CN103415770B - Nnmt作为慢性阻塞性肺病(copd)的标志物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种帮助评估慢性阻塞性肺病（=COPD）的体外方法。它公开蛋白质NNMT作为COPD标志物的用途。而且，它尤其涉及一种用于自衍生自个体的样品评估COPD的方法，其通过在体外测量所述样品中的蛋白质NNMT来进行。

Description

NNMT作为慢性阻塞性肺病(COPD)的标志物

发明领域

本发明涉及一种帮助评估慢性阻塞性肺病（=COPD）的体外方法。它公开蛋白质NNMT作为COPD标志物的用途。而且，它尤其涉及一种用于自衍生自个体的样品评估COPD的方法，其通过在体外测量所述样品中的蛋白质NNMT来进行。

发明背景

慢性阻塞性肺病（COPD）是一种特征在于慢性炎症和不可逆气流阻塞及比正常要快的肺功能参数FEV1下降的疾病。这导致出入肺的气流受限，引起呼吸短促。该疾病具有两个主要的病理方面，即慢性支气管炎（特征在于来自导引气道的粘液分泌过多）和肺气肿（特征在于肺泡中的破坏性变化）。在临床实践中，COPD通过它在肺功能测试上的特征性低气流来定义（Nathell，L.，et al.，Respiratory Research8(2007)89）。与哮喘形成对比，这种限制可逆性较差且通常随时间变得日益更差。

COPD排在1990年全世界死亡主导原因的第六位。由于许多国家的人口统计学变化和吸烟率的升高，预计它到2030年成为全世界死亡主导原因的第四位（Mathers，C.D.，et al.，PLoS Med.3(2006)e442）。COPD是美国死亡主导原因的第4位，而且COPD在2007年在美国在卫生保健花费和生产力损失方面的经济负担是426亿美元。

COPD是由有害颗粒或气体引起的，最常见来自吸烟，它在肺中触发异常炎症应答（Rabe，K.F.，et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.176(2007)532-555及Hogg，J.C.，et al.，N.Engl.J.Med.350(2004)2645-2653）。更大气道中的炎症应答称作慢性支气管炎，当人们经常咳出痰时在临床上做出它的诊断。在肺泡中，炎症应答引起对肺组织的破坏，即称作肺气肿的过程。COPD的天然过程特征在于症状的偶尔突然恶化（称作急性加重），其大多数由感染或空气污染引起。

COPD的许多症状由其它呼吸疾病（诸如哮喘、支气管炎、肺纤维化和结核）分享。COPD诊断的当前黄金标准要求肺功能测试（肺活量测定法），这是一种费时且昂贵的规程，只能由专科肺内科医师实施。例如，肺活量测定法测试高度依赖于患者合作和努力，而且在正常情况下重复至少三次来确保再现性。

慢性支气管炎可以通过询问患者他们是否具有“排痰性咳嗽”（即产生痰的咳嗽）来诊断。

哮喘与COPD的区别在于它的致病和治疗应答，而且因此应当认定为一种不同的临床实体。然而，一些哮喘患者发生可逆性较差的气流限制，这当前与COPD患者不可辨别，但是出于实用目的作为哮喘来治疗。哮喘和COPD在一般群体中的高流行程度导致这两种疾病实体在许多个体中共存。这表征为显著的气流限制和对支气管扩张剂的较大响应。在这些患者中，一秒钟用力呼气体积（FEV1）没有回到正常且常常随时间恶化。

已知哮喘患者中的CRP血清水平与正常对照相比显著更高（Fujita，M.，etal.，Ann.Allergy Asthma Immunol.99(2007)48-53）。CRP响应多种传染性和炎性状况而升高，因此它不是COPD特异性的（Donaldson，G.C.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.175(2007)209-210）。因此，CRP没有达到关于对COPD筛选工具要求的诊断精确性的标准。

当前的COPD检测方法（即肺活量测定法）看来不适合用作一般筛选工具。肺活量测定法非常昂贵、费时且是卫生保健***对筛选大量受试者中的一般和广泛使用负担不了的。而且，它的结果强烈依赖于患者的服从。

本领域中描述了在COPD中也观察到肺的多个部分中嗜中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞（具体是CD8+）的增多，这些与气流限制的程度有关（Saetta，M.，et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.157(1998)822-826）。一些患者中可以有嗜酸性粒细胞的增多，特别是加重期间（Saetta，M.，et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.150(1994)1646-1652及Saetta，M.，et al.，Clin.Exp.Allergy26(1996)766-774）。这些炎症细胞能够释放多种细胞因子和炎症介导物，最值得注意的是白三烯-4、白介素-8和TNF-α。这种炎症样式与在支气管哮喘患者中看到的显著不同。炎症变化可持续到戒烟之后。不知道解释这种炎症应答在刺激性事件缺失下的永存性的机制。

如此，本发明的一个目标是提供一种简单且划算的COPD评估规程，例如用于鉴定怀疑具有COPD的个体。为了这个目的，必须找到循环中存在的、在体液（例如血液、血清或血浆）中可检测的一般COPD标志物。

为了有临床效用，作为单一标志物的新诊断标志物应当与本领域已知的其它标志物相当或更好。或者，无论是单独使用还是与一种或多种其它标志物组合使用，新标志物应当导致诊断灵敏度或特异性的改进。测试的诊断灵敏度或特异性通过它的接受者操作特征（receiver-operating characteristics）得到最好地评估，这会在下文中详细描述。

全血、血清或血浆是临床程序中样品的最广泛使用来源。会有助于可靠COPD检测或提供早期预后信息的早期COPD标志物的鉴定能导致会大大有助于诊断和管理这种疾病的方法。因此，改进COPD的体外评估存在迫切的临床需要。改进COPD的早期诊断尤其重要，因为对于在CODP早期阶段诊断的患者，肺损害可逆性的机会与那些在进展更多的疾病阶段诊断的患者相比要高得多。

本领域需要鉴定COPD疾病状态的可靠且直接指标（例如替代标志物），用于可靠地辨别COPD的症状与上文所述其它呼吸疾病的症状，及预测疾病严重性的变化、疾病进展和对药物的响应。

本发明的目标是调查是否能鉴定可用于体外评估COPD的生化标志物。特别地，本发明的发明人调查了是否能鉴定用于在体液样品中评估COPD的生化标志物。

发明概述

现在已经发现蛋白质NNMT的使用至少能部分克服当前已知的可用于评估COPD的方法的一些问题。

令人惊讶地，在本发明中发现体外测定样品中蛋白质NNMT的浓度容许评估COPD。在这个背景中发现自个体获得的此类样品中所述蛋白质NNMT的浓度与蛋白质NNMT参照浓度相比升高指示COPD的存在。

本文中公开一种用于评估COPD的体外方法，其包括通过免疫学检测方法测定体液样品中蛋白质NNMT的浓度并在评估COPD中使用测定得到的结果，特别是测定得到的浓度。

本发明还涉及一种用于在受试者中评估慢性阻塞性肺病（COPD）的体外方法，其包括a）测定样品中蛋白质NNMT的浓度，并b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，其中高于参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD。

在又一个实施方案中，本发明涉及蛋白质NNMT在样品中体外评估COPD中的用途，其中高于蛋白质NNMT参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD。

还公开包括蛋白质NNMT和一种或多种其它COPD标志物的标志物组在样品中体外评估COPD中的用途，其中高于蛋白质NNMT参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD。

在又一个实施方案中，本发明涉及依照本发明评估COPD的体外方法用于区分COPD与其它类型肺病（优选哮喘）的用途。

在又一个实施方案中，本发明涉及一种用于实行依照本发明评估COPD的体外方法的诊断装置。

还提供一种用于实施依照本发明评估COPD的体外方法的试剂盒，其包括特异性测定蛋白质NNMT的浓度需要的试剂。

鉴于下面的详细描述，本发明别的方面和优点会是明显的。然而，应当理解，详细描述和具体实施例，虽然指出本发明的优选实施方案，但是仅仅作为例示给出，因为根据此详细描述，本发明的精神和范围之内的各种变化和变更对本领域技术人员会变得明显。

发明详述

令人惊讶地，本发明的发明人能够证明标志物蛋白质NNMT可用于评估COPD。由于通过现有技术方法将肺损害（尤其是COPD）的各个阶段分类的不确定性，完全有可能的是蛋白质NNMT将来可能成为评估COPD患者的关键标准之一。

本发明的方法适合于评估COPD。发现了样品中与正常对照相比升高的蛋白质NNMT浓度指示COPD。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于在受试者中评估慢性阻塞性肺病（COPD）的体外方法，包括：a）测定样品中蛋白质NNMT的浓度，并b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，其中高于参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD。

在又一个实施方案中，本发明涉及一种用于在受试者中评估慢性阻塞性肺病（COPD）的体外方法，包括：a）测定体液样品中蛋白质NNMT的浓度，并b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，其中高于参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD的存在。

ASC，“含有胱天蛋白酶相关募集域的凋亡相关斑点样蛋白”也称作“甲基化诱导的沉默的靶物1”（TMS1）（Swiss-PROT：Q9ULZ3）。就本发明而言，特征在于SEQ ID NO:1中给出的序列，ASC蛋白质是一种22kDa蛋白质。胱天蛋白酶相关募集域（CARD）介导衔接蛋白（诸如APAF1（凋亡蛋白酶活化因子1））和参与凋亡的胱天蛋白酶（例如CASP9）的原形式（pro-form）之间的相互作用。ASC是包括CARD的衔接蛋白家族的一个成员。在WO2006/105252中显示了ASC（=CARD-9）的基因表达水平指示COPD的诊断。

ARMET（富含精氨酸的，在早期肿瘤中突变的，ARP，Swiss-PROT ID：P55145）蛋白质的生物学作用和功能仍然在很大程度上难以捉摸。就本发明而言，特征在于SEQ ID NO:2中给出的序列，ARMET蛋白质是一种20.3kDa蛋白质。ARMET蛋白质由179个氨基酸组成且携带预测的信号序列（aa1-21）。对应的基因位于染色体条带3p21.1中，而且由Shridhar等人首次表征（Shridhar，V.，et al.，Oncogene12(1996)1931-1939）。该基因高度保守且可见于多种哺乳动物物种，像大鼠、小鼠、牛、和仓鼠。ARMET如此命名是因为初始研究提示ARMET在N端要长出50个氨基酸，携带富含精氨酸的区域（Shridhar，V.，et al.，Oncogene12(1996)1931-1939；Shridhar，R.，et al.，CancerRes.56(1996)5576-5578；Shridhar，V.，et al.，Oncogene14(1997)2213-2216）。然而，更多最近的研究指示不编码精氨酸束的更小可读框的转录证据（Tanaka，H.，et al.，Oncol.Rep.7(2000)591-593；Mizobuchi，N.，et al.，CellStruct.Funct.32(2007)41-50）。凭借对应的蛋白质大小修正，初始描述的突变密码子（ATG50）现在鉴定为初始密码子。Petrova等人（Petrova，P.，et al.，J.Mol.Neurosci.20(2003)173-188）自大鼠中脑1型星形胶质细胞细胞系的条件化培养基纯化了ARMET基因产物，并将其命名为MANF（中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子）。更多最近的研究证明了ARMET通过“解折叠蛋白质应答”（UPR）（一旦错误折叠蛋白质在内质网（ER）中积累就被激活的一种过程）而上调（Tanaka，H.，et al.，Oncol.Rep.7(2000)591-593；Apostolou，A.，et al.，Exp.Cell Res.314(2008)2454-2467）。基于这项研究，ARMET被表征为UPR的适应性途径的一种新型分泌型介导物。

