CN103443287B - 泡腾组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了包含选择剂的潜泡腾体。本发明还公开了在用于选择性富集靶微生物的方法中使用所述潜泡腾体的方法。所述方法包括提供样品、培养基和所述潜泡腾体。所述方法还包括使所述样品、所述培养基和所述潜泡腾体在有利于所述靶微生物生长的条件下接触。所述方法还包括从所述潜泡腾体释放所述选择剂。可任选地,所述方法包括检测微生物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2010年12月31日的美国临时专利申请No.61/428,856的权益,将该申请以引用方式全文并入本文。
背景技术
用于检测样品中病原体的快速方法已受需要有利于细菌生长至可检测水平(例如对于ELISA检测方法,约106个集落形成单位(cfu)/mL)的至少一个富集步骤限制。目前的监管方针规定必须在25克食物样品中检测单个cfu。可用的技术不能在如此大的样品中即刻检测单个细菌。因此,富集程序通常用于增加样品中微生物的数目以利于检测。
在产品的处理期间病原体通常受到损害。也就是说,病原体可能已经历加热、冷冻、与化学添加剂接触或机械加工步骤,这些可损害病原体或使之虚弱。因而,经常需要在检测前使病原体复苏。
因为受胁迫的微生物可能受到通常不抑制健康微生物的选择剂抑制,用于筛选病原体的存在的通用技术涉及使用一系列培养基(即营养流体)传送,该培养基传送开始是使用非选择性富集培养基,然后使用选择培养基。非选择性富集培养基通常用来使潜在受损的病原体复苏。一旦病原体复活,则将小量的非选择性富集培养基转移进选择培养基中。这项技术(经常受人的工作模式和病原体的生长模式限定)通常耗费数天来完成。多年来,已经进行了很多尝试来缩短初级富集步骤的时长以减少总测定时间。一般来讲,已经发现需要至少8至24小时的非选择性富集以获得足够的活病原体用于进一步测试。
涉及预富集步骤和选择性富集步骤的检测方法是费力的,并且因为它们的复杂性,可受多种人为误差影响,这些人为误差可能会影响结果。需要更简单的富集程序以在样品中获得较大量的靶微生物,或其可检测的生物分子组分。
发明内容
本发明整体涉及在含有或者可能含有非靶微生物的样品中检测靶微生物。本发明方法提供一种形成各组分的混合物的方式,所述各组分包括样品、含水生长培养基和包含选择剂和泡腾化合物的泡腾组合物,从而在该泡腾组合物与该生长培养基接触后的预定时间使所述选择剂释放入该培养基中。有利的是,该方法允许操作者使样品在形成液体混合物后的预定时间暴露于选择剂,而不必在预定时间将该选择剂单独地添加至该混合物。该方法还提供用于在选择剂从泡腾组合物释放时使其混合至培养基中的手段,从不需要提供额外的混合力以使选择剂分布遍及整个液体。
在一个方面,本公开提供一种富集靶微生物生长的方法。该方法可以包括提供培养基、样品和潜泡腾体(latenteffervescentbody)。该潜泡腾体可以包括芯组合物设置于其中的外壳。这种芯组合物可以包含两种或更多种泡腾组分和相对于至少一种其它微生物的生长而有利于靶微生物生长的选择剂。该方法还可以包括使样品、潜泡腾体和培养基在有利于靶微生物生长的条件下接触。该方法还可以包括从该潜泡腾体释放选择剂。
在所述实施例任一者中,释放选择剂还可以包括使选择剂分布于培养基中。在上述实施例任一者中,使选择剂分布还可以包括通过由气体泡腾引起的混合过程使选择剂分布。在上述实施例任一者中,使选择剂释放还可以包括将包含样品和培养基的液体混合物置于与潜泡腾体处于流体接触预定的一段时间后使选择剂释放。在上述实施例任一者中,使样品、潜泡腾体和培养基接触还可以包括使样品与有效量的所释放的选择剂接触足以允许选择性富集靶微生物的一段时间。在上述实施例任一者中,该方法还可以包括检测微生物。在上述实施例任一者中,检测微生物可以包括使微生物在半固体培养基上或之中繁殖、通过显微镜观察该微生物、检测该微生物的代谢活动、检测该微生物的生物分子或检测该微生物的核酸。
在另一个方面,本公开提供潜泡腾体。潜泡腾体可以包括与含水液体接触时崩解的外壳和设置在其中的芯组合物。该芯组合物可以包含第一和第二泡腾组分和相对于至少一种其它微生物的生长而有利于靶微生物生长的选择剂。在所述实施例任一者中,潜泡腾体还可以包括助流剂、缓冲组分、微生物生长指示剂、营养物质、粘合剂、崩解助剂、润滑剂、填充剂、防粘着剂或上述物质中任意两种或更多种的组合。在潜泡腾体的上述实施例任一者中,外壳可以包含聚乙烯醇、聚(甲基)丙烯酸酯、纤维素和甲基纤维素、任何上述物质的衍生物以及任何上述物质的混合物。在潜泡腾体的上述实施例任一者中,芯组合物可以包括成形组合物。在潜泡腾体的上述实施例任一者中,其中外壳可以包括小袋。在潜泡腾体的上述实施例任一者中,第一泡腾组分可以包含碱并且第二泡腾组分可以包含酸。在潜泡腾体的上述实施例任一者中,选择剂可以包括盐、抗生素、表面活性剂或细菌素(bacteriocin)。在潜泡腾体的上述实施例任一者中,外壳可以构造成在预定量的时间后将芯组合物释放至含水液体中。在潜泡腾体的上述实施例任一者中,外壳可以包含乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素的混合物。在一些实施例中,乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素的混合物可以包括至少约25重量百分比的羟丙基甲基纤维素。在一些实施例中,乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素的混合物可以包括至少约33重量百分比的羟丙基甲基纤维素。在一些实施例中,乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素的混合物可以包含至少约50重量百分比的羟丙基甲基纤维素。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些有益效果的本发明的实施例。然而,在相同的情况或其它情况下,其它实施例也可能是优选的。此外,对一个或多个优选实施例的表述并不暗示其它实施例是不可用的,且并非意图将其它实施例排除在本发明范围之外。
当术语“包括”和其变型出现在说明书和权利要求书中时,这些术语不具有限制性含义。
本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种或多种(一个或多个)”可互换使用。因而,例如,一种微生物可以解释为意指“一种或多种”微生物。
术语“和/或”意指所列要素的一个或全部,或所列要素的任何两个或两个以上的组合。
本文所用的“选择剂”是指当与敏感微生物处于流体接触时,会相对于该敏感微生物在不存在该选择剂时在类似条件下的生长,延迟或防止该敏感微生物生长的化学或生物学化合物或分子。应该认识到,敏感性为相对条件并且微生物(例如靶微生物)虽然在一定程度上对选择剂敏感,但可能比其它微生物(例如非靶微生物)对该选择剂较不敏感。
另外,本文通过端点表述的数值范围包括所述范围内包含的所有数值(例如,1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本发明的上述发明内容并不意图描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。以下描述更具体地举例说明了示例性实施例。在整个申请的若干地方,通过实例清单提供了指导,所述实例可以按多种组合方式来使用。在各情形下,所列举的清单仅仅作为代表性群组,而不应被理解为排他性清单。
上述及其它实施例的更多细节在下面的描述中陈述。根据该描述和权利要求书,其它特征、目标和优点将变得显而易见。
附图说明
图1为根据本公开的富集微生物的方法的一个实施例的框图。
图2为已将本公开的泡腾组合物的不同实施例添加至其中的各水溶液在一段时间内的可见光吸光度的图。
