CN103432579B - 一种羔羊痢疾b型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法；是将B型产气荚膜梭菌接种在硫乙醇酸盐流体培养基中，在厌氧环境条件下38℃14h培养增菌;将上述培养物加入到由缓冲液溶解的胰蛋白胨、糊精、酵母浸膏、L-精氨酸培养基中，在厌氧环境下振荡培5h，然后4℃15min3800g离心，蔡氏滤器中过滤除菌;将灭活好的类毒素按1:1比例加入灭菌的白油佐剂，并加入0.01%硫柳汞，即得类毒素疫苗。该疫苗无毒副作用，效价高，免疫力强，能有效预防、控制由B型产气荚膜梭菌引起的羔羊痢疾、绵羊、山羊、驹及犊牛的肠毒血症或坏死性肠炎。

Description

一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法

（一）技术领域

本发明涉及一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。

（二）发明背景

B型产气荚膜梭菌可引起羔羊痢疾、绵羊、山羊、驹及犊牛的肠毒血症或坏死性肠炎，主要致病毒素为α、β、ε毒素。由β-毒素引起的坏死性肠炎，一般认为是由于食物中的胰蛋白酶阻止了肠道中该毒素的分解，从而导致该病的发生。此外，该毒素可能还是一种神经毒素。而B型ε-毒素的分泌量少，它则可促使动物的主动脉和其它动脉收缩而导致血压升高；此外，还具有与血脑屏障内血管上皮受体结合的能力，从而引起血管通透性增高，最终导致致死性水肿，但ε-毒素不耐热（Mcdonel,1986）。

多年来，我国生产中使用的是灭活菌苗，早在1989年，陈锡全等已经开展了“兔病毒性出血症和A型魏氏梭菌联苗”的研究并且取得成功；佟承刚等（1991）研制兔的魏氏梭菌单苗，对实验动物可以产生82.01%的保护率；鲁承（1997）等对兔瘟病毒和A型魏氏梭菌二联苗进行了研究；杨瑛（1997）对A型魏氏梭菌氢氧化铝灭活苗进行研究，疫苗0.6ml、2ml、4ml可以保护小鼠、兔和猪抵抗标准A型1MLD毒素的攻击；姚湘燕等（1998）采用三个不同来源的牛源魏氏梭菌分离株研制牛魏氏梭菌浓缩AL(OH)₃灭活苗；王克领（1998）等对兔出血病、魏氏梭菌病、巴氏杆菌病三联苗进行了研究；谭诗文等（2000）进行了羔羊痢疾、羊肠毒血症、大肠杆菌病、羊猝狙四联油佐剂灭活苗的研制。这些菌苗对该病的预防有一定的效果，同时也存在一些不足：最关键地是疫苗中的有效成分主要为菌体抗原，诱导机体产生的抗体只能够中和菌体抗原，却难以中和毒素抗原，与家畜“猝死症”致病机理不全相符。因此，灭活菌苗的有效性还存在一些质疑。

柴同杰（2001）对家畜“猝死症”致病机理的研究发现：在某种应激状态下，动物肠道中微生态平衡破坏，使魏氏梭菌呈‘***性’的繁殖，瞬间产生大量的外毒素，肠粘膜通透性的升高使得毒素或细菌+毒素进入血液循环引起毒血症（有时伴有菌血症），从而导致重要器官的衰竭，造成动物死亡；由此，进一步提出，“魏氏梭菌感染致病以及动物快速死亡的主要原因是肠源性毒血症，预防的关键在于针对毒素引起的毒血症，疫苗的抗原成分应是相应的类毒素”的学说。

B型产气荚膜梭菌引发的羔羊痢疾等疾病发病急，死亡快，有时症状不太明显并且根本来不及治疗。要从根本上控制本病的传播，减少或避免经济损失，必须采取切实有效的预防措施。产气荚膜梭菌形成的主要外毒素的化学成分为蛋白质，具有较好的免疫原性。因此，根据产气荚膜梭菌的发病机理，制备产气荚膜梭菌外毒素，将其灭活后做成类毒素疫苗，用于畜禽预防。

（三）发明内容

为了解决上述问题，本发明发明提供了一种效价全、免疫力强、针对性好、无毒副作用的羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，用于动物的B型产气荚膜梭菌病特别是羔羊痢疾的预防，控制羔羊痢疾等B型产气荚膜梭菌病的流行。

羔羊痢疾等B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1B型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上在厌氧环境（气体的组成为85％氮气9％氢气6％二氧化碳）下37℃46h复苏。

2B型产气荚膜梭菌接种在硫乙醇酸盐流体培养基中，在厌氧环境（气体的组成为85％氮气9％氢气6％二氧化碳）下38℃14h培养增菌。

3将8ml上述培养物加入到产毒培养基（每100mlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸）中，在厌氧环境下振荡培养，221摆/min，38℃培养5h，然后在4℃3800g离心15min，再用孔径0.22μm的蔡氏滤器中过滤除菌,即得外毒素溶液。

4在外毒素溶液中加入外毒素溶液体积比为0.3%的甲醛，充分振荡混匀，置37℃48h灭活，间隔5-6h振摇一次，得到灭活好的类毒素溶液。

5在类毒素溶液中按1:1体积比加入灭菌的白油佐剂乳化，每100毫升乳化液中加入0.01克硫柳汞制得B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗；

