JP5658973B2

JP5658973B2 - 乳酸菌検出用培地

Info

Publication number: JP5658973B2
Application number: JP2010242970A
Authority: JP
Inventors: 功勝結城; 崇朝原; 琢也 ▲高▼橋; 高橋　明; 明高橋; 康二野本
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2030-10-29
Also published as: JP2012090611A

Description

本発明は、ヒト糞便中の乳酸菌、特にラクトバチルス・カゼイを選択的に検出できる培地、及び当該培地を用いる乳酸菌の検出法に関する。

ラクトバチルス・カゼイ等の乳酸菌には、整腸作用、術後感染性合併症予防効果、乳がんや膀胱がんに対する発がん予防作用等種々の生理作用を有することが知られており、乳酸菌の生菌を含有する飲食品が広く使用されている。乳酸菌がこのような生理作用を示すには、乳酸菌は生きて腸に到達することが重要である。

乳酸菌が生きて腸に到達したかどうかを確認する手段としては、乳酸菌や乳酸菌含有飲食品を摂取したヒトの糞便中の乳酸菌を検出する方法が広く採用されている。

乳酸菌検出用培地としては、ＬＢＳ培地が広く一般に使用されている。一方、ヒト糞便中の乳酸菌を検出する培地としてＬＢＳ培地を改変したＬＬＶ（ｌａｃｔｉｔｏｌ−ＬＢＳｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）寒天培地（非特許文献１）が知られている。

Ｉｎｔ．Ｊ．ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８，５１−５７（１９９９）

しかしながら、ヒト糞便には、種々の抗生物質耐性菌が含まれることが多く、例えばバンコマイシン耐性大腸菌群等の発生が知られている。このような大腸菌群を多量に含有する糞便を測定対象とした場合には、ＬＬＶ培地において、大腸菌群と乳酸菌を見分けることが難しく、乳酸菌検出培地として使用できないことが明らかとなってきた。
従って、本発明の課題は、バンコマイシン耐性であってかつＬＬＶ寒天培地で生育可能な腸内細菌を含む糞便を対象とした場合であっても、乳酸菌を選択的に検出できる培地を提供することにある。

そこで本発明者は、ＬＢＳ培地を基礎培地とし、種々の成分の添加、削除等を検討したところ、ＬＢＳ培地からグルコースを除いた成分に、ホスホマイシン、ラクチトール及びバンコマイシンを含有させた培地を用いれば、ヒト糞便中のバンコマイシン耐性大腸菌群の生育を有効に抑制でき、乳酸菌を選択的に検出できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ＬＢＳ培地からグルコースを除いた成分、ホスホマイシン、ラクチトール及びバンコマイシンを含有することを特徴とする改変ＬＢＳ培地を提供するものである。
また本発明は、上記改変ＬＢＳ培地を用いることを特徴とするヒト糞便中の乳酸菌の検出法を提供するものである。

本発明の培地を用いれば、バンコマイシン耐性大腸菌群がヒト糞便中に存在したとしても、糞便中の乳酸菌、特にラクトバチルス・カゼイを高感度で選択的に検出可能である。従って、乳酸菌又は乳酸菌含有飲食品を摂取したヒトの腸に、乳酸菌が到達したかどうかが正確に判定できる。

各種選択培地におけるラクトバチルス・カゼイ(ＹＩＴ９０２９）及び大腸菌群（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）３菌株の発育状況を示す図である。図中の符号は次のとおり。Ａ，Ｄ，Ｇ：糞便懸濁液Ａ＋大腸菌群３菌株（各１０⁸ＣＦＵ／ｍＬ）＋ラクトバチルス・カゼイ（１０³ＣＦＵ／ｍＬ）Ｂ，Ｅ，Ｈ：糞便懸濁液Ｂ＋大腸菌群３菌株＋ラクトバチルス・カゼイＣ，Ｆ，Ｉ：糞便懸濁液Ｃ＋大腸菌群３菌株＋ラクトバチルス・カゼイＰ：輸送培地＋ラクトバチルス・カゼイ

