CN103424481A

CN103424481A - 林可霉素、克林霉素和大观霉素的残留分析方法

Info

Publication number: CN103424481A
Application number: CN2013101627699A
Authority: CN
Inventors: 袁宗辉; 陶燕飞; 陈冬梅; 潘源虎; 王玉莲; 黄玲利; 王旭; 刘振利; 谢书宇; 彭大鹏; 戴梦红; 郝海红; 程古月
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2013-05-06
Filing date: 2013-05-06
Publication date: 2013-12-04

Abstract

本发明属于兽药残留分析领域，具体涉及林可霉素、克林霉素和大观霉素的残留分析方法。林可胺类药物包括林可霉素、克林霉素，将上述药物与硅烷基化试剂进行衍生化反应，所得到的产物更容易气化。奔发明对反应的条件进行优化选择，结果表明，在75～85℃水浴中，林可霉素、克林霉素与硅烷基化试剂衍生化反应0.5～1.5h，室温冷却后，即可直接进行气相色谱质谱分析。最小检出量5μg/L，结果重现性良好，3个浓度，5次单独重复的变异系数小于17％。该方法各项指标均能满足该兽药残留量分析对检测水平的要求，灵敏度有较大的提高。

Description

林可霉素、克林霉素和大观霉素的残留分析方法

技术领域

本发明属于兽药残留分析技术领域，本发明具体涉及一种林可胺类和大观霉素药物的残留分析方法，本发明与分析化学领域相关。

背景技术

林可霉素(lincomycin)和克林霉素(clindamycin)属于林可胺类抗生素。克林霉素是林可霉素的衍生物，其抗菌作用、应用与林可霉素相同，但抗菌效力比林可霉素强4-8倍。林可胺类抗生素对革兰氏阳性菌(葡萄球菌、溶血性链球菌和肺炎球菌等)有较强抗菌作用，对支原体也有抑制作用，但对革兰氏阴性菌如(粪链球菌、某些梭状芽胞杆菌、奴卡菌、酵母菌等)无效。大观霉素(spectinomycin)属于氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阴性菌(如布鲁氏菌、克雷伯菌属、变形杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等)有较强作用，对革兰氏阳性菌(链球菌、葡萄球菌等)作用较弱，对支原体亦有一定作用。大观霉素、林可霉素两者联合使用具协同作用，常用于防治猪腹泻、猪的支原体肺炎和败血支原体引起的鸡慢性呼吸道病等，是兽医上常用的复方制剂。

林可霉素和克林霉素对敏感人群副作用较强：可引起消化道反应，如恶心、呕吐等；还可导致过敏反应，如皮疹、荨麻疹、多形性红斑等。大观霉素可损害第八对脑神经，有肾脏毒性及对神经肌肉的阻断作用。不规范用药可导致在动物组织或其产品中残留，不仅影响动物性产品的加工生产，而且还会严重影响消费者的身体健康。欧盟2002年颁布了关于大观霉素和林可霉素在组织中的最大残留限量(残留标示物均为原形)。所有食品动物的肌肉、脂肪、肝、肾、奶中大观霉素的最大残留限量分别为300μg/kg，500μg/kg，1000μg/kg，1500μg/kg，200μg/kg，绵羊肝脏中大观霉素的最大残留限量为2000μg/kg；林可霉素在牛/羊/猪/禽的肌肉、脂肪、肝、肾中最大残留限量分别为100μg/kg，50μg/kg，500μg/kg和1500μg/kg，在牛奶中最大残留限量为150μg/kg。中国农业部于2003年颁布了关于大观霉素和林可霉素在组织中的最大残留限量。大观霉素在牛/羊/猪/鸡的肌肉、脂肪、肝、肾、奶和蛋中最大残留限量分别为500μg/kg、2000μg/kg、2000μg/kg、5000μg/kg、200μg/kg和2000μg/kg；林可霉素在牛/羊/猪/禽的肌肉、脂肪、肝和肾中最大残留限量分别是100μg/kg、100μg/kg、500μg/kg和1500μg/kg，在牛奶中最大残留限量为150μg/kg，在鸡蛋中最大残留限量为50μg/kg。目前还没有国家或组织规定克林霉素的最大残留限量，但由于其具有与林可霉素类似的毒副作用，也有必要加强残留监控。目前使用的方法对仪器设备和技术要求较高。目前有针对单种药物残留检测的方法报道，对于大观霉素以HPLC法和HPLC-MS/MS法为主，对于林可霉素和克林霉素以HPLC-MS/MS法为主。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种林可胺类和大观霉素药物的残留分析方法，本发明的方法与柱前衍生化方法有关。本发明是在以硅烷基化试剂为衍生化试剂进行柱前衍生化，后经气相色谱质谱检测分析，林可霉素、克林霉素及大观霉素与硅烷基化试剂的反应产物更容易气化，即该方法的灵敏度更高。

