CN103436452B - 一株桃色顶孢霉jx524288及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288，其保藏编号为CCTCC NO:M2013200。本发明还提供了该菌种的发酵液在拮抗病原真菌以及促进大豆萌发上的应用。本发明的桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288真菌菌株具有广谱的拮抗植物病原真菌的作用，可用于农作物防治病害；同时由于该菌株的代谢物对植物种子相对安全，且具有促进大豆种子萌发的作用，因此，可克服施用化学试剂所带来的危害，在农业生产中具有广阔的应用前景。

Description

一株桃色顶孢霉JX524288及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株桃色顶孢霉JX524288及其应用，特别涉及一株能够广谱拮抗病原真菌以及促进大豆萌发的桃色顶孢霉JX524288及其应用。

背景技术

植物病害是严重危害农业生产的自然灾害之一，据***粮农组织估计，世界上每年因病害造成的粮食减产在10%以上。使用化学杀菌剂可以有效控制植物病害的为害，但化学杀菌剂存在污染环境、破坏生态平衡、药物残留等问题,尤其是20世纪50年代以来，全球环境遭到空前破坏和污染，1992年***环境与发展大会通过了《21世纪议程》，确立了可持续发展在全球经济和社会中的战略地位，因此，植物病害的生物防治越来越受到重视。

生物防治的科学记载是从sanfprd(1926)报道土壤中某些拮抗性微生物对于土传病原菌的抑制性开始的。我国植物生防的研究工作开始于50年代初期，70年代以来，病害生物防治的研究和实践十分活跃，而且发展迅速。近几年来，国内外有关生物防治的文献资料急剧增加，生物防治的生产实践也在扩大。

生物防治微生物从腐生的土壤微生物到植物体微生态系中微生物的利用；防治病害的种类从种传和土传病害到地上部的气传和虫传病害。由于生物防治具有对环境、生态和人类健康较为安全的优点，因此，世界各国十分的重视生防微生物的开发与研究。

目前的研究已发现许多微生物具有生防功能，在生产上广泛应用的真菌有木霉、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉、厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌等。李莉报导了顶孢霉对菜青虫的生长抑制作用，宋丽雯报导了顶孢霉对蚜虫的抑制作用，但顶孢霉在抑制植物病原真菌中还未见报道。

发明内容

本发明的第一目的是提供一株桃色顶孢霉JX524288，具有广谱的拮抗病原真菌效果的同时，其代谢物对大豆种子萌发具有一定的促进作用，为植物病害生物防治提供新的微生物资源。

本发明的第二目的是提供上述桃色顶孢霉JX524288的用途。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一株桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288，其保藏编号为CCTCC NO:M2013200。

该微生物的无性阶段属于半知菌门Deuteromycota，丝孢纲Hyphomycetes，丛梗孢目Moniliales，淡色菌科Moliliaceae。

在大庆选校园内山坡上，用铁锹挖取土壤深度约为4-10cm的土样，装入取样纸袋中，将纸袋标记好并带回实验室进行土壤内真菌的分离得到。本发明桃色顶孢霉在固体查氏培养基平板中的菌落菌丝为绒毡状，菌落表面为淡粉色，显微观察显示，该菌株的产孢结构为瓶梗，瓶梗底部膨大，互生，孢子着生在瓶梗顶端。

本发明桃色顶孢霉真菌菌株的***发育学鉴定。通过真菌通用引物ITS4和ITS5利用PCR扩增出546bp的rRNA基因，将此序列通过BLAST程序与GenBank中收集的核苷酸序列对比，结果表明，相似性在99%以上的有30个菌株核苷酸序列，主要是顶孢霉菌（Acremonium）、子囊菌（Ascomycota）、虫草菌（Cordyceps），菌株Acremoniumpersicinum FN706545与拮抗真菌的序列非常相似，长度相差1个碱基。比对鉴定的结果表明，这一菌株为桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）。

本发明菌株的序列与GenBank中与其相似的20个菌株的序列用clustalx软件进行比较，再用MEGA4程序中Neighbor Joining方法建立***发育树，发现，拮抗真菌与Acremonium persicinum FN706545的亲缘关系最近，达99%，验证了该菌株为桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）。

