CN105287632A - 一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药pdx模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于肺癌吉非替尼耐药模型构建技术领域，具体涉及一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法的专利申请。该方法包括：构建非小细胞肺癌PDX模型、筛选吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型、诱导构建非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型三个过程。本发明可以作为由非小细胞肺癌吉非替尼耐药的肿瘤组织直接构建的PDX模型的替代品，对于研究吉非替尼耐药机制，筛选吉非替尼耐药过程的靶点和小分子药物，进而延缓或干预吉非替尼耐药过程提供了较好的研究基础，具有较好的推广应用价值。

Description

一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法

技术领域

本发明属于肺癌吉非替尼耐药模型构建技术领域，具体涉及一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法的专利申请。

背景技术

肺癌位居全球癌症死亡率中的第一位，非小细胞肺癌（Non-small-celllungcancer，NSCLC）占肺癌的80%。非小细胞肺癌5年生存率小于15%，主要原因是大约70%的患者首次诊断为非小细胞性肺癌时已处于晚期，多合并有远处转移。肺癌是率先在临床中应用靶向治疗的癌症种类之一。在过去的十年中，小分子化合物酪氨酸激酶抑制剂在临床上广泛应用于NSCLC患者的靶向治疗，其靶点为表皮生长因子受体（EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR）。吉非替尼是在临床上应用于EGFR突变的NSCLC患者的靶向药物之一。吉非替尼治疗非小细胞肺癌中取得了显著的疗效，然而吉非替尼靶向治疗长期使用后，几乎所有患者都会产生耐药性。因此，模拟NSCLC肺癌吉非替尼耐药过程并深入明确NSCLC吉非替尼耐药机制具有重要意义。

对于吉非替尼敏感的NSCLC患者治疗中，吉非替尼耐药性的出现严重限制了其临床疗效。为了研究吉非替尼获得性耐药机制，许多人非小细胞肺癌细胞系被诱导为吉非替尼耐药细胞系，例如HCC827、PC-9、A549长期暴露于吉非替尼，最终就会诱导成为吉非替尼耐药细胞系HCC827GR、PC9/ZD和A549GR。利用这种方法所建立的吉非替尼耐药细胞系，国内外许多研究进行了NSCLC吉非替尼耐药机制研究。揭示了3种不同的耐药机制：60%非小细胞肺癌产生获得性吉非替尼耐药的原因是由于特定的EGFR发生了突变，主要是T790M突变；22%是某些基因的扩增，例如，MET、HER2、BRAF、AXL、MAPK1或者PIK3CA等；还有4%是从非小细胞肺癌到上皮细胞肺癌的组织转变，或者是具有干细胞特性；还有10%耐药机制则是不清楚的。然而，由于这些细胞经过多代体外培养而具有同质性，从而导致其并不能充分反映临床病人肿瘤组织中的肿瘤异质性，因而存在较大的局限性。因此，要找到有效的治疗方法来干预NSCLC患者发生吉非替尼耐药的过程，深入研究获得性吉非替尼耐药的发生机制，迫切需要一种能够真实反映NSCLC患者肿瘤特征，并有效模拟NSCLC患者吉非替尼耐药发生过程的动物模型。

将人肿瘤组织直接接种于免疫缺陷小鼠而构建出的人组织来源的移植瘤（patient-derivedxenografts，PDX）模型充分保留了患者肿瘤组织学异质性，因此，在过去的十年中各种肿瘤PDX移植瘤模型广泛建立，并在组织学、基因水平和药理作用水平得到广泛认可。PDX模型的建立提供了一个临床研究应用的前期平台，并且被广泛应用于评价新的临床治疗方案和筛选分子靶标。目前非小细胞肺癌吉非替尼耐药的PDX模型一直未能成功构建。然而，建立吉非替尼耐药的PDX模型有两个方法，一个是直接将吉非替尼耐药的非小细胞肺癌组织进行接种构建，一个是筛选出吉非替尼敏感的NSCLCPDX模型给予吉非替尼进行诱导。第一种构建方法的不足：1吉非替尼耐药的非小细胞肺癌病人通常处于癌症晚期，没有机会进行手术，通常通过穿刺进行再次诊断，而穿刺所取得的组织量少，因此很难得到足够多耐药组织进行PDX模型构建。2吉非替尼耐药是长时间服用吉非替尼后发生耐药的，吉非替尼发生耐药发生之前是无法分阶段对病人进行穿刺获得吉非替尼耐药过程中的组织。因此，我们采取第二种方法即构建NSCLCPDX模型，筛选出对吉非替尼敏感的模型组，然后采用逐步增加吉非替尼剂量的方法诱导NSCLC移植瘤发生吉非替尼耐药，充分模拟了NSCLC患者吉非替尼耐药发生过程，为进一步研究吉非替尼耐药发生机制和筛选干预耐药过程药物提供了临床前平台。