本発明の改変ＬＢＳ培地は、公知のＬＢＳ培地からグルコースを除いた成分、ホスホマイシン、ラクチトール及びバンコマイシンを含有する。ここでＬＢＳ培地は、乳酸菌を検出できる培地として知られている培地であり、培地１Ｌあたり次の成分を含有する。タンパク質分解物（例えばペプトン分解物、カゼイン分解物等）５〜１５ｇ（好ましくは１０ｇ）、酵母エキス３〜７ｇ（好ましくは５ｇ）、リン酸二水素カリウム４〜８ｇ（好ましくは６ｇ）、クエン酸アンモニウム１〜３ｇ（好ましくは２ｇ）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンオレエート０．５〜２ｇ（好ましくは１ｇ）、酢酸ナトリウム２０〜３０ｇ（好ましくは２５ｇ）、硫酸マグネシウム０．３〜０．９ｇ（好ましくは０．５７５ｇ）、硫酸鉄０．０１〜０．０６ｇ（好ましくは０．０３４ｇ）、硫酸マンガン０．０８〜０．３ｇ（好ましくは０．１２ｇ）、グルコース１５〜２５ｇ（好ましくは２０ｇ）、寒天１０〜２０ｇ（好ましくは１５ｇ）。また、ｐＨは５．５±０．２が望ましい。

本発明においては、上記の成分からグルコースを除いた成分を含有するＬＢＳ培地を用いる。

ラクチトールは、培地１Ｌあたり１５〜２５ｇ、特に２０ｇ含有するのが、乳酸菌選択性の点で好ましい。また、バンコマイシンは、培地１Ｌあたり５〜２０ｍｇ、特に１０ｍｇ含有するのが、乳酸菌選択性の点で好ましい。

本発明の培地には、ホスホマイシンを含有するのが、バンコマイシン耐性菌の発育を抑制する点で好ましい。ホスホマイシンの含有量は、培地１Ｌあたり５００〜１５００ｍｇ、特に５００〜１０２４ｍｇであるのか好ましい。

本発明の培地には、前記成分の他、水が含まれる。

本発明の培地は、前記成分のうち、ホスホマイシン、バンコマイシンは濾過滅菌（フィルター滅菌）で、それ以外の成分については加熱滅菌した後、両者を混合し、必要により寒天を添加してゲル化することにより製造できる。形態は寒天平板培地が好ましい。

本発明の培地は、ヒト糞便中の乳酸菌の選択培地として有用である。ここで乳酸菌のうち、ラクトバチルス属乳酸菌、特にラクトバチルス・カゼイの選択培地として有用である。

さらに、本発明の培地は、バンコマイシン耐性大腸菌群の生育抑制能を有するので、ヒト糞便中にバンコマイシン耐性大腸菌群が含まれている場合であっても、乳酸菌、特にラクトバチルス・カゼイを検出することができる。ここでバンコマイシン耐性大腸菌群には、バンコマイシン耐性のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓから選ばれる１種又は２種以上が含まれる。

本発明の培地を用いて乳酸菌を検出するには、培地に段階希釈した試料を添加して通常の好気培養条件で培養し、コロニーの有無を検出すればよい。培養条件は、好気条件下、３７±２℃で２４〜７２時間程度培養するのがよい。コロニーの検出は、培地上のコロニーをカウントすればよい。なお、液体培地の場合には、濁度等の菌体濃度測定に用いられる方法により乳酸菌の検出をすることができる。また、特定の乳酸菌の生菌数を測定する場合には、コロニー形状による判定、菌種あるいは菌株特異的抗体による判定、菌種あるいは菌株特異的プライマーあるいはプローブを用いたＰＣＲ法・ＲＴ−ＰＣＲ法あるいはＦＩＳＨ法による判定等を単独あるいは組み合わせて用いることにより、高精度な定性・定量が可能となる。