该真菌菌株的培养条件为：在PDA培养基上，其菌丝及孢子的生长状态最佳，气生菌丝生长发达，产孢量较多。以查氏培养基为基础培养基，菌丝生长的最适碳源为蔗糖、氮源为胰蛋白胨；在pH8.5、温度为30℃时可提高菌丝生长速率，添加无机离子Zn²⁺对菌丝生长有利。

二、上述的桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288在拮抗病原真菌以及促进大豆萌发上的应用。

采用上述技术方案的积极效果：本发明的桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288真菌菌株具有广谱的拮抗植物病原真菌的作用，可用于农作物防治病害；同时由于该菌株的代谢物对植物种子相对安全，且具有促进大豆种子萌发的作用，因此，可克服施用化学试剂所带来的危害，在农业生产中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为菌株在固体培养基上的菌落形态图；

图2为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株的分生孢子梗及分生孢子的显微形态图；

图3为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与水稻纹枯病丝核病菌对峙培养的形态图；

图4为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株18S rRNA序列的***发育树状图；

图5为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与镰刀菌的对峙培养的形态图；

图6为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与玉米大斑病菌的对峙培养的形态图；

图7为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与向日葵菌核病菌的对峙培养的形态图；

图8为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与马铃薯丝核菌的对峙培养的形态图；

图9为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与大豆菌核病菌的对峙培养的形态图；

图10为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与小麦赤霉病菌的对峙培养的形态图；

图11为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与水稻恶苗病菌的对峙培养的形态图；

图12为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与大豆根腐镰刀菌的对峙培养的形态图；

图13为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与燕麦镰刀菌的对峙培养的形态图；

图14为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与玉米圆斑病菌的对峙培养的形态图；

图15为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与黄瓜枯萎病菌的对峙培养的形态图；

图16为本发明桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288菌株与番茄早疫病菌的对峙培养的形态图；

图17为不同浓度桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288发酵液对大豆种子发芽率的影响；

图18为不同浓度桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288发酵液对大豆种子发芽势的影响；

图19为不同浓度桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288发酵液对大豆种子发芽指数的影响；

本发明所涉及的桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288，于2013年5月14日在中国专利局或国际专利组织承认的保藏中心进行了专利程序保藏，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2013200。

具体实施方式

下面结合实施例和对比例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明菌株的分离。

选取校园内山坡上具有代表性的地点，用铁锹挖取土壤深度约为4-10cm的土样，装入取样纸袋中，纸袋中的土壤应没有较大颗粒，将纸袋标记好并带回实验室进行土壤内真菌的分离。称取5g阴干的土样，放入已灭菌的研钵里进行研磨，将土样研磨成大小均一的颗粒为止。用无菌水将土样稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍的土壤悬液，吸取不同稀释度的土壤悬液约0.1mL涂布在PDA培养基上，每组设三个重复，28℃恒温箱暗培养。待菌落长出后，挑取大小、形态、色泽不同的单菌落在PDA平板上重新培养纯化。

其中，PDA平板的组方是：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。

将实验室冰箱内保存的植物病原菌丝核菌（Rhizoctonia solani）从斜面转接到PDA平板上进行活化，28℃培养，待丝核菌长满平板后，用直径为5mm的打孔器将丝核菌平板打成若干菌牒，用接种针挑取菌牒接入PDA平板中，并在距离丝核菌菌牒3cm处接入从土壤当中分离得到的真菌菌牒，28℃培养2-4d后测量土壤内真菌与病原真菌之间的距离，对土壤内的拮抗真菌进行筛选。

抑制作用强弱用“+”表示。“+++”表示抑制作用很强，抑菌半径长度大于6.0mm；“++”表示抑制作用中等强度，抑菌半径长度在2.0mm和6.0mm之间；“+”表示抑制作用弱或者没有活性，抑菌半径小于2.0mm或者无抑菌半径，病原菌生长正常并覆盖了拮抗真菌。对采集的土样进行分离，根据平板上长出的菌落的颜色和形态等差异来进行分离培养，对于菌落颜色及形态目测相似的菌株，只挑取一株进行保存。通过该方法，分离获得了一株抑制作用较强，对病原菌菌丝生长抑制率达到75%的菌株。通过拮抗真菌菌落的形态学观察及显微观察显示，如图1和图2所示，该菌株的菌落菌丝为绒毡状，菌落表面为淡粉色，产孢结构为瓶梗，瓶梗底部膨大，互生，孢子着生在瓶梗顶端。在丝核菌与其距离最近的菌体边缘处，丝核菌的菌丝稀疏且细，颜色变淡，如图3所示，证明该菌株可有效的拮抗丝核菌。通过真菌通用引物ITS4和ITS5利用PCR扩增出546bp的rRNA基因，将此序列通过BLAST程序与GenBank中收集的核苷酸序列对比，结果表明，相似性在99%以上的有30个菌株核苷酸序列，主要是顶孢霉菌（Acremonium）、子囊菌（Ascomycota）、虫草菌（Cordyceps），菌株Acremonium persicinumFN706545与拮抗真菌的序列非常相似，长度相差1个碱基。比对鉴定的结果表明，这一菌株为桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）。菌株的序列与GenBank中与其相似的20个菌株的序列用clustalx软件进行比较，再用MEGA4程序中Neighbor Joining方法建立***发育树，发现，拮抗真菌与Acremonium persicinum FN706545的亲缘关系最近，达99%，验证了该菌株为桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）。***发育学的鉴定结果与形态学的鉴定结果相同，***发育树状图如图4所示。

