CN103409520A - 同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的pcr试剂盒及其制备方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒及其制备方法和使用方法，属于人畜共患传染病病原体的基因检测领域，该PCR试剂盒由PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成；PCR反应液包括鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的四对引物和含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液。该PCR试剂盒实用性强，可直接检测样品中污染的布鲁氏菌的种型，检测速度快，灵敏度高，灵敏度达到102cfu/mL，特异性强，可重复性好，安全可靠、快速简便，可对样品中的布鲁氏菌的种型进行定性检测，可替代传统的病原学和血清学方法。
Description
技术领域
本发明涉及人畜共患传染病病原体的基因检测技术领域，具体涉及一种同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒及其制备方法和使用方法。
背景技术
布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，为革兰氏阴性球杆菌，牛、羊、猪、狗、马、鹿、骆驼、人易感。布鲁氏菌侵袭力很强，主要是通过消化道感染，完整的皮肤粘膜也能受到布鲁氏菌的侵入，造成布鲁氏菌病。
布鲁氏菌病（Brucellosis），又称地中海弛张热，波浪热，是一种世界范围内流行的人畜共患传染病。世界布鲁氏菌病的患者约有500～600万人，每年新发病人约有50万，我国受布鲁氏菌病威胁的人口约有3.5亿，该病不仅能够造成巨大的经济损失，而且在疾病流行地区可引发人群的高发病率，因此对布鲁氏菌病的检疫和防控显得尤为重要。
布鲁氏菌属由9个种组成，分别是牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌、沙林鼠种布鲁氏菌、田鼠型布鲁氏菌、鳍型布鲁氏菌和鲸型布鲁氏菌。
目前，布鲁氏菌的检测以血清学方法为主，但没有统一标准，血清学方法检测只能达到布鲁氏菌属的水平，不能区别是哪种布鲁氏菌种型引起的布鲁氏菌病，且存在交叉反应，严重影响了布鲁氏菌病的诊断、流行病学调查和疫病预防。
以PCR试剂盒为基础的布鲁氏菌检测方法较传统的血清学方法更为适用，而且用于布鲁氏菌种属和生物型鉴定的PCR检测方法在不断的发展和完善之中。因此，建立一种能同时鉴别牛羊猪犬这四个种的布鲁氏菌的多重PCR检测方法，对于布鲁氏菌病的检疫和防控具有非常重要的意义。
发明内容
为了解决现有的以血清学方法检测布鲁氏菌无法同时区分引起感染的种型的问题，本发明提供一种同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒及其制备方法和使用方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒，该PCR试剂盒由PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成；
所述PCR反应液包括鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的四对引物，分别为PIS711f和P494r，PIS711f和P732r，P591f和P591r，P272f和P272r：
正向引物PIS711f：5′-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′，
反向引物P494r：5′-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′，
反向引物P732r：5′-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3′，
正向引物P591f：5′-CTGGTGGGTATCGCATTACTCGG-3′，
反向引物P591r：5′-TTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG-3′，
正向引物P272f：5′-GGAACACTACGCCACCTTGT-3′，
反向引物P272r：5′-GATGGAGCAAACGCTGAAG-3′；
所述阳性质控标准品包括牛种布鲁氏菌阳性质控标准品、羊种布鲁氏菌阳性质控标准品、猪种布鲁氏菌阳性质控标准品和犬种布鲁氏菌阳性质控标准品；
所述牛种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述羊种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述猪种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述犬种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成；
所述含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒、含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒、含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒均能在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；