次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。

実施例１
Ａ．実験方法
（１）供試菌株
ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭＢＰ−１３６６）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＡＴＣＣ１１７７５（バンコマイシン耐性）、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ１３８８３（バンコマイシン耐性）、ＰｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓＡＴＣＣ２９９０６（バンコマイシン耐性）を試験に用いた。ＹＩＴ９０２９については１０ｍＬのＭＲＳ液体培地（１００％ＣＯ₂ガス，ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて、３７℃、２４時間嫌気培養した後、その菌液を４℃にて３５００×ｇ、１０分間遠心分離して上清を取り除き、菌体を再び１０ｍＬのＭＲＳ液体培地に懸濁した（１０⁹ＣＦＵ／ｍＬ）。大腸菌群の３菌株については、それぞれ１０ｍＬのＢＨＩ液体培地（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて、３７℃で１６時間振湯培養（１４０ｒｐｍ／ｍｉｎ）した後、ＹＩＴ９０２９と同条件で遠心分離操作を行い、菌体を１０ｍＬのＢＨＩ液体培地に懸濁した（それぞれ１０⁹ＣＦＵ／ｍＬ）。以上のＹＩＴ９０２９及び大腸菌群３菌株の菌液を以下の実験に用いた。

（２）最小発育阻止濃度の測定
ＹＩＴ９０２９及び大腸菌群の３菌株における最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）測定用基礎培地として、それぞれＭＲＳ液体培地（１００％ＣＯ₂ガス）及びＢＨＩ液体培地を用いた。抗菌薬には、クロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ，Ｃａ．Ｎｏ．Ｃ０３７８）、ホスホマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａ．Ｎｏ．Ｐ５３９６）、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａ．Ｎｏ．Ｋ４０００）あるいはバンコマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａ．Ｎｏ．Ｖ２００２）を用いた。各抗菌薬を２０４８μｇ／ｍＬになるようにＭＲＳ液体培地、あるいはＢＨＩ液体培地に溶解して０．４５μｍのメンブランフィルター（クラボウ）を用いてろ過滅菌した後、基礎培地にて抗菌薬を２倍段階希釈した（試験管段階希釈法）。この各２倍段階希釈液にＹＩＴ９０２９を１０⁵ＣＦＵ／ｍＬ、あるいは大腸菌群の３菌株を１０⁹ＣＦＵ／ｍＬになるように添加して３７℃、４８時間（ＹＩＴ９０２９）、あるいは３７℃、１６時間（大腸菌群の３菌株）培養した。培養後、培養液の濁度を観察して対照（抗菌薬非存在下）に比べて増殖が抑えられた各種抗菌薬の最低濃度をＭＩＣとした。判定は、ＣＬＳＩＭ１００−Ｓ１８を参考にして感受性（Ｓ）、中間（Ｉ）、耐性（Ｒ）を判定した（Peformance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eighteenth Infomational Supplement: CLSI M100-S18 vol. 28 No.1.）。

（３）ホスホマイシン（ＦＯＭ）添加ＬＬＶ寒天培地におけるＹＩＴ９０２９及び大腸菌群の発育性
ＦＯＭを蒸留水に溶解して０．４５μｍのメンブランフィルターにてろ過滅菌した後、最終濃度が０、１００、２５０、５００、あるいは１０００μｇ／ｍＬになるようにＦＯＭを添加したＬＬＶ寒天培地（表１）を作製した。ＹＩＴ９０２９の各培地上におけるコロニー形成を確認するため、ＹＩＴ９０２９菌液を１〜２×１０³ＣＦＵ／ｍＬになるようにＭＲＳ液体培地で１０倍段階希釈した後、その５０μＬを各ＦＯＭ濃度のＦＯＭ−ＬＬＶ寒天培地に塗抹した。３７℃、４８時間培養後、培地上に発育したコロニー数をカウントした。一方、大腸菌群３菌株の培養液（１０⁹ＣＦＵ／ｍＬ）５０μＬを各ＦＯＭ濃度のＦＯＭ−ＬＬＶ寒天培地に塗抹した後、３７℃、４８時間培養して、培地上に発育したコロニー数をカウントした。コロニー形成の陽性対照となる非選択培地として、ＹＩＴ９０２９にはＭＲＳ寒天培地、大腸菌群３菌株にはＢＨＩ寒天培地を用いた。ここでＬＬＶ寒天培地は、ＬＢＳ培地からグルコースを除き、ラクチトール及びバンコマイシンを添加した培地である（Ｉｎｔ．Ｊ．ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４８（１９９９）５１−５７）。