就本发明而言，特征在于SEQ ID NO:3中给出的序列，NNMT（烟酰胺N-甲基转移酶；Swiss-PROT：P40261）蛋白质是一种29.6kDa蛋白质且具有5.56的等电点。NNMT催化烟酰胺和其它吡啶的N-甲基化。这种活性对于多种药物和异型生物质化合物的生物转化是重要的。已经报告了该蛋白质在肝中优势表达且位于胞质中。NNMT已经自来自人肝的cDNA克隆且含有792个核苷酸的可读框，其编码264个氨基酸的蛋白质，计算分子量为29.6kDa（Aksoy，S.，et al.，J.Biol.Chem.269(1994)14835-14840）。文献中关于该酶在人COPD中的潜在作用知道得很少。观察到NNMT在COPD患者的骨骼肌细胞中的更高mRNA表达（Kim，H.C.，et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.181，pp.797-805）。在一项研究中已经显示了NNMT是肺癌（LC）的有用生物标志物（Tomida，M.，et al.，J.Cancer Res.and Clin.Onc.，135(2009)1223-1229）。在所述研究中，已经发现NNMT的血清水平在LC患者中比在COPD患者和健康供体中要显著更高。

就本发明而言，特征在于SEQ ID NO:4中给出的序列，Flap内切核酸酶-1蛋白（=FEN1，FEN-1），Swiss-PROT ID：P39748是一种380个氨基酸的核蛋白，分子量42.6kDa。人FEN1的编码区是由Murray在1994年（Murray，J.M.，et al.，Mol.Cell.Biol.14(1994)4878-4888）自一种新克隆的序列预测的。基于酵母同系物rad2的功能，提议在高保真染色体分离中及在UV诱导的DNA损害的修复中的功能。因为这些是染色体完整性中的基本过程，所以作者还提议该蛋白质涉及癌症避免。稍后由Hiraoka等人（Hiraoka L.R.，et al.，Genomics25(1995)220-225）和Taylor等人（Taylor，T.D.，et al.，Nature440(2006)497-500）鉴定了人染色体11上的基因座。FEN1的功能及其与DNA的相互作用已经成为众多研究的焦点（Robins，P.，et al.，J.Biol.Chem.269(1994)28535-28538；Shen，B.，et al.，J.Biol.Chem.271(1996)9173-9176；Hasan，S.，etal.，Mol.Cell7(2001)1221-1231；Qiu，J.，et al.，J.Biol.Chem.277(2002)24659-24666及Sakurai，S.，et al.，EMBO J.24(2005)683-693）。已经证明了在DNA代谢中的数项酶功能，包括切割当DNA聚合酶遭遇下游Okazaki片段5'端时通过置换合成而生成的5'-悬垂flap结构的内切核酸酶活性。另外，FEN1还拥有针对带缺刻或带缺口的双链DNA的5'至3'外切核酸酶活性，而且展现RNA酶H活性。Shen等人（Shen，B.，et al.，BioEssays27(2005)717-729）或Liu等人（Liu，Y.，et al.，Annu.Rev.Biochem.73(2004)589-615）综述了这些。

就本发明而言，AP内切核酸酶（APEX1，APEX-1）（Swiss-Prot.P27695）特征在于SEQ ID NO:5中给出的序列。未加工的前体分子由318个氨基酸组成且具有35.6kDa的分子量。APEX1涉及DNA修复且切除DNA链的无嘌呤或无嘧啶位点。此类无碱基位点自发地或经由化学剂或通过清除特定异常碱基的DNA糖基化酶相对频繁生成。

AP位点是能阻止正常DNA复制的前诱变损害，因此细胞含有鉴定和修复此类位点的***（Barzilay，G.，and Hickson，I.D.，Bioessays17(1995)713-719）。阐明了3D结构，而且鉴定了涉及内切核酸酶活性的氨基酸（Barizilay，G.，et al.，Nature Structural Biology2(1995)561-567；Gorman，M.A.，et al.，EMBO Journal16(1997)6548-6558；Beernink，P.，et al.，J.Mol.Biol.307(2001)1023-1034）。APEX1还是多种转录因子（诸如c-Fos、c-Jun、NF-KB和HIF-1）的氧化还原调节剂。这种活性似乎独立于内切核酸酶活性。两种功能位于该蛋白质的不同结构域上（Barzilay，G.，and Hickson，I.D.，Bioessays17(1995)713-719）。蛋白质激酶C对APEX1的磷酸化提高氧化还原活性，而未磷酸化形式涉及DNA修复（Yacoub，A.，et al.，Cancer Res.57(1997)5457-5459）。Rush等人（Rush，J.，et al.，Nature Biotech.23(2005)94-101）鉴定了一个磷酸化位点，Y261（依照Swissprot序列）。

就本发明而言，表面表达蛋白酶（Seprase），也称作成纤维细胞激活蛋白（=FAP），是一种具有明胶酶和二肽基肽酶活性的170kDa糖蛋白，由两个相同的单体Seprase单元组成（Pineiro-Sanchez，M.L.，et al.，J.Biol.Chem.272(1997)7595-7601；Park，J.E.，et al.，J.Biol.Chem.274(1999)36505-36512）。人膜结合Seprase蛋白的单体包含760个氨基酸且显示于SEQ ID NO：6。人Seprase预测具有成纤维细胞胞质内的头4个N端残基，接着是21个残基的跨膜域，然后是734个残基的胞外C端催化域（Goldstein，L.A.，et al.，Biochim.Biophys.Acta.1361(1997)11-19；Scanlan，M.J.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(1994)5657-5661）。本领域技术人员知道人Seprase蛋白的一种较短形式，即可溶性Seprase或循环抗纤溶酶切割酶（=APCE）（Lee，K.N.，et al.，Blood103(2004)3783-3788；Lee，K.N.，et al.，Blood107(2006)1397-1404），其包含来自Swissprot数据库登录号Q12884的氨基酸位置26-760。可溶性Seprase的二聚体是一种160kDa糖蛋白，由两个相同的单体可溶性Seprase蛋白单元组成。等人（见上文）发现升高的Seprase表达与人黑素瘤和癌瘤细胞的侵入性表型有关联。Henry等人（Henry，L.R.，et al.，Clin.Cancer Res.13(2007)1736-1741）描述了具有高水平基质Seprase的人结肠肿瘤患者更有可能具有攻击性疾病进展和转移或复发的潜在发生。

就本发明而言，人二肽基肽酶IV（=DPPIV），也称作CD26，是一种110kDa细胞表面分子。人DPPIV蛋白的氨基酸序列包含766个氨基酸且显示于SEQ ID NO：7（Swissprot数据库登录号P27487）。它含有内在二肽基肽酶IV活性，自在第三个氨基酸位置具有脯氨酸或丙氨酸的肽选择性消除N端二肽。它与多种胞外分子相互作用，而且还涉及胞内信号转导级联。人DPPIV的多功能活性取决于细胞类型和胞内或胞外条件，它们影响它作为蛋白水解酶、细胞表面受体、共刺激相互作用蛋白和信号转导介导物的作用。人DPPIV具有较短的胞质域（氨基酸位置1-6）、跨膜区（氨基酸位置7-28）、和具有内在二肽基肽酶IV（DPPIV）活性的胞外域（氨基酸位置29-766）。人可溶性二肽基肽酶IV（=可溶性DPPIV）氨基酸序列包含来自Swissprot数据库登录号P27487的氨基酸位置29-766。可溶性DPPIV的二聚体是一种170kDa糖蛋白，由两个相同的单体可溶性DPPIV单元组成。

就本发明而言，“可溶性DPPIV/Seprase蛋白质复合物”（=DPPIV/Seprase）指可溶性DPPIV同二聚体（170kDa）和可溶性Seprase同二聚体（160kDa）形成的可溶性复合物，分子量330kDa。在某些条件下，这种复合物可形成具有660kDa分子量的双重复合物。

对熟练技术人员显而易见的，本发明不应解释为限于SEQ ID NO:3之全长蛋白质NNMT。本发明还涵盖蛋白质NNMT的生理或人造片段、蛋白质NNMT的次级修饰、以及蛋白质NNMT的等位变体。多肽的变体由相同基因编码，但是它们的等电点（=PI）或分子量（=MW）或二者可以不同，例如由于可变mRNA或前mRNA加工。变体的氨基酸序列与对应标志物序列95%或更多相同。人造片段优选涵盖合成或通过重组技术生成的肽，其至少包含一个有诊断兴趣的表位，由自SEQ ID NO:3中公开的序列衍生的至少6、7、8、9或10个连续氨基酸组成。此类片段可有利地用于生成抗体或用作免疫测定法中的标准品。

看来现有技术不知道体液中蛋白质NNMT的存在或水平在评估COPD中具有诊断效用。本发明的发明人现在发现且能确立升高的蛋白质NNMT浓度（自衍生自个体的体液样品测定）指示COPD。

除非另外指明，本发明的实施会采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学、和免疫学的常规技术，它们在本领域的技术之内。文献中完整解释了此类技术，诸如Sambrook，et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，second edition，(1989)；Gait，M.J.，(ed.)OligonucleotideSynthesis(1984)；Freshney，R.I.，(ed.)，Animal Cell Culture(1987)；Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.)；Ausubel，F.M.，et al.，(eds.)，CurrentProtocols in Molecular Biology(1987)及定期更新；Mullis，et al.，(eds.)PCR:The Polymerase Chain Reaction(1994)。

除非另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员普通理解相同的含义。Singleton，et al.，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology，2nd ed.，John Wiley&Sons，New York，N.Y.(1994)；March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure，4thed.，John Wiley&Sons，New York，N.Y.(1992)；Lewin，B.，Genes V，publishedby Oxford University Press(1994)，ISBN0-19-8542879；Kendrew，J.，et al.，(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，published by Blackwell ScienceLtd.(1994)，ISBN0-632-02182-9；及Meyers，R.A.，(ed.)，Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference，published by VCH Publishers，Inc.(1995)，ISBN1-56081-5698)给本领域技术人员提供了对本申请中使用的许多术语的一般指导。

如本文中使用的，下面的每项术语具有此部分中与其有关的意义。

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个/种或超过一个/种（即至少一个/种）该冠词的语法对象。举例而言，“一种标志物”表示一种标志物或超过一种标志物。术语“至少”用于指示任选可以存在一个/种或超过一个/种别的对象。

表述“一个/种或多个/种”指1-50，优选1-20，还优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、或15个/种。