具体实施方式
本公开涉及检测样品中的靶微生物。具体地讲,本公开涉及在可能包含非靶微生物的样品中检测靶微生物,所述非靶微生物在一些情况下可能以比靶微生物显著更大的数目存在于样品中。另外,本公开涉及检测可能存在于包含非靶微生物的样品中的受胁迫微生物。
本公开认识到,伴随选择性富集以检测病原微生物的传统方法的一个问题是,为了检测受胁迫的或受损害的微生物,必须使用两种类型的培养基,即非选择营养培养基(以允许受损害的靶微生物复苏)和选择营养培养基(杀死或抑制非靶微生物生长)。另外,该方法通常在规定时间需要人为干预以1)添加一种或多种外来选择剂至富集批料(例如食品样品、富集肉汤和微生物的混合物),或者2)将包括一部分微生物的富集批料的等分试样从非选择培养基转移至选择培养基用于进一步温育。在任一种情况下,最终的富集培养物需要机械混合以使样品有效分布或以确保充分代表所富集的食品样品。
本公开提供用于富集靶微生物的方法的潜泡腾体。该潜泡腾体用于本发明的方法中,所述方法允许操作者使用单种营养培养基来完成复苏步骤和选择步骤二者,从而避免需要上述的时间敏感性和劳动密集型干预。本发明的潜泡腾体允许操作者添加高度选择性的选择剂至非选择营养培养基,其中所述选择剂在预定的一段时间内不对该培养基中存在的微生物发挥作用。本发明的潜泡腾体还提供在不需要人为或外部机械干预的情况下将选择剂的成分瞬时混合入营养培养基中的手段。该潜泡腾体和方法可以用于检测靶微生物的方法中。
本公开提供潜泡腾体。根据本公开,潜泡腾体包括外壳和设置于其中的芯组合物。根据本公开,芯组合物包含相对于至少一种其它微生物而有利于预定靶微生物的生长的选择剂和至少两种泡腾组分。
用于芯组合物中的选择剂可以是本领域已知可用于选择性富集靶微生物的任何选择剂,只要该选择剂不实质地干扰该潜泡腾体的外壳的功能(例如实质性地加速或实质性地抑制该外壳的崩解)。干扰外壳可以轻易地检测到,例如通过监测(例如目视观测)和/或测量(例如通过光谱学测量有色试剂的释放,如实例4中所述)在使用或不使用该选择剂的情况下所制备的潜泡腾体的崩解进行检测。优选地,该选择剂不会实质性地干扰泡腾组分的稳定性和/或功能。干扰泡腾组分可以例如通过监测(目视监测)由使用或不使用该选择剂的情况下所制备的潜泡腾体释放的泡腾进行监测。选择剂的类别的非限制性例子包括抗生素(吖啶黄)、杀生物剂、盐(例如LiCl)、表面活性剂(例如胆汁盐)、染料、细菌素和噬菌体。可以将选择剂(例如吖啶黄、LiCl)以可以用来递送有效浓度(例如0.6μg/mL吖啶黄、3mg/mLLiCl)的选择剂至富集培养物中的量配混入该潜泡腾体中,如随附的实例中所示。其它合适的选择剂的例子包括但不限于新生霉素、青霉素、吖啶黄、萘啶酸(naladixicacid)、环己酰亚胺、两性霉素B、链霉素、头孢他啶水合物、氨苄青霉素、粘菌素、乳链菌肽、四环素、苯乙醇、去氧胆酸盐、胆汁盐、牛胆汁、硫代硫酸钠、NaCl、亚甲蓝、亮绿染料、结晶紫和孔雀石绿。
芯组合物中所用的泡腾组分包括至少两种组分,当合并于水溶液中时,这两种组分起反应以形成气体产物(例如二氧化碳)。优选地,芯组合物中所用的泡腾组分是干燥试剂(例如颗粒或粉末,含有不超过约环境水分)。芯组合物中的泡腾组分中的至少一者包含酸,并且芯组合物中的泡腾组分中的至少一者包含碱。合适的酸泡腾组分的非限制性例子包括柠檬酸、酒石酸、衣康酸和与碱泡腾组分反应并且不会实质性地抑制靶微生物生长的任何其它有机酸。合适的碱泡腾组分的非限制性例子包括碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸锂、碳酸氢锂和与酸泡腾组分反应并且不会实质性地抑制靶微生物生长的任何其它金属碳酸盐或金属碳酸氢盐。优选地,泡腾组分不会实质性地干扰选择剂的稳定性和/或功能。
除了选择剂和泡腾组分外,芯组合物任选还可以包含其它试剂例如助流剂、缓冲组分、微生物生长指示剂、营养物质、粘合剂、崩解助剂、润滑剂、填充剂、防粘着剂或上述物质任意两种或更多种的组合。
例如,可以将助流剂添加至芯组合物以助于混合芯组合物的组分以及助于使该混合物分散入例如片剂模具中。合适的助流剂的非限制性例子包括L-亮氨酸和亲水性(例如熔融的)和/或疏水性二氧化硅粒子(包括纳米粒子,例如如共同待审的专利申请美国专利申请No.61/384574的实例1中所公开的用异辛基三甲氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷改性的纳米粒子,将该专利以引用的方式全文并入本文)。缓冲组分包括可以维持培养基处于最佳pH以支持靶微生物生长的缓冲剂。合适的缓冲组分的非限制性例子包括碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢钾、MOPS、Tris和HEPES。微生物生长指示剂包括例如pH指示剂(例如中性红、氯酚红、溴甲酚紫)或酶底物(例如发色酶底物如邻硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷或对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)。可以将润滑剂添加至芯组合物以降低片剂形成期间的摩擦力以及降低从片剂形成模腔弹出组合物期间的摩擦力。润滑剂可以是水溶性的或水不溶性的。合适的水溶性润滑剂的非限制性例子包括硼酸、油酸钠和醋酸钠。合适的水不溶性润滑剂的非限制性例子包括滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸钠、蜡和硬脂醇富马酸酯钠。可以将填充剂添加至芯组合物,例如以便提供将有助于处理包含该芯组合物的混合物的本体。合适的填料的非限制性例子包括乳糖、山梨醇、甘露糖醇、纤维素和蔗糖。可以添加粘合剂以促进芯组合物的组分在加工期间或之后(例如在形成成形组合物(如片剂)的工过程期间或之后)的内聚力。合适的粘合剂的非限制性例子包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(PEG)6000、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羟丙基纤维素(HPC)。
崩解助剂可以有利于潜泡腾体的快速崩解。有利的是,这可以通过有利于含水培养基渗透进部分崩解的外壳而允许选择剂快速分布遍及整个培养基。不受理论的约束,据认为,含水培养基最初突破外壳时,该液体与崩解助剂接触,引起崩解助剂吸收该液体并引起其溶胀。崩解助剂溶胀对削弱的外壳施加额外的压力(即除了来自气体泡腾的压力外),从而引起其比这种额外压力不存在的情况下更快地裂开。合适的崩解助剂的非限制性例子包括例如,水可溶胀的聚合物如羧甲基纤维素(例如可得自宾西法尼亚州费城的FMC生物聚合物公司(FMCBiopolymer,Philadelphia,PA)的AC-DI-SOL交联羧甲基纤维素钠)、交联的聚乙烯吡咯烷酮(例如,可得自新泽西州韦恩的国际特殊品公司(InternationalSpecialtyProducts,Wayne,NJ)的POLYPLASDONEXL-10)和羧甲淀粉钠(例如可得自新泽西州普林斯顿的DMV-Fonterra赋形剂公司(DMV-FonterraExcipients,Princeton,NJ)的PRIMOJEL羧甲淀粉钠)。
在一些实施例中,芯组合物的组分可以用来制备成形组合物(片剂)。用于制备具有总体均一尺寸和形状的组合物的工艺是本领域已知的并且包括例如使用制片冲模(例如单头冲模)。冲模可以与机械压力机一起使用,以便获得每个片剂的均一压实度。在一些实施例中,可以将芯组合物在形成成形组合物之前研磨,以便获得所述组分的均质混合物。
将潜泡腾体的外壳构造成在预定量的时间后将芯组合物释放入含水液体(例如水、含水缓冲液、培养基)中。也就是说,外壳包含部分而不完全耐受含水液体向其渗透的材料(聚合材料)。然而,一段时间后,含水液体可以完全渗透外壳并与芯组合物反应。
