纸，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为2500～10000Da木质素磺酸钠，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为4.7%。统计结果如表1所示。
试验例2
取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入25质量份分子量为10000～50000Da木质素磺酸钠，再加入5FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为9.5%。统计结果如表1所示。
试验例3
取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入1.0质量份正辛醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为11.3%。统计结果如表1所示。
试验例4
取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入0.5质量份正癸醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为13.2%。统计结果如表1所示。
试验例5
取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入0.5质量份正十二醇，再加入10FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得糖类化合物水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，得到糖化得率增加量为14.2%。统计结果如表1所示。
实验结果
表1各例糖化得率增加量
| 糖化得率增加量 | 起泡情况 | |
| 试验例1 | 4.7% | 有泡沫 |
| 试验例2 | 9.5% | 有泡沫 |
| 试验例3 | 11.3% | 无泡沫 |
| 试验例4 | 13.2% | 无泡沫 |
| 试验例5 | 14.2% | 无泡沫 |
| 实施例1 | 24.6% | 无泡沫 |
| 实施例2 | 17.0% | 无泡沫 |
| 实施例3 | 15.1% | 无泡沫 |
| 实施例5 | 18.9% | 无泡沫 |
| 实施例7 | 19.8% | 无泡沫 |
| 实施例8 | 18.0% | 无泡沫 |
| 实施例9 | 16.9% | 无泡沫 |
| 实施例10 | 19.0% | 无泡沫 |
| 实施例11 | 19.3% | 无泡沫 |
| 实施例12 | 22.6% | 无泡沫 |
实验结果讨论
采用本发明方法的实施例1～12及加入单一的木质素磺酸盐或直链醇的对照组试验例1～5的糖化得率增加量如表1所示。通过表1结果可知，本发明按照一定比例将木质素磺酸钠与直链醇混合加入反应体系中可以使糖化得率增加值达到15.1～24.6%。实验证明，与单一加入木质素磺酸钠或直链醇相比，加入木质素磺酸盐与直链醇的混合物可以更为显著提高纤维素酶解糖化得率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种提高纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）将100质量份的纤维素加入到500～5000质量份的缓冲溶液中；
（2）往步骤（1）的溶液中加入0.5～100质量份木质素磺酸盐与0.5～100质量份直链醇按比例混合的混合物；
（3）往步骤（2）的溶液中加入5～20FPU/g以纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在45～60℃温度下反应48-96h，获得糖类化合物水解液；
步骤（1）所述的纤维素为纯纤维素或木质纤维素；所述的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液；所述的缓冲溶液pH=4.5～6.0，离子强度为25～100mmol/L；
步骤（2）所述的木质素磺酸盐为木质素磺酸钠、木质素磺酸钙和木质素磺酸镁中的一种以上；所述的直链醇为正辛醇、正癸醇、正十二醇、正十四醇、正十六醇和正十八醇中的一种以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的木质素磺酸盐的重均分子量为2500～50000Da。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的木质素磺酸盐为木质素磺酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的直链醇为正辛醇、正癸醇和正十二醇中的一种以上。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的木质素磺酸盐和直链醇的质量比为（0.5～50）:1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的温度为50℃，所述反应的时间为72h。
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