CN103411818B - 一种固定生物大分子的改性载玻片及方法 - Google Patents

Abstract

一种固定生物大分子的改性载玻片及方法，其包括载玻片和盖玻片，在载玻片与盖玻片之间设置有一层与载玻片表面共价键连接的改性层，在载玻片上开设有加液孔，改性层为生物素标记的牛血清白蛋白或生物素标记的聚乙二醇衍生物，载玻片为石英载玻片，经生物素标记牛血清白蛋白为每个白蛋白分子6-8个生物素分子，而生物素标记聚乙二醇衍生物与无标记的聚乙二醇衍生物的质量比3%~10%之间。通过加液孔加入中间介质层室温孵育后再加入样品溶液实现对生物分子的固定。很方便对核酸、蛋白质生物分子进行固定，实现生物单分子成像数据采集。

Description

一种固定生物大分子的改性载玻片及方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是指进行生物分子观察分析时，对生物分子在载玻片上的固定方法。

背景技术

分子固定是单分子技术的关键，只有将分子固定之后才能稳定长时间地采集单分子信号。未经过处理的载玻片在中性条件下略带负电荷，对带有正电荷的蛋白质分子有非特异吸附作用，在单分子成像中需要分子的密度足够低，非特异结合使分析者不能有效地控制分子密度。当分子被控制在足够低的条件下，且分子被固定在激发光的焦平面内，这样就可以稳定地采集单分子信号而保证样品不会漂移出物镜观察的窗口。在固定样品时，要保证固定不影响分子功能，并且不能影响标记在生物大分子上的荧光分子极性，极化的荧光小分子发射将使数据处理变得复杂。而通过载玻片表面电荷的非特异结合会提高背景噪音，就无法解决上述两个问题。另外也可以通过将分子固定在凝胶中不需要对分子修饰处理，但凝胶固定方法因分子扩散问题不适于研究分子的相互作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种改性载玻片及通过该载玻片固定生物分子的固定方法，通过对载玻片进行生物素标记的牛血清白蛋白或聚乙二醇的处理，使其可以很方便对核酸、蛋白质生物分子进行固定。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是一种改性载玻片，其包括载玻片和盖玻片，在载玻片与盖玻片之间设置有一层与载玻片表面共价键连接的改性层，其特征在于所述载玻片上开设有至少1个孔，所述改性层为生物素标记的牛血清白蛋白或生物素标记的聚乙二醇衍生物，所述载玻片为石英载玻片，所述聚乙二衍生物由以下方法得到：将净化处理的载玻片置于氨基硅烷溶液中，置于暗环境下10~20分钟，超声波处理1~3分钟，再在暗环境下放置10~20分钟后清洗吹干，在载玻片表面加入经生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液，在暗环境下放置12小时以上生成；所述氨基硅烷溶液浓度为1毫升氨基硅烷加在100毫升甲醇与5毫升醋酸的混合液中，所述经生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液为3.45 ~11. 5毫克生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与115毫克无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯混合溶解在500微升的碳酸氢钠溶液中。

所述载玻片上开设有若干个供溶液加入所述孔，在所述载玻片与盖玻片之间设置有隔离介质将所述改性层隔离为若干个样品池，所述每个样品池具有两个所述孔。

所述隔离介质为胶带。

所述载玻片净化包括：通过有机溶剂进行水浴超声波处理，然后进行碱性溶液水浴超声波处理，再进行清洗吹干。

一种固定生物大分子的方法，其步骤包括：1）载玻片盖玻片净化处理，首先通过有机溶剂进行表面处理，再通过碱性溶液表面处理后水洗吹干；2)载玻片打孔处理，在载玻片上开设有至少一个加液孔；

