CN103417982A - 人源性长寿保障基因2在制备提高乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人源性长寿保障基因2(LASS2)在制备提高乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性的药物中的用途。本发明首次揭示，LASS2能够改变肿瘤细胞内及周边的微环境，使得抗癌药物更易于进入到肿瘤细胞内，从而增加了乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性。

Description

人源性长寿保障基因2在制备提高乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物制药领域；更具体地，本发明涉及人源性长寿保障基因2(LASS2)、其编码的蛋白或其上调剂在制备提高乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性的药物中的用途。 

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，死亡率排名第二。据统计，全球每年超过100多万人被诊断为乳腺癌，同时约有40多万人因患乳腺疾病而死亡。近十年来，我国乳腺癌发病率与过去相比上升了27%左右，发病高峰年龄已由50-60岁降至40-50岁，呈年轻化趋势，乳腺癌已成为妇女健康的重大威胁。因此提高乳腺癌治疗效果，降低乳腺癌死亡率已成为亟待解决的重大课题。 

乳腺癌治疗主要包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗等综合性治疗手段。乳腺癌已被认为是一种全身性疾病，化疗是乳腺癌全身治疗的重要策略。化疗对于术前缩小病灶，术后预防复发和转移，以及失去手术机会的转移性晚期乳腺癌患者的治疗中具有不可替代的作用，因此，如何进行合理、有效的化学治疗是提高临床治疗效果的关键之一。由于肿瘤异质性的存在，不同肿瘤类型在不同发展阶段对化疗药物的敏感性存在很大差别。虽然乳腺癌治疗方案不断改进，但部分病人经过规范的化疗后仍出现复发或转移。导致治疗失败的主要原因是肿瘤细胞产生耐药特别是多药耐药(multidrug resistance，MDR)。乳腺癌耐药机制尚未完全明确，目前研究表明，乳腺癌耐药是一个极其复杂并且不断变化的过程。 

肿瘤多药耐药是指肿瘤细胞对某一种抗肿瘤药物出现耐药；与此同时，还出现对其它多种结构不同、作用靶点不同的抗肿瘤药物也产生耐药性。MDR的形成机制复杂，涉及多个因素、多个环节及多条途径。主要包括：(1)ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白表达增加；(2)解毒***有关基因的表达增加或激活；(3)药物作用靶点结构发生改变或受损靶点修复能力增强；(4)肿瘤细胞存活相关应答(包括DNA修复、细胞周期和凋亡)因素的改变；(5)信号转导通路异常介导的耐药。 

有研究表明，在耐药肿瘤细胞株中，存在着V-ATPase质子泵高表达现象(Ma,L.and M.S.Center,The gene encoding vacuolar H(+)-ATPase subunit C is overexpressed in multidrug-resistant HL60cells.Biochem Biophys Res Commun,1992.182(2):p.675-81)。而这种高表达的质子泵解释了耐药细胞中溶酶体与胞浆之间存在的高pH梯度。最近研究表明，质子泵抑制剂如bafilomycin A1、NiK-12192、奥美拉唑(Omeprazole)和艾美拉唑(esomeprazole)可以通过破坏这种pH梯度，达到增敏化疗药物对具有不同耐药机制如P-gp、MRP高表达及内在耐药的肿瘤细胞株的作用(Luciani,F.,Spada,M., De Milito,A.,et al.,Effect of proton pump inhibitor pretreatment on resistance of solid tumors to cytotoxic drugs.J Natl Cancer Inst,2004.96(22):p.1702-13；Petrangolini,G.,Supino,R.,Pratesi,G.,et al.,Effect of a novel vacuolar-H+-ATPase inhibitor on cell and tumor response to camptothecins.J Pharmacol Exp Ther,2006.318(3):p.939-46)。 

本发明人前期采用以细胞生长为基础的功能筛选方法，获得了一批影响肝癌细胞生长和凋亡等方面的新基因。其中，通过功能筛选和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)方法从人肝cDNA文库中克隆到一个与酵母长寿保障基因LAG1高度同源的人类新基因，经“国际人类基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee)”认可，由本发明人正式命名为人源性长寿保障基因(homo sapiens longevity assurance homologue 2of yeast LAG1，LASS2)，并于1999年将该基因的cDNA序列在GenBank上登录(登录号AF177338)。对该基因的初步研究显示，LASS2能抑制肝癌细胞的生长(Thomas,J.A.,Buchsbaum,R.N.,Zimniak,A.,et al.,Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ.Biochemistry,1979.18(11):p.2210-8)和抑制肝癌细胞的克隆形成(Colony formation)(Pan,H.,Qin,W.X.,Huo,K.K.,et al.,Cloning,mapping,and characterization of a human homologue of the yeast longevity assurance gene LAG1.Genomics,2001.77(1-2):p.58-64)，提示LASS2对癌细胞的生长有调控和影响作用。 

LAS S2又称TMS G-1(Homo sapiens tumor metastasis-suppressor gene-1，人肿瘤转移抑制基因)。有报道显示：LASS2/TMSG-1表达水平的降低与肿瘤转移潜能的升高具有相关性(Fei,P.,Junyu,N.,Jiangfeng,Y.,et al.,Monoclonal antibodies against human tumor metastasis suppressor gene-1(TMSG-1):preparation,characterization,and application.Hybrid Hybridomics,2004.23(5):p.318-25)，因此，LASS2/TMSG-1在肿瘤转移过程中可能起着重要作用，其在肿瘤转移中的作用和分子机理有待阐明。肿瘤的侵袭转移与细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的分解密切相关。肿瘤细胞较正常组织细胞有较低的细胞外pH值(Extracellular pH，pHe)，这主要与肿瘤细胞的糖酵解代谢特点(糖酵解将导致肿瘤细胞持续产生乳酸)、肿瘤细胞质膜上V-ATPase质子泵跨质膜外排氢离子等有关，由此形成肿瘤酸性微环境。肿瘤细胞外的这种酸性微环境有利于蛋白水解酶激活、消化细胞外基质，从而利于肿瘤细胞侵袭和转移。 

但是，目前还没有研究发现LASS2与肿瘤耐药机制具有相关性。 

发明内容

本发明的目的在于提供LASS2对乳腺癌化疗的增敏作用。 

在本发明的第一方面，提供一种人源性长寿保障基因2(LASS2)、其编码的蛋白或其上调剂的用途，用于制备提高乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性的药物。 

在一个优选例中，所述的抗癌药物是弱碱性的化疗药物。 

在另一优选例中，所述的抗癌药物选自(但不限于)：阿霉素(多柔比星，Dox)，米托蒽醌(MTO)、表柔比星(EPI)、长春瑞滨(VRL)、顺铂(DDP)和5-氟脲嘧啶(5-FU)， 柔红霉素(daunorubicin)，长春新碱(vincristine)，喜树碱(camptothecin)，表阿霉素，长春碱，长春花碱，长春瑞宾，及其衍生物或混合物。 

在另一优选例中，所述的药物还用于： 

抑制V-ATPase质子泵运输氢离子； 

提高细胞溶酶体pH值； 

使乳腺癌细胞内(特别是细胞核内)积聚抗癌药物； 

联合抗癌药物增加乳腺癌细胞的细胞周期的G₂/M阻滞； 

联合抗癌药物增加乳腺癌细胞的细胞凋亡率； 

联合抗癌药物增加乳腺癌细胞的Caspase-3和Caspase-7蛋白活性； 

抑制乳腺癌细胞的迁移。 

在另一优选例中，所述的人源性长寿保障基因2上调剂是重组表达载体，所述表达载体中含有一表达盒，其中包含人源性长寿保障基因2以及与之操作性连接的表达调控元件。 

在本发明的另一方面，提供一种预防、缓解或治疗乳腺癌的药盒，包括： 

(a)人源性长寿保障基因2编码的蛋白；或表达人源性长寿保障基因2的表达构建物；和 

(b)抗癌药物。 

在一个优选例中，所述的表达构建物是重组表达载体，所述表达载体中含有一表达盒，其中包含人源性长寿保障基因2以及与之操作性连接的表达调控元件。 

在另一优选例中，所述的抗癌药物选自(但不限于)：：阿霉素(Dox)，米托蒽醌(MTO)、表柔比星(EPI)、长春瑞滨(VRL)、顺铂(DDP)和5-氟脲嘧啶(5-FU)，柔红霉素(daunorubicin)，长春新碱(vincristine)，喜树碱(camptothecin)，表阿霉素，长春碱，长春花碱，长春瑞宾，及其衍生物或混合物。 