发明内容

本发明目的是提供一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法，所构建的非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型可以作为直接用吉非替尼耐药组织构建的PDX模型的替代品，并模拟了NSCLC患者发生吉非替尼耐药过程，对于研究吉非替尼耐药机制，筛选吉非替尼耐药过程的靶点和小分子药物，进而延缓或干预吉非替尼耐药过程具有重要的意义和实用价值。

下面对本发明的详细技术方案介绍如下。

一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法，包括以下步骤：

（1）首先构建非小细胞肺癌（NSCLC）PDX模型，具体为：

首先，获得非小细胞肺癌病人的组织样本，具体为：对临床确诊为非小细胞肺癌、且术前均未接受过放疗和化疗的病人，在获得其同意并办理相关手续后，取其肿瘤组织作为样本，即人来源的非小细胞肺癌肿瘤样本；

其次，将所获得的人来源的非小细胞肺癌肿瘤样本处理后，常规操作植入，所形成的肿瘤即为移植瘤；

监控植入人来源非小细胞癌肿瘤（移植瘤）的SCID小鼠生长情况，当肿瘤长到有坏死或者液化现象时（此时肿瘤体积一般在500~1500mm³左右），应及时进行传代；

当肿瘤（移植瘤）被稳定传代至三代或三代以上时则认为该非小细胞肺癌（NSCLC）PDX模型构建成功；

（2）对步骤（1）中所构建的非小细胞肺癌（NSCLC）PDX模型进行评价，筛选出吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型；具体为：

首先，对所构建的非小细胞肺癌（NSCLC）PDX模型中肿瘤生长界限进行记录和判定，所述肿瘤生长界限即移植瘤在小鼠体内生长时坏死或者出现液化现象时的肿瘤体积临界值；

其次，对所构建的非小细胞肺癌（NSCLC）PDX模型中肿瘤进行病理学和免疫组化染色评价，所述免疫组化染色评价采用如肺鳞癌的标记物CK5/6、P63和P40（CK5/6、P63和P40是在临床上公认的鳞癌标记指标），肺腺癌的标记物TTF-1、CK8/18和NapsinA（TTF-1、CK8/18和NapsinA是在临床上公认的腺癌标记指标）等进行评价，以确定移植瘤类型为典型的非小细胞癌移植瘤；

最后，对所构建的非小细胞肺癌（NSCLC）PDX模型中肿瘤的EGFR基因进行突变检测，检测时可采用现有的检测试剂盒（如北京雅康博生物科技有限公司的“人EGFR基因突变检测试剂盒），通过荧光PCR法定性确定EGFR基因类型；根据EGFR突变情况筛选出吉非替尼敏感的非小细胞癌PDX模型，

对吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型中的EGFR基因突变类型具体如：L858R、L861Q、G719C、Exon19缺失等；

对于吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型发生耐药后基因型改变情况，出现EGFRT790M基因突变，c-Met,HER2,BRAF,AXL,MAPK1或者PIK3CA基因扩增等。

（3）构建非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型，具体为：

对步骤（2）中筛选获得的吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型，给予吉非替尼灌胃处理，剂量从10~100mg/kg逐步增加给药，从而诱导获得性非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型；

诱导过程中，吉非替尼诱导剂量先从10mg/kg升至50mg/kg，再从50mg/kg升至100mg/kg；

为便于检测，可在每个剂量产生耐药的情况下，传代前冻存组织样本，以便于后期复苏后研究耐药过程中的分子改变；

吉非替尼耐药诱导过程总体需要7~10个月左右时间。

目前，PDX模型具有功能性的基质和血管、肿瘤微环境、并能反映肿瘤中心坏死和肿瘤分化的特征，因此被认为是反映人体内肿瘤生长的真实情况的最佳模型。这些PDX模型比来源于细胞系的移植瘤更能够反映病人体内肿瘤的真实分子特征和肿瘤的异质性。肿瘤的生长和药物的作用均可受到血管生成、生长因子、间质和肿瘤微环境的影响，因此，基于PDX模型所获得的结果要比单纯细胞系获得的移植瘤更有信服力。

现有技术中虽然有部分非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞系模型的成功构建，但基于临床研究应用的复杂性和特殊性，加上细胞系模型的局限性，因而构建非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型仍然具有十分重要的意义。采用一般性思路，从非小细胞肺癌病人中获得吉非替尼耐药的肿瘤组织并构建PDX模型，虽然具有理论操作的可能性，但实际实践中，由于非小细胞肺癌吉非替尼耐药过程中肿瘤组织的不可获得性，因而使得这一思路无法实现。

