CN103454413A - 双峰驼特异性抗体制备及免疫检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种免疫骆驼的最佳免疫程序及方法，所述免疫方法为双峰驼背部皮下多点注射，免疫周期为2周，注射抗原剂量为1mg/mL，免疫次数为3次。本发明还涉及兔抗骆驼IgG酶标二抗的制备流程及方法以及应用兔抗骆驼酶标二抗通过ELISA检测骆驼抗血清效价的方法及最佳检测条件。

Description

双峰驼特异性抗体制备及免疫检测方法

（一）技术领域

本发明属于抗体工程技术领域，本发明以内蒙古苏尼特双峰驼为研究对象，利用牛血清白蛋白（BSA）制备抗BSA的骆驼多抗，优化免疫条件。并制备兔抗骆驼IgG酶标二抗，建立间接ELISA检测试剂盒。

（二）背景技术

免疫***分为固有免疫和适应免疫，其中适应免疫又分为体液免疫和细胞免疫。

抗血清之所以能和有关抗原起免疫结合反应，是因为在抗血清中，含有相关的抗体蛋白质。在20世纪60年代初将具有抗体活性的动物蛋白定义为免疫球蛋白（immunoglobulin）。主要存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。一般Ig分子上L链的抗原性总是相同的(κ或λ)。但H链抗原性不相同（μ链、γ链、α链、δ链和ε链），据其将不同H链与L链组成完整Ig的分子可分为五类，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE），IgG，IgA和IgM还有亚类。Ig分子的基本结构是由四肽链组成的，即由二条相同的分子量较小的轻链（L链）和二条相同的分子量较大的重链（H链）组成的。

人体血清免疫球蛋白的主要成分是IgG，它占总的免疫球蛋白的70-75%，分子量约15万，含糖2～3%。

人体血清免疫球蛋白IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在。大多是抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，它在抗感染中起到主力军作用，能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用（调理作用），中和细菌毒素的毒性（中和毒素）和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力（中和病毒）。IgG在机体合成的年龄要晚于IgM，在出生后第3个月开始合成，3-5岁接近成年人水平。它是唯一能通过胎盘的Ig，在自然被动免疫中起重要作用。此外，IgG还具有调理吞噬和结合SPA等作用。

1993年，Hamers-Casterman等报道了在骆驼科动物（单峰驼，双峰驼，美洲驼等）体内存在一种只含重链不含轻链的天然重链抗体（Heavy chain antibody，HCAb）。之后，在一些软骨鱼体内也发现了与骆驼重链抗体结构相似的新抗原受体(new antigen receptor，NAR)。

由于骆驼重链抗体是纯天然的，不能直接作用于人，或者为人类所用。因此克隆骆驼体内重链抗体的可变区后，得到的仅由一个重链可变区组成的单域抗体，称之为重链可变区基因抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody，VHH)，其直径为2.5nm，长4nm，因此又被称为纳米抗体。作为一种小型的基因工程抗体，纳米抗体具备的高表达性、水溶性、稳定性、强组织穿透性及较弱的免疫原性等优点，使得该抗体在基础研究及药物开发等领域拥有广阔的前景[10]。目前，在欧美地区，基于骆驼重链抗体的VHH单域抗体的研究已成为一热点[11]，但在国内仍鲜见报道。

纳米抗体作为一个严格的单体，其特殊的结构及性质，使其具备一些其他普通抗体不具有的独特性质。如容易获得和表达、高水溶性和稳定性、靶向性、人源化简单等。

目前国内报道中，仅对一峰骆驼的血清分析不同抗原在骆驼的免疫过程中产生重链抗体的情况，不免存在偏颇。而则国外的研究重点在于重组VHH抗体的理化性质、应用以及抗原靶向性方面。目前对于制备骆驼抗体免疫过程的最佳条件却未有报道。

鉴于纳米抗体的强大优势及应用。本发明以内蒙古苏尼特双峰驼为研究对象，本着抗原应用最普遍、易得的原则，针对一定量的骆驼群体进行分析，制备骆驼抗BSA多克隆抗体，探索双峰驼特异性抗体制备过程中的机体反应变化，确定骆驼的最佳免疫次数。为今后分析双峰驼重链抗体的抗病保护作用，制备纳米抗体做铺垫，同时为今后研发新型的基因工程抗体提供新的方向。