在本发明的另一方面，提供一种人源性长寿保障基因2或其编码的蛋白的用途，用于制备检测乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性的试剂或试剂盒。 

在一个优选例中，人源性长寿保障基因2的表达量越低，则该乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性越差。 

在本发明的另一方面，提供一种特异性识别人源性长寿保障基因2或其编码的蛋白的试剂的用途，用于制备检测乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性的试剂盒。 

较佳的，所述的特异性识别人源性长寿保障基因2或其编码的蛋白的试剂选自： 

特异性扩增人源性长寿保障基因2的引物； 

特异性识别人源性长寿保障基因2的探针；或 

特异性结合人源性长寿保障基因2编码的蛋白的抗体或配体。 

较佳的，所述的特异性扩增人源性长寿保障基因2的引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列。 

在本发明的另一方面，提供一种检测乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性的试剂盒，所述的试剂盒中含有：特异性识别人源性长寿保障基因2或其编码的蛋白的试剂。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1、LASS2表达与化疗敏感性的相关性分析。 

在敏感细胞株MCF-7和耐药细胞株MCF-7/ADR中LASS家族基因的相对mRNA水平检测(A)和LASS2蛋白水平检测(B)；(C-L)收集52例化疗方案中包含阿霉素的乳腺癌患者的临床肿瘤标本，用免疫组化的方法检测LASS2的表达水平，并且对LASS2表达水平与患者的预后进行相关性分析。(C)-(D)，强表达(3分)；(E)-(F)，中度表达(2分)；(G)-(H)，弱表达(1分)；(I)-(J)，表达阴性(0分)。最终将临床标本中LASS2的表达分为两种：阴性表达和阳性表达，其中评分为0-1分的计入阴性表达；评分为2-3分的计入阳性表达。(K)无病生存期；(L)整体生存期；标尺：10微米(C，E，G和I)；标尺：2.5微米(D，F，H和J)。***P<0.001。 

图2、LASS2影响细胞对于阿霉素的半抑制浓度IC50。 

在MCF-7/ADR中过表达LASS2(A)可以显著降低细胞对于阿霉素的半抑制浓度IC₅₀(B)；在MCF-7中干扰LASS2的表达(C)可以显著增加细胞对于阿霉素的半抑制浓度IC₅₀(D)。 

图3、在MCF-7/ADR细胞中干扰ATP6V0C表达可以显著影响细胞对阿霉素的半抑制浓度IC₅₀。 

在MCF-7/ADR中，通过慢病毒感染的方法降低ATP6V0C的表达，利用实时定量扩增(A)和蛋白印迹(B)的方法从核酸和蛋白的水平进行干扰效果验证。(C)在MCF-7/ADR中干扰ATP6V0C可以降低细胞对于阿霉素的半抑制浓度(IC₅₀)。*P<0.05；**P<0.01。 

图4、V-ATPase质子泵活力检测。 

(A)检测细胞外pH值(pHe)所作的标准曲线；(C)检测细胞内pH值(pHi)所作的标准曲线；(B)9h时，Lenti-LASS2细胞培养液中氢离子浓度小于对照组。(D)-(F)，实时pHi显示Lenti-LASS2细胞在无Na+溶液中静息pHi较对照组低。在溶液中引入NH₄Cl后，Lenti-LASS2细胞和对照组细胞pHi均上升，去除NH₄ ⁺后，pHi迅速下降，对照组pHi迅速恢复至静息pH，而Lenti-LASS2细胞恢复受阻。对照组的细胞内pH恢复可被V-ATPase特异性抑制剂Balfilomycin A1抑制。*P<0.05。 

图5、在MCF-7/ADR中过表达LASS2对细胞溶酶体的酸度及阿霉素分布的影响。 

(A)利用流式细胞仪检测Lenti-vector和Lenti-LASS2细胞中溶酶体酸碱度荧光染料LysoSensor Green DND-189的荧光强度；(B)利用激光共聚焦检测Lenti-vector和Lenti-LASS2细胞中荧光染料LysoSensor Green DND-189阳性的酸性囊泡；(C)利用流式细胞仪检测细胞内阿霉素的阻滞情况；(D)分别向细胞培养液中先后加入阿霉素和荧光染料Hoechst 33342，然后利用激光共聚焦进行检测。红色荧光指示阿霉素，蓝色荧光指示核，标尺为5微米(B和D)。 

图6、对Lenti-vector和Lenti-LASS2细胞进行阿霉素处理后，进行细胞周期分析。DNA用碘化丙啶(PI)进行标记，然后用流式细胞仪进行检测，细胞分别在G0/G1，S和G2/M期的分布如图所示。 

图7、过表达LASS2联合阿霉素处理可以显著增加细胞的凋亡率 

(A)过表达LASS2联合阿霉素处理对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)活力的影响，通过检测细胞培养液的发光强弱可以反映出细胞中caspase-3/7活力强弱。(B)Hoechst 33342染色。细胞用阿霉素处理并且用Hoechst 33342染核，箭头所示为凋亡小体。(C)过表达LASS2联合阿霉素处理对细胞中凋亡相关蛋白的影响。(D)推测过表达LASS2联合阿霉素处理引起细胞发生凋亡的可能途径，标尺为1微米。*P<0.05;**P<0.01。 

图8、过表达LASS2对MCF-7/ADR细胞增殖和“药泵”核酸表达没有影响，但是可以显著抑制细胞迁移。 

(A)过表达LASS2对于MCF-7/ADR增殖没有显著性影响。(B)过表达LASS2可以显著抑制MCF-7/ADR细胞的迁移，细胞迁移过程用活细胞工作站记录，仪器每间隔1小时拍1张照片，共拍68小时，做3个复孔。图中所示为0小时(图8B，a和c)和50小时(图8B，照片。Lenti-LASS2的划痕间距(图8B，b和d)显著宽于对照组细胞(图8B，b)。实时定量分析MDR1/ABCB1(C)和BCRP/ABCG2(D)mRNA水平。 

图9、在裸鼠体内过表达LASS2联合阿霉素处理可以显著抑制瘤体生长 

(A)在注射肿瘤细胞3天前，在裸鼠的左肩区域皮下包埋17β-***药片，以利用成瘤。粉色箭头所示药片，黄色箭头所示瘤体。(B)处死裸鼠，剥离瘤体，进行拍照。(C)利用小动物活体成像***拍摄的小鼠皮下瘤体所发的绿色荧光，荧光越强，说明瘤体越大。(D)-(F)瘤体的大小，重量和荧光强度。*P<0.05;**P<0.01。 

图10、在裸鼠体内过表达LASS2联合阿霉素处理可以显著增强细胞的凋亡率。 

将裸鼠皮下所成瘤体进行***浸泡和石蜡包埋，切片，用TUNEL方法检测凋亡细胞。TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-ediated dUTP-biotin nick end labeling)，末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记。标尺为2微米。 

具体实施方式

近年来研究表明，肿瘤细胞的酸性微环境(Tumor acidic-microenvironment)对于肿瘤细胞耐药的形成起着关键作用。在酸性环境下，弱碱性药物被质子化而带上电荷，不易进入到细胞内。因此酸性微环境可导致进入细胞的弱碱性药物减少。临床中运用的大部分化疗药物是弱碱性的，如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春新碱(vincristine)及喜树碱(camptothecin)等。5-氟脲嘧啶(5-FU)虽然是属于弱酸性药物，但商品化的产品在溶液中是弱碱性的。另外如环磷酰胺(cyclophosphamide)的代谢激活和失活的过程也受酸性微环境的影响。虽然紫杉醇(paclitaxel)没有离子基团，但是它作用的靶点是微管，而微管的聚集也受酸性微环境的影响。因此酸性微环境对化疗药物能否充分发挥作用非常重要。而发明人在研究中 发现，LASS2能够改变肿瘤细胞内外的酸性微环境，并且提高溶酶体的pH值，通过这种改变，使得抗癌药物更易于进入到肿瘤细胞内。 