后经GC-MS在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，检测限可达到5μg/kg，它与HPLC法相比，假阳性率低，检测灵敏度更高。

本发明方法所述的衍生化试剂为硅烷基化试剂，该物质与林可霉素、克林霉素及大观霉素发生衍生化反应具有反应快速，产物易于气化等特点。在75～85℃水浴中，反应0.5～1.5h。衍生化反应的具体条件为：衍生化反应体系中衍生化试剂为硅烷基化试剂；最佳反应温度在75～85℃水浴中；最佳反应时间为0.5～1.5h。

生化反应的方程式如下：-

具体地，本发明的步骤如下所述：

1、林可霉素、克林霉素及大观霉素与硅烷基化试剂的衍生化反应

取经过净化处理的样本溶液在45～50℃下氮气吹干，加甲苯100μL和双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)100μL，加盖旋涡混合，80℃加热衍生1h(盖住盖子)，室温冷却后进行气相色谱-质谱分析。

2、衍生产物气相色谱-质谱测定，技术条件如下：

a)色谱柱：毛细管色谱柱Rtx-5(5％苯基甲基聚硅氧烷)，柱长30m，内径0.25mm。或相当者。

b)进样口温度：280℃

c)进样方式：不分流

d)进样体积：1μL

e)模式：恒流

f)载气：氦气(99.999％)

g)柱流速：1mL/min

h)柱温升温程序见表1。

表1柱温升温程序

质谱条件如下：

i)离子源温度：200℃

j)接口温度：280℃

k)质谱采集(SIM)：

林可霉素和克林霉素扫描离子：126(定量离子)，127，73(定性离子)；

大观霉素扫描离子：145(定量离子)，171，187，201(定性离子)。

本发明克服了以往分离物补容易气化的缺陷，通过柱前衍生化有效提高了GC-MS在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，检测限可达到5μg/L，它与HPLC法相比，假阳性率低，检测灵敏度更高。

附图说明

图1：标准溶液SIM提取离子色谱图。

图2：猪肾添加林可霉素、壮观霉素、克林霉素提取离子色谱图(林可霉素50μg/kg，壮观霉素50μg/kg，克林霉素50μg/kg)。

图3：牛肾添加林可霉素、壮观霉素、克林霉素提取离子色谱图(林可霉素50μg/kg，壮观霉素50μg/kg，克林霉素50μg/kg)。

图4：鸡肾添加林可霉素、壮观霉素、克林霉素提取离子色谱图(林可霉素50μg/kg，壮观霉素50μg/kg，克林霉素50μg/kg)。

图5：猪肉添加林可霉素、壮观霉素、克林霉素提取离子色谱图(林可霉素20μg/kg、壮观霉素50μg/kg、克林霉素20μg/kg)。

图6：牛肉添加林可霉素、壮观霉素、克林霉素提取离子色谱图(林可霉素20μg/kg、壮观霉素50μg/kg、克林霉素20μg/kg)。

图7：鸡肉添加林可霉素、壮观霉素、克林霉素提取离子色谱图(林可霉素20μg/kg、壮观霉素50μg/kg、克林霉素20μg/kg)。

图8：鸡蛋添加林可霉素、壮观霉素、克林霉素提取离子色谱图(林可霉素20μg/kg、壮观霉素50μg/kg、克林霉素20μg/kg)。

图9：牛奶添加林可霉素、壮观霉素、克林霉素提取离子色谱图(林可霉素20μg/kg、壮观霉素50μg/kg、克林霉素20μg/kg)。

具体实施方式

实施例1：林可霉素、克林霉素及大观霉素与硅烷基化试剂的衍生化反应

(1)准确量取林可霉素、克林霉素和大观霉素标准贮备液适量，用甲醇稀释成50、100、200、400、800、1600、3200μg/L浓度的标准工作液，取系列标准工作液各1.0mL，分别溶解空白组织经提取、净化及吹干后的残余物，充分混匀(提取、净化方法：肌肉、肾脏样品提取方法称取试料5g置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加样品提取液(称取磷酸二氢钾1.36克，加水溶解并稀释至1000mL，磷酸调节pH值至4.0)10mL，摇床振荡5min，5000r/min离心10min。收集上清液，残余物用样品提取液(配方同上)10mL重复提取一次。合并上清液，加3％三氯乙酸溶液5mL，8000r/min离心10min。上清液用2mol/L的氢氧化钾溶液调节pH值至5.8±0.2，加十二烷基磺酸钠溶液(称取十二烷基磺酸钠2.78克，用水溶解定容至50mL)2mL，漩涡混匀后静置15min，备用。牛奶、鸡蛋样品的提取方法为量取试料5g置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加样品提取液(称取磷酸二氢钾1.36克，加水溶解并稀释至1000mL，磷酸调节pH值至4.0)10mL，摇床振荡5min，5000r/min离心10min。收集上清液，残余物用样品提取液(配方同上)10mL重复提取一次。合并上清液，加入正己烷5mL，5000r/min离心15min，弃有机层，水层用2mol/L的氢氧化钾溶液调节pH值至5.8±0.2，加十二烷基磺酸钠溶液(称取十二烷基磺酸钠2.78克，用水溶解定容至50mL)2mL，漩涡混匀后静置15min，备用。固相萃取柱依次用甲醇、水、十二烷基磺酸钠缓冲液(称取十二烷基磺酸钠2.78克，用水溶解，加入乙酸1mL，定容至500mL)各3mL预洗，取备用液过柱，用水3mL淋洗两次，甲醇4mL洗脱，收集洗脱液，水浴40℃下氮气吹至近干时取出，室温下吹干。加500μL硅烷化试剂和100μL乙腈，涡旋混合1分钟，密封，75℃恒温箱中，衍生反应1h，室温下氮气吹干，加0.5mL正己烷，涡旋混合，供气相色谱-质谱联用仪分析。作为系列混合标准溶液，室温下完全吹干，加入500μL硅烷化试剂(N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺)和100μL乙腈，涡旋混合1分钟，密封，75℃恒温箱中，衍生反应1h，室温下氮气吹干，加入0.5mL正己烷，涡旋混合，得到系列衍生化产物，供气相色谱-质谱联用仪分析。