3）载玻片表面改性处理，在载玻片表面加上经生物素标记的牛血清白蛋白溶液或经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液后盖上盖玻片进行改性处理，生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液处理的载玻片放置在暗环境下12小时以上，牛血清白蛋白溶液处理的载玻片在室温放置30分钟，其中，生物素标记的白蛋白为每个白蛋白分子6-8个生物素分子，经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液中生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯质量含量约为非标记生物素的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯的3%~10%；聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯和甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯纯度大于等于95%；在所述步骤3）中对载玻片进行经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液改性处理前需对载玻片进行改性前处理，将净化处理的载玻片置于氨基硅烷溶液中，放置在暗环境下20~40分钟后清洗吹干，在载玻片表面加经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液进行改性处理； 4)加入中间介质层，在经改性处理的载玻片上的加液孔中加入样品缓冲液冲洗后，加入浓度为1毫克/毫升的链霉亲和素溶液室温孵育5-10分钟；5）加入样品溶液，通过载玻片上的加液孔加入经生物素标记的样品溶液，经生物素标记的牛血清白蛋白对应的样品为经生物素标记的核酸分子，经生物素标记的聚乙二醇衍生物进行改性处理的对应的样品为经生物素标记的蛋白质分子。

所述步骤3）中所述氨基硅烷溶液浓度为1毫升氨基硅烷加在100毫升甲醇与5毫升醋酸的混合液中，所述经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液为3.45-11.5毫克生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与115毫克无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯混合溶解在500微升的碳酸氢钠溶液中。

所述经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液为4.5-5.75毫克生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与115毫克无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯混合溶解在500微升的碳酸氢钠溶液中。

上述步骤1）中，载玻片和盖玻片在丙酮中水浴超声处理，然后在甲醇中水浴超声处理，再在氢氧化钾溶液中水浴超声处理，再在甲醇中水浴超声处理，上述水浴超声处理时间为30分钟；进行甲醇冲洗后用纯净水冲洗至少三遍，然后氮气吹干后烧灼1~2秒。

所述步骤2）中对载玻片的加液孔数至少为两个以上，在进行所述步骤3）的改性处理后，在载玻片和盖玻片之间通过隔离介质隔离形成数个样品池，每个样品池具有添加溶液的所述加液孔。

本发明的生物分子固定的方法，由于改性处理方法简单，经过改性的载玻片可以长时间保存，保存期在半年以内，在进行生物分子固定时，仅需将改性的载玻片取出进行中间介质层的室温短时间孵育即可对生物分子样品进行固定，节省了在每次进行试验数据采集时，需对载玻片进行改性处理的麻烦。节省了生物分子样品数据采集的时间。且由于改性的载玻片上有隔离的若干个样品池，可以同时进行对照组和实验组的试验数据采集，极大程度节省了数据采集时间。

附图说明

图1， 改性载玻片结构示意图。

具体实施方式

 固定生物大分子的载玻片，其包括载玻片和盖玻片，在所述载玻片和盖玻片之间设置有与载玻片以共价建方式连接的改性层，且在载玻片上开设有独立的样品池。

首先进行载玻片净化处理：首先要用锋利的刀片将载玻片上表面残留的物质刮掉，因为载玻片一般都是反复使用的，载玻片表面会残存一些上一次实验剩余的环氧树脂胶。然后将载玻片竖直放置在玻璃容器内，在该容器内加入纯度为99.6%的丙酮，在水浴中超声处理30分钟，随后将丙酮按照规定的污物处理方法倒掉，加入纯度为99.9%甲醇水浴超声处理30分钟。然后将载玻片转移到塑料容器中，因为碱性物质对玻璃有损失。加入4摩尔的氢氧化钾（87.8%,Sigma CAS 1310-58-3）溶液进行水浴超声处理30分钟，再用甲醇水浴超声处理30分钟。随后将载玻片用甲醇冲洗三遍，再用纯净水冲洗三遍以上，用氮气吹干载玻片表面，氮气比较干净，然后在酒精灯上烤1-2秒钟，烧掉残存的有机成分。盖玻片采取和载玻片同样的处理方法。

经上述处理的载玻片在盖上盖玻片后并在四周密封后，没有办法再在载玻片和盖玻片之间加入新的溶液，比如要加入一些其它分子看看观察其对分子动态或功能的影响。因此在载玻片做改性处理前需要对载玻片进行打孔，以增加新的溶液。根据需要，可以在载玻片上打几个微孔，用隔离介质隔离形成若干个样品池，经生物素标记的牛血清白蛋白或经生物素标记的聚乙二醇衍生物