术语 

如本文所用，所述的“抗癌药物”是指用于抑制癌细胞(肿瘤细胞)的药物，本发明中其可与“抗肿瘤药物”互换适用。较佳地，本发明所述的“抗癌药物”是指一些弱碱性的化疗药物。 

如本文所用，所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。 

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为LASS2多肽)所需的所有必要元件的基因表达***，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。 

如本文所用，所述的“癌细胞”与“肿瘤细胞”可互换使用。 

LASS2及其用途 

人源性长寿保障基因2(LASS2)是本发明人前期采用分离获得的基因，已证明其影响肝癌细胞生长和凋亡。经过深入的研究，本发明人进一步发现，LASS2能够改变肿瘤细胞内外的酸性微环境，提高溶酶体的pH值，通过这种改变，使得抗癌药物更易于进入到肿瘤细胞内。 

因此，基于本发明人的新发现，本发明提供了LASS2的用途，用于制备提高乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性的药物；或用于筛选提高乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性的物质。 

在本发明中，所用的LASS2基因或其编码的蛋白(后称为LASS2蛋白)可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的LASS2基因或LASS2蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组LASS2蛋白。优选的，本发明可采用重组的LASS2蛋白。 

任何适合的LASS2蛋白均可用于本发明。所述的LASS2蛋白包括全长的LASS2蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的LASS2蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号NP_859530.1所示的序列基本上相同。优选的，所述的LASS2基因的核苷酸序列可以与GenBank登录号NM_181746所示的序列基本上相同。 

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的LASS2蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。LASS2蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变 单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。 

任何一种LASS2蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，LASS2蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的LASS2蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长LASS2蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长LASS2蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。 

本发明也可采用经修饰或改良的LASS2蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的LASS2蛋白。所述经过修饰或改良的LASS2蛋白可以是一种LASS2蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的LASS2蛋白可以是与天然存在的LASS2蛋白具有较小的共同点，但也能增加癌细胞对于抗癌药物的敏感性，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响LASS2蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。 

LASS2的上调剂及其用途 

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种LASS2或其上调剂的用途，用于制备提高乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性的药物。所述的LASS2的上调剂通过上调LASS2的表达或活性，从而发挥作用。 

如本文所用，所述的LASS2的上调剂包括了激动剂、促进剂等。任何可在肿瘤细胞内促进LASS2基因的表达、提高LASS2蛋白的活性、维持LASS2蛋白的稳定性、促进LASS2蛋白的积聚、延长LASS2蛋白有效作用时间、或促进LASS2的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于提高乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性的有效物质。 

作为本发明的优选方式，所述的LASS2的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)LASS2的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一表达盒，所述的表达盒含有LASS2基因及与之操作性相连的表达调控序列。 

本发明中，LASS2多核苷酸序列可***到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。 

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含LASS2的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。 

药盒及给药 

本发明还提供了一种药盒，它含有预防、缓解或治疗乳腺癌的药盒，包括：(a)人源性长寿保障基因2编码的蛋白；或表达人源性长寿保障基因2的表达构建物；和(b) 抗癌药物；较佳地，所述的表达构建物是重组表达载体，所述表达载体中含有一表达盒，其中包含人源性长寿保障基因2以及与之操作性连接的表达调控元件。较佳地，所述的药盒中还包含了知道临床患者使用该药盒的使用说明书。 

本发明还提供了一种预防、缓解或治疗乳腺癌的方法，包括给予受试者有效量的LASS2蛋白或其调节剂。 

在得知了所述的LASS2蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的LASS2蛋白或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可直接将LASS2蛋白通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带LASS2基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的LASS2蛋白。 

作为本发明的一种实施方式，可将所述的LASS2蛋白直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码LASS2蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如慢病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述LASS2蛋白的细胞中，使所述的细胞表达LASS2蛋白。可通过将适量的所述细胞引入到哺乳动物身体的适当部位，实现LASS2蛋白的表达。 

LASS2蛋白的上调剂的给药方式主要取决于所述上调剂的类型和特性，这是本领域人员可以评估的。 

筛选增加乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性的潜在物质的方法 

在得知了所述的LASS2蛋白在肿瘤细胞增敏中用途后，可以基于该特征来筛选促进LASS2的表达或活性的物质。 

因此，本发明提供一种筛选可用于增加乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达LASS2的体系接触；和检测候选物质对LASS2的影响；若所述候选物质可提高LASS2的表达或活性，则表明该候选物质是可用于增加乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性的潜在物质。 

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到LASS2的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达LASS2的体系。 

所述的表达LASS2的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达LASS2的细胞；或可以是重组表达LASS2的细胞。所述的表达LASS2的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。 

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于增加乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性真正有用的物质。 

本发明对于LASS2蛋白的表达、活性、存在量的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法， Western-Blot法，ELISA等。 

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于增加乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出真正有用的物质，从而用于临床。 

检测乳腺癌的试剂或试剂盒 

本发明人还发现，乳腺癌中LASS2的表达量与抗癌药物的治疗有效性密切相关，乳腺癌细胞中，LASS2的表达量越低，则该乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性越差。 

基于本发明人的上述新发现，可以将LASS2作为诊断乳腺癌对于抗癌药物的敏感性的标志物：(i)进行乳腺癌的分型、鉴别诊断，早期监测早期防治；(ii)评估相关人群的乳腺癌治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法。比如，可分离出由LASS2基因表达异常的导致乳腺癌人群，从而可进行更有针对性地治疗。 

因此，本发明提供了LASS2基因或蛋白的用途，用于制备诊断(或检测)乳腺癌的试剂或试剂盒。 

可采用各种本领域已知的技术来检测LASS2基因的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。 

本发明还提供了用于在分析物中检测LASS2基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增LASS2的引物；或特异性识别LASS2的探针来确定LASS2基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合LASS2编码的蛋白的抗体或配体来确定LASS2蛋白的表达情况。 

作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，其可特异性扩增出LASS2基因或基因片段。更优选的，所述的引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列。该引物扩增获得的扩增产物具有合适的长度，且特异性高，对于复杂体系的扩增也具有良好的特异性。 

针对LASS2基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与LASS2基因上特定位点发生特异性结合，而不与LASS2基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。 

利用特异性结合LASS2蛋白的抗体来检测分析物中LASS2蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。 

本发明还提供了用于在分析物中检测LASS2基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增LASS2基因的引物；特异性识别LASS2基因的探针；或特异性结合LASS2基因编码的蛋白的抗体或配体。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。 

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

I.材料和方法 

1、细胞培养(1)细胞耐药性获得及维持 

MCF-7/ADR(购自中国科学院天津血液学研究所)及MCF-7细胞(购自中国科学院天津血液学研究所)均在RPMI-1640的完全培养液中、于37℃、5%CO₂条件的培养箱中培养。MCF-7/ADR耐药细胞由MCF-7细胞经逐步增加阿霉素药物浓度诱导得到。MCF-7/ADR细胞在含有1μg/ml的低浓度阿霉素的完全培养液中培养以保持细胞的耐药性。实验前，耐药细胞均要用无药物的培养液培养传代一个星期。细胞长至70-80%融合时，用0.25%胰酶消化，以1:3比例进行传代。 

(2)细胞冻存与复苏 

a细胞冻存 

收集对数生长期细胞，1500rpm离心5min，弃去上清，重新悬浮细胞于预冷的冻存液中。分装细胞于已标示的无菌冻存管中。然后经梯度降温(4℃10min，-20℃30min，-80℃16-18h)，最后转入液氮中长期储存。 

b细胞复苏 

取出液氮中冻存的细胞，立即放入37℃水浴，使其快速融化。直接加入10ml细胞培养液，使细胞均匀悬浮。待细胞贴壁后，更换新的培养液。 

2、药物IC₅₀的测定 

将生长状态良好的细胞种在96孔板内(5000个细胞/孔)，培养过夜。将不同浓度的待测药物加入培养液中作用48h。然后将10μl的CCK-8试剂(Dojindo Laboratories，Kumamoto，Japan)加入含100μl培养液的细胞中37℃孵育2h。用96孔酶标仪测定490nm的吸光度。根据与无药物对照相比得出细胞存活率，根据药物剂量及存活率即可得到药物的IC₅₀值。 