在一些实施例中,外壳的耐水性可以通过用对水的渗透和/或崩解具有预定敏感性的材料制造外壳来进行控制。例如,可以例如从德州休斯敦的美国可乐丽公司(KurarayAmerica,Houston,TX)以若干等级获得在水中具有相对慢或相对快的溶解速率的聚乙烯醇(“PVA”)(例如分别为Kuraray等级28-99和30-92)。在这些实施例中,可以将聚合物溶解于水中、浇注于载体(例如塑料膜)上、干燥,并可以将干燥的PVA膜从载体取下。可以将干燥的膜用来通过以下方式制备潜泡腾体:将芯组合物的组分(其可以是成形组合物的形式)沉积于第一PVA膜的中部,用第二PVA膜覆盖在该第一PVA膜(芯组合物处于其上)上,并将膜密封(例如通过粘结密封或加热密封)在一起以形成容纳芯组合物的小袋。可以在加热密封过程期间小心以尽可能多地从该小袋除去空气,从而使芯组合物与PVA外壳之间的接触最佳。设想用于形成潜泡腾体的小袋构造的干燥膜可用包含两种或多种独特的聚合物的共混物形成。也可以购买可以用来形成潜泡腾体的小袋构造的聚合物膜。这类膜的例子包括例如SOLUBLON等级EF-30、BP-26和KA-40,全部可得自日本爱知县的Aicello化学品公司(AicelloChemicalCo.,Aichi,JP)。
在一些实施例中,外壳的耐水性可以通过用两种或更多种材料(第一材料是实质上耐水的并且第二材料相对较不耐水)的混合物制造外壳来控制。通过调节这两种或更多种材料在外壳中的比例和/或通过调节外壳的厚度,操作者可以制造被构造成将芯组合物释放入含水液体中的潜泡腾体。通常,在混合物中具有的第一材料越多,则水溶液渗透外壳所需的时间越长。在一些实施例中,第一和第二材料为聚合材料。在任何实施例中,例如,第一材料可以是乙基纤维素(下文中的“ETC”)(例如10cp,48%乙氧基化的乙基纤维素;可得自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich;St.LouisMO))或EudragitRS/RO(可得自特拉华州纽瓦克的赢创德固赛国际公司(EvonikDegussaInternational;Newark,DE)的聚丙烯酸酯聚合物)。在任何实施例中,例如,第二材料可以是羟丙基纤维素(下文中的“HPC”)(例如细磨KlucelEXF羟丙基纤维素;可得自特拉华州威尔明顿的Hercules公司(HerculesInc.;WillmingtonDE))、羟丙基甲基纤维素(可得自特拉华州纽瓦克的陶氏化学公司(DowChemicalCompany,Newark,DE))或甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的阴离子共聚物(例如EUDRAGITL-100,可得自特拉华州纽瓦克的赢创德固赛国际公司)。可以将第一和第二材料(例如分别是ETC和HPC)合并于混合物中,其中所述混合物包含小于或等于约75重量百分比的ETC、小于或等于约67重量百分比的ETC、小于或等于约50重量百分比的ETC。第一和第二材料的各种比例对潜泡腾体崩解的影响以及测量崩解速率的简单方法在图2中显示并在下面实例4中描述。可以将两种或更多种外壳材料的混合物溶解、浇注成膜并用来制备潜泡腾体的小袋构造,如上所述。另外,可以将两种或更多种聚合物的混合物用于下述的备选外壳形成工艺。
或者,可以使用与用来形成成形芯组合物的工艺类似的工艺,在芯组合物周围形成外壳。在这种备选工艺中,例如,使用第一制片冲模将芯组合物的组分用来形成成形组合物,如上所述。将第一部分(例如约50%)的外壳材料置于第二较大的冲模腔中。将来自第一冲模的成形组合物置于第二冲模腔中(例如大概在中央),处于外壳材料的顶部上。将外壳材料的其余部分沉积于第二冲模中的成形组合物的顶部上并施加适当压力(例如约1360kg)至冲模,以使潜泡腾体具有芯组合物和外壳。
或者,可以使用涂布工艺,在芯组合物周围形成外壳。在这种备选工艺中,例如,可以使用第一制片冲模将芯组合物的组分用来形成成形组合物,如上所述。然后,成形组合物可以用液体溶液涂覆,所述溶液含有形成外壳的材料(例如甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的阴离子共聚物、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇等或它们的组合)。例如,可以使用本领域已知的任何液体涂布工艺如浸涂、帘式涂布或喷涂,涂覆成形组合物。涂层的组成以及涂层的厚度将控制含水液体渗透和/或崩解外壳并释放芯组合物所耗费的时间量。因而,为了将芯组合物的释放延迟更长的周期,设想可以施加若干层(例如2层、3层、4层、5层)涂层。还设想,多层外壳的每层可以包含相同的材料或者它们可以包含不同的材料,以便控制芯组合物的释放。
或者,在一些实施例中,本公开的潜泡腾体可以通过将芯组合物装填进预成形的胶囊(例如用来封装药物的胶囊类型)中来制备。该预成形胶囊可以从纤维素基材料形成并且可以按两个长方形半块提供,在每一端具有允许所述半块通过摩擦配合接合的互补开口,如制药工业中装填有粉末药物的胶囊所惯用的。可以将包含泡腾组分(例如碳酸氢钠和柠檬酸)、选择剂(例如盐酸吖啶黄)和助流剂(例如熔融二氧化硅粒子)的粉末的芯组合物装填进胶囊的一半中,并且装填的一半可以通过摩擦配合接合至胶囊的另一半。任选地,可以使用由QualicapsGroup公司制造的胶囊带密封装置(CapsuleBand-sealingequipment)用液体溶液(例如羟丙基甲基纤维素)密封填充的组装好的胶囊的边缘,并且可以将涂料溶液(例如乙基纤维素和HPMC,或者EudragitS100或L100在乙醇或异丙醇中的混合物)喷涂至胶囊上,如本文中所述。涂层的厚度可以通过增重来测量,并可以实现芯组合物释放的预定延迟时间。
喷涂是片剂的优选液体涂布方法。通常,将一批至少600g片剂(每片大约250mg)放入旋转包衣锅中。通过喷嘴喷洒水性溶剂或有机溶剂中的涂料溶液以在包衣锅附近产生雾化的薄雾,其中在通风***下维持所述包衣锅处于高温以干燥包衣片剂。等于片剂重量的约2-20%的干涂层重量可以使该包衣片剂的芯组合物具有有用的延迟释放时间。示例性的包衣机为可得自艾奥瓦州马里恩的向量公司(VectorCorporation,Marion,IA)的Hi-coater包衣机。
本公开提供选择性富集靶微生物的方法。应当理解,这种靶微生物是预定微生物(即由进行该方法的操作者预定)并且该方法的许多方面(例如培养基或介质的类型、配方和供应商、选择剂、温育时间和温度)由操作者选择和/或由参考方法规定以有利于从给定样品材料富集特定靶微生物。图1显示根据本公开的选择性富集微生物的方法的一个实施例的框图。该方法包括提供样品、培养基和潜泡腾体的步骤120。
本文所用的“选择性富集”是指使样品经受有利于预定靶微生物生长的条件(包括添加选择剂至样品)的过程。这些条件包括但不限于具有足够水活度以促进靶微生物生长的营养环境、支持靶微生物生长的温度和经选择以相对于至少一种非靶微生物而言增强靶微生物生长的选择剂。
样品可以是可能含有待选择性富集的靶微生物的任何样品。合适的样品的非限制性例子包括环境样品(例如表面拭子/海绵、污垢、沉积物、污染物)、食物(例如原材料、加工中的样品和成品样品)、起子培养物、饮料、临床/兽医样品(例如血液、血清、血浆、尿液、痰、组织、粘液、粪便、伤口渗出物、脓汁、脑脊液)和水(例如表面水、饮用水、工艺用水)。
在一些实施例中,靶微生物可以使用源自多种食物、饮料或食物或饮料加工环境来源的样品来富集。食物来源的非限制性例子包括生肉或经加工过的肉、生的或经加工过的水果或蔬菜、非流体乳制品(例如奶酪、奶油和冰淇淋)、起子培养物、坚果、调味料、作料和浆料。饮料的非限制性例子包括饮用水、水果或蔬菜汁、牛奶和发酵饮料。经巴氏消毒的食物或饮料也可以是合适的来源。食物或饮料加工环境样品的非限制性例子包括食物处理表面样品(例如传送带、刀片、切割表面、混合装置表面、过滤器、存储容器)、室内样品(例如墙壁、地板、排水沟、通风装置)和清洁装置(例如软管、清洁工具)。