(2)衍生产物检测结果

在仪器最佳工作条件下，对林可霉素、克林霉素及大观霉素的标准溶液分别进样，做单点或多点校准，以峰面积定量。林可霉素、克林霉素及大观霉素标准溶液色谱图见图1。检测限可达到10μg/L，三种药物的线性范围、线性方程和相关系数见表1

表1林可霉素、克林霉素、大观霉素的线性范围、线性方程和相关系数

实施例2：样本的测定

(1)样本的提取

选取猪、牛、鸡的肌肉、肾脏，牛奶及鸡蛋作为分析样本，在各肌肉中分别添加林可霉素20、100、200μg/kg，克林霉素20、50、100μg/kg，大观霉素50、300、600μg/kg；肾脏中分别添加林可霉素50、1500、3000μg/kg，克林霉素50、100、200μg/kg，大观霉素50、1500、3000μg/kg；牛奶中分别添加林可霉素20、150、300μg/kg，克林霉素20、50、100μg/kg，大观霉素50、200、400μg/kg；鸡蛋中分别添加林可霉素20、50、100μg/kg，克林霉素20、50、100μg/kg，大观霉素50、2000、4000μg/kg；按样品处理方法，提取、净化，然后进行GC-MS分析，用外标法计算，测定回收率。每一浓度5个样，进行5次单独实验。回收率和日内、日间相对标准偏差结果。

(2)检测结果

经分析可知，该方法在猪、牛、鸡肌肉中分别添加林可霉素20、100、200μg/kg，克林霉素20、50、100μg/kg，大观霉素50、300、600μg/kg时，回收率范围在73.1％～86.9％；猪、牛肾脏中分别添加林可霉素50、1500、3000μg/kg，克林霉素50、100、200μg/kg，大观霉素50、1500、3000μg/kg时，回收率范围在70.1％～88.1％；牛奶中分别添加林可霉素20、150、300μg/kg，克林霉素20、50、100μg/kg，大观霉素50、200、400μg/kg时回收率范围在73.9％～85.9％；鸡蛋中分别添加林可霉素20、50、100μg/kg，克林霉素20、50、100μg/kg，大观霉素50、2000、4000μg/kg时回收率范围在76.1％～84.9％。本发明中林可霉素、克林霉素在猪、牛、鸡肌肉、肝脏和肾脏及鸡蛋、牛奶样品中检测限均为15μg/kg，大观霉素在各组织样品中的检测限均为25μg/kg。将林可霉素、克林霉素和大观霉素对照品添加到组织样品中，当林可霉素、克林霉素浓度为20μg/kg，大观霉素浓度为50μg/kg时回收率70％～110％，变异系数小于20％。因此，本发明的定量限为林可霉素、克林霉素20μg/kg和大观霉素50μg/kg，符合兽约残留检测方法的中国农业行业标准。

Claims

1.林可霉素、克林霉素和大观霉素的残留分析方法，其特征在于：以硅烷基化试剂为衍生化试剂，与胺类药物林可霉素、克林霉素和大观霉素进行衍生化反应，得到衍生产物，然后通过气相色谱-质谱进行分离检测，衍生化反应的方程式如下：

上述衍生化反应温度为75～85℃水浴，反应时间为0.5～1.5h；

气相色谱-质谱条件：

色谱柱为毛细管色谱柱Rtx-5，5％苯基甲基聚硅氧烷；

柱长30m，内径0.25mm；

载气：氦气，1.0mL/min，恒流；

质谱条件：EI源为70ev，接口温度：280℃，

质谱采集：林可霉素和克林霉素扫描离子：126(定量离子)，127，73；

大观霉素扫描离子：145(定量离子)，171，187，201。