每两个孔就可以组成一个微小的样品池，样品的上下两个面分别是载玻片和盖玻片。在经生物素标记的牛血清白蛋白或聚乙二醇处理后的载玻片上，以每两个孔为一组，在其旁边贴上一圈双面胶带，然后盖上盖玻片，每两孔一组的样品池就通过双面胶带与其他样品池隔开，样品池的厚度就是双面胶带的厚度，样品池大小由双面胶带围成的距离面积决定。在本实施例中，在载玻片1上打6个加液孔3，就可以在一个载玻片上做成三个样品池，样品池间有双面胶带2隔开，一定要紧压胶带使它贴紧粘住载玻片与盖玻片使不同样品池内地液体不能穿过(图1)。做成三个样品池是因为实验时通常有对照组和实验组，这个可以比较一个对照和两个实验组的结果，因为他们在同一个载玻片上且之前经过相同的处理。在钻孔时，钻头一定要垂直于载玻片，此时手要按住载玻片不能让它移动，否则高速转动的钻头和容易打碎载玻片，载玻片通常是石英材料的价格较贵。

对载玻片经生物素标记的牛血清白蛋白的改性处理：

在经过上述处理过的载玻片上，加上生物素标记的牛血清白蛋白溶液，溶液的组分依赖于需要研究分子适合的缓冲液，常见的是用pH7.5,10毫摩尔的Tris-HCl或50毫摩尔NaCl，在本实施中选择Tris-HCl作为缓冲液。生物素标记的牛血清白蛋白用来固定核酸分子，但不能用来固定蛋白质分子，因为小蛋白质在这样的表面容易被变性，而大的蛋白质分子会非常紧的粘附到牛血清白蛋白处理的载玻片表面。通过生物素标记的牛血清白蛋白与没有标记的牛血清白蛋白(BSA)的比例，通过控制标记分子在载玻片表面的密度，实现特异吸附作用。在载玻片上加上生物素标记的牛血清白蛋白溶液后生物素标记的牛血清白蛋白为Sigma A8549010, 8-16摩尔生物素每摩尔牛血清白蛋白，载玻片上用双面胶带隔离形成三个样品池，盖上盖玻片，放置在暗环境中过夜，时间不低于12小时，这样载玻片表面就会覆盖上一层生物素标记的牛血清白蛋白。牛血清白蛋白与载玻片通过正负电荷相互作用结合，石英载玻片在中性条件下通常带负电荷。将处理好的载玻片及盖玻片立刻使用或置于零下80摄氏度左右进行保存，保存期在半年以内。

对载玻片经聚乙二醇的改性处理：

首先，将经过上述处理过载玻片泡在氨基硅烷溶液中浸泡处理，氨基硅烷的型号规格为纯度为98%, UCT SPECIALTIES, LLC公司生产,其化学编号为 CAS#1760-24-3，氨基硅烷溶液为1毫升氨基硅烷加在100毫升甲醇与5毫升醋酸(Fisher Scietific, 纯度>99.9%， A38-212)中形成的混合溶液，放在暗环境中处理10分钟，然后超声1分钟，再在暗环境中放置10分钟。氨基硅烷与石英载玻片表面二氧化硅的羟基反应，形成Si-O-Si硅氧键。然后将载玻片取出用甲醇冲洗三遍，然后用水冲洗三遍，氮气吹干，在每个载玻片表面加上50微升的聚乙二醇衍生物溶液，该聚乙二醇衍生物溶液为4.5毫克生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(Laysan Bio Inc, BIO-PEG-SC-5000)与115毫克无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(Laysan Bio Inc, mPEG-SC-5000)混合溶解在500微升的碳酸氢钠溶液中形成，碳酸氢钠溶液浓度为84毫克的NaHCO₃溶解在10毫升纯水中，溶液为碱性。生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯和无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯的纯度均≧95%。在其他实施例中，仅通过改变经生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯的质量比即可控制生物分子密度。一般加入的经生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯5毫克或5.75毫克 与115毫克的无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(Laysan Bio Inc, mPEG-SC-5000)混合溶解在500微升的碳酸氢钠溶液中形成，碳酸氢钠溶液浓度为84毫克的NaHCO₃溶解在10毫升纯水中，溶液为碱性。也就是说在生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯的质量比控制在约4%~5%之间的比例最好。