本发明首先通过构建非小细胞肺癌PDX模型，进一步筛选出对于吉非替尼耐药敏感的PDX模型，并以此为基础采用吉非替尼诱导获得了非小细胞肺癌吉非替尼耐药的PDX模型，可以作为由非小细胞肺癌吉非替尼耐药的肿瘤组织直接构建的PDX模型的替代品，对于研究吉非替尼耐药机制，筛选吉非替尼耐药过程的靶点和小分子药物，进而延缓或干预吉非替尼耐药过程提供了较好的研究基础，具有较好的推广应用价值。

附图说明

图1为实施例1中其中一例非小细胞肺癌移植瘤模型的肿瘤生长曲线图，其中P1（第一代）、P2（第二代）和P3（第三代）的生长时间分别为100天、84天和48天；

图2为实施例1中另外一例非小细胞肺癌移植瘤模型的肿瘤生长曲线图，其中P1（第一代）、P2（第二代）和P3（第三代）的生长时间分别为133天、92天和61天；

图3为非小细胞癌病人肿瘤组织（P0）和移植瘤组织（P1和P3）HE染色和免疫组织化学染色图；其中第一列P0移植瘤组织，第二列为P1移植瘤组织，第三列为P3移植瘤组织，第一行为各代移植瘤的HE染色(X200)，第二到四行分别为CK5/6、p40、p63在各代移植瘤中的阳性表达(X200)；

图4为吉非替尼耐药前后移植瘤生长曲线，吉非替尼耐药前移植瘤生长周期为28天，吉非替尼耐药后移植瘤生长周期为21天；

图5为吉非替尼敏感移植瘤阳性对照组（吉非替尼100mg/kg）肿瘤生长曲线；

图6为吉非替尼耐药前后移植瘤HE染色和免疫组织化学染色图；其中第一行为吉非替尼耐药后移植瘤组织，第二行为吉非替尼耐药前移植瘤组织，第一列为各代移植瘤的HE染色(X200)，第二到四列分别为CK8/18、NapsinA、TTF1在各代移植瘤中的阳性表达(X200)；

图7为吉非替尼耐药前后移植瘤EGFR突变情况；其中左侧为吉非替尼耐药前移植瘤EGFR突变情况，为L858R突变；右侧吉非替尼耐药后移植瘤EGFR无突变，为野生型；

图8为吉非替尼耐药前后移植瘤c-Met基因扩增情况；其中左图为吉非替尼耐药后c-Met扩增，箭头所示的灰色地方均为扩增区域，右图为吉非替尼耐药前无c-Met基因扩增。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，对下述实施例中所用部分物料简要介绍如下。

材料与试剂

CB17-SCID小鼠，雌性，6~8周龄，18~20g，北京维通利华动物实验公司；需要注意的是，小鼠生长环境为恒温恒湿、无菌环境；

无菌的PRMI1640培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS），Hyclone；

二甲基亚砜、青霉素/链霉素溶液100x，Sigma；

L-15溶液，Gibco；

吉非替尼药片(易瑞沙),英国阿斯利康；

戊巴比妥钠，国药集团；

人EGFR基因突变检测试剂盒，北京雅康博生物科技有限公司；

另外，下述实施例中无血清的培养基中加有1%抗生素(100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)；同时需要注意的是无菌培养基应当保持新鲜，未使用时应当4℃储存，且在3周内使用完毕。

关于人的非小细胞肺癌肿瘤组织的获得，需要说明的是，患者均是经现有技术临床确诊的非小细胞癌病人，患者在术前均未接受过放疗和化疗治疗，且患者亦未患有其他传染性疾病，患者也均签署有相关的用于研究的知情同意书。患者的肿瘤组织在手术切除后立即被放入含有青霉素和链霉素的无血清的PRMI1640的培养基中，并被迅速转运到研究场地用于实验研究。从所收集的病人的肿瘤组织中选择肿瘤活力较好的组织部分，在去除出血坏死组织后，浸入4℃无菌生理盐水中漂洗3次，然后进行后续实验处理。

实施例1

本实施例主要介绍非小细胞肺癌（NSCLC）PDX模型的构建过程。

1、获取非小细胞肺癌病人的组织样本

所获得的非小细胞癌肿瘤组织样本来自于手术后的新鲜组织标本，一般而言，在进一步选取肿瘤样本时应尽可能取边缘肿瘤组织，以避免所取组织中含有坏死组织。

根据需要，最终所选取的肿瘤组织样本大小为1cm×1cm即可。对所选取的肿瘤组织样本拍照和称重并做好记录后，为后续检测、实验方便，可将所取得的肿瘤组织样本分为三部分：一部分用10%***固定，并制作石蜡标本以进行病理检查和免疫组织化学分析；一部分于-80℃冷藏以用于DNA/RNA的提取分析；一部分植入重度联合免疫缺陷（SevereCombinedImmunodeficiency，SCID）小鼠体内进行PDX模型构建。