3、定量PCR测定基因的表达水平 

(1)细胞总RNA的提取 

用Trizol试剂抽提生长状态良好的细胞总RNA，每皿细胞(直径6cm)加入1mlTrizol，用细胞刮刀刮几次，然后转移至离心管中，充分混匀至不粘稠。按每毫升Trizol加0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温孵育5-10min；4℃，11,000g离心15分钟；将无色上清液移入新的离心管中，按每毫升Trizol加0.5ml异丙醇，室温孵育10分钟，11,000g，4℃离心10分钟；倒掉上清，用75%乙醇(每毫升Trizol至少用1ml 75% 乙醇)洗涤，4℃，7,500g离心5分钟；室温干燥RNA沉淀5-10分钟(勿使RNA完全干燥)，用DEPC-H₂O溶解沉淀。分光光度计定量RNA，并取少量总RNA进行1%琼脂糖电泳，检查RNA是否溶解。 

(2)逆转录反应 

37℃逆转录反应45min，85℃作用5sec使逆转录酶失活。 

(3)实时定量PCR反应 

逆转录反应得到的cDNA稀释40倍作为模板。 

按以上体系加样(总体积20μl)，反应条件为：95℃预变性15s，然后95℃5s，60℃31s，40个循环；融解曲线条件为95℃15s，60℃30s，95℃15s。置ABI 7300PCR仪上进行反应。以β-actin的表达作为内参。PCR完成后，经电脑自动分析，查看每个基因的扩增情况，导出相应的域值循环数，采用2^-ΔΔCt方法，计算每个基因的相对表达量。对融解曲线分析以确定得到的扩增产物是否为单一的目的片段。 

定量PCR的引物为： 

L:5’-GCCCAAGCAGGTGGAAGTAGAG-3’(SEQ ID NO:1)； 

R:5’-CCAGGGTTTATCCACAATGACG-3’(SEQ ID NO:2)。 

4、质粒构建、慢病毒载体的包装及感染 

(1)LASS2慢病毒表达载体Lenti-LASS2和Lenti-LASS2-GFP 

LASS2的编码区(open reading frame，ORF)序列采用nest-PCR方法由正常肝组织基因组中扩增得到，引物序列如下： 

Nest-PCR-LASS2-F1：5’-CGGGCGGAAGAGGGAGGAGA-3’(SEQ ID NO:3)； 

Nest-PCR-LASS2-R1：5’-GGCAAACAGCTGGGGCCAAA-3’(SEQ ID NO:4)； 

Nest-PCR-LASS2-F2：5’-CGGAGCAACCACCCGAGCA-3’(SEQ ID NO:5)； 

Nest-PCR-LASS2-R2：5’-GCGCAGGGAGCGGGGTAGTT-3’(SEQ ID NO:6)； 

连接到TA克隆上，通过MluI和EcoRI两个酶切位点亚克隆入慢病毒表达载体pWPXL(获自瑞士日内瓦大学)上，从该重组质粒切除GFP，主要用于体外细胞水平实验，经Invitrogen公司测序验证，命名为Lenti-LASS2。另外为了利用小动物活体成像设备观察小鼠体内成瘤情况，还构建了含GFP的慢病毒表达载体。pWPXL空载质 粒本身是含有GFP基因序列的，前面的Lenti-LASS2是先将pWPXL的GFP序列切掉，然后接入LASS2序列。Lenti-LASS2-GFP是不切掉pWPXL的原始自带GFP序列，直接接入LASS2序列，最终表达出来的蛋白是LASS2与GFP的融合蛋白，LASS2接入pWPXL的酶切位点是PmeI/MluI，命名为Lenti-LASS2-GFP。 

(2)LASS2慢病毒干扰载体Lenti-shRNA-LASS2 

干扰靶点为：基于NM_181746GenBank登录号的LASS2基因中以下基因片段：5’-GGCCCAGTCTCCTCAAGAA-3’(SEQ ID NO:7)，对应于shRNA1；以及以下基因片段：5’-AGTATTGGTACTACATGAT-3’(SEQ ID NO:8)，对应于shRNA2。 

将合成的干扰片段通过MluI和ClaI两个酶切位点亚克隆入慢病毒干扰载体pLVTHM（获自瑞士日内瓦大学）上，经Invitrogen公司测序验证，命名为Lenti-shRNA1-LASS2和Lenti-shRNA2-LASS2，两者中选择干扰效果最好的进行后续实验。 

(3)ATP6V0C慢病毒干扰载体Lenti-shRNA-ATP6V0C 

干扰靶点：基于NM_001694.3GenBank登录号的ATP6V0C基因第396-414位。 

构建过程同上，经Invitrogen公司测序验证，命名为Lenti-shRNA1-ATP6V0C和Lenti-shRNA2-ATP6V0C，两者中选择干扰效果最好的进行后续实验。 

采用脂质体(Lipofectamine 2000，Invitrogen)转染法按一定的比例将包装质粒共转染入HEK 293T细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，得到病毒颗粒。而后用连续稀释法在HEK 293T细胞中测定病毒的滴度。测定后的病毒感染肿瘤细胞，而后根据荧光强度判定感染效果。具体步骤如下： 

(1)慢病毒载体的包装(转染HEK 293T细胞) 

第一天，将生长状态良好的2×10⁶HEK 293T细胞接种到直径10cm的细胞培养皿中； 

第二天，脂质体转染，其中psPAX2，pMD2.G质粒获自瑞士日内瓦大学，具体操作如下： 

Transfer vector(重组的pWPXL或pLVTHM)12μg 

Packaging plasmid(psPAX2)9μg 

Envelope plasmid(pMDG2.G)3.6μg，加无血清培养基至1.5ml混匀； 

Lipofectamine 200060μl加无血清培养基至1.5ml混匀； 

室温孵育5min后，两者混匀，室温孵育20min，然后将上述混合物缓慢滴加入培养皿中。 

6-8h后，弃转染培养基，加入含有10%胎牛血清的培养基(9ml)； 

第三天，荧光显微镜观察对照组(有荧光)的转染效率； 

第四天，收集培养基，3,000rpm室温离心5min，用0.45μm滤膜抽滤。病毒可直接用于感染或-80℃保存，但要避免反复冻融降低其有效性。 

(2)慢病毒滴度测定(用HEK 293T细胞测定) 

第一天，将生长状态良好的2-4×10⁵HEK 293T细胞接种到6孔板内； 

第二天，换液，加入完全培养基。消化其中一孔细胞计算细胞数目。剩余的孔每孔加入聚凝胺(polybrene，Sigma,MO)，使终浓度为6μg/ml。1-2h以后，加入病毒Lenti-vector(带GFP荧光，病毒量按梯度加入，10μl，50μl，100μl，200μl四个梯度)； 

第三天，用完全培养基换液； 

第四天，消化细胞，加入2ml PBS，3000r/min离心5min，用0.5ml PBS重悬细胞，把细胞置于冰上准备分析。用流式细胞仪检测含GFP细胞数目。根据公式计算病毒滴度： 

滴度=[GFP细胞数%]×[第二天细胞数(细胞/ml)]/病毒液体积(ml)。 

(3)慢病毒感染 

第一天，将生长状态良好的2-4×10⁵细胞(指MCF-7/ADR细胞或MCF-7细胞)接种在6孔板内； 

第二天，换液，加入完全培养基，加入Polybrene使终浓度为6μg/ml。2h后，加入2-4×10⁶单位病毒(Lenti-vector或Lenti-LASS2或Lenti-shRNA-vector或Lenti-shRNA-LAS S2)； 

第三天，用完全培养基换液； 

第四天，荧光显微镜下观察，对照细胞可看到绿色荧光，以确定感染效率。慢病毒感染后的稳定细胞系用Real-time PCR和Western Blotting方法检测基因过表达或干扰效果。 

5、Western blot分析 

(1)细胞总蛋白抽提 

生长状态良好的细胞经冰预冷的PBS缓冲液洗涤两次后，加入适量含1mmol/L PMSF(蛋白酶抑制剂)的细胞裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1%CHAPS，pH 7.4)，置冰上裂解细胞30min，用细胞刮刀收集细胞裂解液，4℃12,000rpm离心15min，取上清，-80℃保存。 