如本文中使用的，术语“标志物”或“生化标志物”指作为靶物用于分析个体的测试样品的分子。在一个实施方案中，此类分子靶物的例子是蛋白质或多肽。用作本发明中的标志物的蛋白质或多肽包括所述蛋白质的天然存在变体以及所述蛋白质或所述变体的片段，特别是免疫学可检测片段。免疫学可检测片段优选包含所述标志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域技术人员会认识到，例如，在炎症期间，由细胞释放的或胞外基质中存在的蛋白质可能受到损伤，而且可能被降解或切割成此类片段。某些标志物以无活性形式合成，其随后可以通过蛋白水解来活化。正如熟练技术人员会领会的，蛋白质或其片段也可以作为复合物的一部分存在。就本发明而言，此类复合物也可以用作标志物。

如本文中使用的，术语“标记物”指任何能够经直接或间接检测产生信号的物质。

对于直接检测，可以自任何已知可检测标志物基团选择适合在本发明中使用的标记基团或标记物，但不限于色原体、荧光、化学发光基团（例如吖啶酯或二氧杂环丁烷（dioxetane））、电化学发光化合物、催化剂、酶、酶的底物、染料、荧光染料（例如荧光素、香豆素、若丹明、口恶嗪、试卤灵、花青及其衍生物）、胶态金属和非金属颗粒、和有机聚合物胶乳颗粒。标记基团的其它例子是发光金属复合物（诸如钌或铕复合物）、酶（例如用于ELISA）、和放射性同位素。

例如，间接检测***包括用生物亲和结合对的第一配偶标记的检测试剂（例如检测抗体）。合适的结合对的例子是半抗原或抗原/抗体、生物素或生物素类似物（诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素）/亲合素或链霉亲合素、糖/凝集素、核酸或核酸类似物/互补核酸、及受体/配体（例如类固醇激素受体/类固醇激素）。优选的第一结合对成员包括半抗原、抗原和激素。尤其优选半抗原，像地高辛和生物素及其类似物。通常标记此类结合对的第二配偶（例如抗体、链霉亲合素、等）以容许直接检测，例如通过上文所述标记物。

另外/或者，标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。优选的翻译后修饰是糖基化、酰化、或磷酸化。

术语“评估慢性阻塞性肺病”或“评估COPD”用于指示依照本发明的方法单独地或与其它标志物或变量一起会例如帮助内科医师建立或确认COPD的缺失或存在。例如，该方法对于建立或确认COPD的缺失或存在会是有用的。

就本发明而言，“COPD标志物”指作为单一标志物或与标志物NNMT组合，在评估COPD中对调查中的诊断问题添加有关信息的标志物。对于评估COPD，如果在给定特异性时的灵敏度或在给定灵敏度时的特异性分别可以通过将所述标志物纳入已经包括标志物NNMT的标志物组（标志物组合）来改进，那么该信息认定是有关的或具有附加价值。优选地，灵敏度或特异性的改进在p=0.05、0.02、0.01或更低的显著性水平上分别是统计显著的。

如本文中使用的，术语“样品”或“测试样品”指出于体外评估目的自个体获得的生物学样品。在本发明的方法中，在本发明的一个实施方案中，样品或患者样品可以包括任何体液。优选的样品是体液，诸如血清、血浆、或全血，血清或血浆是最优选的。

在体外在适宜样品中测定蛋白质NNMT，特别是蛋白质NNMT的可溶性形式。优选地，样品衍生自人受试者，例如COPD患者或有COPD风险的人或怀疑具有COPD的人。还优选在血清或血浆样品中测定蛋白质NNMT。

如本文中使用的，术语“参照样品”指自表观健康个体的参照群提供的、用于体外评估目的的生物学样品。如本文中使用的，术语“参照浓度”指在表观健康个体的参照群中建立的值。

本领域技术人员知道，会将依照本发明方法的步骤（a）的测量结果与参照浓度比较。此类参照浓度可以使用阴性参照样品、阳性参照样品、或包括一种或超过一种这些类型对照的混合参照样品来测定。阴性参照样品优选会包括来自不吸烟者、没有诊断COPD的对照吸烟者、哮喘的样品或其各种组合。阳性参照样品优选会包括来自有诊断COPD的受试者的样品。

无论如何，表述“将测定得到的浓度与参照浓度比较”仅仅用于进一步例示对熟练技术人员显而易见的内容。在对照样品中建立参照浓度。对照样品可以是内部或外部对照样品。在一个实施方案中，使用内部对照样品，即在测试样品中以及在自同一受试者采集的一份或多份其它样品中评估标志物水平以确定所述标志物的水平是否存在任何变化。在另一个实施方案中，使用外部对照样品。对于外部对照样品，将自个体衍生的样品中标志物的存在或量与其在已知患有给定状况或已知有给定状况风险的个体或已知没有给定状况的个体（即“正常个体”）中的存在或量比较。例如，可以将患者样品中的标志物水平与已知与特定COPD过程相关的水平比较。通常，直接或间接地将样品的标志物水平与诊断关联起来，而且例如使用标志物水平来确定个体是否有COPD风险。或者，例如，可以将样品的标志物水平与已知与COPD患者中对治疗的响应、COPD的诊断、选择针对COPD的适宜药物的指导、判断疾病进展风险、或跟踪COPD患者相关的标志物水平比较。根据目的诊断用途，选择适宜的对照样品并在它们中为标志物建立对照或参照值。熟练技术人员会领会，在一个实施方案中，自年龄匹配的且没有混淆疾病的参照群体获得此类对照样品。正如熟练技术人员也会清楚的，在对照样品中建立的绝对标志物值会依赖于所使用的测定法。优选使用来自100名表征较好的个体（来自适宜参照群体）的样品来建立对照（参照）值。还优选参照群体可以选择成由20、30、50、200、500或1000名个体组成。健康个体代表用于建立对照值的一种优选参照群体。

术语“测量”或“测定”优选包括定性、半定量或定量测量。在本发明中，在体液样品中测量蛋白质NNMT。在一个优选实施方案中，测量是半定量测量，即测定蛋白质NNMT的浓度是否高于或低于截留值。正如熟练技术人员会领会的，在是（存在）或否（缺失）测定法中，测定法灵敏度通常设置成与截留值匹配。

例如，使用在对照组或对照群体中为蛋白质NNMT测定的值来建立截留值或参照范围。高于此类截留值或在其较高端在参照范围以外的值认定为升高的或指示COPD的存在。

在一个实施方案中，建立固定的截留值。选择此类截留值来匹配感兴趣的诊断问题。

在一个实施方案中，截留设置为导致特异性90%，还优选截留设置为导致特异性95%，或者还优选截留设置为导致特异性98%。

在一个实施方案中，截留设置为导致灵敏度90%，还优选截留设置为导致灵敏度95%，或者还优选截留设置为导致灵敏度98%。

在一个实施方案中，使用在对照组或对照群体中为蛋白质NNMT测定的值来建立参照范围。在一个优选实施方案中，如果测定值高于参照范围的90%百分位，那么认为蛋白质NNMT的浓度是升高的。在又一些优选实施方案，如果测定值高于参照范围的95%百分位、96%百分位、97%百分位或97.5%百分位，那么认为蛋白质NNMT的浓度是升高的。

例如，高于截留值的值可以指示COPD的存在。例如，低于截留值的值可以指示COPD的缺失。

在又一个优选实施方案中，蛋白质NNMT的测量是定量测量。在又一些实施方案中，将蛋白质NNMT的浓度与根本的诊断问题关联起来。

在某些设置中，自已经确认COPD的患者提供的样品可用作阳性对照样品，而且优选与要调查的样品平行测定。在此类设置中，阳性对照样品中标志物蛋白质NNMT的阳性结果指示测试规程在技术水平上起作用。

正如熟练技术人员会领会的，任何此类评估在体外进行。之后丢弃样品（测试样品）。样品仅仅用于本发明的体外诊断方法，而且不将样品的材料转移回患者的身体中。典型地，样品是体液样品，例如血清、血浆、或全血。

依照本发明的方法基于自个体获得的液体或体液样品且基于此类样品中蛋白质NNMT的体外测定。如本文中使用的，“个体”指单个人或非人生物体。如此，本文中描述的方法和组合物适用于人和兽疾病二者。优选地，个体、受试者、或患者指人类。

优选地，在体外通过使用特异性结合剂自液体样品特异性测定标志物蛋白质NNMT。

在依照本发明的一个优选实施方案中，测定蛋白质NNMT的浓度。在一个实施方案中，在体外通过使用特异性结合剂自样品特异性测定标志物蛋白质NNMT的浓度。

特异性结合剂是例如蛋白质NNMT的受体、结合蛋白质NNMT的凝集素、针对蛋白质NNMT的抗体、针对蛋白质NNMT的肽抗体（peptidebody）、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。特异性结合剂对它的对应靶分子至少具有10⁷l/mol的亲和力。特异性结合剂对它的靶分子优选具有10⁸l/mol或还优选10⁹l/mol的亲和力。

正如熟练技术人员会领会的，术语特异性用于指示样品中存在的其它生物分子没有显著结合对SEQ ID NO:3之蛋白质NNMT序列特异性的结合剂。优选地，对靶分子以外的生物分子的结合水平所导致的结合亲和力至多是对靶分子的亲和力的只有10%或更少、只有5%或更少、只有2%或更少或只有1%或更少。优选的特异性结合剂会满足上述亲和力以及特异性最小标准二者。

特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体（参见Hey，T.，et al.，.TrendsBiotechnol.23(2005)514-522）和单价抗体片段。

在某些优选实施方案中，特异性结合剂是多肽。

在某些优选实施方案中，特异性结合剂是抗体或单价抗体片段，优选自单克隆抗体衍生的单价片段。

单价抗体片段包括但不限于Fab、Fab’-SH、单域抗体、Fv、和scFv片段，如下文提供的。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，而且明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体（例如双特异性抗体）、及抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。在某些优选实施方案中，特异性结合剂是抗体或单价抗体片段，优选自单克隆抗体衍生的单价片段。

“分离的”抗体指已经鉴定且与/自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，而且可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至（1）根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95%，且在一些实施方案中，重量超过99%，（2）足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或（3）根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常会通过至少一个纯化步骤来制备。

“天然抗体”通常指由两条相同的轻（L）链和两条相同的重（H）链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫化物连接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域（VH），接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域（VL），而且在另一端具有一个恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。

抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称作“VH”。轻链的可变域可以称作“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。

术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于整个抗体可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区（HVR）的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区（FR）。天然重和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-片层构象，通过形成环连接且在有些情况中形成β-片层结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与来自另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成（参见Kabat，et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，National Institute of Health，Bethesda，MD(1991)）。恒定域不直接参与抗体对抗原的结合，但是展现多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的“轻链”可分入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕（κ）和拉姆达（λ）。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体（免疫球蛋白）可分入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而且这些中的数种可进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的，而且一般性描述于例如Abbas，et al.，Cellular and Mol.Immunology，4th ed.，W.B.Saunders，Co.(2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价联合而形成的更大融合分子的一部分。

术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非下文定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')₂、和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及自抗体片段形成的多特异性抗体。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段（称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点）和一个剩余的“Fc”片段（其名称反映它易于结晶的能力）。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价联合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv（scFv）种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻和重链能在与双链Fv种类的结构类似的“二聚体”结构中联合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用，在VH-VL二聚体表面上定义一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域（或只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力比完整结合位点要低。