2、将所获得的人来源的非小细胞癌肿瘤样本植入小鼠

将所获得的人来源的非小细胞癌肿瘤样本处理后，常规操作植入SCID小鼠，所形成的肿瘤即为移植瘤；具体过程如下：

首先，将人来源的非小细胞癌肿瘤样本分切成大小一致的肿瘤组织，规格大致为：直径3mm左右，重量0.12~0.15g；

其次，将小鼠麻醉并植瘤，具体过程为：按每20g体重给予0.3mL0.4%（质量/体积）的戊巴比妥钠将小鼠进行麻醉，待其麻醉后，用21G针头破皮，在皮下注射入青霉素和链霉素0.1mL，然后皮下植入分切后的肿瘤组织样本；

在将非小细胞肺癌肿瘤组织植入SCID小鼠后，定期监控小鼠体重和瘤子（肿瘤）生长情况，当肿瘤长到有坏死或者出现液化现象时，记录此时肿瘤体积大小并及时进行传代；

在已经进行的肿瘤移植实验中，统计结果表明，当肿瘤长到有坏死或者出现液化现象时，肿瘤体积一般在500~1500mm³左右（因肿瘤样本差异，此数据并不完全相同）；

需要强调和说明的是，下述实施例中针对特定来源的肿瘤样本进行移植瘤操作时，移植瘤在小鼠体内生长至500mm³时开始出现坏死或液化现象，因而后续实施例中肿瘤生长均以500mm³这一数值为生长界限；

当肿瘤（移植瘤）被稳定传代至三代或三代以上时则认为该非小细胞肺癌（NSCLC）PDX模型构建成功；而三代至十代则用于后续的实验研究，并将三到五代进行冻种保存。

需要解释的是，小鼠体内肿瘤（移植瘤）体积按如下公式计算：

V=LD×(SD)²/2；

其中V是肿瘤体积，LD是肿瘤的最长直径，SD是肿瘤的最短直径，LD、SD测量时采用游标卡尺测量。

还需解释和说明的是，肿瘤传代过程按常规操作即可，与肿瘤植入过程大致相同，具体为：

将需要肿瘤传代的小鼠施予颈椎脱臼，于75%乙醇中浸泡，擦干后解剖取出肿瘤（第一代小鼠处死时即为第一代肿瘤组织，第二代小鼠处死时即为第二代肿瘤组织，依次类推）；

将所取出的肿瘤组织置于含有青霉素和链霉素的PBS中，拍照和称重后，根据需要，可将所取肿瘤组织分为三部分，一部分置10%***溶液，并制作标本以便进一步评价，一部分于-80℃冷藏以用于DNA/RNA的提取分析，另一部分按照植入操作要求植入SCID小鼠即可，从而完成传代工作。

在上述方法基础上，发明人共成功建立了40例非小细胞肺癌移植瘤模型，且40例移植瘤均可以稳定传代。总体而言，所构建的非小细胞肺癌移植瘤模型中，第一代移植瘤生长速度较缓慢，但自第三代及以后移植瘤生长速度较快且稳定。其中两例移植瘤肿瘤生长曲线（肿瘤植入小鼠体内后，每周测量一次肿瘤体积，依此绘制生长曲线）如图1、图2所示。

PDX模型的特点之一就是肿瘤生长的滞后性。当人肿瘤组织植入免疫缺陷小鼠体内后，前期要克服异种移植的排异性，并完成人肿瘤组织中的间质和血管由小鼠的间质和血管所替代的过程，所以就发生肿瘤生长的滞后期。在滞后期内，肿瘤生长缓慢，而且通常发生于PDX模型的第一代和第二代中，所以PDX模型中第一代和第二代肿瘤生长通常缓慢，到第三代及其以后肿瘤生长稳定，特征保持。这一特点在图1、图2中均得到了较好地证明。

实施例2

本实施例主要介绍一下对于实施例1所构建的非小细胞肺癌PDX模型的评价和筛选吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型的过程。

对于实施例1中所构建的非小细胞肺癌PDX模型进行评价，主要包括组织病理学评价和EGFR基因分子评价两个方面，具体如下。

组织病理学评价中首先要绘制肿瘤生长曲线，具体为：

如实施例1中所述肿瘤体积的计算方法，每周测量并计算一次肿瘤生长体积，并据此绘制肿瘤生长曲线；同时要记录和判定肿瘤生长的临界体积值（即传代时肿瘤体积值）；

需要强调的是，下述实施例中采用的特定的非小细胞肺癌PDX模型中小鼠体内的肿瘤生长的临界体积值为500mm³左右，此数值不仅是肿瘤传代过程的肿瘤生长体积临界值，也是后续吉非替尼诱导的耐药过程中诱导终止时的肿瘤生长体积终止值。