载玻片上用双面胶带隔离形成三个样品池，盖上盖玻片，去除气泡，放在暗环境中过夜，时间为12小时以上。生物素标记的和无标记的聚乙二醇是琥珀酰亚胺(NHS酯化)型的，酯化后使聚乙二醇带有NHS功能团，聚乙二醇末端的NHS功能团与氨基硅烷的氨基(NH)反应形成稳定的氨基键。生物素标记的聚乙二醇由于同样有NHS酯化功能团，因此生物素标记的聚乙二醇与非标记的聚乙二醇固定到氨基硅烷的方法是同样的。次日取出载玻片与盖玻片，用水冲洗三遍，然后氮气吹干，可以立刻使用或置于零下80摄氏度保存，保存期在半年以内。因此，通过氨基硅烷处理的载玻片，可以将生物素标记的和非标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺型的聚乙二醇衍生物通过NHS功能团固定在载玻片上。

通过双面胶带隔离形成样品池，在经生物素标记的牛血清白蛋白或经生物素标记的聚乙二醇衍生物进行表面改性处理之前。

聚乙二醇衍生物的疏水侧链由于疏水作用自我聚集成一个薄层，而疏水链两端的亲水基团可以结合其它介质,聚乙二醇可以有效的抑制蛋白质的非特异结合，柔软约3.5纳米的聚乙二醇层可以弥补氨基硅烷层的粗糙性。

生物素标记的聚乙二醇衍生物处理的载玻片可以用来固定蛋白质分子，蛋白质分子与聚乙二醇衍生物没有非特异性相互作用。通过控制标记生物素的和非标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺型衍生物的比例，可以控制标记分子在载玻片表面的密度，一般只有约3~10%的聚乙二醇衍生物是生物素标记的，即聚乙二醇衍生物溶液为3.45~11.5毫克的生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与115毫克无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯混合溶解在500微升的碳酸氢钠溶液中形成。生物素标记的与非标记的聚乙二醇衍生物的比例，根据研究分子的大小，荧光标记的效率等上下略微调节并保持在3%-10%内，通过控制纯度大于95%生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与纯度大于95%的非标记生物素的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯之间的质量比，实现载玻片表面固定的生物分子的低密度，只有低密度的生物分子，才更有利于进行生物单分子的成像数据采集。低于3%时，固定的生物分子密度太低，不易成像数据采集，高于10%时，固定的生物分子密度太高，生物分子间的相互影响会影响成像数据采集。这一比例通常在进行实际操作时，比例控制在约4%~5%之间。

通过生物素标记的牛血清白蛋白或聚乙二醇衍生物处理载玻片的方法中，载玻片经过丙酮，甲醇，氢氧化钾，洗涤剂等处理保证在处理前尽可能干净，且每一步都要水浴超声处理。处理后在酒精灯上烧1-2秒钟去除残存有机成分，过长容易使载玻片破碎，并且不能夹得太紧。每125毫升氨基硅烷溶液可以处理14个载玻片或盖玻片，暗环境中放10分钟，超声1分钟然后在暗环境中再放10分钟。5毫克生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与115毫克无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶解在500微升的碳酸氢钠溶液中，生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液可以处理8-12个载玻片，在暗环境如抽屉中室温放过夜，时间12小时以上。如果将载玻片放置在一个盒子中时，过夜时最好在载玻片下面放一些水，不然载玻片变干而聚乙二醇衍生物溶液会聚集在载玻片表面形成显微镜下可见的污染颗粒。在吹干载玻片与盖玻片时最好用氮气，空气中的污染物或颗粒等可以在载玻片表面聚集。在吹干时，用镊子夹住盖玻片时用力要恰到好处，盖玻片很容易碎，吹干的氮气风不能太强，为保证每个载玻片最后都有几个盖玻片，因为载玻片是聚乙二醇衍生物处理过的更有用，可以多处理几个盖玻片以免破碎等原因引起的数目减少。聚乙二醇处理好的载玻片在室温放置时间不能过长，而且一旦从-80冰箱取出后最好不要再放回去。固定效果可以通过对比加入前后荧光分子的数量多少，在加入样品后要用缓冲液冲洗几遍使悬浮未被固定的分子冲出去。在荧光显微镜镜尤其是近场TIRF显微镜下，固定的荧光标记的分子会留在一个位置持续的发出荧光信号，而且固定的分子始终保持着生物功能和动态变化性质，这样通过固定分子发出的荧光信号我们就可以在体外研究单个分子的生物学功能。

