CN103432579B - 一种羔羊痢疾b型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法 - Google Patents
一种羔羊痢疾b型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法;是将B型产气荚膜梭菌接种在硫乙醇酸盐流体培养基中,在厌氧环境条件下38℃14h培养增菌;将上述培养物加入到由缓冲液溶解的胰蛋白胨、糊精、酵母浸膏、L-精氨酸培养基中,在厌氧环境下振荡培5h,然后4℃15min3800g离心,蔡氏滤器中过滤除菌;将灭活好的类毒素按1:1比例加入灭菌的白油佐剂,并加入0.01%硫柳汞,即得类毒素疫苗。该疫苗无毒副作用,效价高,免疫力强,能有效预防、控制由B型产气荚膜梭菌引起的羔羊痢疾、绵羊、山羊、驹及犊牛的肠毒血症或坏死性肠炎。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。
(二)发明背景
B型产气荚膜梭菌可引起羔羊痢疾、绵羊、山羊、驹及犊牛的肠毒血症或坏死性肠炎,主要致病毒素为α、β、ε毒素。由β-毒素引起的坏死性肠炎,一般认为是由于食物中的胰蛋白酶阻止了肠道中该毒素的分解,从而导致该病的发生。此外,该毒素可能还是一种神经毒素。而B型ε-毒素的分泌量少,它则可促使动物的主动脉和其它动脉收缩而导致血压升高;此外,还具有与血脑屏障内血管上皮受体结合的能力,从而引起血管通透性增高,最终导致致死性水肿,但ε-毒素不耐热(Mcdonel,1986)。
多年来,我国生产中使用的是灭活菌苗,早在1989年,陈锡全等已经开展了“兔病毒性出血症和A型魏氏梭菌联苗”的研究并且取得成功;佟承刚等(1991)研制兔的魏氏梭菌单苗,对实验动物可以产生82.01%的保护率;鲁承(1997)等对兔瘟病毒和A型魏氏梭菌二联苗进行了研究;杨瑛(1997)对A型魏氏梭菌氢氧化铝灭活苗进行研究,疫苗0.6ml、2ml、4ml可以保护小鼠、兔和猪抵抗标准A型1MLD毒素的攻击;姚湘燕等(1998)采用三个不同来源的牛源魏氏梭菌分离株研制牛魏氏梭菌浓缩AL(OH)3灭活苗;王克领(1998)等对兔出血病、魏氏梭菌病、巴氏杆菌病三联苗进行了研究;谭诗文等(2000)进行了羔羊痢疾、羊肠毒血症、大肠杆菌病、羊猝狙四联油佐剂灭活苗的研制。这些菌苗对该病的预防有一定的效果,同时也存在一些不足:最关键地是疫苗中的有效成分主要为菌体抗原,诱导机体产生的抗体只能够中和菌体抗原,却难以中和毒素抗原,与家畜“猝死症”致病机理不全相符。因此,灭活菌苗的有效性还存在一些质疑。
柴同杰(2001)对家畜“猝死症”致病机理的研究发现:在某种应激状态下,动物肠道中微生态平衡破坏,使魏氏梭菌呈‘***性’的繁殖,瞬间产生大量的外毒素,肠粘膜通透性的升高使得毒素或细菌+毒素进入血液循环引起毒血症(有时伴有菌血症),从而导致重要器官的衰竭,造成动物死亡;由此,进一步提出,“魏氏梭菌感染致病以及动物快速死亡的主要原因是肠源性毒血症,预防的关键在于针对毒素引起的毒血症,疫苗的抗原成分应是相应的类毒素”的学说。
B型产气荚膜梭菌引发的羔羊痢疾等疾病发病急,死亡快,有时症状不太明显并且根本来不及治疗。要从根本上控制本病的传播,减少或避免经济损失,必须采取切实有效的预防措施。产气荚膜梭菌形成的主要外毒素的化学成分为蛋白质,具有较好的免疫原性。因此,根据产气荚膜梭菌的发病机理,制备产气荚膜梭菌外毒素,将其灭活后做成类毒素疫苗,用于畜禽预防。
(三)发明内容
为了解决上述问题,本发明发明提供了一种效价全、免疫力强、针对性好、无毒副作用的羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法,用于动物的B型产气荚膜梭菌病特别是羔羊痢疾的预防,控制羔羊痢疾等B型产气荚膜梭菌病的流行。
羔羊痢疾等B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法,包括以下步骤:
1B型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上在厌氧环境(气体的组成为85%氮气9%氢气6%二氧化碳)下37℃46h复苏。
2B型产气荚膜梭菌接种在硫乙醇酸盐流体培养基中,在厌氧环境(气体的组成为85%氮气9%氢气6%二氧化碳)下38℃14h培养增菌。
3将8ml上述培养物加入到产毒培养基(每100mlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸)中,在厌氧环境下振荡培养,221摆/min,38℃培养5h,然后在4℃3800g离心15min,再用孔径0.22μm的蔡氏滤器中过滤除菌,即得外毒素溶液。
4在外毒素溶液中加入外毒素溶液体积比为0.3%的甲醛,充分振荡混匀,置37℃48h灭活,间隔5-6h振摇一次,得到灭活好的类毒素溶液。
5在类毒素溶液中按1:1体积比加入灭菌的白油佐剂乳化,每100毫升乳化液中加入0.01克硫柳汞制得B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗;
所述白油佐剂构成:9份白油和一份Span-80混合后加入白油和Span-80混合液体积比2%的Tween-20和质量比1%的硬脂酸铝;
所述的血平板培养基成分为:100毫升蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5%体积比绵羊血;