组织病理学评价中其次要对肿瘤组织样本进行基本病理学评价，具体为：

实际操作过程中，可对人来源的初始肿瘤组织样本和每次传代过程中的肿瘤组织样本分别制备肿瘤组织切片，并对其中肿瘤细胞比例进行判定，以确定肿瘤组织的基本情况；其次对肿瘤组织切片进行HE染色和免疫组织化学染色，以确定肿瘤的类型和其他病理特征；

对于肿瘤细胞比例的统计结果表明，在本发明所构建的各非小细胞肺癌PDX模型中，肿瘤组织中肿瘤细胞比例均大于70%，显示出较好地生长潜力；

对于HE染色和免疫组织化学染色结果表明（其中一例染色情况如图3所示），HE染色显示原代肿瘤组织中存在角化珠和细胞间桥，P1和P3代移植瘤组织与原代肿瘤组织的病理分化程度基本一致；CK5/6、p40和p63在P0、P1和P3代中均为阳性表达，其中CK5/6阳性细胞染色位于细胞膜和细胞质，P40和P63阳性细胞染色位于细胞核；各代肿瘤组织的染色情况基本一致；

上述结果表明肿瘤组织具有较好地生长潜力且传代情况较为稳定。

EGFR基因分子评价方面，主要是采用现有的“人EGFR基因突变检测试剂盒”利用较为成熟的荧光PCR技术对肿瘤组织的DNA进行EGFR（表皮生长因子受体）基因突变位点分析。

EGFR基因位于人第7号染色体短臂（7p12），长约118kb，由28个外显子组成；其转录形成的mRNA长约5.6kb，编码分子量为170kD的跨细胞膜糖蛋白，胞内区具有酪氨酸激酶（tyrosinekinase，TK）活性，负责将胞外信号传递至胞内。异常的EGFR活化能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移、分化、血管新生，并且能够抑制肿瘤细胞的凋亡。

EGFR基因突变主要发生在胞内TK区域的前4个外显子上（18~21外显子），研究表明：EGFR基因18、19、20、21外显子发生突变的肺癌患者服用酪氨酸激酶抑制剂（tyrosinekinaseinhibitors，TKIs）类药物的疗效较好。而中国肺癌患者中，EGFR的突变率约为30%~50%，其中18外显子上发生的G719S点突变约占EGFR突变类型的5%左右，19外显子上发生的多种缺失突变约占EGFR突变类型的45%左右，20外显子上发生S768I点突变约占EGFR突变类型的1%左右，21外显子上发生的L858R、L861Q点突变约占EGFR突变类型的40%~45%。

在上述已有研究基础上，具体分析过程为：

按现有技术，常规操作，对肿瘤组织样本的DNA进行提取操作；

按照试剂盒说明书，采用荧光PCR技术对EGFR突变位点进行定性；检测分析时，具体可依据下表对EGFR基因的18、19、21及20外显子进行突变位点的定性分析：

。

已知的吉非替尼敏感的非小细胞癌模型的EGFR突变类型有：L858R、L861Q、G719C、Exon19缺失，据此可筛选出吉非替尼敏感的非小细胞癌PDX模型。

实施例3

在上述实施例1、2基础上，发明人筛选获得了肿瘤生长临界值为500mm³、EGFR突变类型为L858R的非小细胞肺癌PDX模型，本实施例主要介绍对此PDX模型进行吉非替尼诱导以获得非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的过程。

对于筛选获得的非小细胞肺癌PDX模型，使用其第三代移植瘤小鼠来诱导、构建获得吉非替尼耐药的移植瘤模型；具体过程为：

将小鼠分为两组，一组为对照组，另一组为实验组，阳性对照组灌胃吉非替尼溶液，每天100mg/kg，连续灌胃一周后肿瘤体积可以明显缩小(阳性对照组设立的意义：1证实实施例2中所选基因型的移植瘤对吉非替尼是敏感的2证实吉非替尼耐药诱导前的移植瘤对吉非替尼是敏感的)；实验组所给予的吉非替尼溶液，剂量按低剂量（10mg/kg）、中剂量（50mg/kg）、高剂量（100mg/kg）依次增加。

需要解释的是，吉非替尼剂量设置依据是：按照人的剂量，吉非替尼换算成大鼠剂量大概为50mg/kg；而在目前文献报道中，吉非替尼诱导的吉非替尼耐药细胞的移植瘤实验中，小鼠给予吉非替尼剂量为100mg/kg，因此将100mg/kg作为非小细胞肺癌吉非替尼耐药的标准剂量；取其1/10为起始剂量即10mg/kg，逐渐增加剂量，从而诱导获得性非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型。