同时，由于国际市场上抗骆驼IgG酶标二抗还没有商品化，为今后纳米抗体的研究带来不便，本发明通过制备兔抗骆驼IgG酶标二抗，建立ELISA方法诊断试剂盒，检测免疫后的骆驼血清中抗体的效价。

（三）发明内容

1.本发明要求保护免疫骆驼的最佳免疫程序及方法；

本发明免疫方法为双峰驼背部皮下多点注射，免疫周期为2周，注射抗原剂量为1mg/mL，免疫次数为3次；

2.本发明要求保护制备兔抗骆驼IgG酶标二抗所涉及的技术指标及结果；

本发明制备兔抗骆驼IgG酶标二抗步骤如下：①亲和层析Pro A法纯化骆驼IgG，②Lowry法蛋白定量③SDS-PAGE纯度检测④制备兔抗骆驼IgG抗血清，背部皮下多点注射，注射抗原剂量为0.6mg/mL，免疫周期为2周，免疫次数为3次。⑤亲和层析Pro A法纯化兔抗骆驼IgG，⑥ELISA法检测兔抗骆驼IgG抗血清效价⑦简易过碘酸钠法标记抗体⑧Lowry法蛋白定量标记抗体⑨ELISA法测定标记抗体效价；

3.本发明要求保护应用兔抗骆驼酶标二抗ELISA检测骆驼抗血清效价方法及最佳检测条件。

本发明检测骆驼抗血清最佳检测条件包括：①抗原抗体最佳工作浓度②最佳二抗稀释浓度③最佳封闭液。

本发明以内蒙古苏尼特双峰驼为研究对象，利用牛血清白蛋白（BSA）制备抗BSA的骆驼多抗及兔抗骆驼IgG酶标二抗，并建立间接ELISA检测试剂盒。

实验分为三部分：第一部分免疫骆驼，制备免疫骆驼血清；第二部分用纯化的骆驼IgG免疫兔子，制备兔抗骆驼IgG酶标二抗，为ELISA检测做准备；第三部分应用间接ELISA法检测免疫各个时期骆驼抗血清效价，最终确定最佳免疫次数，阐述双峰驼特异性抗体制备过程中的机体反应变化。

（四）附图说明

图11是非还原条件下SDS-PAGE，条带于170KD为纯化内蒙双峰驼血清中的的混合的IgG1、IgG3，条带于90KD处为纯化内蒙双峰驼血清中的的IgG2；2是还原条件下SDS-PAGE，条带于55处为重链，40处为轻链。

图2纯化的骆驼IgG Lowry法蛋白定量标准曲线

图3兔抗骆驼IgG酶标二纯化后和标记后Lowry法蛋白定量标准曲线

图4兔抗骆驼IgG抗血清效价

图5标记后兔抗骆驼IgG抗血清效价

图6实验组每次免疫P/N，同一稀释度下五道柱状体从左至右分别是免疫前、初免、二免、三免和四免。由图可知，0免及初免P/N＜2.1，无抗体产生；二免P/N＞2.1的血清最大稀释度为1:400；在第三次和第四次免疫P/N＞2.1的血清最大稀释度为1:25600.

图7对照组每次免疫P/N，同一稀释度下五道柱状体从左至右分别是免疫前、初免、二免、三免和四免。由图可知，初免及之后的加强免疫的P/N值均未＞2.1，及无抗体产生。

图8实验组随免疫次数增加，免疫血清中抗血清效价图中可知，免疫三次即可。

（五）具体实施方式

1.多克隆抗体的制备

实验动物分成空白组（3峰）和实验组（3峰）两组。初免前分别颈部静脉抽取20mL阴性血液，分离血清，无菌分装后于-40℃冻存。空白组每次免疫生理盐水；实验组免疫0.1mg/ml BSA，共免疫4次。每次免疫前及终免15天后从骆驼颈部静脉取血，分离血清。

2.ELISA检测方法的初步建立

2.1兔抗驼IgG酶标二抗的制备

1）亲和层析法骆驼IgG的提纯；

①洗涤将Protein A固定于铁架台。填料装柱后，用超纯水10个柱床体积洗掉保护剂即乙醇；

②平衡用10个柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，洗出液与起始缓冲液pH相等即可；

③上样将血清上柱，上样流速≤60cm/h.