通过生物素标记的牛血清白蛋白或聚乙二醇衍生物处理载玻片可以特异性固定生物大分子，并且不影响生物分子的功能和生物分子上标记的荧光分子极性。固定分子的随机分布均匀，操作简单，处理的载玻片可以长期保存，打孔的载玻片允许同时进行多个样品的观察和随时引入其它分子。这种方法是目前单分子研究中最好的样品固定方法。

通过生物素标记的牛血清白蛋白和聚乙二醇衍生物处理过的载玻片，在进行生物分子固定分析时，通过载玻片上微孔向样品池中添加样品溶液。在加入样品前，用样品的缓冲液冲洗样品池3遍，然后在每个样品池中加入约25微升的浓度为1毫克/毫升的链霉亲和素溶液，链霉亲和素（Streptavidin，货号31000），室温孵育5分钟使链霉亲和素可以结合到载玻片表面牛血清白蛋白或聚乙二醇衍生物上标记的生物素，然后加入生物素标记的样品，样品通过链霉亲和素就固定在载玻片表面了。然后对固定的样品进行单分子荧光，单分子荧光共振能量转移，FIONA(纳米分辩率的荧光成像)等实验数据采集。

链霉亲和素与生物素的结合强度接近共价键且每个链霉亲和素分子上有四个生物素结合位点，然后加入生物素标记的生物分子，生物分子通过生物素与链霉亲和素结合固定在载玻片上。通过对载玻片进行生物素标记的牛血清白蛋白或生物素标记的聚乙二醇衍生物的改性处理，使载玻片通过化学处理与生物素标记的牛血清白蛋白或聚乙二醇衍生物实现近似共价键结合，然后通过链霉亲和素作为中间介质层，与载玻片结合的牛血清白蛋白或聚乙二醇衍生物上标记的生物素，及样品上标记的生物素结合，实现将样品生物分子固定在载玻片上，进行单分子成像数据采集。生物素标记的牛血清白蛋白可以用来固定核酸分子，但不能用来标记蛋白质分子，因为小蛋白质在这样的表面容易被变性，而大的蛋白质分子会非常紧的粘附到牛血清白蛋白处理的载玻片表面。生物素标记的聚乙二醇衍生物用来固定蛋白质分子。通过控制控制标记分子在载玻片表面的密度，一般只有3~10%的聚已二醇衍生物是生物素标记的，且其均匀分布在载玻片表面上，实现载玻片上固定的生物分子的低密度，保证生物分子的低密度，才可以很好的实现对生物单分子的成像数据的采集。

本发明中进行改性处理的载玻片，可以很方便快捷的对核酸分子、蛋白质进行固定。由于在载玻片上设置有用以添加样品的独立样品池，可以随时对各类蛋白质或核酸分子进行固定并进行实验数据采集，本发明尽心改性处理的载玻片，其适应性好。

Claims (9)