(2)BCA法蛋白定量 

采用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce)，将试剂A和试剂B按1：50的比例混合，制成工作液待用。稀释标准蛋白，使其浓度依次为0μg/μl，25μg/μl，50μg/μl，100μg/μl，250μg/μl，500μg/μl，750μg/μl，1000μg/μl，2000μg/μl。在酶标板中加入5μl标准蛋白或5μl样品，再加入100μl BCA工作液，混合均匀后37℃水浴30min，用酶标仪读取570nm波长的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线，计算样品的浓度。 

(3)SDS-PAGE电泳 

配制12%SDS-聚丙烯酰胺分离胶(5ml体系包含30%丙烯酰胺2ml，ddH₂O 1.6ml，1.5M pH8.8Tris-HCl 1.3ml，10%SDS 50μl，10%过硫酸铵50μl，TEMED 2μl)， 迅速混匀后注入干净的预置玻璃板(Bio-Rad)空隙中，并在顶层加入适量去离子水以阻止空气对凝胶聚合的抑制作用，室温下静置30min，待分离胶完全凝聚后，弃上层去离子水并用滤纸吸净残留液体。配制浓缩胶(2ml体系中包含30%丙烯酰胺0.33ml，1.0M pH6.8Tris-HCl 0.25ml，10%SDS 20μl，10%过硫酸铵20μl，TEMED 2μl)，混匀后立即加到分离胶上层，***干净的10齿或15齿梳子，并注意避免气泡的产生，室温下静置30min，待浓缩胶凝固完全后拔去梳子，用ddH₂O洗涤加样槽数次，将凝胶置于电泳槽(Bio-Rad)，加入电泳缓冲液(含25mM pH8.0Tris，0.25M Glycine，0.1%SDS)。蛋白样品按5:1比例加入6×上样缓冲液(含300mM pH6.8Tris-HCl，12%SDS，600mM DTT，60%甘油，0.6%溴酚蓝)混匀，沸水浴10min，冰浴冷却5min，结合蛋白定量结果，各泳道加入等量蛋白样品，用Electrophoresis power supply(Bio-Rad)电泳仪进行电泳，先以68V电压进行电泳至溴酚蓝前沿进入分离胶后，把电压提高至108V，继续电泳至溴酚蓝条带到达分离胶底部，关闭电源。 

(4)蛋白转膜 

SDS-PAGE电泳后，将凝胶取下，切除浓缩胶及无样品区域，另裁切大小与凝胶大小相吻合的6张Bio-Rad 3mm滤纸及一张硝酸纤维素滤膜。将硝酸纤维素滤膜在ddH₂O中浸泡10min，并将滤纸浸泡于电泳转移缓冲液(含39mM Glycine，48mM Tris，0.037%SDS，20%甲醇)中。在电转移装置(Bio-Rad)上由阳极至阴极依次放上3张Bio-Rad 3mm滤纸、硝酸纤维素滤膜、凝胶、Bio-Rad 3mm滤纸，叠放整齐，注意各接触面之间不要有气泡。根据凝胶面积以1.0mA/cm²的电流进行电转移1.5h。转膜结束后，通过预染Marker和用0.1%丽春红染色观察转移效率，并用ddH₂O脱色5min。 

(5)抗体标记 

将转印有蛋白质的硝酸纤维素滤膜在适量的封闭液(含5%脱脂奶粉，0.1%Tween-20的PBS)中室温封闭2h。弃去封闭液，配制一抗杂交液，把膜置于杂交袋中，并按照0.1ml/cm²加入含一抗的杂交液，排除气泡后用热封仪封闭，4℃孵育过夜。次日弃去杂交液，用20ml PBST(含0.02%Tween-20的PBS)室温漂洗滤膜，共漂洗6次，每次5min。将滤膜置于另一干净杂交袋中，加入以封闭液配制的含0.01μg/ml辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗的杂交液，排除气泡后封闭杂交袋，室温下在平稳摇床上孵育1.5h。弃去二抗杂交液，用20ml PBST室温漂洗滤膜，共漂洗6次，每次5min。 

(6)化学发光检测 

将漂洗后的滤膜在ddH₂O中平衡5min，使用SuperSignal West Pico化学发光检查试剂盒(Pierce)进行检测。将等比例的底物及增强剂混合，根据滤膜面积，按0.125ml/cm²将混合后的检测试剂均匀滴加到滤膜上，室温孵育5min。将滤膜放入封口膜中，赶去多余液体后，封口，曝光X光片，显影、定影后，扫描X光片，利用ImageProPlus 6.0软件分析条带灰度并定量。 

6、细胞增殖实验 

细胞增殖采用cell counting kit-8(CCK-8)试剂检测。此法是基于WST-8染料的一种计数方法。WST-8是一种类似于MTT的化合物，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan，细胞数越多，则颜色越深，可直接用酶标仪检测450nm吸光度值(OD₄₅₀)，OD₄₅₀与活细胞数量呈正比。96孔板每孔种植1,000个细胞，每孔加入10μl CCK-8试剂，37℃孵育2h，检测450nm波长吸收值。自接种之日起开始检测，并将其标记为Day 0。待测样品为三复孔，同类实验至少重复三次。 

7、Transwell法检测细胞迁移及侵袭实验 

Transwell小室(BD Biosciences，NJ)是外形类似杯子，可用于检测细胞运动能力的一种膜滤器，可放于24孔板中，小室底层为一张有通透性的膜，带有微孔，孔径视用途而异。用于检测肿瘤细胞运动能力的孔径大小一般为8μm。检测时将待测细胞悬于培液中种入Transwell小室内，在小室外的空中加入完全培养基，利用完全培养基中的血清作为趋化因子，检测细胞迁移(Migration)及侵袭(Invasion)能力，具体方法如下： 

(1)检测细胞迁移能力 

①观察Transwell小室的滤膜是否完整，将其放入24孔板中； 

②将经胰酶彻底消化的细胞用无血清的1640培养液重悬浮，计数并调整细胞浓度至2.5×10⁵细胞/ml，每个Transwell小室内接种200μl细胞悬液，并在小室外的孔中加入800μl含血清的完全培养液，37℃培养； 

③按细胞运动能力差异及实验设计目的不同，选取不同时间点取出小室； 

④弃小室内的残余培养基，用棉签仔细擦去小室内表面的细胞后，将小室置于含0.1%结晶紫和20%甲醇的PBS中染色30min； 

⑤用PBS清洗小室2次，再用棉签仔细擦干净小室内表面，将小室置于新的24孔板中，用倒置显微镜下观察小室外表面的细胞并计数(10×放大倍数的物镜下随机选择五个视野分别计数)，同类实验至少重复三次。 

(2)检测细胞侵袭能力 

①同上，另事先将冻存于-20℃的细胞基质胶Matrigel (BD Biosciences，NJ)置于4℃过夜，使其由凝固状态变为液态；以无血清的1640培养液按比例稀释Matrigel，均匀铺在小室内膜上，每孔加入80μl，37℃孵育，1h； 

②细胞浓度调整为5×10⁵细胞/ml，其余同上。 

8、V-ATPase功能检测 

ATP6L是V-ATPase功能所必需的亚基。ATP6L被抑制后V-ATPase功能会受影响。用细胞泌氢功能和pHi酸化后恢复作为MCF-7/ADR的V-ATPase功能检测指标。pHe和pHi用pH-敏感染料BCECF和酯型BCECF-AM测定(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。BCECF的特点是490nm和440nm光激发下535nm处发射光光密度比 值F490/F440与pH值成线性关系，利用该特点可灵敏地测定pH值。 

(1)细胞泌氢能力 

泌氢能力通过细胞外pH的变化检测。6孔板接种细胞，1×10⁶每孔，24h后，细胞用胰酶消化成细胞悬液接种96孔板，在96孔培养板上每孔种1×10⁴个细胞，HCO₃ ^-缓冲的含5%FBS pH7.0的1640细胞悬液，置于37℃5%CO₂中培养12h，贴壁后换液。细胞用生理盐水洗涤两次，每孔新加120μl无血清HCO₃ ^-缓冲的1640(pH 7.0)，在37℃5%CO₂条件下继续分别培养3h，6h，9h。培养结束后每孔吸取100μl上清，加入终浓度为1μM的BCECF，分别用荧光分光光度计(Perkin Elmer，LS 55)在490nm和440nm光激发下测535nm处发射光，pHi标准曲线由100μl含1μM的BCECF的1640的F490/F440对相应pH作图获得。细胞外pHe值转化为细胞外氢离子浓度。 