所述含有494个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-gacgaacggaatttttccaatcccatcgtttccgtttcacttggcctgccggcaacgtttcagtttggcggaatgaaacggacggacccgatcaccaaatatatcctgcaccatggcgacgtggttgtctggggcgggccgtcgcggcttttctatcacggtattctaccattgaagtctggcgagcatgagcggctggggccgtttcggcttaatctgaccttccgaaaggcgttctagggcgtgtctgcatttaacgtaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaaacccatgaatgcggtcaatgttttctcgcatcgcagcgcaatacgacgatagcgtttcaacttgttaaaaaagcattcaatctgatggcgttccttgtacagcctccagtcgattgttggggcactggaacgtgttggattgaccttgatctgagccgttgccttgagatcgctggcaatgaaggcccttaagtgatcggca-3′，
所述含有732个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-tgccgatcacttaagggccttcattgccagcaatctcaaggcaacggctcagatcaaggtcaatccaacacgttccagtgtcccaacaatcgactggaggctgtacaaggaacgccatcagattgaatgcttttttaacaagttgaaacgctatcgtcgtattgcgctgcgatgcgagaaaacattgaccgcattcatgggcttcgtccatctcgcatgcgctatgatctggttacgttgaatgcagacacgccctaggggtgaatctggaaattgtcagaaagacagtgcttcgtcacgctagagcgctcgctgccatacttgcaacagtgacagcgataattgccgttattggctggtggcagggcgaagattggcgggtaagctattccaatctcgctattgttaatggcgtctattggatattactgctctaccttctgtggattattctgagccgaaacactcctgattttttaggggtgccgcttgttaaggcgattcacgacaagaaacttcttatagtcgatggtgcaccatggctaagtttgggtgtcatgaccgcgatttacgtcaaagacggtgaatatgagcggcttgtgtgcaccggagaggtagtaaacgttcagacaaataagctggttcagattcatatccggggttatgaagaaatttataacgatatcgaagctgttggtgaaaaacttaatcagaccagcaaggacgcgattt-3′，
所述含有591个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-ctggtgggtatcgcattactcggcgccctggggctgacggggctgacaagtagcggcatcggggcggtggctgccggcgggcttctcggttttgccctgttcaaccgcccgcctgccagcatttttctcggcgattccggaagccccccattggggctgatcgtaggaacagccttgctgctgcttgcgcgtgaaacacacatcgtggtcgcgcttgttctgccgctttattatattctggatgcgggcaccacaattgtcatgcgtgcagcccaaggtgagaacatcctcaaggctcactcgaaacatgcctatcagatagcaaaacgcagtggctggagtgtgccgaaagtggtggcccatgtggcgcttttaaatacaatcctgatcgcctgcgtggtggccttgctggcgctggatcatccgctcgcacaactgacatttctgctggtcgcagccgttgccacactcattctgctgctcgatttccgcgggcgcttcaggaagctatgacctcgaaaagcaccttgcggaccatttcgatatccttcttttccatggcggtccgcagtaccgccaggctttcctgaa-3′，
所述含有272个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-gatggagcaaacgctgaagcccaagcgaggccccgaaatagaccaggaagagcgtcaggagttccggcagaccgcgaaagatggtggtgtagatattagccgcaagccgcatcgaaggttcgctggactgcttgcccagagcgaccagaaaaccgaggatgagaccaacgggaagtgtggcgagtgccagactgacggtaacaagaagtcctttggcaatgctgataccccagccatcgggaccgaaactcaacaaggtggcgtagtgttcc-3′。
所述PCR反应液还包括含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液。
所述含有494个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌标准菌株544A中克隆得到，所述含有732个碱基的核苷酸片段是从羊种布鲁氏菌标准菌株16M中克隆得到，所述含有591个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌标准菌株544A、羊种布鲁氏菌标准菌株16M、猪种布鲁氏菌标准菌株1330S中同时克隆并测序一致后从中取出的一个标准品，所述含有272个碱基的核苷酸片段是从犬种布鲁氏菌标准菌株RM6/66中克隆得到。
所述阴性质控标准品为无菌双蒸水。
本发明还提供了同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒的制备方法，该方法的条件和步骤如下：
（1）配制PCR反应液：所述PCR反应液由鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的四对引物和含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液组成，所述四对引物分别为PIS711f和P494r，PIS711f和P732r，P591f和P591r，P272f和P272r：