在一些实施例中,可以使用源于多种人或动物来源的样品富集靶微生物,例如生理流体,如血液、唾液、眼晶体液、滑液、脑脊液、脓汁、汗液、渗出物、尿液、粘液、哺乳期乳汁等。此外,测试样品可以源自身体部位,例如伤口、皮肤、鼻孔、头皮、指/趾甲等。
来自人或动物来源的特别关注的样品包括粪便样品以及含有粘液的样品和来自粘膜组织、外耳、中耳、口、直肠、***或其它类似组织的样品。具体的粘膜组织的例子包括口腔、齿龈、鼻、眼、气管、支气管、胃肠、直肠、尿道、输尿管、***、子宫颈和子宫的粘膜。
除了生理流体外,其它测试样品可以包括其它液体以及溶于液体介质的固体。所关注的样品可以包括工艺流、水、土壤、植物或其它植被、空气、表面(例如被污染的表面)等。样品还可以包括经培养的细胞。样品可以还包括在包含细胞、孢子或酶的装置(例如生物指示装置)上或之中的样品。
用于本公开的方法的合适样品可以包括某些固体样品。可以将固体样品分解(例如通过共混、超声处理、均化)以及可以将其悬浮于液体(例如水、缓冲液、肉汤)中。在一些实施例中,可以将容纳有样品材料的样品收集装置(例如拭子、海绵)用于该方法。或者,可在将样品材料用于该方法之前,将样品材料从样品收集装置洗脱(例如冲洗、刮擦、表达)。在一些实施例中,可以将液体或固体样品在液体(例如水、缓冲液、肉汤)中稀释。
特别关注的靶微生物包括原核和真核生物体,特别是革兰氏阳性菌细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、支原体和酵母。特别相关的生物体包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或微球菌科(Micrococcaceae)或葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)、链球菌属(Streptococcusspp.)、假单胞菌属(Pseudomonasspp.)、肠球菌属(Enterococcusspp.)、沙门氏菌属(Salmonellaspp.)、军团菌属(Legionellaspp.)、志贺氏菌属(Shigellaspp.)、耶尔森菌属(Yersiniaspp.)、肠杆菌属(Enterobacterspp.)、埃希杆菌属(Escherichiaspp.)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)、李斯特菌属(Listeriaspp.)、弧菌属(Vibriospp.)、棒状杆菌属(Corynebacteriaspp.)以及疱疹病毒、曲霉菌属(Aspergillusspp.)、镰刀菌属(Fusariumspp.)和念珠菌属(Candidaspp.)的成员。毒力特别强的生物体包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(包括耐药菌株例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、无乳链球菌(S.agalactiae)、产脓链球菌(S.pyogenes)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)、万古霉素中度耐药金黄色葡萄球菌(VISA)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)、烟曲霉(A.fumigatus)、棒曲霉(A.clavatus)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、厚孢镰刀菌(F.chlamydosporum)、单核细胞增多性李斯特菌、依氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerasuis)、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、克鲁斯假丝酵母(C.krusei)、坂崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)、肠杆菌O157和多重耐药性革兰氏阴性杆菌(MDR)。
革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌是特别关注的。特别要关注的是***,如单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogeness)。另外,特别要关注的是抗生素抗性微生物,包括MRSA、VRSA、VISA、VRE和MDR微生物。
除了提供样品外,该方法还包括提供培养基。对培养基进行选择以有利于靶微生物的生长。“生长”在本文中以最广的意义使用并且指同化细胞活动,包括例如蛋白质合成、核酸合成、细胞膜合成、细胞壁合成、细胞***或上述细胞活动中的两种或更多种的任何组合。一般来讲,培养基包含水、必需矿物质和营养物质以支持靶微生物的生长。可以基于待富集的靶微生物选择特定的细胞培养基并且选择恰当的培养基完全处于本领域普通技术人员的能力范围内。
重新参考图1,本公开的方法还包括使样品、潜泡腾体和培养基在有利于靶微生物生长的条件下接触的步骤122。通常,培养基是含水液体。在一些实施例中,培养基容纳于容器,例如烧瓶、烧杯、袋子、管、培养皿、多孔板等中。优选地,将该容器在培养基置于其中之前进行灭菌或将容器随培养基一起原位灭菌。可以通过将培养基转移至装有样品的容器中或通过将样品转移至装有培养基的容器来实现样品与培养基接触。在一些实施例中,可以使样品和培养基在第一容器(搅拌杯、样品袋或兜袋(stomacherbag))中实现相互接触,随后,可以将样品/培养基混合物的全部或一部分转移至第二容器(例如管或烧瓶)用于温育。可以按多种方式实现潜泡腾体与样品和培养基的接触。可以将潜泡腾体沉积进空的容器中,可以将培养基和样品依次(以任何顺序)、同时或作为混合物添加至该容器。或者,可以将潜泡腾体转移至装有样品、培养基或培养基和样品的容器;随后,添加还未加入的其它组分(样品或培养基)。在一个优选的实施例中,使样品和培养基在容器中实现接触,并在之后不久将潜泡腾体转移至该容器。在一些实施例中,可以使培养基与样品实现接触并可以将所得的复合混合物温育一段时间,然后使潜泡腾体与该混合物接触。
本领域普通技术人员认识到有利于靶微生物生长的条件并且可以包括但不限于温育阶段(例如在培养箱中)期间培养基的营养物质组成、培养基pH、培养基的离子强度、培养基对光的暴露、培养基的氧张力和培养基的温度。将认识到,这些条件中的一些(例如pH、温度)还可以影响潜泡腾体崩解耗费的时间量。这可以通过根据实例4中所述的简单程序,筛选外壳材料(在类似的pH和温度条件下)来测定。
本公开的方法还包括从潜泡腾体释放选择剂的步骤124。优选地,在将包含样品和培养基的液体混合物置于与潜泡腾体处于流体接触预定的一段时间后释放选择剂。潜泡腾体与含水流体之间的接触引发外壳崩解的过程,这最终导致芯组合物释放。有利的是,通过将选择剂释放延迟预定的一段时间,原始样品中的任何受损或受胁迫的靶微生物将有时间在选择剂释放前在培养基中充分地复苏和生长。在一些实施例中,预定时间为样品、培养基和潜泡腾体之间接触后小于或等于约24小时。在一些实施例中,预定时间为样品、培养基和潜泡腾体之间接触后约30分钟或更长,但小于约24小时。在一些实施例中,预定时间为样品、培养基和潜泡腾体之间接触后约30分钟或更长,但小于或等于约2小时。在一些实施例中,预定时间为样品、培养基和潜泡腾体之间接触后约2小时或更长,但小于或等于约6小时。在一些实施例中,预定时间为样品、培养基和潜泡腾体之间接触后小于约2小时。在一些实施例中,预定时间为样品、培养基和潜泡腾体之间接触后约2小时或更长,但小于或等于约12小时。
