CN103492415A - 针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题为提供针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体。本发明提供针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体。

Description

针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体
技术领域
本发明涉及针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体。另外，本发明还涉及针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的单克隆抗体以及生产所述抗体的杂交瘤。
背景技术
通常广泛已知在生物体内肽自身具有激素、神经传导物质等各种各样的机能。近年公开了这样的肽中担负多个生理作用的肽。以往，一直认为被称作信号肽的短肽领域只担负使新合成蛋白质向内质网转移的作用，但是，近年，其他的生理作用相继被公开(非专利文献1)。
例如，已知钙网织蛋白(calreticulin)的信号肽的一部分通过主要组织相容性复合体(MHC)被提呈至细胞表面(非专利文献2)。对于该现象的生理学意义，考虑可能是为了监控细胞内蛋白质表达量或者正常的信号肽的生产比例的机制的一部分，但是没有得出结论。
另外提示，降钙素(calcitonin)的信号肽的一部分通过MHC被提呈至非小细胞性肺癌细胞的表面，细胞毒性T细胞将该信号肽作为表位识别，被期待涉及肿瘤疫苗的开发(非专利文献3)。
如上所述，逐步知晓信号肽不仅作为将蛋白质导入内质网的简单信号，而且具有新的生理·病理意义，不能否认尚未进行研究的信号肽与何种重要的生理现象例如作为原因不明的疑难病的重要因素相关的可能性。
作为所述疑难病的一例，可以举出阿尔茨海默病。阿尔茨海默病为以脑中的神经细胞脱落、淀粉状蛋白β蓄积、神经原纤维变化为病理特征的进行性认知症。基于该病理的特征，淀粉状蛋白β为根本原因的假说普及，虽对阿尔茨海默病的诊断·治疗方法进行了长年研究，但是，治疗方法根本不明确，甚至发病机理也尚未明确。鉴于这样的现状，最近，逐渐提出了淀粉状蛋白β原因说是否错误这样的意见(非专利文献4)。进而，存在提示淀粉状蛋白β以外的因子与阿尔茨海默病发病相关的报道。
非专利文献5中公开了，由淀粉状蛋白前体蛋白质的N末端到286残基的区域促进神经细胞的变性，笔者提到作为除淀粉状蛋白β以外的阿尔茨海默病的原因物质的可能性。
以往技术文献
非专利文献
非专利文献1：Trends in Cell Biology，1998，vol.8，pp.410-415
非专利文献2：Science，1992，vol.255，pp.1264-1266
非专利文献3：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，vol.29，no.105，pp.10119-10124
非专利文献4：Nature，2008，vol.456，pp.161-164
非专利文献5：Nature，2009，vol.457，pp.981-989
发明内容
发明要解决的技术问题
非专利文献5公开了，由淀粉状蛋白前体蛋白质的N末端到第286残基的蛋白质促进神经变性，但是，没有公开到该领域内的哪个部分为神经变性的本质原因部分的程度。
解决技术问题的技术手段
由该淀粉状蛋白前体蛋白质的N末端到17残基中含有序列编号1表示的信号肽(Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala TrpThr Ala Arg Ala：APP-SP)。因此，APP-SP具有有助于阿尔茨海默病的发病的可能性，今后，在用于阿尔茨海默病的诊断、治疗等方面，也可期待针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体是有用的。
本发明的一个目的在于，提供针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体。
也就是说，本发明如下所述。
(1)
针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体。
(2)
如(1)所述的抗体，上述信号肽为含有序列编号1的氨基酸序列的肽。
(3)
如(1)或者(2)所述的抗体，其是采用含有序列编号1的氨基酸序列的肽而得到的。
(4)