（４）ＦＯＭ−ＬＬＶ寒天培地における糞便懸濁液からのＹＩＴ９０２９の回収性及び大腸菌群３菌株のコロニー形成の抑制
健常成人ボランティア３名（Ａ、Ｂ及びＣ）の新鮮***便を嫌気輸送培地［０．０２２５％ＫＨ₂ＰＯ₄，０．０２２５％Ｋ₂ＨＰＯ₄，０．０４５％ＮａＣｌ，０．０２２５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，０．００２２５％ＣａＣｌ₂，０．００２２５％ＭｇＳＯ₄，０．３％Ｎａ₂ＣＯ₃，０．０５％Ｌ−システイン塩酸塩，０．０００１％リサズリン，１０％グリセロール（ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌ），１．０％Ｌａｂｌｅｍｃｏｐｏｗｄｅｒ（Ｏｘｏｉｄ）］により、それぞれ１０倍希釈［糞便１ｇ／１０ｍＬ（嫌気輸送培地）］した。そこに大腸菌群３菌株の菌液をそれぞれの最終菌数が１０⁸ＣＦＵ／ｍＬになるように添加した。さらにこれらの懸濁液（Ａ，Ｂ，又はＣ）に最終菌数がそれぞれ１０²，１０³，１０⁴，１０⁵，１０⁶，１０⁷又は１０⁸ＣＦＵ／ｍＬになるようＹＩＴ９０２９菌液を添加した。以上の菌液を添加した糞便懸濁液を滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈した後、各希釈濃度の検体をＦＯＭ（１０００μｇ／ｍＬ）−ＬＬＶ寒天培地、ＬＬＶ寒天培地及びＤＨＬ寒天培地（日水製薬）（腸内細菌分離用培地）にそれぞれ１００μｌずつ塗抹した。ＦＯＭ−ＬＬＶ寒天培地及びＬＬＶ寒天培地については、３７℃、４８時間培養した後、培地上に発育したＹＩＴ９０２９の白色正円コロニー数をカウントした。発育したコロニーについて、菌株特異的モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によりＹＩＴ９０２９コロニーであることを確認した。ＤＨＬ寒天培地については、３７℃、２４時間培養後、培地上に発育したＥ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓのコロニー数をカウントした。大腸菌群３菌株の発育コロニーについては、ＡＰＩ２０Ｅ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）にて菌種の同定を行った。陽性対照として、試験に使用したＹＩＴ９０２９菌液（１０²〜１０⁸ＣＦＵ／ｍＬ）をＭＲＳ寒天培地に塗抹した。３７℃、４８時間培養した後、培地上に発育したコロニー数をカウントした。

Ｂ．実験結果
（１）ＹＩＴ９０２９が高度耐性で且つ大腸菌群３菌株が感受性な抗菌薬の選択
種々の抗菌薬４種に対するＹＩＴ９０２９及び大腸菌群３菌株のＭＩＣを表２に示した。ＹＩＴ９０２９及び大腸菌群３菌株は、いずれもバンコマイシンに対して高度耐性［ＭＩＣ；＞１０２４（μｇ／ｍＬ）］であった。ＹＩＴ９０２９及び大腸菌群３菌株のクロラムフェニコール、ＦＯＭ又はカナマイシンに対するＭＩＣは１６〜１０２４で、ばらつきが大きかった。ＦＯＭについては、ＹＩＴ９０２９のＭＩＣが＞１０２４と高度耐性で、且つ大腸菌群３菌株のＭＩＣがいずれも２５６であり、ＹＩＴ９０２９と大腸菌群３菌株間のＭＩＣに明確な差が認められた。