④清洗用20个柱体积的平衡缓冲液清洗柱床体积，直至UV线至基线。

⑤洗脱用洗脱缓冲液（甘氨酸PH2.2）洗脱，在紫外280nm处高于0.1开始收集洗脱峰，低于0.1时结束，洗脱液立即用中和缓冲液中和到中性，浓缩到所需体积。

2）Lowry法测定蛋白含量为2.4mg/ml；

①根据蛋白质浓度，分别精确量取不同体积的标准蛋白质溶液，各加PBS补至0.2ml，使标准蛋白的溶度分别为0，12.5，25，50，100，200μg/ml；

②精确量取样品加PBS补至0.2ml；

③将标准曲线和样品各加1ml碱性硫酸铜和0.1ml Folin-酚试剂混匀，在750nm处测OD；

④以标准蛋白的浓度为Y轴，光吸收值为X轴，得一标准曲线。由样品的光吸收值计算其浓度；

3）SDS-PAGE纯度检测；

①准备一个干净的200ml的烧杯，配制质量浓度为10%的分离胶

②把配制好的分离胶加4.7ml至两块玻璃板中，用少量异丙醇液封；

③静置凝固，倒掉异丙醇,用滤纸吸干；

④在干净的50ml烧杯内配制质量浓度为5%浓缩胶（配制分离胶和浓缩胶时，加质量浓度为10%的过硫酸铵和TEMED的时候，要边摇烧杯边加，保证均匀），配方见表

⑤用移液枪加1mL浓缩胶至分离胶上部，并轻轻插上梳齿，保证每个齿周围无气泡；

⑥放置半小时，待浓缩胶凝固后，小心取出梳子，装进电泳槽。

⑦蛋白跑胶：将还原Loading Buffer、非还原Loading Buffer、天然供试品Buffer见表1

表1 Loading Buffer

制得的样品分别跑胶，每孔上样10ul；

⑧整个电泳过程冰浴，先用80V电压，待样品跑过浓缩胶后，加电压到120V，当溴酚蓝跑到胶的底部时关闭电源；

⑨电泳完后，卸下PAGE胶，在考马斯亮蓝染色液内染色过度，或者用微波炉略加热，加速染色；

⑩旋转摇床，摇动脱色，1h后看电泳结果并拍照。

4）兔抗骆驼IgG抗血清的制备

实验动物平行2只。初免前分别颈部静脉抽取20mL阴性血液，分离血清，无菌分装后于-40℃冻存。剂量为0.6mg/mL兔抗骆驼IgG于0.5mL PBS/只，加0.5mL佐剂。共免疫3次。每次免疫前及终免15天后从颈部静脉取血，分离血清；

5）兔抗骆驼IgG纯化；

同1）

6）ELISA法测定兔抗骆驼IgG抗血清效价为1:64000；

①包被抗原

抗原稀释的最终浓度是1.25μg/ml。每孔加样100μl，即每孔包被抗原的量为0.125μg。每个血清样品做12个梯度稀释。

抗原稀释好后,混匀.每孔加样100μl,盖上铝箔纸，4度冰箱过夜.

②洗涤：从冰箱取出板子，用排枪加PBST洗三次，每次于37℃5min后，拍干。

③BSA封闭

从冰箱取出板子，用排枪加PBST洗三次，每次于37℃5min后，拍干。每孔加入混匀好的BSA200μl，盖上铝箔纸，37℃烘箱放置2小时。

④洗涤：从冰箱取出板子，用排枪加PBST洗三次，每次于37℃5min后，拍干。

⑤加一抗

将兔的阴阳血清用BSA分别作1:1000、1：4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000倍稀释。稀释完毕之后，每孔加样100ul。37℃烘箱放置2小时。

⑥洗涤：从冰箱取出板子，用排枪加PBST洗三次，每次于37℃5min后，拍干。

⑦加二抗

用BSA把二抗作1：2500稀释。然后每孔加100μl,37℃烘箱放置1.5小时。

⑧洗涤：从冰箱取出板子，用排枪加PBST洗三次，每次于37℃5min后，拍干。

⑨显色

加新鲜配制的TMB底物溶液100mL/孔，37℃暗处放置30min，显示蓝色。

⑩终止

每孔加入2M的浓硫酸50ul。颜色变黄，用酶标仪测定450nm处各孔OD值，阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。