(2)pHi酸化后的恢复 

细胞在NH₄Cl的刺激下被酸化，pHi酸化后的恢复是V-ATPase的功能指标之一(Thomas,J.A.,Buchsbaum,R.N.,Zimniak,A.,et al.,Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ.Biochemistry,1979.18(11):p.2210-8)。通过Perkin Elmer荧光光度计(LS55)的氢离子快速滤光片可实时监测pHi酸化后的恢复(Kaplan,D.L.and W.F.Boron,Long-term expression of c-H-ras stimulates Na-H and Na(+)-dependent Cl-HCO₃exchange in NIH-3T3 fibroblasts.J Biol Chem,1994.269(6):p.4116-24；Amlal,H.,A.Goel,and M.Soleimani,Activation of H⁺-ATPase by hypotonicity:a novel regulatory mechanism for H⁺secretion in IMCD cells.Am J Physiol,1998.275(4Pt 2):p.F487-501)。方法如下：①细胞负载酯型BCECF-AM。细胞生长在盖玻片(Fisher Scientific，Fair lawn，NJ)上，达到约80%的融合度，在培养基中加1μM酯型BCECF-AM于37℃中孵育20min，用PBS洗涤两次。酯型BCECF-AM可穿过细胞膜，在细胞中的酯酶作用下，BCECF可从BCECF-AM中释放，被激发发射荧光。但BCECF-AM不能被激发出荧光。故F490/F440与细胞内pH相关。②NH₄Cl介导pHi酸化。负载BCECF的单层细胞在无Na⁺的溶液solutionA中平衡，然后浸入含NH₄ ⁺的无Na⁺溶液solution B中，孵育5min。NMGCl的作用为调节细胞外渗透压，NMG⁺不与细胞内、外阳离子交换。Solution B为含NH₄ ⁺溶液，NH₃较H⁺易进入细胞，故pHi先迅速上升，随着H⁺的进入而渐渐下降。当细胞重新浸于无NH₄ ⁺溶液中，NH₃首先溢出，故pHi迅速下降，被酸化。③pHi酸化后的恢复。实时测定F490/F440pHi的标准曲线用Nigricin-高K⁺技术测定。Nigricin是K⁺通透剂，在细胞外高K⁺的条件下，细胞内pHi=细胞外pHe。细胞浸入不同pH值的含5μM Nigricin的高K⁺溶液中，即将solution A中的NMGCl换成KCl，测得标准曲线。根据标准曲线，将F490/F440转化为pHi。 

pHi酸化后的恢复是在无Na⁺条件下进行的，因此排除Na⁺-H⁺交换。solution A为Hepes缓冲体系，而不是HCO₃ ^-缓冲体系，因此排除HCO₃ ^-依赖的H⁺分泌。故在此条件下，pHi的恢复归结为V-ATPase的作用结果。为进一步证实pHi恢复的确为V-ATPase的作用结果，在第二次浸入的solution A中加入终浓度为1μM的V-ATPase 的特异性抑制剂balfilomycin A1，以观察pHi恢复能否被抑制。 

9、溶酶体酸性测定及定位检测 

溶酶体探针LysoSensor Green DND-189可以聚集在溶酶体及酸性囊泡中。随着酸性的增加，此探针呈现出pH依赖的荧光强度的增加，因而可以用它来检测囊泡中酸性的变化。将稳转细胞株Lenti-vector和Lenti-LASS2种于培养板，48h后，用胰酶消化细胞，并用PBS洗涤。然后将细胞重悬于500μl预热的含1μmol/l DND-189的PBS中，37℃孵育1min，立即置冰，尽快用流式细胞仪分析荧光强度。用未经探针染色的细胞设定荧光的背景，实验重复三次。 

为了确定溶酶体及酸性囊泡在细胞内的定位，Lenti-vector细胞和Lenti-LASS2细胞用预热的含有DND-189的PBS孵育1h，然后用激光共聚焦(IX-70，Olympus 60M，Olympus)进行拍照。 

10、细胞内药物量及分布检测 

将指数生长期的Lenti-vector细胞和Lenti-LASS2细胞种于6cm板，24h后，换新鲜培养液，6h后，加入20μg/ml的阿霉素。37℃孵育4h，用PBS洗涤后，用流式细胞仪进行检测。 

将指数生长期的Lenti-vector细胞和Lenti-LASS2细胞种于24孔板中的盖玻片上，24h后，于细胞中加入20μg/ml的阿霉素。37℃孵育1h，PBS洗3次后，用2%的多聚甲醛室温固定10min。用PBS洗涤后，加入1:10,000稀释的Hoechst 33342。4℃染色10min。用PBS洗涤后，将盖玻片置共聚焦显微镜上，分别观察激发阿霉素及Hoechst 33342的荧光。阿霉素用488nm的光激发，发射的红色荧光用585-615的滤光片接收，Hoechst激发及发射的条件同DAPI。 

11、细胞周期测定 

将对数生长期的细胞种于6cm板中，24h后，于细胞中加入不同浓度的阿霉素。经阿霉素处理24h后，收集细胞。细胞用胰酶消化后，PBS重悬细胞。2000rpm离心5分钟，再用PBS洗涤细胞一次。用300μl PBS重悬细胞，吹打细胞成悬液，加入700μl冰的无水乙醇，置-20℃固定细胞。 

固定后的细胞用PBS洗涤两次后，用100μl PBS重悬细胞，加入2.5μl RNaseA(100mg/ml)，37℃孵育30min。然后细胞用5μl PI(0.5mg/ml)于室温避光染色30min。转移至流式管中，上流式细胞仪检测。 

12、细胞凋亡的测定 

将指数生长期的细胞种于96孔板中，过夜后，用不同浓度的阿霉素处理细胞。24h后，测定Caspase-3/7活性。 

用Caspase- 

3/7assay试剂盒测定Caspase-3/7的活性。预先混合Caspase-Glo 3/7buffer及Caspase-Glo 3/7substrate，然后将100μl的此混合物加入到含100μl培养液的细胞中。300-500rpm混匀96孔细胞培养板。室温避光孵育1h，最后用多功能酶标仪测定每个孔的生物发光量。 

13、划痕实验 

6孔板接种Lenti-vector和Lenti-LASS2细胞，0.5×10⁶每孔，24h后，用枪头在培养板上十字划痕，用无血清的培养液清洗两遍，加入含2%的FBS的1640继续培养，用活细胞工作站实时观察，1小时采集1张图片，共采集68小时。 

14、裸鼠皮下成瘤实验 

所用小鼠为8周龄雌性裸鼠(BALB/c-nu/nu)，每组小鼠6只。提前三天将***缓释片包埋于裸鼠左肩皮下，然后将Lenti-vector细胞或Lenti-LASS2细胞(1×10⁷)皮下种于小鼠的右上腹部，当肿瘤可触及时，一周测两次肿瘤大小。肿瘤大小计算采用下面公式：体积(cm³)=长×宽×宽/2。肿瘤细胞注射11天后，小鼠随机被分为四组：1)Lenti-vector-GFP组；2)Lenti-LASS2-GFP组；3)Lenti-vector-GFP加阿霉素处理组，4)Lenti-LASS2-GFP加阿霉素处理组。其中第三组和第四组腹腔注射阿霉素，剂量为2毫克/千克，该剂量相当于临床上6.5毫克/平方米。药物一周注射两次，共注射三周。每4天称一次小鼠体重，以调整给药剂量。在皮下注射细胞的第32天，用戊巴比妥钠麻醉小鼠，用小动物活体成像***拍照。然后处死小鼠，取瘤称重，然后瘤体用***固定并石蜡包埋后，切片进行TUNEL凋亡检测。裸鼠的饲养及处理等操作严格遵照上海交通大学实验动物伦理委员会的规定。 