如(1)～(3)中任一项所述的抗体，为单克隆抗体。
(5)
生产(4)所述单克隆抗体的杂交瘤。
(6)
为受理编号(NITE ABP-1198)表示的杂交瘤。
发明效果
通过本发明，可以提供针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体。本发明的孔APP-SP抗体有可能能够用于阿尔茨海默病的诊断、治疗等。
附图说明
图1表示实施例1中抗体效价的测定结果。
图2表示竞争ELISA的测定结果。
图3表示抗APP-SP单克隆抗体的ELISA测定结果。
图4表示对于随机APP-SP(序列编号2)的ELISA测定结果。
图5表示圆点印迹法中的测定结果。
图6表示参考例中的抗体效价测定结果。
具体实施方式
以下，针对本发明，具体说明其优选的方式。需要说明的是，本发明并不限于为了实施以下发明的方式，可以在本发明主旨的范围内进行各种变形来实施。
本发明的抗体为针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体，该抗体优选为特异地识别淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体。
本发明中，所谓“淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽”(或者，有时表示为“APP-SP”)的含义为，由(a)序列编号1记载的氨基酸序列表示的肽。该序列中，在描述为Met(M)时表示游离(free)的蛋氨酸或者S-甲基蛋氨酸，氨基酸按照IUPAC的命名法由1个文字或者3个文字的表述来表示。
淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽可以为天然由来的游离的肽，也可以为按照以往公知的方法制备的肽。在肽合成的领域中，具有含有序列编号1的氨基酸序列的肽是既可以采用以往公知的方法化学合成，也可以采用微生物等利用重组技术合成的肽。
由本发明得到的识别APP-SP的抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体。根据近年的研究结果(例如，参照非专利文献5)，淀粉状蛋白前体蛋白质的含有信号肽部分的N末端区域显示促进神经细胞变性的作用，以作为阿尔茨海默病的原因物质被关注的APP-SP为抗原的抗体，将来可期待于能够应用于阿尔茨海默病的解析、诊断、治疗等。
本发明的针对APP-SP的抗体为使用含有APP-SP的抗原作为抗原而得到的抗体，可以使用例如，
(a)含有序列编号1的氨基酸序列的肽，或者
(b)含有序列编号1的氨基酸序列中，1个或者多个氨基酸被替换、缺失、添加以及/或者***后的氨基酸序列的肽，作为抗原。
优选，通过使用含有序列编号1的氨基酸序列的肽作为抗原而得到的抗体识别APP-SP。
抗原抗体反应可以通过使用上述抗原，像以往公知的那样，向被免疫动物给予作为抗原的物质来进行。
通过给予作为抗原的物质，引起被免疫动物中的免疫反应，从而可以生产本发明的针对APP-SP的抗体。
作为被免疫动物，没有特殊限定，但是，可以举出作为实验动物使用的豚鼠、大鼠、小鼠、兔以及棉羊等。
作为抗原的给予方案，没有特殊限定，但是，可以举出例如，皮下、腹腔内、静脉内、肌肉以及皮内等给予途径。作为抗原的给予方案，没有特殊限定，但是，可以通过例如，以2周的给予间隔，给予抗原约2～10次，从而生产针对APP-SP的抗体。
也可以根据给予方案适当地、由被免疫动物采集血清样本确认抗体的生产量，确认是否充分引起免疫反应。
最终免疫后，可以由被免疫动物采集血清，通过以往公知的方法精制得到抗APP-SP抗体。
用于初次免疫、追加免疫的抗原给予量，没有特殊限定，但是，作为与APP-SP相当的抗原的给予量，可以为例如，每只小鼠给予10～200μg。
给予抗原时，也可以同时给予佐剂。作为所述佐剂，可以使用能够以高效价引起免疫反应的以往公知的佐剂。可以举出例如，完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝等。
通过本发明的抗体的制备方法，可以得到多克隆抗体，接着，通过以往公知的方法精制抗体，能够得到纯度高的抗体。
另外，通过由生产抗体的被免疫动物的脾脏或者***等采集生产抗体的细胞，可以制备杂交瘤，另外，也能够得到单克隆抗体。
为了得到本发明的针对APP-SP的抗体，可以使用如下抗原溶液。
作为抗原溶液是含有为了得到针对APP-SP的抗体的抗原的溶液，作为抗原而使用：
(a)含有序列编号1的氨基酸序列的肽，或者
(b)含有序列编号1的氨基酸序列中，1个或者多个氨基酸被替换、缺失、添加以及/或者***后的氨基酸序列的肽时，