通常,从潜泡腾组合物释放选择剂后,使包含样品样品、培养基和选择剂的混合物接触(例如温育)一段时间。额外的接触时间允许有效量的选择剂从潜泡腾体释放,并因而抑制或阻止至少一种非靶微生物的生长。额外的接触时间还可以允许培养基中靶微生物或其生物分子(例如核酸分子、蛋白质、多糖、脂质、酶、抗原)的数目增加。
本公开的方法还包括检测微生物的可选步骤126。在一些实施例中,检测微生物可以包括检测靶微生物。在一些实施例中,检测微生物可以包括检测非靶微生物。可以通过本领域已知的任何微生物检测手段检测微生物,所述检测手段包括但不限于光学(例如显微镜法、流式细胞术)检测、涂布接种技术(例如使用琼脂培养基或基于干燥的可复水膜的培养装置等)、免疫测定技术(例如ELISA、凝集、侧流免疫测定法)、酶测定法、分子遗传技术(例如等温核酸扩增方法、PCR、LCR、NASBA、PFGE)和噬菌体分型。
实施例
实施例1为增进靶微生物的生长的方法,该方法包括:
提供培养基、可能包括靶微生物的样品和潜泡腾体;
其中所述潜泡腾体包括芯组合物设置于其中的外壳;
其中所述芯组合物包含两种或更多种泡腾组分和相对于至少一种其它微生物的生长而有利于靶微生物生长的选择剂;
使所述样品、所述潜泡腾体和所述培养基在有利于所述靶微生物生长的条件下接触;以及
从所述潜泡腾体释放选择剂。
实施例2为实施例1的方法,其中释放所述选择剂还包括使所述选择剂分布于所述培养基中。
实施例3为实施例2的方法,其中使所述选择剂分布还包括通过气体泡腾引起的混合过程使所述选择剂分布。
实施例4为实施例1至3中任一项的方法,其中释放所述选择剂还包括在将包含所述样品和所述培养基的含水混合物置于与所述潜泡腾体处于流体接触预定的一段时间后释放所述选择剂。
实施例5为前述实施例中任一项的方法,其中所述预定时间小于或等于24小时。
实施例6为实施例5的方法,其中预定时间为约30分钟至约24小时。
实施例7为实施例6的方法,其中预定时间为约30分钟至约2小时。
实施例8为实施例6的方法,其中预定时间为约2至约6小时。
实施例9为实施例5的方法,其中预定时间小于2小时。
实施例10为前述实施例中任一项的方法,其中使所述样品、所述潜泡腾体和所述培养基接触还包括使所述样品与有效量的所释放的选择剂接触足以允许选择性富集所述靶微生物的一段时间。
实施例11为前述实施例中任一项所述的方法,该方法还包括检测微生物。
实施例12为实施例11的方法,其中检测所述微生物包括使所述微生物在半固体培养基上或之中繁殖、通过显微镜观察所述微生物、检测所述微生物的代谢活动、检测所述微生物的生物分子或检测所述微生物的核酸。
实施例13为潜泡腾体,其包括:
当与含水液体接触时崩解的外壳;和
设置于外壳中的芯组合物;
其中所述芯组合物包含第一和第二泡腾组分和相对于至少一种其它微生物的生长而有利于靶微生物生长的选择剂;
实施例14为实施例12的潜泡腾体,其还包含助流剂、缓冲组分、微生物生长指示剂、营养物质、粘合剂、崩解助剂、润滑剂、填充剂、防粘着剂或上述物质任意两种或更多种的组合。
实施例15为实施例12的潜泡腾体,其中所述芯组合物包含所述崩解助剂。
实施例16为实施例12至14中任一项的潜泡腾体,其中所述外壳包含聚乙烯醇、聚(甲基)丙烯酸酯、纤维素和甲基纤维素、丙基纤维素、任何上述物质的衍生物或任何上述物质的混合物。
实施例17为实施例12至15中任一项的潜泡腾体,其中所述芯组合物包括成形组合物。
实施例18为实施例12至16中任一项的潜泡腾体,其中所述外壳包括小袋。
实施例19为实施例17的潜泡腾体,其中所述外壳贴合所述成形组合物的形状。
实施例20为实施例12至18中任一项的潜泡腾体,其中第一泡腾组分包含碱而第二泡腾组分包含酸。
实施例21为实施例12至19中任一项的潜泡腾体,其中第一泡腾组分包含碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸锂、碳酸氢锂或前述物质任意两种或更多种的混合物。
实施例22为实施例12至20中任一项的潜泡腾体,其中第二泡腾组分包含柠檬酸、酒石酸、衣康酸或前述物质任意两种或更多种的混合物。
实施例23为实施例13至22中任一项的潜泡腾体,其中所述微生物生长指示剂包含pH指示剂、酶底物或氧化还原指示剂。
实施例24为实施例12至23中任一项的潜泡腾体,其中所述选择剂包含盐、抗生素、表面活性剂、染料或细菌素。
实施例25为实施例24的潜泡腾体,其中所述选择剂选自新生霉素、青霉素、盐酸吖啶黄、萘啶酸、环己酰亚胺、两性霉素B、链霉素、头孢他啶水合物、氨苄青霉素、粘菌素、乳链菌肽、四环素、苯乙醇、去氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、胆汁盐、牛胆汁、硫代硫酸钠、NaCl、氯化锂、碳酸锂、亚甲蓝、亮绿染料、结晶紫和孔雀石绿。
实施例26为实施例13至25中任一项的潜泡腾体,其中所述外壳被构造成在预定量的时间后将所述芯组合物释放入所述含水液体中。
实施例27为实施例26的潜泡腾体,其中所述外壳包含乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素或羟丙基纤维素的混合物。
实施例28为实施例27的潜泡腾体,其中所述乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素的混合物包含至少约25重量百分比的羟丙基甲基纤维素。
实施例29为实施例28的潜泡腾体,其中所述乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素的混合物包含至少约33重量百分比的羟丙基甲基纤维素。
实施例30为实施例29的潜泡腾体,其中所述乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素的混合物包含至少约50重量百分比的羟丙基甲基纤维素。
实例
除非另外规定,否则所有百分比和份数均以重量计。如本文所用,崩解助剂还可称为崩解剂。
所用的材料
■SIL1-CAB-O-SILTS-530.表面改性的热解法二氧化硅;马萨诸塞州波士顿的卡博特公司(CabotCorporation;BostonMA)
■SIL2-AEROSIL200热解法二氧化硅;新泽西州帕西帕尼的赢创德固赛公司(EvonikDeGussaCorporation;ParsippanyNJ)
■二氧化硅纳米粒子-如共同待审的专利申请美国专利申请No.61/384574的实例1中所公开的用异辛基三甲氧基硅烷和甲基三甲氧基硅烷改性的纳米粒子。
■羧基与酯基比例为1:1的甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物-EudragitTML100聚合物(新泽西州帕西帕尼的赢创德固赛公司)
■硬脂酸镁NF(新泽西州吉布斯敦的EM科学公司(EMScience;GibbstownNJ))
■碳酸锂粉末(新泽西州菲利普斯堡的J.T.Baker公司(J.T.Baker;PhilipsburgNJ))
■崩解助剂-A型交联羧甲基纤维素(Ac-Di-SolTM聚合物;宾夕法尼亚州费城的FMC生物聚合物公司(FMCBioPolymer;PhiladelphiaPA))
■亮氨酸(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich;St.LouisMO))
■ETC1-乙基纤维素(10cp,48%乙氧基;密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)
■ETC2-乙基纤维素(乙基纤维素P10;宾夕法尼亚州费城的陶氏化学公司(DowChemicalCo.))