15、临床标本实验 

免疫组化采用ELPS(enhance labeled polymer system)法，具体步骤如下：常规脱蜡，0.6%H₂O₂-甲醇在37℃孵育30min，然后用0.01M pH6.0的柠檬酸缓冲液修复20min，室温冷却30min，用正常羊血清封闭20min，用LASS2一抗(多抗，购自Sigma公司，货号为HPA027262)(1:500)在37℃孵育1h，移至4℃冰箱过夜。第二天用TBS洗三次，二抗(羊抗兔)在37℃孵育45min，再用TBS洗3次，最后用DAB显色。 

II.实施例 

实施例1、LASS2表达的检测 

1、LASS2在敏感细胞株MCF-7和耐药细胞株MCF-7/ADR中的表达检测 

LASS家族基因共有6个成员：LASS1-LSS6。本发明人检测了它们在敏感细胞株MCF-7和耐药细胞株MCF-7/ADR中的核酸表达情况。 

结果表明，在MCF-7/ADR中，LASS2表达水平明显低于MCF-7(降低6.81倍，P<0.001，图1A)。本发明人进一步利用Western Blot方法检测了蛋白水平上是否有差异。结果显示，在MCF-7/ADR中，LASS2的蛋白表达水平同样明显低于MCF-7(图 1B)。 

2、LASS2在乳腺癌病理切片中的表达检测 

本发明人利用免疫组化方法，在52例乳腺癌临床标本中检测了LASS2的表达情况，如图1C-J。提取标本的患者的基本情况见表1。LASS2的表达部位为细胞膜和细胞质，并且LASS2在乳腺癌中的表达强弱也有差异。本发明人发现患者的1年肿瘤复发率和LASS2表达具有比较明显的负相关(P=0.006)，复发率越高的患者，免疫组化结果显示LASS2表达越低。并且还发现，患者的无病生存时间和总生存时间与LASS2的表达具有显著的正相关性。无病生存时间越长，免疫组化结果显示LASS2表达越高(P=0.006)，如图1K；总生存时间越长，免疫组化结果显示LASS2表达越高(P=0.019)，如图1L。 

表1.LASS2表达与乳腺癌患者肿瘤的病理参数相关性 

注：ER(estrogen receptor)，***受体；PR(progesterone receptor)，孕激素受体；HER2(human epidermal growth factor receptor 2)，人表皮生长因子受体2。 

实施例2、LASS2对化疗药物敏感性的检测 

本发明人构建了LASS2的重组质粒，然后进行慢病毒包装，用慢病毒颗粒感染MCF-7/ADR细胞，建立了稳转Lenti-LASS2的细胞株，以及对应的空载(Lenti-vector)对照稳转细胞株(图2A)。 

本发明人同时还构建了LASS2干扰的重组质粒，进行慢病毒包装，用慢病毒感染MCF-7细胞，建立了稳转Lenti-shRNA-LASS2的细胞株，以及对应的空载(Lenti-shRNA-vector)对照稳转细胞株(图2C)。 

另外还构建了ATP6V0C干扰的重组质粒，进行慢病毒包装，用慢病毒感染MCF-7/ADR细胞，建立了稳转Lenti-shRNA-ATP6V0C的细胞株，以及对应的空载(Lenti-shRNA-vector)对照稳转细胞株(图3A-B)。 

结果发现，过表达LASS2可以显著性降低MCF-7/ADR对于阿霉素的半抑制浓度IC₅₀值(P=0.0074，图2B)，干扰LASS2可以显著性增高MCF-7细胞对于阿霉素的半抑制浓度IC₅₀值(P=0.0260，图2D)。 

在MCF-7/ADR中，通过慢病毒感染的方法降低ATP6V0C的表达，利用实时定量扩增(图3A)和蛋白印迹(图3B)的方法从核酸和蛋白的水平进行干扰效果验证，干扰第二个片段(shRNA2)的效果显著更好，因此，以下采用干扰片段shRNA2进行实验。干扰试验结果证明MCF-7/ADR中，干扰ATP6V0C后，显著降低了细胞对于阿霉素的半抑制浓度IC₅₀(P=0.0042，图3C)。 

而且，在MCF-7/ADR中过表达LASS2可以使细胞对下面这些药物增敏：米托蒽醌(MTO)、表柔比星(EPI)、长春瑞滨(VRL)、顺铂(DDP)和5-氟脲嘧啶(5-FU)，如表2。 

表2、Lenti-vector和Lenti-LASS2细胞对化疗药物的半抑制浓度(IC₅₀)检测 

实施例3、LASS2对V-ATPase质子泵活力的影响 

细胞培养液的H⁺浓度用pH-敏感的探针BCECF来检测，BCECF在适当的pH情 况下可以被激发形成绿色荧光，通过检测荧光强度可以反映培养液的pH值。结果显示，在培养9小时后，稳转Lenti-LASS2的细胞株(简称Lenti-LASS2)的培养液的H⁺浓度明显低于稳转Lenti-vector的细胞株(简称Lenti-vector)(P=0.0120，图4B)。 

BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。BCECF-AM没有荧光，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成BCECF，从而被滞留在细胞内。在本研究中，细胞内H⁺浓度用BCECF-AM来检测。细胞生长于盖玻片，长满单层细胞的盖片在荧光分光光度仪上实时测定细胞内pH值。Lenti-LASS2细胞在无Na⁺溶液中静息pHi较对照组低。在溶液中引进NH₄Cl后，Lenti-LASS2细胞和对照组细胞pHi均上升，去除NH₄ ⁺后，pHi迅速下降，随后，对照组pHi逐渐恢复至静息pH，而Lenti-LASS2细胞恢复受阻(图4F)。对照组的细胞内pH恢复可被V-ATPase特异性抑制剂Balfilomycin A1抑制，故细胞内pH的恢复主要为膜V-ATPase作用的结果(图4D-E)。 

实施例4、MCF-7/ADR细胞溶酶体酸性的检测 

用流式细胞仪测定细胞内溶酶体指示剂DND-189的荧光强度，结果表明，Lenti-LASS2细胞内荧光强度明显低于对照组细胞(图5A)，表明过表达LASS2可以提高溶酶体的pH值。用激光共聚焦检测的结果同样也表明过表达LASS2可以提高溶酶体的pH值(图5B)。 

实施例5、阿霉素(Doxorubicin hydrochloride，DOX)在MCF-7/ADR细胞中分布的改变 

用流式细胞仪测定细胞内Dox的荧光强度，结果表明，Lenti-LASS2细胞内荧光强度明显高于对照组细胞(图5C)。提示相比对照组细胞Lenti-vector而言，更多的Dox进入Lenti-LASS2细胞，表明过表达LASS2可以使细胞内积聚的Dox增多。 

依次用Dox及Hoechst 33342孵育细胞，共聚焦显微镜观察Dox发射的红色荧光及Hoechst 33342染核后发射的蓝色荧光。结果显示，在MCF-7细胞中，Dox主要分布在细胞核中；在MCF-7/ADR细胞中，Dox很少分布在细胞核中。LASS2的表达上调以后，也就是在Lenti-LASS2细胞中，Dox在细胞核中大量分布，而对照组细胞Lenti-vector的Dox很少分布在细胞核中(图5D)。 

实施例6、细胞周期分布变化 

细胞周期分布分析表明，单纯地过表达LASS2对细胞周期没有显著性影响。用Dox处理后，Lenti-vector细胞出现了明显的G₂/M期阻滞，并且是剂量依赖性：Dox剂量为0μg/ml时，G₂/M期为11.3%；Dox剂量为10μg/ml时，G₂/M期为22.7%；Dox剂量为20μg/ml时，G₂/M期为26.1%。而且，相比较Lenti-vector细胞而言，过表达LASS2联合Dox处理可以显著地增加G₂/M阻滞程度：Dox剂量为10μg/ml时，Lenti-LASS2细胞的G₂/M期的比例为27.7%，而Lenti-vector细胞的G₂/M期的比例为22.7%；Dox剂量为20μg/ml时，Lenti-LASS2细胞的G₂/M期的比例为39.7%，而 Lenti-vector细胞的G₂/M期的比例为26.1%(图6)。 