可以使用含有该肽与PEG类表面活性剂的肽胶束凝集体溶液作为抗原溶液。
本发明中，作为“PEG类表面活性剂”，只要是分子内具有聚乙二醇(PEG)结构的表面活性剂即没有特殊限定。
作为PEG类表面活性剂，可以举出，作为亲水性部分结构的PEG与，作为疏水性部分结构的胆固醇骨架、碳原子数8～20的饱和或者不饱和的脂肪族烃骨架等之间，通过与PEG末端的醇性羟基的醚键、酯键等而共价键合的化合物。
作为PEG部分的重复结构(乙二醇结构)的聚合度，为例如70以下，也可以为60以下。
作为PEG类表面活性剂，可以举出，例如，选自以下述式表示的组的至少1种化合物等。
化1
Figure BDA00003455368400061
(式中，m为0～10的整数，n为10～70的整数。x为30～60的整数。)
式中，n或者x表示重复结构的聚合度。
作为选自以上述式表示的组的至少1种化合物所示的PEG类表面活性剂，可以举出，上述式中，x为50的CS-050，m为1、n为60的PEG60，n为36的PEG36，n为24的PEG24，n为12的PEG12等。
上述肽与含有PEG类表面活性剂的溶液之间的混合没有特殊限定，只要将上述肽混合入含有PEG类表面活性剂的溶液中即可。
接着，混合佐剂作为肽胶束凝集体溶液，通过将上述肽作为抗原给予至被免疫动物，可以得到抗APP-SP抗体。
作为佐剂，可以举出，例如，完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝等。
混合佐剂时，优选使用超声波处理装置形成乳液。
对于肽胶束凝集体溶液，为了统一肽胶束凝集体的粒度分布也可以进行整粒，也可通过例如由凝胶过滤色谱、利用滤膜的过滤等方法统一粒度。
肽胶束凝集体的粒度可以为5μm～200μm，也可以为5μm～100μm。
肽胶束凝集体的粒度可以使用日机装社制的动态光散射粒度测量装置进行测定。
作为以往公知的方法，在希望制作针对肽的抗体时，使用载体蛋白质共价结合有多个肽的抗原。
该肽与载体蛋白质的结合可以通过以往公知的方法形成。
作为载体蛋白质，可以举出，例如，匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、小鼠血清白蛋白(MSA)、兔血清白蛋白(RSA)等。
使载体蛋白质结合上述肽时，可以在上述肽的N末端添加半胱氨酸等，使用与载体蛋白质结合的连接物(linker)。
作为所述连接物，只要是能够与载体蛋白质以及添加了半胱氨酸的肽相共价结合的连接物即没有特殊限定，但是，可以举出，例如具有N-羟基琥珀酰亚胺活化酯(NHS酯)、马来酰亚胺、碳二亚胺等官能基团的连接物。
本发明中，使载体蛋白质上载有抗原部位而得到针对APP-SP的抗体的情况下，如实施例公开的那样，作为抗原，使用(a)含有序列编号1的氨基酸序列的肽那样的具有APP-SP全长肽的肽时，不能得到针对APP-SP的抗体。
为了得到本发明的抗体，作为抗原的给予方法，没有特殊限定，但是，也可以测定抗体效价，给予抗原直到能够获得所希望的抗体效价。
抗体效价可以通过吸光度测定。抗体效价可以通过使用由被免疫动物适当采集的血液样本测定，优选使用通过离心分离等除去夹杂物的血清样本。
抗体效价没有特殊限定，但是，可以通过ELISA(enzymelinked immunosorbent assay：酶联免疫吸附测定)等以往公知的方法测定。
通过追加免疫得到显示所期望的抗体效价的血清时，通过以往公知的方法精制，可以得到抗APP-SP抗体。
抗体的精制中，可以使用例如，离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等色谱精制，盐析等方法，按照这样由血清样本得到的抗体为识别APP-SP的多克隆抗体。
对于多克隆抗体的抗原特异性可以通过ELISA等方法确认。
在已知得到识别APP-SP的抗体的情况下，可以通过以往公知的方法，由被免疫动物的脾脏或者***等采集生产抗体的细胞。通过使用所得到的生产抗体的细胞进行细胞融合，可以得到杂交瘤(融合细胞)。通过使生产抗体的细胞与骨髓瘤细胞(myelomacells)融合，可以得到杂交瘤。
作为与生产抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用小鼠等动物的通常能够获得的细胞株。
作为骨髓瘤细胞，可以举出例如，P3-X63-Ag8-U1、SP2/0-Ag14等。