■HPC-细磨羟丙基纤维素(KlucelEXF;特拉华州威尔明顿的Hercules公司)
■HPMC-羟丙基甲基纤维素(甲基纤维素E5:宾夕法尼亚州费城的陶氏化学公司)
■从密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司获得的试剂:
○盐酸吖啶黄
○PBS缓冲液-磷酸盐缓冲液盐水溶液
■从加利福尼亚州加迪纳的光谱实验室公司(SpectrumLaboratories;GardenaCA)获得的试剂:
○PVP-聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)
○硬脂醇富马酸酯钠NF
○碳酸钠粉末
○碳酸氢钠粉末
○山梨醇
○柠檬酸粉末
○乳糖
■单核细胞增多性李斯特菌的细菌储用培养物(ATCC11994)-弗吉尼亚州马纳萨斯的美国美国典型培养物保藏中心(TheAmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA)。通过用该储用培养物对SBA板进行划线接种并在35℃温育过夜来制备划线接种板。
■胰酶大豆琼脂板-获自马里兰州斯帕克斯的BD公司(BectonDickinson,Sparks,MD)的DifcoTM胰酶大豆琼脂,使用马里兰州斯帕克斯BD公司的DifcoTM胰酶大豆肉汤根据生产商的说明以3重量百分比(wt%)制备
■Butterfield磷酸盐稀释剂(也称为Butterfield缓冲剂)-明尼苏达州圣保罗的3M公司
■胰酶大豆肉汤-明尼苏达州圣保罗的3M公司
■从加利福尼亚州圣玛丽亚的哈迪诊断公司(HardyDiagnostics;SantaMariaCA)获得的培养基
○MOX板-牛津培养基,针对李斯特菌进行改良,琼脂基生长培养基
■血琼脂板-含有5%绵羊血的胰酶大豆琼脂;
实例1.含有崩解助剂的包衣片剂的制备
通过将表1中所列的用于实例1的材料添加至10mL球磨管中来制备片剂组合物。该批料的总量为2.04克。该管配备有1.25cm直径的球,将该组合物在混合磨(MM300型混合磨;宾夕法尼亚州纽敦的莱驰公司(RetschInc.;NewtownPA)上以16-s的频率处理60秒。将大约20mg经研磨的组合物放进制片冲模中的6个3mm直径的圆形腔体的每一者中。将具有对应于每个腔体的推杆的配合模设置于腔体之上并用手动压机压缩来形成片剂。每片重约19mg。将以这种方式制备的十片片剂放进10mL去离子水中。全部片剂均在10-20分钟内完全溶解。
通过将7.5%EudragitL100聚合物和3.25%ETC1溶解于乙醇中来制备涂料溶液。将片剂在一侧进行浸涂,在60℃的热风中干燥,然后在另一侧浸涂和干燥,务必涂覆整个片剂。重复该过程两次以在片剂上提供3层涂层。放入20mL去离子水的十片包衣片剂在约3小时内完全溶解。
实例2.泡腾片剂的制备
根据实例1中所述的程序制备具有表1中所示的用于实例2的材料的片剂组合物。片剂每片重约18mg并且在每枚片剂中含有约4.5mg吖啶黄。将10枚片剂放进10mL去离子水中时产生气泡。片剂在1-2分钟内溶解,在气体冒出后得到均质溶液。
表1.
实例3.具有各种涂层厚度的片剂的制备
通过将表2中对实例3所列的材料量添加至200mL玻璃杯中并涡旋2分钟来制备片芯组合物。批料量为20克。将0.3125英寸直径的制片冲模填充250mg该组合物并在半自动压机(印第安纳州瓦巴什的卡夫公司(CarverInc.;WabashIN))上以3,000磅的力压缩以形成250mg片剂。
将0.5英寸直径的第二制片冲模用于制备包衣片剂。将比例为1:2、1:1和2:1的ETC1和HPMC粉末的混合物一起搅拌。用每种混合物以及单独用ETC1涂覆片芯。对于每枚片剂,将120mg粉末放进冲模腔中并压平。将片芯在粉末上保持居中,添加另外120mg该混合物以覆盖该片剂。以3000磅力压缩该模具以形成包衣片剂。
对每种粉末重复该程序。将包衣片剂放入40mLPBS缓冲液中并监测溶解情况。比例为2:1的片剂溶解超过6小时,而比例为1:2和1:1的片剂在约3小时内溶解。
表2.
实例4.带崩解助剂的包衣片剂的制备
根据实例3中所述的程序,使用表2中的用于实例4的材料制备片芯,并用ETC1与HPMC之比为2:1的粉末混合物包衣。将冲模腔填充200mg该粉末并压平,将片芯在冲模腔中保持居中,添加另外200mg粉末以覆盖该片剂并压缩。对多个片剂重复该过程,每片在冲模腔底部具有225mg、250mg和275mg并且有相同的量覆盖该片剂。
将每种片剂(包括未包衣的片剂)添加至烧杯中的40mLTSB中。在多个时间点取出300μL缓冲液样品,并在片剂周围出现气泡(这是片剂接近其破裂点的指示)后提取更多样品。在SpectraMax190光谱仪(加利福尼亚州森尼韦尔的分子仪器公司(MolecularDevices,Sunnyvale,CA))上测量各缓冲液样品在550nm的吸光度。未包衣的片剂在5分钟内完全溶解。一旦芯完全溶解,则泡腾混合产生均质溶液。包衣片剂完全溶解的破裂时间是在片剂出现稳定的气泡流开始的20-30分钟内。这表明芯中的崩解助剂与泡腾材料所产生的气泡之间使物质从片剂释放的协同增强效应。图2显示了通过监测在550nm的吸光度,具有不同量的涂层的片剂在TSB中的定量性破裂释放曲线。在每一侧具有约225mg或250mg涂层的片剂可以用于其中对于某些生物体如(李斯特菌)期望5.5-6.6小时延迟的富集培养基,而较低的涂层重量可以用于需要较短时间来生长的微生物的富集培养基。
实例5.具有选择剂和6小时延迟释放的包衣片剂
使用表3的组成制备片芯组合物。添加碳酸锂以提供锂离子来充当单核细胞增多性李斯特菌的选择剂。使材料通过30目筛网,然后根据实例3中所述的程序混合并压缩成片剂。将该组合物在具有0.5英寸圆形腔体的片剂冲模中压缩。重大约1g的这种片芯含有约0.3g碳酸锂。通过片剂硬度测定仪(Dr.Schleuniger8M;新罕布什尔州曼彻斯特的Pharmtron公司(PharmtronInc.;ManchesterNH))测定,该片芯的硬度为约7。
通过在200mL玻璃杯中手动涡旋表3中的包衣组合物2分钟来制备包衣组合物。根据实例3中所述的程序制备包衣片剂,不同的是片剂冲模具有0.6875直径的腔体以及将约0.60克包衣组合物放入该腔体的底部并将约0.95g的该组合物覆盖片芯。将5,000磅的力用于压缩片剂。该片剂在40mLTSB中在约6小时内溶解。
表3.
实例6.具有吖啶黄和6小时延迟释放的包衣片剂
根据实例5中的程序,使用表4中的片剂组成制备片芯。每片重约1g,含有约0.6毫克盐酸吖啶黄。片剂的硬度为约7。用实例5的组成和程序对片剂进行包衣,不同的是大约0.45g包衣组合物用于底层而约0.70g用于覆盖片剂。在室温下该包衣片剂在约6小时内溶解于40mLTSB中。
表4
材料 | 片剂组成-实例6-重量%VII |
二氧化硅纳米粒子 | 0.5 |
硬脂酸镁 | 1.25 |
HPC | 5 |
碳酸氢钠粉末 | 31 |
碳酸钠粉末 | 9 |
柠檬酸粉末 | 34.51 |
山梨醇 | 18.683 |
盐酸吖啶黄 | 0.06 |
实例7-具有吖啶黄和锂以及6小时延迟释放的包衣片剂
使用实例5中的组成根据实例5的程序制备片芯,该片芯具有用于单核细胞增多性李斯特菌的两种选择剂和两种泡腾试剂(碳酸锂和柠檬酸)。每枚片剂重约1g,含有0.26g碳酸锂和0.6mg盐酸吖啶黄。片剂的硬度为约7。在Natoli工程公司(NatoliEngineering)(密苏里州圣路易斯)制造的0.6275英寸冲模中将如表3所示的外包衣层(涂层)施加于片芯。如实例5中所述对顶部和底部均施加0.38克的包衣粉末,并以3200磅压制。在35℃片剂在约6小时内溶解于40mL肉汤中。
表5.