实施例2

本实施例说明菌株抑菌谱的测定。

根据实施例1获得的对丝核菌具有较强拮抗能力的有效菌株，采用菌丝生长抑制法对其进行抑菌谱测定。菌丝生长抑制法：将实验室冰箱内保存的各种植物病原菌转接到PDA平板上进行活化，在28℃恒温箱内培养4-6d，用直径为5mm的无菌打孔器分别在病原菌菌体边缘位置打成大小一致的菌牒，用接种针挑取菌牒分别接入PDA平板中，在距离菌牒3mm处接入拮抗真菌的菌牒，每组3次重复，置于28℃恒温箱中培养3-5d后分别测量拮抗真菌与不同病原菌之间的抑菌半径。

抑制作用强弱用“+”表示。“+++”表示抑制作用很强，抑菌半径长度大于6.0mm；“++”表示抑制作用中等强度，抑菌半径长度在2.0mm和6.0mm之间；“+”表示抑制作用弱或者没有活性，抑菌半径小于2.0mm或者无抑菌半径，病原菌生长正常并覆盖了拮抗真菌。本发明的真菌菌株，对大量植物病原真菌菌丝的生长均具有抑制能力，且抑菌能力较强，如表1所示，该菌株对抗多种病原真菌的对峙图如图5至图16所示。

表1桃色顶孢霉抑菌谱测定

注：“+++”表示抑制作用很强，抑菌半径长度大于6.0mm；“++”表示抑制作用中等强度，抑菌半径长度在2.0mm和6.0mm之间；“+”表示抑制作用弱或者没有活性，抑菌半径小于2.0mm或者无抑菌半径，病原菌生长正常并覆盖了拮抗真菌。

实施例3

本实施例说明该菌株的培养。

以查氏培养基（组方：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂15g，蒸馏水1000mL）为基本培养基，分别称取20g葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘露糖和纤维素取代查氏培养基中的蔗糖，制成含不同碳源的培养基。同样，分别称取3g尿素、硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨，大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏取代查氏培养基中的NaNO₃，制成含不同氮源的培养基。

用1mol/L的盐酸及氢氧化钠溶液将培养液的pH值分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0，再加入琼脂粉，分装灭菌（121℃，20min），制成不同pH值的培养基。分别置于培养温度为25℃、28℃、30℃、32℃和35℃的恒温箱中培养。以查氏培养基为基本培养基，分别添加0.01g的MnSO₄、CuSO₄和ZnSO₄制成含不同无机离子的培养基，培养第6d开始测量每组菌丝生长直径，每隔24h测量一次。计算不同培养条件下本发明菌株的菌丝生长速率。

结果发现，本发明菌株以查氏培养基为基础培养基，菌丝生长的最适碳源为蔗糖、氮源为胰蛋白胨；在pH8.5、温度为30℃时可提高菌丝生长速率，添加无机离子Zn²⁺对菌丝生长有利。