（２）各濃度のＦＯＭを添加したＬＬＶ寒天培地におけるＹＩＴ９０２９及び大腸菌群３菌株の発育性
０〜５００μｇ／ｍＬのＦＯＭを添加したＬＬＶ培地では大腸菌群３菌株のコロニー形成を完全に抑制することは出来なかった（表３）。１０００μｇ／ｍＬのＦＯＭを添加したＦＯＭ−ＬＬＶ寒天培地においては、ＹＩＴ９０２９の回収性は非選択培地やＬＬＶ寒天培地とほぼ同等であり、ＦＯＭによるＹＩＴ９０２９の増殖抑制作用は認められなかった。一方で大腸菌群３菌株の発育が完全に抑制された（表３）。

（３）ＦＯＭ−ＬＬＶ寒天培地による糞便懸濁液からのＹＩＴ９０２９回収性及び大腸菌群のコロニー形成抑制
ＹＩＴ９０２９（１０²〜１０⁸ＣＦＵ／ｍＬ）及び大腸菌群３菌株（１０⁸ＣＦＵ／ｍＬ）を添加した糞便懸濁液からのＹＩＴ９０２９の回収性は、ＹＩＴ９０２９を糞便懸濁液に添加した際（１０²〜１０⁸ＣＦＵ／ｍＬ）と同等であった（表４）。なおＦＯＭ−ＬＬＶ寒天培地によるＹＩＴ９０２９回収菌数については被験者３名間の差は認められなかった。糞便懸濁液中の大腸菌群３菌株は、ＦＯＭ−ＬＬＶ寒天培地上に全くコロニーを形成しなかった。一方、ＬＬＶ寒天培地では、ＤＨＬ寒天培地に比べて１／１０以下の菌数レベルではあるが、大腸菌群３菌株が大量に発育していた（表５）。

（４）ＹＩＴ９０２９及び大腸菌群の各培地におけるコロニー性状
ＦＯＭ−ＬＬＶ寒天培地おいて、ＹＩＴ９０２９は正円白色コロニーを形成し（図１−Ａ〜Ｃ）、陽性対照のＭＲＳ寒天培地とほぼ同数のコロニーが観察された（図１−Ｐ）。また大腸菌群３菌株の発育は認められなかった（図１−Ａ〜Ｃ）。一方、ＤＨＬ寒天培地には、大腸菌群３菌株の赤色コロニーが大量に観察された（図１−Ｄ〜Ｆ）。さらに、ＬＬＶ寒天培地でも、大腸菌群３菌株の黄色コロニーが大量発育しており、ＹＩＴ９０２９のコロニーを観察することは出来なかった（図１−Ｇ〜Ｉ）。

Claims

ＬＢＳ培地からグルコースを除いた成分、ホスホマイシン、ラクチトール及びバンコマイシンを含有することを特徴とする、ヒト糞便に含まれる乳酸菌検出用改変ＬＢＳ培地。
ホスホマイシン濃度が５００〜１０２４ｍｇ／Ｌである請求項１記載の培地。
ヒト糞便に含まれるラクトバチルス・カゼイ検出用培地である請求項１又は２記載の培地。
バンコマイシン耐性大腸菌群の生育抑制能を有するものである請求項１〜３のいずれか１項記載の培地。
バンコマイシン耐性大腸菌群が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈiａｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＰｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓから選ばれる１種以上を含むものである請求項４記載の培地。
請求項１〜５のいずれか１項記載の培地を用いることを特徴とするヒト糞便中の乳酸菌の検出法。
請求項１〜５のいずれか１項記載の培地を用いることを特徴とするヒト糞便中のラクトバチルス・カゼイの検出法。