Fab片段包含重和轻链可变域，而且还包含轻链恒定域和重链第一恒定域（CH1）。Fab'片段与Fab片段的区别在于重链CH1结构域的羧基末端增加少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为成对Fab'片段（在它们之间具有铰链半胱氨酸）生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链中。一般地，scFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Pluckthuen，In:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore(eds.)，Springer-Verlag，New York(1994)pp.269-315。

术语“双抗体”（diabody）指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链（VH-VL）中包含相连接的重链可变域（VH）和轻链可变域（VL）。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并创建两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整地描述于例如EP0404097；WO1993/01161；Hudson，et al.，Nat.Med.9(2003)129-134；及Hollinger，et al.，PNAS USA90(1993)6444-6448。三抗体（triabody）和四抗体（tetrabody）也描述于Hudson，et al.，Nat.Med.9(2003)129-134。

如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的抗体个体相同，除了可以以微小量存在的可能的突变，例如天然存在突变。如此，修饰语“单克隆”指示抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型地包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括自众多多肽序列选择单一靶物结合多肽序列的过程获得的。例如，选择过程可以是自众多克隆（诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、或重组DNA克隆）的集合选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体、等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势还在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。

特异性结合剂优选是与SEQ ID NO：3反应性的抗体。

对于本发明中公开的成就，可以使用来自各种来源的抗体。可以使用用于获得抗体的标准方案以及现代备选方法。用于生成抗体的备选方法包括例如使用合成或重组肽（它们呈递NNMT的临床有关表位）进行免疫接种。或者，可以使用DNA免疫接种（也称作DNA疫苗接种）。明显地，可以使用来自不同物种（例如家兔、绵羊、山羊、大鼠或豚鼠）的单克隆抗体或多克隆抗体。因为单克隆抗体可以以任何要求量及恒定特性生成，所以它们代表开发用于临床程序的测定法中的理想工具。

正如熟练技术人员会领会的，蛋白质NNMT现在已经鉴定为可用于评估COPD的标志物。多种免疫诊断规程可用于达到与本发明的成就相当的数据。

对于测定蛋白质NNMT，将自个体获得的样品与针对NNMT的特异性结合剂一起在适合于结合剂NNMT复合物形成的条件下在体外温育。不需要规定此类条件，因为熟练技术人员无需任何创造性努力就能容易地鉴定此类适宜的温育条件。测定结合剂NNMT复合物的量，并用于评估COPD。正如熟练技术人员会领会的，有多种方法测定特异性结合剂NNMT复合物的量，在有关教科书中都有详细描述（参见例如Tijssen，P.，supra或Diamandis，E.P.，andChristopoulos，T.K.(eds.)，Immunoassay，Academic Press，Boston(1996)）。

免疫测定法是熟练技术人员公知的。相关教科书中汇总了用于实行此类测定法的方法以及实际应用和规程。相关教科书的例子是Tijssen，P.，Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates，In:Practice and theory of enzyme immunoassays，pp.221-278，Burdon，R.H.and v.Knippenberg，P.H.(eds.)，Elsevier，Amsterdam(1990)及Colowick，S.P.，andCaplan，N.O.，(eds.)，Methods in Enzymology，Academic Press关于免疫学检测方法的多个卷，尤其是卷70、73、74、84、92和121。

在一个实施方案中，本发明还涉及特异性结合蛋白质NNMT的抗体在依照本发明的方法中的用途。

在一个实施方案中，在依照本发明的方法中在免疫测定法规程中测量蛋白质NNMT。

在又一个实施方案中，在酶联免疫测定法（ELISA）中检测蛋白质NNMT。

在又一个实施方案中，在夹心式测定法（夹心型测定法形式）中检测蛋白质NNMT。在此类测定法中，在一侧上使用第一特异性结合剂捕捉蛋白质NNMT，并在另一侧上使用第二特异性结合剂（其经过标记从而直接或间接可检测）。夹心型测定法形式中使用的特异性结合剂可以是特异性针对蛋白质NNMT的抗体。一方面，可以使用不同捕捉和标记抗体（即识别NNMT多肽上不同表位的抗体）实行检测。另一方面，也可以用针对蛋白质NNMT的同一表位的捕捉和标记抗体实行夹心型测定法。在这个实施方案中，只可以检测蛋白质NNMT的二和多聚体形式。在一个实施方案中，在定性（NNMT的存在或缺失）或定量（测定NNMT的量）免疫测定法中使用针对蛋白质NNMT的抗体。

在又一个实施方案中，依照本发明的方法基于NNMT的测量，其中采用与至少两种非交叠表位反应性的至少两种抗体在夹心式免疫测定法中实施所述NNMT测量。

在又一个实施方案中，在竞争性测定法中检测蛋白质NNMT。在此类测定法形式中，使用特异性结合SEQ ID NO：3之NNMT的结合剂。在混合物中，添加至混合物的经过标记的NNMT和样品中包含的NNMT竞争结合特异性结合剂。可以依照标准规程测量此类竞争的程度。

可以使用特异性ELISA体外测定测试样品中蛋白质NNMT的浓度，如上文早已描述的。使用这种测定法形式，发明人显示了来自已经通过经典方法（例如肺活量测定法）诊断为具有COPD的患者的样品可以与来自表观健康个体的样品辨别开。本申请的实施例部分中显示了结果。

令人惊讶地，本发明的发明人能够检测体液样品中的蛋白质NNMT。甚至更加令人惊讶地，他们能够证明此类自个体获得的液体样品中蛋白质NNMT的存在可以与COPD关联起来。在评估COPD中利用标志物NNMT不需要组织和活检样品。认为测量（例如小等分试样）简单体液样品中蛋白质NNMT的水平在COPD领域是非常有利的。

在一个优选实施方案中，用血清作为样品材料来实施依照本发明的方法。在又一个优选实施方案中，用血浆作为样品材料来实施依照本发明的方法。在又一个优选实施方案中，用全血作为样品材料来实施依照本发明的方法。

在又一个优选实施方案中，本发明涉及蛋白质NNMT作为标志物分子自液体样品（自个体获得）体外评估COPD的用途。

诊断的理想情形会是其中单一事件或过程会引起呼吸疾病的情况，像例如在传染病中。在所有其它情况中，正确诊断会是非常困难的，尤其当没有完全了解疾病的病因时，正如COPD的情况。正如熟练技术人员会领会的，对于给定的多因素疾病（像例如COPD），没有以100%特异性和同时100%灵敏度做出诊断的生化标志物。而是说，使用生化标志物以某种可能性或预示值评估根本的诊断问题，例如疾病的存在、缺失、或严重性。因此，在例行临床诊断中，一般在评估根本的疾病中一起考虑各种临床症状和生物学标志物。熟练技术人员完全熟悉例行用于计算要评估的诊断问题的相对风险或可能性的数学/统计方法。在例行临床实践中，内科医师在诊断、治疗、和管理根本的疾病时一般一起考虑各种临床症状和生物学标志物。

COPD患者传统上用支气管扩张剂或类固醇来治疗，并通过肺活量测定法检查气流阻塞的可逆性。如果可逆性小于15%，且特别是如果他们具有较长吸烟史，那么他们会分类为COPD患者。

用于诊断COPD的ATS（美国胸学会）标准如下：

·  FEV1/FVC比<0.7

·  对于吸入式B2激动剂，<15%可逆性，FEV1<70%预测：

·  2周口服***龙试验-FEV1可逆性小于15%

·  吸烟史

FEV1指自最大吸气位置开始且受试者做出最大努力，一秒钟自肺排出的空气的体积。FEV1%指作为用力肺活量（FVC）的百分比表述的FEV1。FVC指自最大吸气位置，受试者做出最大努力，自肺排出的空气的总体积。FEV1可以使用肺活量计测量呼气头一秒钟呼出空气的体积来测量。

表1中显示COPD依照ATS（美国胸学会）/欧洲呼吸学会2004的肺活量测定法分类。当前ATS分类***中不再使用ATS COPD0期。

表1：

COPD阶段

严重性

支气管扩张剂后FEV1/FVC

FEV1%预测

0	有风险#	>0.7	≥80%
				I	轻度COPD	≤0.7	≥80%
II	中等COPD	≤0.7	50%-80%
				III	严重COPD	≤0.7	30%-50%
IV	很严重COPD	≤0.7	<30%

FEV1：一秒钟用力呼气体积；FVC：用力肺活量；^#：吸烟或暴露于污染物，具有咳嗽、痰或呼吸困难，具有呼吸病家族史的患者。

在评估COPD中，标志物蛋白质NNMT在一个或多个下述方面会是有利的：评估；筛选；疾病分期；监测疾病进展；预后；指导治疗和监测对治疗的响应。

评估怀疑或已知具有COPD的个体中的诊断实用性的优选领域是筛选、疾病分期、监测疾病进展和监测对治疗的响应。

筛选（评估个体是否有风险发生COPD或具有COPD）：

筛选定义为***应用测试针对疾病的指标（例如COPD的存在）鉴定个体（例如有风险的个体）。优选地，筛选群体由已知COPD风险高于平均的个体构成。例如，COPD的筛选群体由已知COPD风险高于平均的个体构成，像吸烟者和前吸烟者。

就本发明而言，筛选涉及关于个体发生COPD的风险无偏评估他们。在一个实施方案中，依照本发明的方法用于筛选目的。即，它用于评估没有在先COPD诊断的受试者，通过a）体外测定样品中蛋白质NNMT的浓度，并b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，其中高于参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD的存在。在一个实施方案中，体液样品（诸如血液、血清、或血浆）用作COPD筛选中的样品。

蛋白质NNMT的测量会帮助内科医师评估怀疑具有COPD的个体中COPD的存在或缺失。

在一个实施方案中，本发明涉及用于在受试者中评估慢性阻塞性肺病（COPD）的存在或缺失的体外方法，包括：a）测定样品中蛋白质NNMT的浓度，并b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，其中高于参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD的存在。在一个优选实施方案中，样品是体液样品。在又一个优选实施方案中，样品选自血清、血浆和全血。

在一个实施方案中，本发明涉及用于在受试者中评估慢性阻塞性肺病（COPD）的存在或缺失的体外方法，包括：a）测定样品中蛋白质NNMT的浓度，b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，并c）基于步骤（b）的比较来评估COPD的存在或缺失，其中高于参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD的存在。在一个优选实施方案中，样品是体液样品。在又一个优选实施方案中，样品选自血清、血浆和全血。

在一个实施方案中，本发明涉及对受试者评估COPD的存在或缺失的体外方法，该方法包括：a）测定样品中蛋白质NNMT的浓度，并b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与在参照群体中建立的蛋白质NNMT截留值比较，其中高于截留值的蛋白质NNMT浓度指示COPD的存在。在一个实施方案中，本发明涉及对受试者评估COPD的存在或缺失的体外方法，该方法包括：a）测定样品中蛋白质NNMT的浓度，并b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与在参照群体中建立的蛋白质NNMT截留值比较，其中低于截留值的蛋白质NNMT浓度指示COPD的缺失。