正向引物PIS711f：5′-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′，
反向引物P494r：5′-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′，
反向引物P732r：5′-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3′，
正向引物P591f：5′-CTGGTGGGTATCGCATTACTCGG-3′，
反向引物P591r：5′-TTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG-3′，
正向引物P272f：5′-GGAACACTACGCCACCTTGT-3′，
反向引物P272r：5′-GATGGAGCAAACGCTGAAG-3′；
（2）建立阳性质控标准品：
所述阳性质控标准品包括牛种布鲁氏菌阳性质控标准品、羊种布鲁氏菌阳性质控标准品、猪种布鲁氏菌阳性质控标准品和犬种布鲁氏菌阳性质控标准品；
所述牛种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述羊种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述猪种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述犬种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成；
所述含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒、含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒、含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒均能在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；
所述含有494个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-gacgaacggaatttttccaatcccatcgtttccgtttcacttggcctgccggcaacgtttcagtttggcggaatgaaacggacggacccgatcaccaaatatatcctgcaccatggcgacgtggttgtctggggcgggccgtcgcggcttttctatcacggtattctaccattgaagtctggcgagcatgagcggctggggccgtttcggcttaatctgaccttccgaaaggcgttctagggcgtgtctgcatttaacgtaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaaacccatgaatgcggtcaatgttttctcgcatcgcagcgcaatacgacgatagcgtttcaacttgttaaaaaagcattcaatctgatggcgttccttgtacagcctccagtcgattgttggggcactggaacgtgttggattgaccttgatctgagccgttgccttgagatcgctggcaatgaaggcccttaagtgatcggca-3′，
所述含有732个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-tgccgatcacttaagggccttcattgccagcaatctcaaggcaacggctcagatcaaggtcaatccaacacgttccagtgtcccaacaatcgactggaggctgtacaaggaacgccatcagattgaatgcttttttaacaagttgaaacgctatcgtcgtattgcgctgcgatgcgagaaaacattgaccgcattcatgggcttcgtccatctcgcatgcgctatgatctggttacgttgaatgcagacacgccctaggggtgaatctggaaattgtcagaaagacagtgcttcgtcacgctagagcgctcgctgccatacttgcaacagtgacagcgataattgccgttattggctggtggcagggcgaagattggcgggtaagctattccaatctcgctattgttaatggcgtctattggatattactgctctaccttctgtggattattctgagccgaaacactcctgattttttaggggtgccgcttgttaaggcgattcacgacaagaaacttcttatagtcgatggtgcaccatggctaagtttgggtgtcatgaccgcgatttacgtcaaagacggtgaatatgagcggcttgtgtgcaccggagaggtagtaaacgttcagacaaataagctggttcagattcatatccggggttatgaagaaatttataacgatatcgaagctgttggtgaaaaacttaatcagaccagcaaggacgcgattt-3′，
所述含有591个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-ctggtgggtatcgcattactcggcgccctggggctgacggggctgacaagtagcggcatcggggcggtggctgccggcgggcttctcggttttgccctgttcaaccgcccgcctgccagcatttttctcggcgattccggaagccccccattggggctgatcgtaggaacagccttgctgctgcttgcgcgtgaaacacacatcgtggtcgcgcttgttctgccgctttattatattctggatgcgggcaccacaattgtcatgcgtgcagcccaaggtgagaacatcctcaaggctcactcgaaacatgcctatcagatagcaaaacgcagtggctggagtgtgccgaaagtggtggcccatgtggcgcttttaaatacaatcctgatcgcctgcgtggtggccttgctggcgctggatcatccgctcgcacaactgacatttctgctggtcgcagccgttgccacactcattctgctgctcgatttccgcgggcgcttcaggaagctatgacctcgaaaagcaccttgcggaccatttcgatatccttcttttccatggcggtccgcagtaccgccaggctttcctgaa-3′，