需要注意的是，由于实验组小鼠最终可能不会全部出现吉非替尼耐药现象，因而实验组每组小鼠数量建议至少不少于10只；发明人实验过程中实验每组小鼠数量为12只。

另外需要解释的是，实验过程中灌胃用吉非替尼溶液按如下方法制备：

将含有250mg吉非替尼的药片称重，记为A；

然后用研钵将吉非替尼药片研磨成粉末，收集粉末于50mL离心管中称重，记为B；

计算实际的吉非替尼量，公式为：（A/B）×250mg；

根据实验剂量所需将吉非替尼溶解于生理盐水中，并分装成够一次使用剂量的小容量；然后冻存于-20°C。

阳性对照组实验

对筛选所获得的吉非替尼敏感的非小细胞癌PDX模型，在小鼠体内植入肿瘤组织样本后，定期观察记录肿瘤组织生长情况，阳性对照组体内移植瘤组织长到100~200mm³时，每日灌胃给予吉非替尼（100mg/kg）,对照组的移植瘤会越来越小，会在1~3周内消失。肿瘤生长曲线如图5所示。从图5中结果可以说明，上述所筛选获得的非小细胞癌PDX模型肿瘤组织对于吉非替尼是非常敏感的。

吉非替尼诱导组详细实验过程介绍如下。

低剂量（10mg/kg）吉非替尼诱导过程

对筛选所获得的吉非替尼敏感的非小细胞癌PDX模型，在小鼠体内植入肿瘤组织样本后，定期观察记录肿瘤组织生长情况，待其体内移植瘤组织长到100~200mm³时，实验组开始每天灌胃吉非替尼溶液（10mg/kg）。灌胃后，正常饲喂，定期观察记录移植瘤生长情况及大小，这些小鼠被记录为第一代吉非替尼治疗组小鼠。

对于实验组小鼠，则需根据情况进行间歇性给药；给药原则为：给药后，当肿瘤组织停止生长时，就要停止给予吉非替尼灌胃；但当肿瘤组织开始变大恢复生长时则需再次给与吉非替尼灌胃治疗。从吉非替尼给药到停止给药记为治疗时间，而从吉非替尼停药后到肿瘤组织再次恢复生长记为停药时间，一个治疗时间和一个停药时间合成为一个治疗周期。

对于实验组小鼠而言，在初始阶段，一个治疗周期中，治疗时间大约为4~5天，停药时间大约为10天。但随着肿瘤组织的生长，每一个治疗周期中，治疗时间会越来越长，而停药时间会越来越短。

在最后一个周期中，持续每天给药的情况下肿瘤可以长至达到传代体积500mm³（直径约1cm）时，整个过程大概需要1~2个月；此时低剂量的诱导过程结束，即此时可以认为筛选获得的吉非替尼敏感的非小细胞癌PDX模型对低剂量的吉非替尼已经产生耐药性。

需要解释的是，耐药诱导过程中，不同来源的肿瘤组织对吉非替尼敏感性不同，部分来源的肿瘤组织在1~2个治疗周期内就会耐药，而部分来源则3~5个治疗周期才会耐药。

还需解释的是，本实施例中治疗终点的肿瘤体积大小为500mm³，然而不同的肿瘤组织终止治疗时体积有可能是不相同的，这是由肿瘤组织的个体差异所决定的；例如有些肿瘤组织达到1500mm³时质地还是好的，而有些肿瘤组织还没有达到500mm³时就会坏死；所以应在前三代密切观察肿瘤组织的生长周期和生长特点，以第三代的瘤组织的生长到最大而且没有坏死组织为终止治疗时的体积（本实施中所应用的肿瘤的生长体积临界点为500mm³）。

在低剂量诱导结束后，处死小鼠取出肿瘤组织，将部分肿瘤组织（称之为第一代吉非替尼耐药肿瘤组织）冻存，并将部分肿瘤组织按照传代过程进行小鼠传代，以用于后续吉非替尼耐药的诱导（此代小鼠称之为第二代吉非替尼治疗的小鼠）。

冻存方法：将组织切为切成直径5~6mm的组织块（约0.2~0.3g），将组织块放入事先盛有1mL冻存液的冻存管内，使冻存液充分覆盖组织；然后放入程序性冻存盒内，置入-80℃冰箱过夜，然后放入液氮中保存。

组织冻存液的配制：50%胎牛血清，40%L-15溶液，10%DMSO。

冻存组织复苏方法：液氮冷藏的肿瘤组织在应用植入小鼠前，需先经过组织复苏阶段，具体过程为：从液氮中取出冷冻的组织块，经37℃恒温水浴融化后，将组织块置于培养皿中，并用含有青霉素和链霉素的PBS清洗两次，然后即可采用皮下移植方式植入小鼠体内。

中剂量（50mg/kg）吉非替尼诱导过程

在将第一代吉非替尼耐药肿瘤组织植入小鼠后，定期观察记录小鼠体内肿瘤的生长过程，当第二代吉非替尼治疗小鼠肿瘤组织长到100~200mm³时，每两天灌胃给予中剂量吉非替尼（50mg/kg）溶液，并每天观察记录肿瘤组织大小和生长情况。