使细胞融合后，通过筛选，可以选择性地仅增殖杂交瘤。作为筛选方法，优选用HAT培养基等培养。此时，为了有助于杂交瘤的增殖，也可以与胸腺细胞等饲养细胞一起培养。得到的杂交瘤生产的抗体的抗原特异性可以将培养上清通过ELISA等公知的方法测定而确认，从而可以仅选择能够确认所期望的抗体生产的杂交瘤。接着，通过克隆得到的杂交瘤，除去混合存在的目的以外的细胞，可以得到含有单克隆的杂交瘤。作为克隆的方法，可以举出例如，有限稀释法、软琼脂法、纤维蛋白凝胶法等。得到的杂交瘤可以通过以往公知的方法冷冻保存。由克隆后的杂交瘤，可以通过以往公知的方法制备单克隆抗体。例如，可以在小鼠的腹腔内使杂交瘤增殖，精制含有单克隆抗体的腹水而制备。另外，也可以用无血清培养基培养杂交瘤，通过精制该培养上清来制备。
本发明中得到的抗体，在使用小鼠作为被免疫动物时，作为小鼠抗体，可以通过以往公知的方法，成为嵌合抗体、人源化抗体、人抗体。特别是，识别APP-SP的嵌合抗体、人源化抗体，人抗体是对于阿尔茨海默病的治疗有效的抗体。
实施例
以下，通过实施例进一步具体说明本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。
实施例1：抗APP-SP单克隆抗体的制作
(1)肽(APP-SP)的合成
委托GL生物有限公司(上海)，通过Fmoc固相合成法进行人淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP，序列编号1)的化学合成。
化学合成的肽(APP-SP)，通过采用ODS柱，使用了含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水/乙腈(MeCN)作为流动相的浓度梯度法进行精制。
(2)抗原溶液的制作和免疫操作
使用下述式(I)表示的PEG60(polypure社制)作为PEG类表面活性剂，调制由(1)化学合成的APP-SP，达到0.8mg/mL APP-SP、1％PEG60，得到APP-SP可溶化的混合水溶液。
式(I)：
Figure BDA00003455368400091
将得到的调制溶液与等量的佐剂混合，超声处理得到作为乳液的抗原溶液。
将抗原溶液按照表1表示的给予方案给予至雌性小鼠BALB/c的腹腔内。采血1～7通过眼底进行。需要说明的是，作为上述佐剂，初次免疫时(0天)使用完全弗氏佐剂(西格玛公司制)，追加免疫时(14天以后)使用不完全弗氏佐剂(西格玛公司制)。
表1
天数 操作项目
0 采血1，给予抗原(60μg)
14 给予抗原(60μg)
21 采血2
28 给予抗原(60μg)
35 采血3
42 给予抗原(60μg)
49 采血4
56 给予抗原(60μg)
63 采血5
70 给予抗原(60μg)
77 采血6
84 给予抗原(60μg)
91 采血7，最终给予抗原(60μg)
(3)抗体效价的测定
为了评价按照(2)进行的免疫结果，使用按照表1所示的采血得到的血清如下进行ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)。
以成为2.5mg/mL APP-SP、1％PEG60的方式，调制由(1)化学合成的APP-SP和PEG60，从而得到调制溶液，将得到的调制溶液用0.45μm过滤器过滤。
将过滤液用纯水稀释350倍，在96微孔板(Nunc社制)中每个添加100μL，室温下静置一晚。丢弃孔内的溶液，添加3％BSA(西格玛公司制，白蛋白，牛血清，片段V，最小96％，冻干粉末)、0.1％NaN3，PBS(磷酸盐缓冲的盐水，pH7.0)250μL，静置3小时。丢弃孔内的溶液，添加用1％BSA、0.05％NaN3、TBS(Tris缓冲的盐水，pH7.5)稀释1000倍后的由采血1～7得到的血清100μL，静置1小时。用PBST(PBS(pH7.4)，0.1％吐温20)洗涤孔内6次后，添加用含有1％BSA的PBS(pH7.4)稀释4000倍后的HRP标记的抗小鼠IgG(H+Lchain)(MBL社制)100μL，静置1小时。用PBST洗涤孔内6回后，添加TMB+(Dako社制)100μL，在暗室静置30分钟。添加2当量硫酸100μL后，测定450nm和650nm的吸光度。将从450nm减去650nm的吸光度后的值作为纵轴，将得到的结果示于图1。
由图1的结果可以确认，在小鼠体内，进行了与人淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)具有结合性的抗体生产。
(4)生产抗APP-SP单克隆抗体的杂交瘤的制作
委托株式会社ベツクス，在(3)抗体效价的测定中，基于能够观察到抗体效价上升的小鼠B细胞制作杂交瘤。
使摘出确认了针对APP-SP的抗体效价上升的免疫开始后第94日的小鼠的脾脏而制备的B细胞，与骨髓瘤细胞P3U1，通过50％PEG1500(ロシユ社制)的作用细胞融合。将融合后的细胞接种至10片预先加入了饲养细胞的96孔板，通过HAT培养基使杂交瘤选择性地增殖。