实施例7、细胞凋亡率检测 

如果细胞凋亡过程有Caspase-3/7的参与，当在细胞裂解液中加入DEVD偶联的底物后，即可以检测到生物发光，且检测到的生物发光量与Caspase-3/7的激活程度呈正相关。本实验中，细胞用Dox处理24小时后，然后再检测Caspse-3/7活性。当Dox的剂量分别为1、2、5、10或者15μg/ml时候，Lenti-LASS2细胞和Lenti-vector细胞的Caspase-3/7活性并没有明显差异。当Dox的剂量为20μg/ml，Lenti-LASS2细胞和Lenti-vector细胞的Caspase-3/7活性出现了明显差异(P=0.0206)；当Dox的剂量为30μg/ml，两种细胞的Caspase-3/7同样出现了差异(P=0.0078)(图7A)。 

用Hoechst 33342染细胞核，然后利用荧光显微镜观察细胞核是否发生固缩，从而就可以判断细胞是否发生了凋亡。本实验中，用Dox处理细胞48小时后，然后加入Hoechst 33342进行染核。当加入的Dox的浓度为1或2μg/ml的时候，Lenti-LASS2细胞和Lenti-vector细胞的细胞核没有发生明显差异(图7B，左侧)。但是当加入的Dox浓度为5、10、20或30μg/ml的时候，细胞核明显发生了固缩。并且Lenti-LASS2细胞的核固缩程度要远远高于Lenti-vector细胞：当Dox浓度为5、10、20、30μg/ml时，Lenti-LASS2细胞中发生核固缩的比例分别为22%，34%、46%和52%，而Lenti-vector细胞分别为9.5%、23%、27.7%和38.7%(图7B，左侧)。以上结果表明，过表达LASS2联合Dox处理可以增强耐药细胞株MCF-7/ADR的凋亡率。 

下面本发明人检测了凋亡通路中蛋白表达的变化。Bax属于前凋亡蛋白Bcl-2家族成员之一，它是线粒体凋亡通路中的重要蛋白因子。在线粒体应急中，Smac/Diablo从线粒体中释放出来，它可以与凋亡蛋白抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)结合，从而促进凋亡的发生。许多凋亡蛋白抑制蛋白，例如Livin，可以通过直接结合而抑制许多caspase家族成员的活力，这些caspase家族包括caspase-3，caspase-7和caspase-9。图7C表明Lenti-LASS2+Dox组的Bax和Smac/Diablo蛋白表达量明显高于其它组，而Livin的表达量明显明显降低(图7C)。另外还观察到过表达LASS2联合Dox处理可以显著地增加Caspase-3/7活性(图7A)。 

以上结果表明：在耐药细胞株MCF-7/ADR中，过表达LASS2联合Dox处理可以显著地增加凋亡的发生，并且在凋亡的过程中，caspase家族成员发挥重要作用。过表达LASS2联合阿霉素处理引起细胞发生凋亡的可能途径如图7D。 

实施例8、LASS对于细胞增殖和转移的影响 

细胞增殖采用CCK-8的方法。结果表明：在72小时内，过表达LASS2对肿瘤细胞的增殖没有明显影响(图8A)。细胞的迁移能力采用活细胞工作站来实时检测，结果表明过表达LASS2可以显著抑制MCF-7/ADR细胞的迁移能力，截图见图8B。活细胞工作站观察的时间为68小时，在这个时间段里，过表达LASS2对于细胞增殖是没有影响的，所以过表达LASS2抑制MCF-7/ADR细胞迁移能力并不是由于细胞增 殖减速引起的。 

图8C-D是用Real-time PCR检测药泵蛋白基因的表达量情况。药泵蛋白是将化疗药物泵出细胞，从而导致细胞内的化疗药物在细胞内的积存量减少，这也是造成肿瘤耐药的重要原因之一。本发明人检测了常见的两种编码药泵蛋白的基因，即MDR1/ABCB1和BCRP/ABCG2（MDR1又称为ABCB1；BCRP又称为ABCG2），结果发现相比较起对照组而言，过表达LASS2并不能引起这两个基因的表达发生显著变化，这样就说明过表达LASS2并不是通过降低药泵蛋白的量而引起增敏的。 

实施例9、LASS2对于裸鼠体内瘤体生长的影响 

为了进行小动物活体成像实验，本发明人将带绿色荧光蛋白(GFP)标记的表达质粒Lenti-LASS2-GFP转MCF-7/ADR细胞，建立稳转细胞株，相应的对照为稳转Lenti-vector-GFP的细胞株。将获得的Lenti-vector-GFP细胞或Lenti-LAS S2-GFP细胞(1×10⁷)皮下种于小鼠的右上腹部，观察成瘤情况。结果表明：相比较对照组而言，单独过表达LASS2或Dox处理并不能明显地抑制瘤体的生长。而Lenti-LASS2-GFP+Dox组的瘤体相比Lenti-vector-GFP+Dox组而言，无论是平均大小还是重量都明显降低(图9D-E)，抑制率分别为52.9%和42.9%。小动物活体成像实验结果表明：Lenti-LASS2-GFP+Dox组的瘤体相比Lenti-vector-GFP+Dox组而言，荧光强度明显较弱(P=0.0464，图9F)。 

另外，裸鼠成瘤后，将瘤体取出，石蜡切片，利用TUNEL检测凋亡情况，结果也显示，过表达LASS2联合Dox处理同样可以显著增加凋亡细胞的出现(图10)。 

四、结论 

1、LASS2可以抑制V-ATPase质子泵运输氢离子的功能； 

2、LASS2可增加阿霉素进入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR的量，且可以减少阿霉素被阻滞在溶酶体的量，最终提高阿霉素在细胞核(阿霉素作用靶点)的积聚量； 

3、LASS2联合阿霉素处理可以增加MCF-7/ADR的凋亡率，并且Caspase-3/7介导该凋亡通路； 

4、临床乳腺癌标本实验表明，乳腺癌中LASS2的表达情况与患者对于阿霉素的敏感性具有相关性，LASS2表达量越低，患者对阿霉素的敏感性越差； 

5、本发明在国内外首次证明LASS2可以作为乳腺癌患者对于化疗药物(如阿霉素)敏感性的预测因子。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.一种人源性长寿保障基因2、其编码的蛋白或其上调剂的用途，用于制备提高乳腺癌细胞对于抗癌药物的敏感性的药物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抗癌药物是弱碱性的化疗药物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抗癌药物选自：阿霉素，米托蒽醌、表柔比星、长春瑞滨、顺铂和5-氟脲嘧啶，柔红霉素，长春新碱，喜树碱，表阿霉素，长春碱，长春花碱，长春瑞宾，及其衍生物或混合物。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还用于：

抑制V-ATPase质子泵运输氢离子；

提高细胞溶酶体pH值；

使乳腺癌细胞内积聚抗癌药物；

联合抗癌药物增加乳腺癌细胞的细胞周期的G₂/M阻滞；

联合抗癌药物增加乳腺癌细胞的细胞凋亡率；

联合抗癌药物增加乳腺癌细胞的Caspase-3和Caspase-7蛋白活性；

抑制乳腺癌细胞的迁移。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的人源性长寿保障基因2上调剂是重组表达载体，所述表达载体中含有一表达盒，其中包含人源性长寿保障基因2以及与之操作性连接的表达调控元件。

6.一种预防、缓解或治疗乳腺癌的药盒，其特征在于，包括：

(a)人源性长寿保障基因2编码的蛋白；或表达人源性长寿保障基因2的表达构建物；和

(b)抗癌药物。

7.如权利要求6所述的药盒，其特征在于，所述的表达构建物是重组表达载体，所述表达载体中含有一表达盒，其中包含人源性长寿保障基因2以及与之操作性连接的表达调控元件。

8.如权利要求6所述的药盒，其特征在于，所述的抗癌药物选自：阿霉素，米托蒽醌、表柔比星、长春瑞滨、顺铂和5-氟脲嘧啶，柔红霉素，长春新碱，喜树碱，表阿霉素，长春碱，长春花碱，长春瑞宾，及其衍生物或混合物。

9.一种人源性长寿保障基因2或其编码的蛋白的用途，用于制备检测乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性的试剂或试剂盒。

10.一种特异性识别人源性长寿保障基因2或其编码的蛋白的试剂的用途，用于制备检测乳腺癌细胞对抗癌药物的敏感性的试剂盒。

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