所述白油佐剂构成：9份白油和一份Span-80混合后加入白油和Span-80混合液体积比2%的Tween-20和质量比1%的硬脂酸铝；

所述的血平板培养基成分为：100毫升蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5%体积比绵羊血；

所述的产毒培养基成分为：每100mlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸；

所述的PBS缓冲液成分为：1L去离子水、8g NaCl、0.2g KCl、3.58g Na₂HPO₄·12H₂O、0.27g KH₂PO₄。

使用时，肌肉注射，一次5毫升。

有益效果

该疫苗无毒副作用，效价高，免疫力强，能有效预防、控制由B型产气荚膜梭菌引起的羔羊痢疾、绵羊、山羊、驹及犊牛的肠毒血症或坏死性肠炎，能为养殖业减少损失，带来可视性利益。

(四)具体实施方式

实施例1  疫苗制备的详细过程

首先，制备菌液。B型产气荚膜梭菌菌种NCTC6121(National Collection of TypeCultures-英国微生物菌种保藏中心保藏保藏号:NCTC6121)挑取一环（约3μl）接种于血平板培养基（100ml蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖、5毫升绵羊血）厌氧环境（各气体浓度为85％N₂、9％H₂、6％CO₂）37℃46h复苏。挑取一个B型产气荚膜梭菌菌落接种在硫乙醇酸盐流体培养基FT（青岛日水生物技术有限公司生产）中，在气体浓度为85％N₂、9％H₂、6％CO₂的厌氧环境条件下38℃14h培养增菌。

将上述培养物加入到自制的产毒培养基（每100mlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸）中，在厌氧环境下振荡培养，221摆/min，38℃5h，4℃15min3800g离心，再用孔径0.22μm的蔡氏滤器中过滤除菌,即得外毒素,将所制备的外毒素加入甲醛使甲醛终浓度达到0.3%，充分振荡混匀，置37℃48h灭活，间隔5-6h振摇一次。

在灭活好的类毒素溶液中按1:1体积比加入灭菌的白油佐剂，加入硫柳汞（每100毫升类毒素溶液中和白油佐剂疫苗混合液中加入0.01克硫柳汞），即得类毒素疫苗。使用时，肌肉注射，一次5毫升。

实施例2  疫苗安全性及效果的验证

最小致死量的确定  用体重30kg的健康绵羊12只，随机分成四组，分别注射5ml、7ml、9ml、11ml制备的B型产气荚膜梭菌外毒素，一天后，注射5ml和7ml外毒素的绵羊发生腹泻但不死亡，注射9ml和11ml毒素的绵羊严重腹泻后死亡，因而确定9ml为绵羊最小致死量。

安全性检验  取1.5kg健康兔4只,分别肌肉接种5ml所制备的B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，连续观察10天。局部无肉芽肿等不良反应，全身亦无异常反应。（参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》）

使用剂量的确定  用体重为30kg的健康绵羊12只，随机分为四组，分别注射4、5、6、7ml所制备的疫苗，18d后四组均注射9ml的B型产气荚膜梭菌外毒素，观察3d，注射5、6、7ml疫苗的绵羊均不死亡，并且无羔羊痢疾的症状，因而，免疫剂量定为5ml。

免疫效力检验  用体重30kg的健康绵羊6只，其中4只肌肉注射5ml制备的类毒素疫苗，另外两只不注射类毒素疫苗作为对照组。18d后，6只绵羊均注射9ml的B型产气荚膜梭菌外毒素。24h后，对照组的2只绵羊严重腹泻并死亡，而免疫过的绵羊均不死亡，并且继续观察3d，无羔羊痢疾等发病症状。说明该疫苗对绵羊的保护力达到了100%。

Claims (1)

1.一种B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，其特征在于通过以下制备方法得到：

1)B型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上在厌氧环境下37℃46h复苏；

2)复苏后的B型产气荚膜梭菌接种在硫乙醇酸盐流体培养基中，在厌氧环境下38℃14h培养增菌；

3)将步骤2)增菌培养物按照接种量8％体积比接种产毒培养基，在厌氧环境下振荡培养，38℃培养5h，然后在4℃3800g离心15min，蔡氏滤器过滤除菌,得到外毒素溶液；

4)在外毒素溶液中加入外毒素溶液体积比为0.3％的甲醛，充分振荡混匀，置37℃48h灭活，间隔5-6h振摇一次，得到灭活好的类毒素溶液；

5)在类毒素溶液中按1:1体积比加入灭菌的白油佐剂乳化，每100毫升乳化液中加入0.01克硫柳汞制得B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗；

所述白油佐剂构成：9份白油和一份Span-80混合后加入白油和Span-80混合液体积比2％的Tween-20和质量比1％的硬脂酸铝；

所述的血平板培养基成分为：100毫升蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5％体积比绵羊血；

所述的产毒培养基成分为：每100mlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸；

所述的PBS缓冲液成分为：1L去离子水、8g NaCl、0.2g KCl、3.58g Na₂HPO₄·12H₂O、0.27g KH₂PO₄。