在一个实施方案中，本发明涉及蛋白质NNMT在评估COPD中的用途。优选地，蛋白质NNMT用于评估COPD的存在或缺失。

在又一个实施方案中，本发明涉及蛋白质NNMT在样品中体外评估COPD中的用途，其中高于蛋白质NNMT参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD。

在一个优选实施方案中，依照该用途的样品是体液样品。在又一个优选实施方案中，依照该用途的所述体液样品选自血清、血浆和全血。

在又一个实施方案中，本发明涉及蛋白质NNMT在体液样品中体外评估COPD中的用途，其中体液样品中高于蛋白质NNMT参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD的存在。

在又一个实施方案中，本发明涉及蛋白质NNMT在血清、血浆、或全血样品中体外评估COPD中的用途，其中血清、血浆、或全血样品中高于蛋白质NNMT参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD的存在。

本发明的一个实施方案涉及筛选群体在大概没有COPD的个体和大概具有COPD的个体之间进行辨别。然后可以对后一组个体进行进一步诊断规程，例如通过肺功能测试、肺活量测定法或其它合适手段。

在一个实施方案中，依照本发明的体外方法特征在于进行蛋白质NNMT评估以依照具有COPD的风险将患者分类，从而做出临床决策，特别是依靠用于COPD的治疗或疗法、和气道和肺的感染/炎性疾病的治疗或疗法、以及抗生素治疗或治疗性抗体治疗的疗法对照的药疗的进一步治疗。

在一个实施方案中，本发明涉及用于评估个体是否有风险发生COPD的体外方法，包括下述步骤：a）测定样品中蛋白质NNMT的浓度，并b）通过将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较来评估所述个体发生COPD的风险，其中高于参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示个体有风险发生COPD。

在一个实施方案中，本发明涉及用于评估个体是否有风险发生COPD的体外方法，包括下述步骤：a）测定体液样品中蛋白质NNMT的浓度，并b）通过将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较来评估所述个体发生COPD的风险，其中高于参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示个体有风险发生COPD。在一个优选实施方案中，体液样品选自血清、血浆和全血。

患者的分期

令人惊讶地，发明人发现蛋白质NNMT的使用可导致COPD患者对于COPD疾病阶段的体外分类，例如分类入依照ATS分类的COPD0-IV期。

在一个实施方案中，本发明涉及帮助COPD患者分期的体外方法，包括下述步骤：a）测定样品中蛋白质NNMT的浓度，b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，并通过将步骤（a）中测定得到的浓度与这种标志物的先前作为指示COPD阶段而建立的浓度比较来进行COPD分期。

在一个实施方案中，本发明涉及帮助COPD患者分期的体外方法，包括下述步骤：a）测定体液样品中蛋白质NNMT的浓度，b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，并通过将步骤（a）中测定得到的浓度与这种标志物的浓度与其指示某些COPD阶段的参照值比较来进行COPD分期。在一个优选实施方案中，体液样品选自血清、血浆和全血。优选地，NNMT的浓度作为辅助手段用于将调查的个体分类入临床“正常”的个体的组、有风险具有COPD的患者的组、和具有COPD的患者的组。在某些实施方案中，NNMT的浓度可进一步用于将患者分组为依照ATS分类***的0-IV期（表1中所示美国胸学会/欧洲呼吸学会2004分类）。熟练技术人员知道其它可得COPD分类***。在一个实施方案中，使用选自APEX1、ASC、NNMT和Seprase的蛋白质将COPD患者分类至COPD阶段。在本发明的又一个实施方案中，优选在将COPD患者体外分类至COPD阶段中使用蛋白质NNMT。实施例4、图3和4中显示使用蛋白质NNMT将COPD患者分类至COPD阶段的实验结果。

预后

预后指标可以定义为COPD患者以某种可能性预测疾病结果的临床、病理或生化特征。它们的主要用途是帮助理性计划患者管理，即分别避免攻击性疾病的治疗不足和无痛性疾病的治疗过度。

因为单独的蛋白质NNMT的水平显著有助于区分COPD患者与健康对照或其它肺病（例如哮喘、支气管炎、肺纤维化和结核），优选区分COPD与哮喘，所以预期它会帮助评估患有COPD的患者的预后。蛋白质NNMT的浓度最有可能会与肺功能测试或肺活量测定法的结果组合。

区分COPD与哮喘

在又一个实施方案中，依照本发明的方法用于区分COPD与其它类型的肺病，优选哮喘。

还优选使用蛋白质NNMT来区分COPD与其它类型的肺病（例如哮喘、支气管炎、肺纤维化和结合），优选区分COPD与哮喘。令人惊讶地，发明人发现COPD特异性标志物（优选NNMT）和选自CRP、白介素-6、血清淀粉状蛋白A、S100和E-选择蛋白的炎症标志物的标志物组合的使用可导致COPD和其它炎性肺病（例如哮喘、急性或慢性肺部炎症）之间的区分。实施例部分中显示蛋白质NNMT和蛋白质CRP的实验结果。

监测疾病进展

当前以合理可能性预测诊断有COPD的患者是否具有更加或不太稳定的状态或疾病是否会进展非常困难。

疾病（即COPD）的进展可以通过体外监测测试样品中蛋白质NNMT的浓度来评估，尤其是通过采集一份或多份连续样品。在一个实施方案中，本发明涉及用于监测患有COPD的患者中疾病进展的体外方法，该方法包括下述步骤：a）测定样品中蛋白质NNMT的浓度，b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，并通过将步骤（a）中测定得到的浓度与这种标志物的在先前的时间点自同一患者采集的样品中测定得到的浓度比较来监测疾病进展。正如会领会的，C端proSP-B的水平随时间升高指示疾病进展。

监测患者对治疗的响应

当用于患者监测时，依照本发明的方法可用于跟踪患者和例如帮助评估COPD的治疗功效。

在一个实施方案中，本发明涉及用于监测患者对目标为减轻COPD的治疗的响应的体外方法，包括下述步骤：a）测定体液样品中蛋白质NNMT的浓度，b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，并通过将步骤（a）中测定得到的浓度与这种标志物的浓度与它的参照值比较来监测患者对COPD治疗的响应。在一个优选实施方案中，体液样品选自血清、血浆和全血。

监测患者对治疗的响应可以例如通过建立蛋白质NNMT的治疗前和后标志物水平并比较治疗前和后标志物水平来实施。

患者对COPD治疗的响应可以通过随时间监测测试样品中蛋白质NNMT的浓度而体外评估。在一个实施方案中，本发明涉及用于监测患者对COPD治疗的响应的体外方法，包括下述步骤：a）测定样品中蛋白质NNMT的浓度，b）将步骤（a）中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的在先前样品中建立的浓度比较，其中蛋白质NNMT降低指示对所述治疗的阳性响应。

蛋白质NNMT的水平表现出适合于监测患者对治疗的响应。如此，本发明还涉及蛋白质NNMT在监测患者对治疗的响应中的用途，其中降低的蛋白质NNMT水平是有效治疗COPD的阳性指标。

标志物组合

因此，在一个实施方案中，本发明涉及蛋白质NNMT作为用于评估COPD的标志物组中的一种标志物的用途。此类标志物组包括蛋白质NNMT和一种或多种别的COPD标志物。例如，某些标志物组合在筛选COPD中会是有利的。

正如熟练技术人员会领会的，有多种方式使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。

生化标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。

正如熟练技术人员会领会的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合蛋白质NNMT和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值与NNMT的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于COPD的风险或与有助于评估COPD患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a）将个体分类入组，例如正常人、有COPD风险的个体、具有急性或慢性肺部炎症的患者等等，b）通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c）对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d）构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

在一个实施方案中，用于组合NNMT的值和至少一种别的标志物的值的对数函数是如下获得：a）分别将个体分类入正常人和有可能具有COPD的个体的组，b）建立NNMT的值和至少一种别的标志物的值，c）实施对数回归分析，并d）构建对数函数以组合NNMT的标志物值和至少一种别的标志物的值。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析（DA）（即线性、二次、规则DA）、Kernel方法（即SVM）、非参数方法（即k-最近邻居分类器）、PLS（部分最小二乘）、基于树的方法（即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法）、广义线性模型（即对数回归）、基于主分量的方法（即SIMCA）、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估COPD中使用的数学算法的统计方法选自DA（即线性、二次、规则判别分析）、Kernel方法（即SVM）、非参数方法（即k-最近邻居分类器）、PLS（部分最小二乘）、基于树的方法（即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法）、或广义线性模型（即对数回归）。关于这些统计方法的详情见下述参考文献：Ruczinski，I.，et al.，J.of Computational and Graphical Statistics12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.of the American Statistical Association84(1989)165-175；Hastie，T.，et al.，The Elements of Statistical Learning，Springer Verlag(2001)；Breiman，L.，et al.，Classification and regression trees，WadsworthInternational Group，California(1984)；Breiman，L.，Machine Learning45(2001)5-32；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classificationand Prediction，Oxford Statistical Science Series，28，Oxford University Press(2003)；及Duda，R.O.，et al.，Pattern Classification，John Wiley&Sons，Inc.，2nded.(2001)。

本发明的一个实施方案是使用针对根本的生物学标志物组合经过优化的多变量截留及区分状态A与状态B，例如分别是正常人和有COPD风险的个体，响应治疗的COPD患者和治疗失败者，具有急性肺部炎症的患者和COPD患者，显示疾病进展的COPD患者和不显示疾病进展的COPD患者。

接受者操作曲线下面积（=AUC）是诊断规程的性能或精确性的一项指标。诊断方法的精确性由它的接受者操作特征（ROC）描述得最好（尤其参见Zweig，M.H.，and Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577）。ROC图是源自在观察的整个数据范围上连续改变决策阈的所有灵敏度/特异性对的线图。

实验室测试的临床性能取决于它的诊断精确性，或将受试者正确分类入临床有关亚组的能力。诊断精确性测量测试正确辨别所调查的受试者的两种不同状况的能力。此类状况是例如健康和疾病或者疾病进展对无疾病进展。

在每种情况中，ROC线图通过对于决策阈的整个范围将灵敏度对1-特异性绘图来描绘两种分布之间的交叠。y轴上是灵敏度，或真阳性分数[定义为(真阳性测试结果的数目)/(真阳性的数目+假阴性测试结果的数目)]。这也称作疾病或状况的存在的阳性。它仅仅自受影响亚组来计算。x轴上是假阳性分数，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性的数目+假阳性结果的数目)]。它是特异性的一项指标，而且完全自不受影响的亚组来计算。因为真和假阳性分数通过使用来自两个不同亚组的测试结果完全分开计算，所以ROC线图不依赖于样品中疾病的流行程度。ROC线图上的每个点代表一个对应于特定决策阈的灵敏度/1-特异性对。一项具有完美区分（两种结果分布没有交叠）的测试具有通过左上角的ROC线图，那里真阳性分数为1.0，或100%（完美灵敏度），且假阳性分数为0（完美特异性）。一项不区分（两个组的结果分布相同）的测试的理论线图是从左下角到右上角的45°对角线。大多数线图落在这两种极端之间。（如果ROC线图完全落在45°对角线以下，那么这容易通过将“阳性”的标准从“大于”颠倒成“小于”或反之来矫正。）定性地，线图越接近左上角，测试的整体精确性越高。