1.一种固定生物大分子的改性载玻片，其包括载玻片和盖玻片，在所述载玻片与盖玻片之间设置有一层与所述载玻片表面共价键连接的改性层，其特征在于所述载玻片上开设有至少一个加液孔，所述改性层为生物素标记的牛血清白蛋白或生物素标记的聚乙二醇衍生物，所述载玻片为石英载玻片，所述聚乙二醇衍生物由以下方法得到：将净化处理的载玻片置于氨基硅烷溶液中，置于暗环境下10~20分钟，超声波处理1~3分钟，再在暗环境下放置10~20分钟后清洗吹干，在载玻片表面加入经生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液，在暗环境下放置12小时以上；所述氨基硅烷溶液浓度为1毫升氨基硅烷加在100毫升甲醇与5毫升醋酸的混合液中，所述经生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液为3.45 ~11. 5毫克生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与115毫克无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯混合溶解在500微升的碳酸氢钠溶液中。

2.根据权利要求1所述的一种固定生物大分子的改性载玻片，其特征在于所述载玻片上开设有若干个供溶液加入所述加液孔，在所述载玻片与盖玻片之间设置有隔离介质将所述改性层隔离为若干个样品池，所述每个样品池至少具有两个所述加液孔。

3.根据权利要求2所述的一种固定生物大分子的改性载玻片，其特征在于所述隔离介质为胶带。

4.根据权利要求1所述的一种固定生物大分子的改性载玻片，其特征在于所述载玻片净化包括：通过有机溶剂进行水浴超声波处理，然后进行碱性溶液水浴超声波处理，再进行清洗吹干。

5.一种固定生物大分子的方法，其步骤包括：1）载玻片盖玻片净化处理，首先通过有机溶剂进行表面处理，再通过碱性溶液表面处理后水洗吹干；2)载玻片打孔处理，在所述载玻片上开设有至少一个加液孔；3）载玻片表面改性处理，在载玻片表面加上经生物素标记的牛血清白蛋白溶液或经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液后盖上盖玻片进行改性处理，生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液处理的载玻片放置在暗环境下12小时以上，牛血清白蛋白溶液处理的载玻片在室温放置30分钟，其中，生物素标记的白蛋白为每个白蛋白分子6-8个生物素分子，经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液中生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯质量含量为非标记生物素的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯的3%~10%；聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯和甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯纯度大于等于95%；在所述步骤3）中对载玻片进行经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液改性处理前需对载玻片进行改性前处理，将净化处理的载玻片置于氨基硅烷溶液中，放置在暗环境下20~40分钟后清洗吹干，在载玻片表面加经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液进行改性处理； 4)加入中间介质层，在经改性处理的载玻片上的加液孔中加入样品缓冲液冲洗后，加入浓度为1毫克/毫升的链霉亲和素溶液室温孵育5~10分钟；5）加入样品溶液，通过载玻片上的加液孔加入经生物素标记的样品溶液，经生物素标记的牛血清白蛋白对应的样品为经生物素标记的核酸分子，经生物素标记的聚乙二醇衍生物进行改性处理的对应的样品为经生物素标记的蛋白质分子。

6.根据权利要求5所述的固定生物大分子的方法，其特征在于所述步骤3）中所述氨基硅烷溶液浓度为1毫升氨基硅烷加在100毫升甲醇与5毫升醋酸的混合液中，所述经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液为3.45-11.5毫克生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与115毫克无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯混合溶解在500微升的碳酸氢钠溶液中。

7.根据权利要求6所述的固定生物大分子的方法，其特征在于所述经生物素标记的聚乙二醇衍生物溶液为4.5-5.75毫克生物素标记的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与115毫克无标记的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯混合溶解在500微升的碳酸氢钠溶液中。

8.根据权利要求5所述的固定生物大分子的方法，其特征在于步骤1）中，载玻片和盖玻片在丙酮中水浴超声处理，然后在甲醇中水浴超声处理，再在氢氧化钾溶液中水浴超声处理，再在甲醇中水浴超声处理，上述水浴超声处理时间为30分钟；进行甲醇冲洗后用纯净水冲洗至少三遍，然后氮气吹干后烧灼1~2秒。

9.根据权利要求5所述的固定生物大分子的方法，其特征在于所述步骤2）中对载玻片的加液孔数至少为两个以上，在进行所述步骤3）的改性处理前，在载玻片和盖玻片之间通过隔离介质隔离形成数个样品池，每个样品池具有添加溶液的所述加液孔。