所述含有272个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-gatggagcaaacgctgaagcccaagcgaggccccgaaatagaccaggaagagcgtcaggagttccggcagaccgcgaaagatggtggtgtagatattagccgcaagccgcatcgaaggttcgctggactgcttgcccagagcgaccagaaaaccgaggatgagaccaacgggaagtgtggcgagtgccagactgacggtaacaagaagtcctttggcaatgctgataccccagccatcgggaccgaaactcaacaaggtggcgtagtgttcc-3′；
（3）阴性质控标准品：所述阴性质控标准品为无菌双蒸水。
所述含有494个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌标准菌株544A中克隆得到，所述含有732个碱基的核苷酸片段是从羊种布鲁氏菌标准菌株16M中克隆得到，所述含有591个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌标准菌株544A、羊种布鲁氏菌标准菌株16M、猪种布鲁氏菌标准菌株1330S中同时克隆并测序一致后从中取出的一个标准品，所述含有272个碱基的核苷酸片段是从犬种布鲁氏菌标准菌株RM6/66中克隆得到。
本发明还提供了同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒的使用方法，该方法的条件和步骤如下：
（1）对待检测的样本提取样本DNA；
（2）以提取的样本DNA为模板，将样本DNA、阳性质控标准品和阴性质控标准品分别加入到含有PCR反应液和DNA聚合酶的管中，按照经过优化后的PCR反应条件进行扩增：95℃5min，94℃30sec、62℃30sec、72℃30sec，30个循环，72℃10min；
（3）取5μLPCR产物，以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察牛种布鲁氏菌扩增出494bp和591bp的条带，羊种布鲁氏菌扩增出732bp和591bp的条带，猪种布鲁氏菌扩增出272bp和591bp的条带，犬种布鲁氏菌扩增出272bp的条带。
所述待检测的样本为牛奶、采用液体培养基增菌的牛肉、采用液体培养基增菌的羊肉、采用液体培养基增菌的猪肉和采用液体培养基增菌的狗肉。
所述PCR反应液由鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的四对引物和含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液组成；
所述四对引物分别为PIS711f和P494r，PIS711f和P732r，P591f和P591r，P272f和P272r：
正向引物PIS711f：5′-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′，
反向引物P494r：5′-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′，
反向引物P732r：5′-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3′，
正向引物P591f：5′-CTGGTGGGTATCGCATTACTCGG-3′，
反向引物P591r：5′-TTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG-3′，
正向引物P272f：5′-GGAACACTACGCCACCTTGT-3′，
反向引物P272r：5′-GATGGAGCAAACGCTGAAG-3′。
发明原理：本发明是通过研究牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌***序列IS711拷贝数的差异以及牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌全基因序列比对后的缺失部分设计引物，根据PCR扩增片段大小的差异最终鉴别牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌。
IS711是布鲁氏菌基因组中特有的***序列，该序列在不同种布鲁氏菌基因组中非常保守，但却存在拷贝数差异，根据牛种和羊种布鲁氏菌中***序列IS711位置的不同设计两对引物，这两对引物分别为：PIS711f和P494r，PIS711f和P732r，即牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌的一个引物同时锚定在***序列IS711上作为公共序列，另一个引物分别选在与***序列IS711邻近的单染色体DNA上，代表种的特异性，选择公共序列和保守序列之间的区域作为扩增区域，通过PCR扩增片段的长度来鉴别牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌。