量化实验室测试的诊断精确性的一项便利目标是通过单一数值来表述它的性能。最常见的全局度量是ROC曲线下面积（AUC）。常规地，此面积总是≥0.5（如果不是这样，那么可以颠倒决策规则来使之这样）。数值范围介于1.0（完美分开两个组的测试值）和0.5（两个组的测试值之间没有明显分布差异）之间。面积不仅取决于线图的特定部分诸如最接近对角线的点或90%特异性处的灵敏度，而且还取决于整个线图。这是ROC线图如何接近完美者（面积=1.0）的一种定量、描述性表述。

整体测定法灵敏度会取决于实施本文公开的方法要求的特异性。在某些优选设置中，特异性75%可能是充分的，而且统计方法和所得算法可以基于此特异性要求。在一个优选实施方案中，用于评估有COPD风险的个体的方法基于特异性80%、85%、或还优选90%或95%。

某些标志物组合在筛选COPD中会是有利的。

在一个实施方案中，本发明致力于通过生化标志物评估COPD的体外方法，包括测定样品中蛋白质NNMT和一种或多种其它标志物的浓度，在数学上组合蛋白质NNMT的测定浓度和一种或多种其它标志物的浓度，其中升高的组合值指示COPD的存在。

在一个实施方案中，本发明致力于通过生化标志物评估COPD的体外方法，包括测定样品中蛋白质NNMT和一种或多种其它标志物的浓度并将蛋白质NNMT的测定浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，其中高于参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD的存在。优选的是，所述方法的一种或多种其它标志物选自ASC、ARMET、FEN1、APEX1和Seprase。在又一个优选实施方案中，所述标志物组至少包括蛋白质NNMT和蛋白质ASC。在又一个优选实施方案中，所述标志物组至少包括蛋白质NNMT和蛋白质ARMET。在又一个优选实施方案中，所述标志物组至少包括蛋白质NNMT和蛋白质FEN1。在又一个优选实施方案中，所述标志物组至少包括蛋白质NNMT和蛋白质APEX1。在又一个优选实施方案中，所述标志物组至少包括蛋白质NNMT和蛋白质Seprase。

在一个实施方案中，本发明涉及标志物NNMT作为标志物分子与一种或多种指示COPD的标志物分子组合用于体外评估COPD的用途。因此，在一个实施方案中，本发明涉及蛋白质NNMT作为COPD标志物组（即包括蛋白质NNMT和一种或多种用于COPD筛选目的的别的标志物的标志物组）的一种标志物的用途。

例如，本发明还涉及包括蛋白质NNMT和ASC的标志物组，或包括蛋白质NNMT和ARMET的标志物组，或包括蛋白质NNMT和FEN1的标志物组，或包括蛋白质NNMT和APEX1的标志物组，或包括蛋白质NNMT和Seprase的标志物组，或包括蛋白质NNMT和两种或更多种选自ASC、ARMET、FEN1、APEX1和Seprase的标志物的标志物组的用途。

在一个实施方案中，与蛋白质NNMT组合在依照本发明的方法中使用的优选标志物选自ASC、ARMET、FEN1、APEX1和Seprase。这些标志物可以每个个别地或与NNMT一起以任何组合用于评估COPD。在又一个实施方案中，本发明涉及选自下组的标志物组（标志物组合）：蛋白质NNMT，ASC，ARMET，FEN1，APEX1，Seprase和CRP。

在一个实施方案中，通过生化标志物评估COPD的体外方法中使用的标志物组包括测定样品中蛋白质NNMT和蛋白质FEN1的浓度的步骤，其中高于蛋白质NNMT参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD的存在。在又一个实施方案中，在体外方法中使用的标志物组包括标志物蛋白质NNMT、FEN1和ASC。在又一个实施方案中，在体外方法中使用的标志物组包括标志物蛋白质NNMT、FEN1、ASC和Seprase。

在又一个实施方案中，与蛋白质NNMT组合使用的标志物是可用于评估炎症（即根本的***性炎症）的标志物。

炎症标志物

目前知道用于诊断炎症的多种血清标志物。熟练技术人员熟悉术语“炎症标志物”。例如，所述炎症标志物选自白介素-6、C-反应性蛋白、血清淀粉状蛋白A、sE-选择蛋白和S100蛋白。

白介素-6（IL-6）是一种21kDa分泌型蛋白质，其具有众多生物学活性，可以分成涉及造血的和涉及激活先天免疫应答的。IL-6是一种急性期反应物且刺激多种蛋白质（包括粘附分子）的合成。它的主要功能是介导肝蛋白质的急性期生成，而且它的合成受细胞因子IL-1和TNF-α诱导。IL-6在正常情况下由巨噬细胞和T淋巴细胞生成。IL-6的正常血清浓度<5pg/ml。

C-反应性蛋白（CRP）是一种同五聚体Ca²⁺结合急性期蛋白质，具有涉及宿主防御的21kDa亚基。CRP合成受IL-6诱导，而且间接受IL-1诱导，因为IL-1能触发肝窦中的库弗细胞合成IL-6。CRP的正常血浆浓度在90%的健康群体中<3μg/ml（30nM），而且在99%的健康个体中<10μg/ml（100nM）。例如，可以通过免疫测定法来测量血浆CRP浓度。例如，可以通过同质测定法形式或ELISA来测量血浆CRP浓度。

血清淀粉状蛋白A（=SAA）是一种急性期蛋白质，分子量较低，11.7kDa。它主要由肝响应IL-1、IL-6或TNF-α刺激而合成，而且涉及T细胞依赖性免疫应答的调节。在急性事件时，SAA的浓度升高，上至1000倍，达到1mg/ml。它用于监测种种疾病（像囊性纤维化病、肾移植物排斥、创伤或感染）中的炎症。在类风湿性关节炎中，它在某些病例中用作CRP的替代品，但是SAA尚未得到广泛接受。

S100蛋白质形成持续增加的Ca²⁺结合蛋白质家族，今天包括超过20个成员。S100蛋白质的生理有关结构是一种同二聚体，但是一些还能彼此形成异二聚体，例如S100A8和S100A9。细胞内功能的范围从调节蛋白质磷酸化、酶活性、或细胞骨架的动态至涉及细胞增殖和分化。因为一些S100蛋白质也自细胞释放，所以也已经描述了细胞外功能，例如神经元存活、星形胶质细胞增殖、诱导凋亡和调节炎症过程。已经在炎症中找到S100A8、S100A9、异二聚体S100A8/A9和S100A12，其中S100A8响应慢性炎症，而S100A9、S100A8/A9和S100A12在急性炎症中升高。已经将S100A8、S100A9、S100A8/A9和S100A12与具有炎症成分的不同疾病（包括一些癌症、肾同种异体移植物排斥、结肠炎和最重要的RA）联系起来（Burmeister，G.，andGallacchi，G.，Inflammopharmacology3(1995)221-230；Foell，D.，et al.，Rheumathology42(2003)1383-1389）。

sE-选择蛋白（可溶性内皮白细胞粘附分子-1，ELAM-1）是一种只在内皮细胞上且只在受炎症细胞因子（IL-1β、TNF-α）或内毒素激活之后表达的115kDa、I型跨膜糖蛋白。细胞表面E-选择蛋白是白细胞滚动附着至内皮（白细胞在炎症部位渗出中的一个关键步骤）的介导物，由此在局限性炎症应答中发挥重要作用。可溶性E-选择蛋白见于健康个体的血液，大概源自表面表达分子的蛋白水解切割。已经在多种病理状况中报告了血清中升高的sE-选择蛋白水平（Gearing，A.J.and Hemingway，I.，Ann.N.Y.Acad.Sci.667(1992)324-331）。

在一个实施方案中，优选在依照本发明的方法中与蛋白质NNMT组合使用的标志物选自CRP、白介素-6、血清淀粉状蛋白A和S100。在又一个实施方案中，将依照本发明的体外方法为NNMT测定的值与至少一种选自CRP、白介素-6、血清淀粉状蛋白A、S100和E-选择蛋白的别的标志物的测定值组合。在一个实施方案中，本发明涉及标志物组合NNMT和C-反应性蛋白（CRP）在评估COPD中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及标志物组合NNMT和白介素-6（IL-6）在评估COPD中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及标志物组合NNMT和血清淀粉状蛋白A在评估COPD中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及标志物组合NNMT和S100在评估COPD中的用途。

在又一个实施方案中，本发明涉及包括蛋白质NNMT和CRP的标志物组在血清或血浆样品中体外评估COPD的存在或缺失中的用途，其中高于蛋白质NNMT参照浓度的蛋白质NNMT浓度和高于蛋白质CRP参照浓度的蛋白质CRP浓度指示COPD的存在。

在又一个实施方案中，本发明涉及包括蛋白质NNMT和CRP的标志物组在血清或血浆样品中体外评估COPD的存在或缺失中的用途，其中等于或低于蛋白质NNMT参照浓度的蛋白质NNMT浓度和高于蛋白质CRP参照浓度的蛋白质CRP浓度指示COPD的缺失。

在一个实施方案中，在单一测试装置内（例如在芯片上或在阵列形式中）组合标志物组。在一个实施方案中，使用生物芯片阵列（蛋白质阵列）技术测定依照本发明的标志物组。阵列是可寻址标志物个体的集合。此类标志物可以是空间可寻址的，诸如微量滴定板内包含的或平坦表面上印刷的阵列，其中每种标志物存在于独特的X和Y坐标处。或者，标志物可以基于标签、珠、纳米颗粒、或物理特性而可寻址。生物芯片阵列可以依照普通技术人员知道的方法来制备（参见例如US5,807,522；Robinson，W.H.，et al.，Nat.Med.8(2002)295-301；Robinson，W.H.，et al.，Arthritis Rheum.46(2002)885-893）。如本文中使用的，阵列指任何带有多种可寻址标志物的免疫学测定法。生物芯片阵列（熟练技术人员也称作微阵列）是阵列的小型化形式。

术语“芯片”、“生物芯片”、“多聚体芯片”或“蛋白质芯片”可互换使用，而且指在共同基片上排列的多种探针、标志物或生化标志物的集合，该基片可以是硅片、尼龙带、塑料带、或玻璃载片的一部分。

“阵列”、“宏阵列”或“微阵列”指有意创建的物质（诸如分子、标志物、开口、微线圈、检测仪和/或传感器）集合，其附着至基片或固体表面（诸如玻璃、塑料、硅片或其它形成阵列的材料）或在基片或固体表面（诸如玻璃、塑料、硅片或其它形成阵列的材料）上装配。阵列可用于同时测量大量（例如数十、数千或数百万）反应或组合的水平。阵列也可含有少量物质，例如一个、少数或一打。阵列中的物质可以彼此相同或不同。阵列可以采取多种形式，例如可溶性分子的文库、固定化分子的文库、固定化抗体的文库、拴系至树脂珠、硅片、或其它固体支持物的化合物的文库。阵列可以是宏阵列或微阵列，取决于阵列上的垫的大小。宏阵列一般含有约300微米或更大的垫大小，而且能容易地通过凝胶和印迹扫描仪来成像。微阵列一般会含有小于300微米的垫大小。