将反应性得到确认的孔内的细胞用24孔板进行扩大培养。扩大培养后，与(3)同样地进行ELISA，选择显示阳性的杂交瘤，进行克隆。克隆通过有限稀释法重复进行2次，最终得到生产对APP-SP显示反应的单克隆抗体的1种克隆(以下，将该克隆称为12A3杂交瘤)。所述12A3杂交瘤在独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD，日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)于2012年1月6日基于专利手续的微生物保藏等的国际承认所相关的布达佩斯条约进行了国际保藏，并被受理(受理编号NITE ABP-1198)。
(5)12A3杂交瘤所生产的抗APP-SP单克隆抗体的评价
为了考察抗APP-SP单克隆抗体对于APP-SP的反应特异性，进行竞争ELISA。具体地，通过与(3)同样的方法，对于一次抗体反应，将培养了12A3杂交瘤的培养上清3倍稀释而使用，将该溶液中含有0.2％PEG60的情况(竞争-)，和含有100μg/mLAPP-SP、0.2％PEG60的情况(竞争+)进行比较。如图2结果所示，使APP-SP竞争时，信号强度减少92％，因此可以确认本单克隆抗体对于APP-SP的结合性。
另外，使用小鼠单克隆抗体亚类判定试剂盒(ロシユ社制)，分析12A3杂交瘤所生产的单克隆抗体亚类时，显示为IgG2a。
(6)抗APP-SP单克隆抗体的制备
对于3只雌性小鼠BALB/c每一只腹腔内给予姥鲛烷(西格玛公司制)0.5mL。1周后，每一只腹腔内给予预先培养的12A3杂交瘤1×107个。1周后，采集腹水，通过离心操作回收上清。由3只得到9.5mL上清液。以成为50％的方式在得到的上清液中滴加饱和硫酸铵溶液，在4℃下搅拌1小时。
接着，进行离心操作，舍弃上清。再次添加50％饱和硫酸铵、PBS(pH7.4)，轻轻搅拌后，进行离心操作，舍弃上清。在得到的沉淀中添加PBS(pH7.4)，并使之溶解。进而，使用脱盐柱PD-10(GEヘルスケア社制)将缓冲液更换为磷酸缓冲液。通过使用蛋白质G柱(GEヘルスケア社制)的亲和色谱，从该溶液仅精制IgG级分。洗脱液以0.1M甘氨酸(pH2.7)进行，通过脱盐柱PD-10将缓冲液更换为PBS(pH7.4)。通过测定UV280nm吸光度，可知得到15mg的抗APP-SP单克隆抗体。
(7)精制后的抗APP-SP单克隆抗体的ELISA评价
使用(6)中得到的抗APP-SP单克隆抗体，进行与(3)同样的ELISA。其中，对于一次抗体，使用含有(6)中得到的抗APP-SP单克隆抗体的溶液。结果示于图3。
如此，精制后，可以确认本抗体对于APP-SP的反应性。
(8)抗APP-SP单克隆抗体的特异性评价
为了评价由本实施例得到的抗体的反应特异性，针对重排(7)中显示反应性的抗原APP-SP的氨基酸序列而制作的随机APP-SP(序列编号2)的反应性，按照与(7)同样的ELISA进行评价。结果示于图4。根据该结果，本抗体对于虽然含有与APP-SP相同氨基酸成分但是序列順序不同的随机APP-SP不显示反应性，因此，可以确认反应特异性高。
(9)圆点印迹法中抗APP-SP单克隆抗体的评价
研究了由本实施例得到的抗体是否能够在圆点印迹法中检出APP-SP。将含有1mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL、0mg/mL APP-SP的1％PEG60水溶液，分别以每个1μL滴到硝基纤维素膜(GEヘルスケア社制)，使其干燥。浸于1％脱脂乳、TBS pH7.5、0.1％吐温20溶液，振荡1小时。接着，弃去溶液，添加含有10μg/mL的抗APP-SP单克隆抗体的0.2％脱脂乳、TBSpH7.5、0.1％吐温20溶液，振荡1小时。此后，弃去抗体溶液，用0.2％脱脂乳、TBSpH7.5、0.1％吐温20溶液进行3次洗涤操作(每次进行5分钟振荡)。然后，添加用0.2％脱脂乳、TBSpH7.5、0.1％吐温20溶液稀释4000倍后的抗-小鼠IgG碱性磷酸酶结合物(西格玛公司制)振荡1小时。弃去溶液后，用0.2％脱脂乳、TBS pH7.5、0.1％吐温20溶液进行3次洗涤操作(每1次振荡5分钟)。最后，添加NBT/BCIP溶液(PIERCE社制)，振荡30分钟。结果如图5所示。由该结果表明，本抗体在圆点印迹法中也可以检测APP-SP。
参考例
(1)肽的合成