组分 | 片剂组成(实例7)重量% |
SIL2 | 1 |
硬脂醇富马酸酯钠 | 1.25 |
Klucel EXF | 5 |
碳酸锂 | 26.2 |
柠檬酸 | 45.41 |
碳酸钠 | 16.00 |
氯化吖啶黄 | 0.066 |
山梨醇 | 4.82 |
实例8-单核细胞增多性李斯特菌的检测
将来自划线接种板培养物的单核细胞增多性李斯特菌(ATCC11994)菌落接种进胰酶大豆肉汤中并在35℃温育20-24小时。将该过夜培养物在Butterfield磷酸盐稀释剂中稀释以提供具有约5000个cfu/mL(集落形成单位/mL)的细菌悬液。
将120g的一部分购自当地杂货店的生火鸡绞肉放进塑料袋中并用含有2000个cfu的单核细胞增多性李斯特菌的约0.4mL细菌悬液接种。手动揉捏火鸡绞肉约5分钟以混合接种物。将接种的火鸡绞肉在约-18℃冷冻约36小时,然后允许其在2-8℃解冻12小时。将20g的一部分来自同一包装的火鸡肉(未接种但冷冻并解冻)用做对照。
制备具有与Fraser肉汤类似的组成(如表6所示组成)的肉汤培养基,不含选择剂即氯化锂和盐酸吖啶黄。将该肉汤培养基蒸汽灭菌。
通过将100毫升该无菌肉汤培养基和10g解冻的接种过的火鸡肉添加至具有过滤器的兜袋(3MTM均化袋-6469;明尼苏达州圣保罗的3M公司)来制备样品。将袋中的样品在兜袋(Stomacher400循环器;英国西萨塞克斯郡Seward公司(Seward;WestSussexUK))上以230rpm均化30秒。在即将温育前,将来自实例7的片剂添加至样品1的袋中。以相同的方式制备另外四份样品,如下添加试剂:将来自实例7的片剂添加至样品2和3的2个袋每一者中,样品2和3为样品1的重复品。通过将液体试剂(0.1mL6mg/mL盐酸吖啶黄溶液(在反渗透水中制备)和0.5mL300mg/mLLiCl溶液(在反渗透水中制备))立刻(t=0)添加至袋中来制备样品4。通过在6小时温育后(t=6)将相同量的液体试剂添加至袋中来制备样品5。以相同的方式制备样品6,不同的是不添加活性物。样品7为仅用肉汤培养和未接种的火鸡绞肉制备的阴性对照。
将所有样品都放入35℃培养箱中。35℃温育6小时后,从培养箱移出样品5并添加吖啶黄和LiCl溶液。将样品放回培养箱,并分别在18、20、22和24小时后,移出5mL滤液样品,放进无菌聚丙烯试管中并在-18℃冷冻用于后续样品制备。在移出每份样品后将袋放回培养箱中。
使用样品制备试剂盒(PrepSEQTM离心样品制备试剂盒(SpinSamplePreparationKit),产品编号N4409735;加利福尼亚州福斯特城的应用生物***公司(AppliedBiosystems;FosterCityCA))制备用于PCR分析的样品。将双份600微升体积的每份收集的样品吸移至微离心机离心柱中并根据生产商的说明书制备DNA。一式两份制备样品。
将单核细胞增多性李斯特菌(ATCC11994-如上所述制备)的过夜培养物在10毫摩尔每升的磷酸盐缓冲液中连续10倍系列稀释,从而得到具有约108至约101个cfu/mL(假设该过夜培养物具有约109个cfu/mL)的细菌悬液。将分别具有约102和101个cfu/mL的稀悬液置于培养装置(如3MTMPetrifilmTM需氧菌均计数板(AerobicCountPlate);3M公司;明尼苏达州圣保罗)上用于精确的cfu测定。也按与处理火鸡肉样品类似的方式处理分别具有约106至约102个cfu/mL的细菌稀释液的600μL等分试样用于PCR分析,如下所述。
将600μL样品上样至为微量离心管上的预过滤器柱并以14,000rpm离心4分钟,弃去顶部的预过滤器柱,抽吸每份样品的上清液并弃去。将50微升体积的来自试剂盒的裂解缓冲液添加至该管中,然后添加10微升蛋白酶K溶液(20mg/mL蛋白酶K溶液,分子生物学级;密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)。将样品在55℃温育30分钟,然后在100℃煮沸10分钟。在冷却至约室温后,将260微升无DNA酶的水(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen;CarlsbadCA))添加至每个微量离心管并以14,000rpm离心1分钟。将来自每根离心柱的澄清上清液用于实时PCR测量。
实时PCR测试用单核细胞增多性李斯特菌检测试剂盒(PN4366102;加利福尼亚州福斯特城的应用生物***公司(AppliedBiosystems;FosterCityCA))根据根据生产商建议的方案来进行,即将来自每份煮沸样品的12微升和18mLPCR预混物吸移进96孔PCR板(MicroAmp板;加利福尼亚州福斯特城的应用生物***公司)中。用透明带密封PCR板并通过涡旋轻轻地混合。在带有数据分析软件(MxPro)的StratageneMx3005PQPCR***(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技公司(AgilentTechnologies,SantaClara,CA))上进心实时PCR测量以测定Ct值。
实例9:用于培养受热胁迫的细菌的控释选择剂
从SBA划线接种板获得单核细胞增多性李斯特菌(ATCC19111)的菌落并接种至5mL灭菌TSBYE(含有6g/L酵母提取物的胰蛋白酶大豆肉汤,二者均从BD公司获得并根据生产商的说明书制备;马里兰州斯帕克斯(SparksMD))中。将接种的肉汤培养基在35℃温育18小时。将离心管(Falcontube)中的4.5ml体积的TSBYE在保持于55℃的水浴中加热30分钟。将0.5mL体积的肉汤培养物添加至该管中并剧烈涡旋3-5秒。通过将稀释的培养物在55℃水浴中温育精确的10分钟,然后立刻放入冰浴中30分钟来制备受胁迫的细胞培养物。
将经类似处理的肉汤培养物的稀释液(未经热处理)也放入冰浴中。将这两种培养物系列稀释(10倍稀释液;0.1mL加入0.9mLButterfield磷酸盐稀释剂中),并将0.1mL该稀释液涂布接种于MOx琼脂板上并且还涂布接种于SBA板上,还涂布接种每种板的重复板。将平板在35℃温育48小时,并且然后计数以确定菌落数和受胁迫细胞的百分比。
制备具有类似于Fraser肉汤的组成如表6所示的组成的肉汤培养基,不含选择剂即氯化锂和盐酸吖啶黄。将该肉汤培养基蒸汽灭菌。
表6
材料 | 终浓度-(g/L) |
酪蛋白胰酶消化物 | 5 |
□蛋白胨No.3 | 5 |
牛肉浸膏 | 5 |
酵母提取物 | 5 |
氯化钠 | 20 |
磷酸二钠 | 9.6 |
磷酸一钾 | 1.35 |
马栗树皮苷 | 1.0 |
萘啶酸,钠盐 | 0.02 |
制备受热胁迫的细胞培养物并将其在Butterfield磷酸盐稀释剂中进行两次系列10倍稀释,并将0.05ml最后的系列稀释液添加至过滤兜袋(均化袋,部件编号6469;明尼苏达州圣保罗的3M公司)中的100mL肉汤培养基。每个袋中的终浓度为约20cfu/mL肉汤培养基。将袋密封并在兜袋(Stomacher400循环器;英国西萨塞克斯郡Seward公司)上以230rpm的设定处理30秒。
于35℃温育之前立刻(t=0)或在温育6小时后(t=6),将表7中所示的选择剂添加至相应兜袋的每一者中。在温育期间,在19小时、21小时和24小时后从每个袋中移出5mL样品。在取得每份样品后将袋放回培养箱中。
如下在MOx琼脂板上计数来自每份样品的活细胞:将5毫升等分试样在Butterfield磷酸盐稀释剂中进行六次系列10倍稀释,然后一式两份将0.1mL每种稀释液部分铺展到MOx琼脂板上并在35℃温育48小时。对每个板上的菌落进行计数并记录为每组一式二份的板的平均logcfu。
表7.