“固体支持物”指不溶性、官能化、聚合材料，可以对其附着或共价结合（常常经由接头）文库成员或试剂，从而固定化或容许它们易于与过量的试剂、可溶性反应副产物、或溶剂分开（通过过滤、离心、清洗等）。

在一个实施方案中，本发明涉及一种生物芯片阵列，其包括标志物蛋白质NNMT和任选的一种或多种其它COPD标志物蛋白质。

在一个实施方案中，本发明还提供用于实施依照本发明的方法以特异性测定蛋白质NNMT和一种或多种选自蛋白质ASC、ARMET、FEN1、APEX1和Seprase的其它标志物的浓度的生物芯片阵列，和任选的用于实施测量的辅助试剂。

在一个实施方案中，本发明还提供用于实施依照本发明的方法以特异性测定蛋白质NNMT和一种或多种选自蛋白质ASC、ARMET、FEN1、APEX1和Seprase的其它标志物的浓度的生物芯片阵列，和任选的评估COPD的存在或缺失中的辅助试剂。

试剂盒

本发明还提供用于实施依照本发明的体外方法的试剂盒，其包括特异性测定蛋白质NNMT的浓度需要的试剂。

本发明还提供用于实施依照本发明的方法的试剂盒，其包括特异性测定蛋白质NNMT和任选的一种或多种如上所述COPD标志物蛋白质的浓度需要的试剂，其中其它标志物可以每种个别地或以其任何组合使用。

本发明还提供用于实施依照本发明的方法的试剂盒，其包括特异性测定蛋白质NNMT和一种或多种选自蛋白质ASC、ARMET、FEN1、APEX1和Seprase的其它标志物蛋白质的浓度需要的试剂和任选的用于实施测量的辅助试剂。

在还有又一个实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包括特异性测定蛋白质NNMT的浓度需要的试剂和测量一种或多种在COPD标志物组合中一起使用的其它COPD标志物需要的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括特异性结合蛋白质NNMT的抗体或其片段。在又一个实施方案中，所述试剂盒中的所述抗体片段选自Fab、Fab'、F(ab')₂、和Fv。在一个实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包括特异性结合SEQ ID NO:3之NNMT序列中包含的至少两种非交叠表位的至少两种抗体或其片段。优选地，依照本发明的试剂盒中包括的至少两种抗体或其片段是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括生物芯片，该生物芯片上固定化有抗体或其片段。

在又一个实施方案中，本发明涉及用于实行依照本发明评估COPD的体外方法的体外诊断医学装置（IVD）。如本文中使用的，“诊断装置”指体外诊断医学装置（IVD），它可以是试剂、校准物、对照材料、试剂盒、标本容器、软件、仪器、装置、设备或***，无论单独地或与体外使用的其它诊断工具组合地使用。制造商的意图在于体外用于检查自人体衍生的样品或标本，仅仅或主要出于给出关于标志物浓度、生理学或病理学状态、先天性异常的信息，或测定安全性和与潜在接受者的相容性，或监测治疗度量的目的。

提供下面的实施例、序列表和图以帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求书中列出。要理解，可以在不背离本发明的精神的情况下在列出的规程中进行变更。

附图描述

图1 图1显示COPD样品中蛋白质NNMT的接受者操作特征的线图（ROC线图），与186份自健康对照患者获得的对照样品相比，123份自COPD患者获得的样品的评估，AUC为0.88（ROC88%）。X轴：1-特异性（假阳性）；Y轴：灵敏度（真阳性）。

图2 图2显示COPD样品中CRP的接受者操作特征的线图（ROC线图），与186份自健康对照患者获得的对照样品相比，123份自COPD患者获得的样品的评估，AUC为0.74（ROC74%）。X轴：1-特异性（假阳性）；Y轴：灵敏度（真阳性）。

图3 图3显示123份COPD样品测定得到的NNMT血清浓度值依照COPD0-IV期的框点分布（COPD病期如表1中描述的）。

图4 图4显示123份COPD样品测定得到的CRP血清浓度依照COPD0-IV期的框点分布（COPD病期如表1中显示的）。

图5 图5显示COPD样品中蛋白质NNMT的接受者操作特征的线图（ROC线图），与26份自哮喘患者获得的对照样品相比，123份自COPD患者获得的样品的评估，AUC为0.88（ROC88%）。X轴：1-特异性（假阳性）；Y轴：灵敏度（真阳性）。

图6 图6显示COPD样品中CRP的接受者操作特征的线图（ROC线图），与26份自哮喘患者获得的对照样品相比，123份自COPD患者获得的样品的评估，AUC为0.70（ROC70%）。X轴：1-特异性（假阳性）；Y轴：灵敏度（真阳性）。

图7 图7显示依照123份病期0-IV的COPD样品（4_COPD）、50份健康样品（1_健康）、135份筛选对照样品（2_筛选对照）和26份哮喘患者样品（3_哮喘），测定得到的NNMT血清浓度[pg/ml]的框点分布。y轴为更好“显现”进行了调整。

图8 图8显示关于NNMT（实线）、NNMT+FEN1（短划线）和NNMT+FEN1+ASC（点线）标志物组合，COPD样品中蛋白质NNMT的接受者操作特征的线图（ROC线图），与161份自健康对照和哮喘患者获得的对照样品相比，评估123份自COPD患者获得的样品。X轴：1-特异性（假阳性）；Y轴：灵敏度（真阳性）。

序列描述

SEQ ID NO：1  显示人蛋白质ASC的氨基酸序列（SwissProt数据库登录号：Q9ULZ3）。

SEQ ID NO：2  显示人蛋白质ARMET的氨基酸序列（SwissProt数据库登录号：P55145）。

SEQ ID NO：3  显示人蛋白质NNMT的氨基酸序列（SwissProt数据库登录号：P40261）。

SEQ ID NO：4  显示人蛋白质FEN1的氨基酸序列（SwissProt数据库登录号：P39748）。

SEQ ID NO：5  显示人蛋白质APEX1的氨基酸序列（SwissProt数据库登录号：P27695）。

SEQ ID NO：6  显示人蛋白质Seprase的氨基酸序列（SwissProt数据库登录号：Q12884）。

SEQ ID NO：7  显示人蛋白质DPPIV的氨基酸序列（SwissProt数据库登录号：P27487）。

实施例

实施例1：COPD研究群体

血清样品的来源：

为了鉴定COPD特异性蛋白质来作为COPD的潜在诊断标志物，血清样品衍生自一项国家多中心研究中表征较好的COPD患者（依照表1的ATS分类***）。自每位样品供体，实施了肺活量测定法。在一份专门的病例报告表（CRF）中记录了肺功能、其它诊断测试以及转移（transferal）的原因、诊断和共发病。已经与自对照组1-4获得的对照样品比较评估了COPD样品，如表2中所示。

血清样品制备：

将血清样品采集入血清管中并容许于室温凝结至少60分钟，上至120分钟。离心（10min，2000g）后，将上清液分成1ml等分试样并于-70℃冷冻。测量前，将样品融化，再等分成适宜原型测定法和参照测定法的更小体积并再冷冻。临分析前将样品融化。因此，组中的每份样品在测量前只有两个冷冻-融化循环。

实施例2.1：针对标志物蛋白质NNMT的抗体的生成

生成针对蛋白质NNMT的多克隆抗体，供进一步使用抗体通过免疫检测测定法（例如Western印迹和ELISA）测量NNMT的血清和血浆和血液水平。

大肠杆菌中的重组蛋白质表达

为了生成针对NNMT的抗体，实施蛋白质的重组表达以获得免疫原。应用RTS100表达***和大肠杆菌中的表达的组合来进行表达。第一步，分析DNA序列，并使用“ProteoExpert RTS大肠杆菌HY”***获得高产量cDNA沉默突变变体和各PCR引物序列的推荐。这是商业性的、基于网络的服务（www.proteoexpert.com）。使用推荐的引物对，使用“RTS100大肠杆菌线性模板生成套组，His标签”（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号3186237）***，自cDNA生成线性PCR模板，用于体外转录和表达编码NNMT蛋白质的核苷酸序列。对于Western印迹检测和后期纯化，表达的蛋白质含有His标签。鉴定了最好的表达变体。从PCR到表达和检测的所有步骤依照制造商的用法说明书实行。遵循制造商的用法说明书将含有所有必需T7调节区（启动子、核糖体结合位点和T7终止子）的各PCR产物克隆入pBAD载体（Invitrogen，Karlsruhe，Germany，目录号K4300/01）。对于使用T7调节序列的表达，将构建物转化入大肠杆菌BL21(DE3)（Studier，F.W.，et al.，Methods Enzymol.185(1990)60-89）中并在1升批次中培养转化细菌以表达蛋白质。

在Ni-螯合柱上遵循标准规程进行His-NNMT融合蛋白的纯化。简言之，通过离心使1L含有His-NNMT融合蛋白的表达载体的细菌培养物形成团粒。在含有磷酸盐pH8.0、7M盐酸胍（guanidium chloride）、咪唑和硫甘油（thioglycerole）的裂解缓冲液中重悬浮细胞团粒，接着使用匀浆。通过高速离心使不溶性材料形成团粒，并将上清液应用于Ni-螯合层析柱。用数个柱体积的裂解缓冲液清洗柱，接着用含有磷酸盐pH8.0和脲的缓冲液清洗。最后，在酸性条件下使用含有SDS的磷酸盐缓冲液洗脱结合的抗原。

多克隆抗体的生成

a）免疫接种

对于免疫接种，制备蛋白质溶液（100μg/ml蛋白质NNMT）和完全弗氏佐剂1:1比例的新鲜乳状液。在第1、7、14和30、60和90天给每只家兔免疫接种1ml乳状液。采集血液，并如实施例3和4中所述使用所得抗NNMT血清进行进一步实验。

b）通过用辛酸和硫酸铵序贯沉淀自家兔血清纯化IgG（免疫球蛋白G）

将一份体积的家兔血清用4份体积的乙酸盐缓冲液（60mM，pH4.0）稀释。用2M Tris-碱将pH调至4.5。在剧烈搅动下逐滴添加辛酸（25μl/ml稀释样品）。30分钟后，将样品离心（13000xg，30min，4℃），丢弃团粒并收集上清液。通过添加2M Tris-碱将上清液的pH调至7.5并过滤（0.2μm）。

通过逐滴添加4M硫酸铵溶液至终浓度2M，在剧烈搅动下沉淀上清液中的免疫球蛋白。通过离心（8000xg，15min，4℃）来收集沉淀的免疫球蛋白。

丢弃上清液。将团粒在10mM NaH₂PO₄/NaOH pH7.5、30mM NaCl中溶解并彻底透析。将透析液离心（13000xg，15min，4℃）并过滤（0.2μm）。