所述的产毒培养基成分为:每100mlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸;
所述的PBS缓冲液成分为:1L去离子水、8g NaCl、0.2g KCl、3.58g Na2HPO4·12H2O、0.27g KH2PO4。
使用时,肌肉注射,一次5毫升。
有益效果
该疫苗无毒副作用,效价高,免疫力强,能有效预防、控制由B型产气荚膜梭菌引起的羔羊痢疾、绵羊、山羊、驹及犊牛的肠毒血症或坏死性肠炎,能为养殖业减少损失,带来可视性利益。
(四)具体实施方式
实施例1 疫苗制备的详细过程
首先,制备菌液。B型产气荚膜梭菌菌种NCTC6121(National Collection of TypeCultures-英国微生物菌种保藏中心保藏保藏号:NCTC6121)挑取一环(约3μl)接种于血平板培养基(100ml蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖、5毫升绵羊血)厌氧环境(各气体浓度为85%N2、9%H2、6%CO2)37℃46h复苏。挑取一个B型产气荚膜梭菌菌落接种在硫乙醇酸盐流体培养基FT(青岛日水生物技术有限公司生产)中,在气体浓度为85%N2、9%H2、6%CO2的厌氧环境条件下38℃14h培养增菌。
将上述培养物加入到自制的产毒培养基(每100mlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸)中,在厌氧环境下振荡培养,221摆/min,38℃5h,4℃15min3800g离心,再用孔径0.22μm的蔡氏滤器中过滤除菌,即得外毒素,将所制备的外毒素加入甲醛使甲醛终浓度达到0.3%,充分振荡混匀,置37℃48h灭活,间隔5-6h振摇一次。
在灭活好的类毒素溶液中按1:1体积比加入灭菌的白油佐剂,加入硫柳汞(每100毫升类毒素溶液中和白油佐剂疫苗混合液中加入0.01克硫柳汞),即得类毒素疫苗。使用时,肌肉注射,一次5毫升。
实施例2 疫苗安全性及效果的验证
最小致死量的确定 用体重30kg的健康绵羊12只,随机分成四组,分别注射5ml、7ml、9ml、11ml制备的B型产气荚膜梭菌外毒素,一天后,注射5ml和7ml外毒素的绵羊发生腹泻但不死亡,注射9ml和11ml毒素的绵羊严重腹泻后死亡,因而确定9ml为绵羊最小致死量。
安全性检验 取1.5kg健康兔4只,分别肌肉接种5ml所制备的B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,连续观察10天。局部无肉芽肿等不良反应,全身亦无异常反应。(参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》)
使用剂量的确定 用体重为30kg的健康绵羊12只,随机分为四组,分别注射4、5、6、7ml所制备的疫苗,18d后四组均注射9ml的B型产气荚膜梭菌外毒素,观察3d,注射5、6、7ml疫苗的绵羊均不死亡,并且无羔羊痢疾的症状,因而,免疫剂量定为5ml。
免疫效力检验 用体重30kg的健康绵羊6只,其中4只肌肉注射5ml制备的类毒素疫苗,另外两只不注射类毒素疫苗作为对照组。18d后,6只绵羊均注射9ml的B型产气荚膜梭菌外毒素。24h后,对照组的2只绵羊严重腹泻并死亡,而免疫过的绵羊均不死亡,并且继续观察3d,无羔羊痢疾等发病症状。说明该疫苗对绵羊的保护力达到了100%。
Claims (1)
1.一种B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,其特征在于通过以下制备方法得到:
1)B型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上在厌氧环境下37℃46h复苏;
2)复苏后的B型产气荚膜梭菌接种在硫乙醇酸盐流体培养基中,在厌氧环境下38℃14h培养增菌;
3)将步骤2)增菌培养物按照接种量8%体积比接种产毒培养基,在厌氧环境下振荡培养,38℃培养5h,然后在4℃3800g离心15min,蔡氏滤器过滤除菌,得到外毒素溶液;
4)在外毒素溶液中加入外毒素溶液体积比为0.3%的甲醛,充分振荡混匀,置37℃48h灭活,间隔5-6h振摇一次,得到灭活好的类毒素溶液;
5)在类毒素溶液中按1:1体积比加入灭菌的白油佐剂乳化,每100毫升乳化液中加入0.01克硫柳汞制得B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗;
所述白油佐剂构成:9份白油和一份Span-80混合后加入白油和Span-80混合液体积比2%的Tween-20和质量比1%的硬脂酸铝;
所述的血平板培养基成分为:100毫升蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5%体积比绵羊血;
所述的产毒培养基成分为:每100mlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸;
所述的PBS缓冲液成分为:1L去离子水、8g NaCl、0.2g KCl、3.58g Na2HPO4·12H2O、0.27g KH2PO4。
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