7）抗体标记；

①取5mgHRP溶液于1ml蒸馏水

②加入0.2ml新配的0.1ml/L NaIO4溶液于上液中，避光搅拌20min。

③将上述溶液用1mmol/L的醋酸钠缓冲液（pH4.4）透析，4℃过夜。

④加0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.5）20μl，使以上醛化HRP的pH值升高到9.0-9.5

⑤立即加入10mg IgG到1ml0.01mol/L碳酸盐缓冲液中，室温避光搅拌2h

⑥加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，4℃放置2h

⑦将上述液用0.15mol/LPBS（pH7.4）透析，4℃过夜

⑧10000g4℃离心30min

⑨将上清移入另一管中，按体积1:1加入甘油，置-20℃保存。

8）标记抗体Lowry法测定蛋白含量为6.7mg/ml；

同2）

9）ELISA法测定标记抗体效价为1:64000。

同6）

2.2 抗原抗体最佳工作浓度的确定

根据点阵滴定法测定，抗原最佳包被浓度为0.39ug/ml，一抗最佳工作浓度为1:200。

2.3 最佳二抗稀释浓度的确定

OD450阳性血清接近于1.000，且P/N最大作为二抗的最佳稀释浓度。二抗最佳工作浓度为1:2000。

2.4 最佳封闭液的确定

选取阴性OD平均值最小，P/N比值最大的封闭组合，以确定封闭液。最佳封闭液为质量浓度5%脱脂奶粉。

2.5 各待测血清效价的确定

以上述确定的最佳抗原包被浓度、最佳一抗稀释度、最佳二抗稀释度、最佳封闭液做ELISA，重复上述步骤。P/N＞2.1最大稀释度为待测血清的效价。如表2所示，初免未生有效抗体，二免抗体效价为1：400，三免抗体效价为1:25600，四免抗体效价为1:25600。

表2 实验组每次免疫抗血清的抗体滴度

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

表3 对照组每次免疫抗血清的抗体滴度

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

2.6 最佳免疫次数确定

据表2、表3可知，实验组第三次免疫血清最大稀释倍数下P/N与第四次免疫血清最大稀释倍数下P/N值无显著差异，而对照组各组之间无明显显著性差异，且并无P/N＞2.1，因此，确定免疫骆驼最佳免疫次数为三次。

Claims (5)

1.一种通过免疫骆驼来制备抗体的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（1）双峰驼背部皮下多点注射抗原，免疫周期为2周，注射抗原剂量为1mg/mL，免疫次数为3次；

（2）终免15天后从骆驼颈部静脉取血，分离血清。

2.根据权利要求1所述的一种通过免疫骆驼来制备抗体的方法，其特征在于所免疫的骆驼为内蒙古苏尼特双峰驼，所采用的抗原为牛血清白蛋白BSA。

3.一种检测权利要求1所述的经过免疫的骆驼体内抗血清效价的方法，其特征在于，所述方法为应用兔抗骆驼酶标二抗的ELISA检测方法，其中抗原包被浓度为0.39ug/ml，一抗最佳工作浓度为1:200，二抗最佳工作浓度为1:2000，封闭液为5%脱脂奶粉。

4.权利要求3所述的一种检测经过免疫的骆驼体内抗血清效价的方法，其特征在于，所述二抗为酶标的兔抗骆驼IgG，制备兔抗骆驼IgG酶标二抗步骤如下：①利用初免前骆驼血清，亲和层析ProA法纯化骆驼IgG；②Lowry法蛋白定量；③SDS-PAGE纯度检测；④制备兔抗骆驼IgG抗血清，背部皮下多点注射，注射抗原剂量为0.6mg/mL，免疫周期为2周，免疫次数为3次；⑤亲和层析ProA法纯化兔抗骆驼IgG，⑥ELISA法检测兔抗骆驼IgG抗血清效价；⑦简易过碘酸钠法标记抗体；⑧Lowry法蛋白定量标记抗体；⑨ELISA法测定标记抗体效价。

5.一种检测权利要求1所述的经过免疫的骆驼体内抗血清效价的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：（1）作为一抗的骆驼IgG，一抗浓度为1:200；（2）抗原，其包被浓度为0.39ug/ml；（3）作为二抗的酶标兔抗骆驼IgG，其浓度为1:2000；（4）作为封闭液的5%脱脂奶粉。

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