多克隆家兔IgG的生物素化

将多克隆家兔IgG在10mM NaH₂PO₄/NaOH pH7.5、30mM NaCl中调至10mg/ml。每ml IgG溶液添加50μl生物素-N-羟基琥珀酰亚胺（3.6mg/ml，在DMSO中）。于室温30分钟后，将样品在Superdex200（10mM NaH₂PO₄/NaOHpH7.5、30mM NaCl）上层析。收集含有生物素化IgG的级分。单克隆抗体已经依照相同规程生物素化。

多克隆家兔IgG的地高辛配基化

将多克隆家兔IgG在10mM NaH₂PO₄/NaOH、30mM NaCl pH7.5中调至10mg/ml。每ml IgG溶液添加50μl地高辛配基-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目录号1333054)（3.8mg/ml，在DMSO中）。于室温30分钟后，将样品在200（10mM NaH₂PO₄/NaOH pH7.5、30mM NaCl）上层析。收集含有地高辛配基化IgG的级分。单克隆抗体已经依照相同规程用地高辛配基标记。

实施例2.2：CRP

使用由Roche Diagnostics（Mannheim，FRG）配售的同质测定法（Hitachi）测量标志物蛋白质CRP。

实施例3：用于测量人血清或血浆样品中的NNMT的ELISA

对于检测人血清或血浆样品中的NNMT，开发了一种夹心式ELISA。对于捕捉和检测抗原，将针对NNMT的抗体的等分试样分别与生物素和地高辛配基缀合。

在经链霉亲合素包被的微量滴定板的分开的孔中将样品（20μl）与100μl抗体试剂混合，抗体试剂在温育缓冲液（40mM磷酸盐、200mM酒石酸钠、10mM EDTA、0.05%酚、0.1%聚乙二醇40000、0.1%Tween20、0.2%BSA、0.1%牛IgG、0.02%5-溴-5-硝基-1，3-二口恶烷，调至pH7.4，补充有200μg/ml多聚体单克隆小鼠IgG Fab片段以消除人抗大鼠抗体反应（HARA）；RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号11096478-001）中含有各0.12μg/ml生物素标记的和地高辛配基标记的抗体。

温育一小时后，将板用清洗缓冲液（10mM Tris、150mM NaCl、0.05%Tween20）清洗三次。

在下一个步骤中，将孔用通用缀合物缓冲液（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号11684825）中的30mU/ml抗地高辛配基-HRP缀合物（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号1633716）温育60分钟并如前清洗。

然后将孔用100μl TMB底物溶液（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号12034425）温育30分钟。添加2N硫酸（50μl）停止了显色并将蓝色变成黄色。用ELISA读数仪于450nm测量OD。

所有温育于室温。将人血清或血浆的样品用温育缓冲液预稀释至5%。对于校准，使用人血清作为标准。将它用温育缓冲液分别稀释至2/4/8/16/32%以生成具有任意给定值2/4/8/16/32U/ml的校准物。

通过非线性最小平方曲线拟合（Wiemer-Rodbard）来计算校准曲线的方程式，并用于将孔的吸光度读数换算成对应的浓度值。将结果乘以预稀释因数以得到各个样品自身的浓度。

实施例4：NNMT作为COPD的血清标志物

使用表1中所示自123名表征较好的、ATS COPD0-IV期分类的COPD患者衍生的血清样品。表2中显示研究群体。

表2：研究群体

与自明显健康个体（=对照群组）获得的对照样品（对照1、2和3）和哮喘患者（对照4）比较，评估COPD样品中蛋白质NNMT的血清浓度，AUC为0.88（表3）。图1中显示标志物NNMT的、表3中所示结果的接受者操作特征曲线（ROC）。图2中显示为炎症标志物CRP测定的数据。标志物NNMT的AUC比CRP的AUC要更高。

表3：标志物蛋白质的ROC分析，与CRP比较

标志物	NNMT	CRP
			ROC	88%	74%

通过计算导致95%特异性的95%分位数，在对照集体中确定截留值。或是通过计算接受者操作特征曲线（ROC）（表3）或是通过预设特异性95%的临床灵敏度（表4）来评估生物标志物的诊断潜力。标志物NNMT对于COPD较之健康个体（对照1）的截留的灵敏度为67%。凭借在各对照群组（对照1、2和3：即健康不吸烟者、吸烟者、从前吸烟者和具有形成COPD的职业风险的个体）上产生95%特异性的截留值，标志物NNMT对于COPD一般筛选的截留的灵敏度为53%。

表4：标志物蛋白质的灵敏度和特异性，与CRP比较

标志物	NNMT	CRP
			特异性	95%	95%
灵敏度（截留对照1）	67%	31%
			灵敏度（截留对照1、2和3）	53%	24%

在应用基于对照1（依照表2的健康对照）或基于对照1、2和3（依照表2的筛选对照）的截留（95%特异性）时，标志物NNMT的灵敏度比CRP的灵敏度要更高（表4）。这还得到ROC分析的反映，其中标志物NNMT展现比标志物CRP要更大的AUC（表3）。

使用依照ATS COPD0-IV期的COPD样品中为蛋白质NNMT测定的数据计算了图3中所示框线图，呈现蛋白质NNMT的血清浓度与ATS COPD0-IV期的关联。使用依照ATS COPD0-IV期分类的每份样品内为炎症标志物CRP测定的数据计算了图4中所示框线图，呈现CRP的血清浓度与COPD病期的关联。

标志物NNMT在将COPD患者分类成ATS0-IV期方面具有与CRP相比略微改进的精确性。

实施例5：NNMT作为血清标志物来区分人COPD与哮喘

使用标志物NNMT分析了自123名表征较好的、依照表1中所示ATSCOPD0-IV期分类的COPD患者衍生的样品以及自26名哮喘患者（表2中所示对照4）衍生的样品。凭借较之哮喘对照群组产生95%特异性的截留值，对于COPD的灵敏度为58%（表5）。

标志物NNMT区分COPD与哮喘的灵敏度比炎症标志物CRP的灵敏度要更高。

表5：使用标志物蛋白质区分COPD与哮喘

标志物	NNMT	CRP
			特异性（较之哮喘）	95%	95%
灵敏度（对于COPD）	58%	25%
			ROC	88%	70%

作为接受者操作特征曲线（ROC），图5中显示标志物NNMT的结果的图示。作为接受者操作特征曲线（ROC），图6中显示炎症标志物CRP的结果。

较之来自健康受试者的样品（n=50）、来自筛选对照的样品（n=135）和来自哮喘患者的样品（n=26），使用COPD样品中为蛋白质NNMT测定的数据计算了基于表6中所示数据的图7中所示框线图，呈现蛋白质NNMT的血清浓度与ATS COPD0-IV期的关联（n=123，如表2中所示）。虽然对照（健康、筛选对照和哮喘）的均值范围介于197和264pg/ml之间，但是COPD患者的NNMT浓度显著更高，均值为885pg/ml。表6中呈现结果。

表6：NNMT的可变性

实施例6：标志物组合/统计分析和结果

使用处罚对数回归（PLR）作为标志物组合的数学模型，如在R工具箱“glmnet”（http://cran.r-project.org/）中执行的。为了搜索别的标志物，将初始标志物以不处罚方式输入模型，而对所有其它标志物进行处罚。

通过一项内部重复10倍交叉验证来进行算法优化（即选择处罚类型及其处罚参数），而性能参数（灵敏度和特异性）的推导基于一项外部重复10倍交叉验证。

将初始数据集拆分成10个部分，之后这些部分中的9个形成练习集而第10个部分形成测试集。然后还将练习集拆分成10个部分，而这些部分中的9个形成亚练习集而第10个部分形成亚测试集。凭借这些亚数据集，基于别的标志物的数目优化了处罚参数。凭借这个经过优化的值，在整个练习集上应用PLR以生成诊断规则。在对照上以及在练习集的病例上确定了评估事后病例-概率上的阈以实现多变量诊断规则的表观特异性和灵敏度90%。然后将这种规则应用于测试集以评估给定阈处的灵敏度和特异性。外部10倍交叉验证重复50次，内部交叉验证重复25次。

一项对来自交叉验证的个别运行的紧密分析揭示了对于NNMT最佳的别的标志物是FEN1，在所有运行中选择它作为最佳的别的标志物。有两种别的标志物的最佳模型是NNMT加FEN1和ASC。有三种别的标志物的最佳模型是NNMT加FEN1、ASC和Seprase。

分析了自123名表征较好的、依照ATS COPD0-IV期分类的COPD患者衍生的样品（如表2中所示），以及由自健康（n=136）和哮喘患者（n=25）衍生的161份样品组成的对照群组。

在表7中，基于特异性90%，给出这些组合在练习和测试集上的分类性能。

表7中的结果清楚地显示，与NNMT作为单一标志物相比，通过组合一种别的标志物能显著改进灵敏度，而特异性没有任何损失。

表7：特异性90%上的标志物组合

在表8中，基于灵敏度90%，给出这些组合在练习和测试集上的分类性能。表8中的结果清楚地显示，与NNMT作为单一标志物相比，通过组合一种别的标志物能显著改进特异性，而灵敏度没有任何损失。

表8：灵敏度90%上的标志物组合

凭借较之对照群组产生90%特异性的截留值，一般筛选的截留的灵敏度对NNMT是87.1%，对NNMT+FEN1是90.9%，对NNMT+FEN1+ASC是91.9%，而对NNMT+FEN1+ASC+Seprase是93.1%（图8中未显示4标志物组合）。作为接受者操作特征曲线（ROC），图8中显示标志物NNMT和上至3种标志物的标志物组合的结果的图示。

Claims (9)

1.特异性测定蛋白质NNMT的浓度需要的试剂在制备用于在人受试者中体外区分慢性阻塞性肺病(COPD)与哮喘的试剂盒中的用途，其中所述区分包括

a)测定血清、血浆、或全血样品中蛋白质NNMT的浓度，并

b)将步骤(a)中测定得到的蛋白质NNMT浓度与蛋白质NNMT的参照浓度比较，其中高于参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD。

2.依照权利要求1的用途，其中在免疫测定法规程中测量蛋白质NNMT。

3.依照权利要求2的用途，其中该免疫测定法规程是酶联免疫测定法(ELISA)。

4.依照权利要求2或3的用途，其中在夹心式测定法形式中测量NNMT。

5.依照权利要求2或3的用途，其中在竞争性测定法形式中测量NNMT。

6.特异性测定蛋白质NNMT的浓度需要的试剂在制备用于在人血清、血浆、或全血样品中体外区分COPD与哮喘的试剂盒中的用途，其中高于蛋白质NNMT参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD。

7.特异性测定包括蛋白质NNMT和蛋白质FEN1的标志物组的浓度需要的试剂在制备用于在人血清、血浆、或全血样品中体外区分COPD与哮喘的试剂盒中的用途，其中高于蛋白质NNMT参照浓度的蛋白质NNMT浓度指示COPD。

8.依照权利要求7的用途，其中该标志物组包括蛋白质NNMT、FEN1和ASC。

9.依照权利要求7的用途，其中该标志物组包括蛋白质NNMT、FEN1、ASC和表面表达蛋白酶(Seprase)。