给药过程中同样采用间歇给药方式，即：当肿瘤组织停止生长时，就要停止给药；而当肿瘤组织长到300~400mm³时，再给予吉非替尼（50mg/kg）灌胃处理。

中剂量诱导过程中：在第一个治疗周期中，给药时间大约是6~10天（给药方式是：每两天给药，具体给药时间依据给药间隔计算，比如两天给药方式，治疗10天，则为第2、4、6、8、10天给药），停药时间大约是10~15天。

在经过2~4个治疗周期后，每两天灌胃方式的小鼠对50mg/kg的剂量已经开始产生耐受性（对此灌药方式的耐受标准为，在该种给药方式的情况下肿瘤生长不受给药剂量影响，肿瘤体积开始增大）；此时改变给药方式，增加给药次数，改为每天灌胃给予吉非替尼溶液（50mg/kg）治疗。

每天灌胃给予吉非替尼溶液治疗过程中，如前所述，同样采用间歇给药方式，即当肿瘤组织停止生长时，就要停止给药；而当肿瘤组织恢复生长时，再给予吉非替尼（50mg/kg）灌胃治疗。

需要解释的是，吉非替尼敏感的肿瘤组织对吉非替尼非常敏感，含有移植瘤的小鼠如果在吉非替尼耐药诱导初期即给予每日灌胃中高剂量的吉非替尼，则肿瘤组织会迅速缩小，不能够重新快速的恢复生长，因而在由相对低剂量吉非替尼诱导转换为相对高剂量吉非替尼诱导时，初始给药时采用间隔给药而非每天给药方式，这样可以减少吉非替尼对肿瘤生长的影响，利于其快速产生耐药性。

在每天灌胃给予吉非替尼溶液治疗过程中，随着瘤组织的生长，每一个治疗周期中，治疗时间会越来越长，停药时间会越来越短。在最后一个周期中，每天灌胃给予小鼠吉非替尼（50mg/kg）情况下，肿瘤组织仍会生长达到500mm³左右，此时，即可认为吉非替尼敏感的非小细胞癌PDX模型的肿瘤组织对中剂量（50mg/kg）的吉非替尼产生了耐药性。

上述中剂量（50mg/kg）吉非替尼耐药诱导过程大致为3-4个月左右。

在中剂量（50mg/kg）诱导耐药后，处死小鼠取出肿瘤组织，将部分肿瘤组织（称之为第一代吉非替尼耐药肿瘤组织）冻存（冻存及复苏参考前述低剂量诱导过程），并将部分肿瘤组织按照传代过程进行小鼠传代，以用于后续吉非替尼耐药的诱导（此代小鼠称之为第三代吉非替尼治疗的小鼠）

高剂量（100mg/kg）吉非替尼诱导过程

将第二代吉非替尼耐药肿瘤组织植入小鼠后，定期观察记录小鼠体内肿瘤的生长过程，当第三代吉非替尼治疗小鼠肿瘤组织长到100~200mm³时，每三天灌胃给予高剂量吉非替尼（100mg/kg）溶液，并每天观察记录肿瘤组织大小和生长情况。

需要解释的是，随着治疗药物浓度的增高，增加剂量的时候需要特别注意给药方式，不宜开始时即直接每天给药，由于吉非替尼在非小细胞癌治疗中的特殊作用，开始时如果直接每天给药方式会造成肿瘤迅速缩小，从而无法获得较好的耐药诱导效果，所以药物剂量越高，初始给药间隔也宜越长，然后当肿瘤对这种间隔较长方式产生耐受性后，缩短给药间隔时间，直至肿瘤对每天给药方式产生耐受性，从而逐步肿瘤逐步获得稳定的耐药性。

每三天给药方式治疗小鼠肿瘤时，初期小鼠肿瘤会较为迅速的缩小，当瘤组织小于200mm³时，就要停止给药；但当瘤组织恢复生长到300mm³甚至更大时，则需重新开始给予吉非替尼高剂量治疗。

在每三天给药方式治疗过程中，第一个治疗周期中，给药时间大约是10~15天（具体给药时间参考中剂量给药计算方法），未给药时间大约是15~20天。在经过1~3个治疗周期后，小鼠对每三天给药方式的高剂量吉非替尼产生耐药性（耐药性判定标准同中剂量诱导过程）；此时改为每两天给与高剂量吉非替尼的治疗方式对小鼠灌胃处理。同样，经过1~3个治疗周期后，在小鼠对每两天给药方式的高剂量吉非替尼治疗产生耐药性后，改为每天给药方式的高剂量吉非替尼治疗。当小鼠在每天给与高剂量吉非替尼治疗时，肿瘤体积仍然生长达到500mm³时，即可认为非小细胞癌吉非替尼耐药PDX模型构建完成。