袋子 | 所添加的试剂 |
1 | 无 |
2 | *立刻添加的Li/ACF液 |
3 | *在温育6小时后添加的Li/ACF |
4 | **立刻添加的包衣片剂1 |
5 | **立刻添加的包衣片剂2 |
6 | **立刻添加的包衣片剂3 |
*Li/ACF-0.1mL6μg/mL吖啶黄和0.5mL600mg/mL的LiCl
**根据实例7制备的包衣片剂
实例10-12用于控制释放活性剂的小袋
具有如表8中所示的用于实例10-12的等级和厚度的聚乙烯醇膜以SOLUBLON商标名从日本丰桥的Aicello化学公司(AicelloChemicalCo.;Toyohashi,Japan)获得。切取约2英寸(5cm)×约3英寸(7.5cm)的小片并在3个侧边加热密封以形成小袋。以1:1的比例制备碳酸氢钠和柠檬酸的混合物(含有约0.1%酚红),并将约2克添加至小袋每一者中,加热密封最后侧边。
在室温下将小袋每一者浸入200mL水中,记录并在表8中显示小袋破裂的时间。就在破裂之前,在小袋周围产生气泡,在这里其已开始溶解。数秒内,小袋破裂,并且泡腾材料将染料在水中快速混合。
表8.
实例 | 膜等级 | 膜厚度 | 溶解度 | 破裂的时间 |
10 | EF-30 | 30微米 | 热水 | 约5分钟 |
11 | BP-26 | 26微米 | 温水 | 约1分钟 |
12 | KA-40 | 40微米 | 冷水 | 约30秒 |
实例13-14用于活性剂控释的胶囊
通过将100g碳酸钠和柠檬酸的2:1混合物与0.1%酚红混合,并将该混合物与20g山梨醇研磨来制备均质粉末。将4号HPMC胶囊手动填充该混合物,并且每粒胶囊重大约215mg。然后对于实例13,将封闭的胶囊手动浸涂进10%EudragitS100聚合物和5%柠檬酸三乙酯的乙醇溶液中。对于实例14,将第二层涂覆在第一层之上。将胶囊每一者放入15mLPBS缓冲液中。没有涂层的胶囊在数分钟内溶解。单涂层将释放时间延迟至1.5小时,双层涂层将释放延迟至约3.5小时,释放时间延迟。
实例15.细菌利用片剂中所递送的选择剂生长
使用表9中所示的组合物,根据实例3的程序制备片剂。片剂的标称重量为100毫克/片(mg/片),并且每片具有0.2817英寸(0.716cm)的直径,具有凸面形状。以1000磅压制片剂。
表9.
*LUTROLmicro127-具有环氧乙烷的甲基-环氧乙烷聚合物;BASF公司;新泽西州弗洛厄姆帕尔克(FlorhamPark,NJ)
通过将每种组成的片剂溶解于1升恢复培养基(改良的李斯特菌恢复肉汤(MLRB),可得自明尼苏达州圣保罗的3M公司)中制备生长培养基的样品。片剂在4.5分钟溶解。通过将10mg头孢他啶水合物粉末(产品号C3809-5G,可得自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)溶解于1升MLRB中制备作为对照的生长培养基样品。制备生长培养基的六种稀释液以获得表9中所示的头孢他啶水合物(CDH)的浓度。
通过将恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(ATCC31483,获自ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯)的纯培养物接种至胰酶大豆肉汤(BDTM胰酶大豆肉汤;BD公司;马里兰州斯帕克斯)中并在37℃温育来制备细菌悬液。将悬液在SMB(标准方法缓冲液(StandardMethodsBuffer);明尼苏达州圣保罗的3M公司)中1:1,000稀释。将稀释的悬液进一步在含有表10中所示的头孢他啶浓度的SMB生长培养基中1:10,000稀释。如下将每种样品的四份重复物吸移进96孔板中:无头孢他啶水合物的生长对照;具有10微克头孢他啶水合物/毫升细菌悬液的未稀释对照;以及含有表10中所示头孢他啶水合物浓度的接种培养基的每种稀释液。将该96孔板在37℃温育过夜并目测检查细菌生长。孔中的浊度表示生长。
表10
*mcgCDH/微升=每微升样品中头孢他啶水合物的毫克数
“+”指示生长;“-”指示物生长
表10中的数据显示,在片剂中递送选择剂与在粉末中递送选择剂相当并且显示无生长的最低头孢他啶水合物浓度为5mcg/微升样品。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物和电子文献的全部公开内容以引用方式并入。在本专利申请和以引用方式并入本文的任何文献的公开内容之间存在矛盾的情况下,应以本发明的公开内容为准。给出上述详细说明及实例仅为清楚地理解本发明。这些说明和实例不应被理解成对本发明进行不必要的限制。而且,本发明并不局限于本文所显示及所描述的具体细节,本发明的各种变化对于本领域技术人员来说是显而易见的,这些变化都包括在本发明由权利要求书所界定的范围内。
所有的标题是为了阅读者方便,而不应该被用于限制该标题后面的正文的含义,除非是这么规定的。
在不脱离本发明的精神和范围的前提下,可以进行各种修改。这些和其它实施例均在所附权利要求书的范围内。
Claims (8)
1.一种增进靶微生物的生长的方法,该方法包括:
提供培养基、可能包括所述靶微生物的样品和潜泡腾体;
其中所述潜泡腾体包括其中设置有芯组合物的外壳;
其中所述芯组合物包含两种或更多种泡腾组分和相对于至少一种其它微生物的生长而有利于所述靶微生物生长的选择剂;
其中所述芯组合物包含第一泡腾组分,所述第一泡腾组分包含碳酸锂或碳酸氢锂;
其中所述碳酸锂或碳酸氢锂被用作所述泡腾组分中的一种和被用作选择剂;
使所述样品、所述潜泡腾体和所述培养基在有利于所述靶微生物生长的条件下接触;以及
从所述潜泡腾体释放所述选择剂;
其中释放所述选择剂还包括在将包含所述样品和所述培养基的含水混合物置于与所述潜泡腾体处于流体接触预定的一段时间后释放所述选择剂。
2.根据权利要求1所述的方法,其中释放所述选择剂还包括使所述选择剂分布于所述培养基中。
3.根据权利要求1所述的方法,该方法还包括检测微生物。
4.一种潜泡腾体,其包括:
当与含水液体接触时崩解的外壳;和
设置于其中的芯组合物;
其中所述芯组合物包含第一和第二泡腾组分和相对于至少一种其它微生物的生长而有利于靶微生物生长的选择剂;
其中所述第一泡腾组分包含碳酸锂或碳酸氢锂;
其中所述碳酸锂或碳酸氢锂被用作所述泡腾组分中的一种和被用作选择剂;
其中所述外壳包含聚乙烯醇、聚(甲基)丙烯酸酯、纤维素和甲基纤维素、丙基纤维素或任何上述物质的混合物。
5.根据权利要求4所述的潜泡腾体,其还包含助流剂、缓冲组分、微生物生长指示剂、营养物质、粘合剂、崩解助剂、润滑剂、填充剂、防粘着剂或上述物质的任意两种或更多种的组合。
6.根据权利要求4所述的潜泡腾体,其中所述外壳包括小袋。
7.根据权利要求4所述的潜泡腾体,其中所述第一泡腾组分包含碱并且所述第二泡腾组分包含酸。
8.根据权利要求4所述的潜泡腾体,其中所述微生物生长指示剂包含pH指示剂、酶底物或氧化还原指示剂。
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