实施例4

本实施例说明该菌株的代谢物的稳定性试验。

首先配制查氏培养基，用接种针刮取桃色顶孢霉孢子接种于培养基中，置于摇床上28℃，160rpm振荡培养，将培养好的桃色顶孢霉发酵液在121℃条件下处理30min，然后用微孔滤膜过滤器过滤除菌，用未经处理的无菌滤液和无菌水作对照，采用管牒法测定其抑菌能力。将发酵液培养到15d后，静置存放，存储时间为3个月和6个月，以无菌水作对照，采用管牒法，吸取发酵上清液对病原指示菌进行抑菌能力检测。将发酵液培养到15d后，用移液枪吸取发酵上清液30mL，平均分成3份，倒入表面皿中，分别放在40w的日光灯和自然可见光下照射，照射时长为4h、8h和12h，处理完之后利用微孔滤膜进行过滤除菌，采用管牒法检测其抑菌活性。实验结果发现，本发明菌株的代谢物在经高温、光照及长时间保存后抑菌能力几乎不变，均在90%以上，稳定性较强。

实施例5

本实施例说明该菌株具有促进大豆种子萌发的作用。

挑选饱满，种皮完整，大小均匀的大豆种子（绥农29）50粒，用蒸馏水冲洗种子表面，然后用0.1%的升汞消毒8min，无菌水冲洗数次，向铺有三层滤纸的培养皿中加入等量无菌水，将滤纸浸湿。将经消毒后的种子均匀摆放在培养皿中的滤纸上，并向每个皿中均匀喷洒不同浓度的处理液10mL，以培养基和发酵原液作对照，每个处理三个重复，28℃的恒温培养。从培养的第2d开始，每天固定时间记录每个培养皿中萌发的种子数（发芽标准为胚根伸出种脐部分长度超过种子纵径一半为标准，要求胚根发育正常，胚根弯曲并呈螺旋状盘绕者不予统计），并补充10mL处理液，取培养3、4、5d的种子4g，放入离心管中冷冻保存，用于酶活性测定实验（标记浓度和日期）。7d后从每个培养皿中随机取20粒发芽种子。统计发芽率、发芽势、发芽指数，如图17-19所示。计算方法如下：

萌发率(Gr)=(萌发种子数/供试种子数)×100%；

发芽势(Gp)=日发芽种子数达到最高时的萌发种子数/供试种子数×100%；

发芽指数(Gi)=ΣGt/Dt；

式中，Gt为t天的萌发数；Dt为发芽日数。

发现，本发明菌株的代谢物对大豆种子安全，且具有促进种子萌发的作用。在发酵液浓度为60%时，种子萌发率最高，可达85%；且发酵液在60%这个浓度时，种子的发芽势和发芽指数也达到最高值，发芽势和发芽指数分别为43%和18%。

对比例1

本对比例用于说明该菌种的作用。

小区设计：试验采用小区试验，3次重复，每处理小区6垄，每垄10m行长。共设3个处理，对照（水浸种），60%顶孢霉发酵液浸种及3‰多菌灵浸种，浸种时间均为6h。

种子处理：选取大豆种子，用75%酒精表面消毒2min，无菌水清洗5次，凉干，留用浸种处理。经浸种后的种子按20粒/m的距离播种。

土壤处理：用锄头给大豆小区起垄，在垄内将用麦粒培养基扩繁后的大豆尖孢镰孢菌按每小区200mL孢悬液（孢悬液浓度为10⁷/mL）接种，接种后马上用土将其混合好。播种于混合后的大豆垄内，大豆出苗后常规管理，不施肥和农药。

调查项目及方法：大豆幼苗出苗后生长30d，调查病情指数，大豆根病发病情况采用辛惠普等（1987）的病害分级标准进行分级，病情指数及防效；收获后测量株高及产量等指标。

病情指数=[∑（病株数×发病级别）/（株数总和×最高发病级别）]×100

大豆根腐病分级标准如下：

0级：主根，须根健全，无病斑，根瘤多；1级：主根上有零星病斑，但不连片，须根上无病斑；2级：主根上病斑连片，但小于根部周长的1/4，须根略微发病；3级：主根上病斑大于周长的1/4，但小于1/2，须根病斑较多，但不连片；4级：主根上病斑大于周长的1/2，但小于3/4，须根略微发病；5级：整个根部均有病斑包围，根部腐烂，须根近无。

实验结果发现，经本发明菌株浸种处理的小区苗期根腐病发病情况同多菌灵浸种区近似，防效可达70%左右，收获后植株高度及小区产量均有提高。如表2和表3所示。

表2不同浸种处理对大豆根腐病的防治效果

Claims (2)

1.一株桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288，其保藏编号为CCTCC NO:M2013200。

2.权利要求1所述的桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）JX524288的发酵液在拮抗病原真菌以及促进大豆萌发上的应用。