上述高剂量吉非替尼诱导过程需要时间大约为3~4个月时间。

将上述对高剂量吉非替尼耐药的小鼠处死，解剖，取出肿瘤组织冻存（冻存及复苏参考低剂量诱导过程）或重新植入小鼠后，即可用于进一步的吉非替尼耐药机制的研究工作。

为进一步验证所构建的非小细胞癌吉非替尼耐药PDX模型是否成功，可将肿瘤组织重新植入小鼠后进行实际验证。验证时分为对照组和吉非替尼耐药验证组。对照组灌胃生理盐水，定期测量瘤组织大小，并绘制肿瘤组织生长曲线。吉非替尼耐药验证组，每天按照高剂量（100mg/kg）给药方式给与吉非替尼灌胃处理，定期测量瘤组织大小，并绘制肿瘤组织生长曲线。当对照组和吉非替尼耐药验证组的肿瘤组织生长曲线一致时，即可认定非小细胞肺癌吉非替尼耐药移植瘤模型构建成功。

为获得更为稳定和可靠的移植瘤模型，可将上述构建成功的非小细胞肺癌吉非替尼耐药移植瘤进行三次以上小鼠传代，这样所得到的非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型就会非常稳定，可以用于吉非替尼耐药机制的研究。

检验例

为进一步确认本发明所构建的非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的技术效果，发明人进行了进一步的检验评估，简要介绍如下。

耐药后的移植瘤与吉非替尼敏感（不耐药）的母体移植瘤的生长情况的对比

对所获得的非小细胞癌吉非替尼耐药PDX模型中的肿瘤组织和其诱导前的人来源的肿瘤组织样本，分别植入SCID小鼠，定期测量肿瘤生长情况，并绘制肿瘤生长曲线。结果如图4所示。

从图中可以看出，耐药后的肿瘤组织的生长周期要比不耐药的肿瘤组织的生长周期要短，及耐药后肿瘤组织生长速度较快。

耐药后的移植瘤与吉非替尼敏感（不耐药）的母体移植瘤的组织学类型和免疫组织分析对比

对所获得的非小细胞癌吉非替尼耐药PDX模型中的肿瘤组织和其诱导前的人来源的肿瘤组织样本，其组织学类型和免疫组织化学分析对比情况如图6所示。

从图6中可以看出，两者的组织学类型相同，免疫组织化学阳性指标是相同的，说明吉非替尼耐药后的肿瘤组织基本保持了原代病人的病理特征。

耐药后的移植瘤与吉非替尼敏感（不耐药）的母体移植瘤的EGFR基因和c-met基因的对比

吉非替尼耐药前肿瘤组织的EGFR基因是L858R突变，而吉非替尼耐药后肿瘤组织则是野生型（即本申请所构建的PDX模型），具体如图7所示。

c-met基因扩增在吉非替尼耐药前移植瘤中是阴性的，而在吉非替尼诱导耐药后移植中是阳性的，具体如图8。

该基因型的变化，说明此移植瘤已经由吉非替尼敏感性移植瘤转变为了吉非替尼耐药性移植瘤，说明在发生吉非替尼耐药过程中，基因突变发生了重组。

Claims (3)

1.一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）首先构建非小细胞肺癌PDX模型，具体为：

首先，获得非小细胞肺癌病人的组织样本；其次，将所获得的人来源的非小细胞癌肿瘤样本处理后，植入SCID小鼠；当肿瘤被稳定传代至三代或三代以上时则认为该非小细胞肺癌PDX模型构建成功；

（2）对步骤（1）中所构建的非小细胞肺癌PDX模型进行评价，筛选出吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型；具体为：

首先，对所构建的非小细胞肺癌PDX模型中肿瘤生长界限进行记录和判定，所述肿瘤生长界限即移植瘤在小鼠体内生长时坏死或者出现液化现象时的肿瘤体积临界值；

其次，对所构建的非小细胞肺癌PDX模型中肿瘤进行病理学和免疫组化染色评价；

最后，对所构建的非小细胞肺癌PDX模型中肿瘤的EGFR基因进行突变检测；根据EGFR突变情况筛选出吉非替尼敏感的非小细胞癌PDX模型，

（3）构建非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型，具体为：

对步骤（2）中筛选获得的吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型，给予吉非替尼灌胃处理，剂量从10~100mg/kg逐步增加给药，从而诱导获得非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型。

2.如权利要求1所述非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法，其特征在于，步骤（2）中对吉非替尼敏感的非小细胞癌PDX模型中的EGFR基因突变类型有：L858R、L861Q、G719C或Exon19缺失。

3.如权利要求1所述非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法，其特征在于，步骤（3）中的吉非替尼灌胃处理耐药诱导过程包括低剂量10mg/kg诱导、中剂量50mg/kg诱导、高剂量100mg/kg诱导三个过程。