委托GL生物有限公司(上海)，进行了在人淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP，序列编号1)的N末端添加了Cys残基的肽(以下，也称为Cys-APP-SP，序列编号3)的化学合成。
肽的化学合成通过Fmoc固相合成法进行。化学合成的肽(Cys-APP-SP)使用ODS柱，使用含有0.1％TFA的水/MeCN作为流动相，通过浓度梯度法精制。
(2)基于Cys-APP-SP和匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)的交联反应的抗原制造
将10mg/mL Cys-APP-SP的DMF溶液、与含有1％PEG60、83mM磷酸钠缓冲液、100mM EDTA、0.9M NaCl pH7.2的溶液，以体积比1∶4进行混和。将该混和溶液与10mg/mL马来酰亚胺活化的KLH等量混和，在室温下搅拌4小时。使用脱盐柱，仅仅将推定含有载体蛋白质与APP-SP的交联反应物的级分分取。
(3)对小鼠的KLH-Cys-APP-SP给予
将(2)中制备的抗原用表2所示的给予方案对小鼠进行免疫，进行采血。由采血得到的血液通过离心操作得到血清级分。
作为抗原，将0.2mg/mL的级分与等量的佐剂混合(形成0.1mg/mL的浓度)，进行超声处理，得到乳液的抗原溶液。需要说明的是，作为上述佐剂，初次免疫时(0天)使用完全弗氏佐剂(西格玛公司制)，追加免疫时(14天以后)使用不完全弗氏佐剂(西格玛公司制)。
表2
天数 操作项目
0 采血1，给予抗原(20μg)
14 给予抗原(10μg)
22 采血2
28 给予抗原(10μg)
35 采血3
42 给予抗原(10μg)
49 采血4
56 给予抗原(10μg)
63 采血5
70 给予抗原(10μg)
77 采血6
85 给予抗原(10μg)
91 采血7
(4)抗体效价的测定
为了评价(3)中进行的免疫结果，使用表2所示的采血方法所得的血清，如下进行ELISA。
将含有10μg/mLAPP-SP的0.002％吐温20溶液添加到微孔板(Nunc社制)，每孔100μL，在室温下，静置状态下过夜。第二天，丢弃孔内的溶液，添加250μL的3％BSA、0.1％NaN3、PBS(pH7.4)，在室温下静置2.5小时。接着，丢弃孔内的溶液，添加将血清用1％BSA，0.05％NaN3、TBSpH7.5稀释100倍后溶液(一次抗体稀释溶液)100μL。静置1小时后，用PBST(PBS pH7.4，0.1％吐温20)洗涤6次。接着，作为二次抗体，将HRP标记的抗鼠IgG(H+L链)(MBL社制)用含有1％BSA的PBS(pH7.4)稀释4000倍，添加100μL。静置1小时后，用PBST洗涤6次。接着，添加TMB+100μL，静置30分钟。添加2当量硫酸100μL，终止酶反应，测定450nm和650nm的吸光度。结果示于图6。通过该结果，显示没有获得针对APP-SP的抗体。
相关申请的相互参照
本申请是基于2011年1月7日申请的日本专利申请(日本特愿2011-2464号)以及2011年1月7日申请的日本专利申请(日本特愿2011-2465号)的申请，其内容在此作为参照而被引入。
产业实用性
通过本发明，可以提供针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的抗体。本发明的孔APP-SP抗体可以用于阿尔茨海默病的诊断、治疗等，由此具有在产业上利用的可能性。
序列表自由内容
序列编号1表示淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽(APP-SP)的氨基酸序列。
序列编号2表示将APP-SP的氨基酸序列重排而制备的随机APP-SP的氨基酸序列。
序列编号3表示在APP-SP的N末端添加Cys残基后的肽的氨基酸序列。
Figure IDA00003455369200011
Figure IDA00003455369200021

Claims (6)

1.一种抗体，其是针对淀粉状蛋白前体蛋白质的信号肽的抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述信号肽是含有序列编号1的氨基酸序列的肽。
3.根据权利要求1或者2所述的抗体，其是使用含有序列编号1的氨基酸序列的肽而得到的。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗体，其是单克隆抗体。
5.一种杂交瘤，其生产权利要求4所述的单克隆抗体。
6.一种杂交瘤，其由受理编号(NITE ABP-1198)表示。
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