脂多糖是布鲁氏菌的主要抗原和毒力因子，光滑型布鲁氏菌的脂多糖由脂质A、核心寡糖和O-侧链基因组成，犬种布鲁氏菌属于粗糙型布鲁氏菌，缺少O-侧链基因，通过分析O-侧链基因的多态性，发现光滑型布鲁氏菌和粗糙型布鲁氏菌的显著差异在于wbkF基因和wbkD基因，这两个毗连的基因与诱导O-侧链基因聚合作用的细菌萜醇有关。犬种布鲁氏菌在wbkF-wbkD区域存在部分缺失，通过扩增wbkF-wbkD区域的基因，并与牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌进行序列比较，得知犬种布鲁氏菌RM6/66（ATCC23365）缺失351bp，在wbkF-wbkD区域缺失的具***置是从wbkD核苷酸1594（inBMEI1426）到wbkF核苷酸918（inBMEI1427），所以在缺失的wbkF-wbkD区域内设计一条引物，缺失的wbkF-wbkD区域外设计另一条引物，采用设计的这一对引物鉴定犬种布鲁氏菌，这一对引物为P591f和P591r。
根据牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的全基因序列比对，牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌在ABC转运结合蛋白（BR0951-BR0955）上缺失2653bp，进而在此缺失区域内设计一对引物用来鉴定猪种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌，这一对引物为P272f和P272r。
综上，本发明根据布鲁氏菌染色体中的遗传成分IS711种特异性定位引起的多态现象，以及牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌在ABC转运结合蛋白（BR0951-BR0955）上缺失2653bp，犬种布鲁氏菌在wbkF-wbkD区域缺失351bp，设计四对引物，从而建立牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的多重PCR检测方法。
根据PCR扩增片段长度判定布鲁氏菌属于牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌中的哪一种型，其中扩增片段长度分别为：牛种布鲁氏菌498bp和591bp，羊种布鲁氏菌731bp和591bp，猪种布鲁氏菌272bp和591bp，犬种布鲁氏菌272bp。
本发明利用Prmier5.0软件，对牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌进行引物设计。
本发明的有益效果是：
本发明的PCR试剂盒实用性强，可以同时检测牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌，检测能达到布鲁氏菌种的水平，并且能区别是由哪种布鲁氏菌种型引起的布鲁氏菌病，且不存在交叉反应，可直接检测样品中污染的布鲁氏菌的种型，检测速度快，灵敏度高，灵敏度达到102cfu/mL，特异性强，可重复性好，使用安全可靠、快速简便，可以对样品中的布鲁氏菌的种型进行定性检测，可以替代传统的病原学和血清学方法，在一般的实验室就可以操作，适合批量检测，完全可以推广应用，对于布鲁氏菌病的诊断、流行病学调查和疫病预防有很大的推动作用。
附图说明
图1为第一批次PCR试剂盒的重复性检测电泳图；
图2为第二批次PCR试剂盒的重复性检测电泳图；
图3为第三批次PCR试剂盒的重复性检测电泳图；
图1至图3中：M是DL1000DNAMarker，1是牛种布鲁氏菌S19第一次PCR扩增结果，2是羊种布鲁氏菌M5第一次PCR扩增结果，3是猪种布鲁氏菌S2第一次PCR扩增结果，4是犬种布鲁氏菌RM6/66第一次PCR扩增结果，5是牛种布鲁氏菌S19第二次PCR扩增结果，6是羊种布鲁氏菌M5第二次PCR扩增结果，7是猪种布鲁氏菌S2第二次PCR扩增结果，8是犬种布鲁氏菌RM6/66第二次PCR扩增结果，9是牛种布鲁氏菌S19第三次PCR扩增结果，10是羊种布鲁氏菌M5第三次PCR扩增结果，11是猪种布鲁氏菌S2第三次PCR扩增结果，12是犬种布鲁氏菌RM6/66第三次PCR扩增结果，13是牛种布鲁氏菌S19第四次PCR扩增结果，14是羊种布鲁氏菌M5第四次PCR扩增结果，15是猪种布鲁氏菌S2第四次PCR扩增结果，16是犬种布鲁氏菌RM6/66第四次PCR扩增结果，17是牛种布鲁氏菌S19第五次PCR扩增结果、18是羊种布鲁氏菌M5第五次PCR扩增结果，19是猪种布鲁氏菌S2第五次PCR扩增结果，20是犬种布鲁氏菌RM6/66第五次PCR扩增结果，21是阴性对照。
图4为本发明的PCR试剂盒的特异性检测电泳图；
图中：M是DL1000DNAMarker，1是牛种布鲁氏菌S19的PCR扩增结果，2是羊种布鲁氏菌M5的PCR扩增结果，3是猪种布鲁氏菌S2的PCR扩增结果，4是犬种布鲁氏菌RM6/66的PCR扩增结果，5是沙门氏菌的PCR扩增结果，6是单增李斯特菌的PCR扩增结果，7是小肠结肠炎耶尔森氏菌O:9的PCR扩增结果，8是大肠杆菌O157:H7的PCR扩增结果，9是大肠杆菌的PCR扩增结果，10是金黄色葡萄球菌的PCR扩增结果，11是猪链球菌2型的PCR扩增结果，12是阴性对照。
图5为阳性质控标准品中，由含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒的敏感性检测电泳图；
图6为阳性质控标准品中，由含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒的敏感性检测电泳图；
图7为阳性质控标准品中，由含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒的敏感性检测电泳图；
图8为阳性质控标准品中，由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒的敏感性检测电泳图；
图5至图8中：M是DL1000DNAMarker，1～9是10倍倍比稀释的阳性重组质粒，1是1.0×101copies/μL，2是1.0×102copies/μL，3是1.0×103copies/μL，4是1.0×104copies/μL，5是1.0×105copies/μL，6是1.0×106copies/μL，7是1.0×107copies/μL，8是1.0×108copies/μL，9是1.0×109copies/μL。
图9为本发明的PCR试剂盒对细菌参考品（牛种布鲁氏菌S19）的敏感性检测电泳图；
图中：M是DL1000DNAMarker，0～9是10倍倍比稀释牛种布鲁氏菌S19基因组DNA的PCR扩增图，0的浓度为1.1×100cfu/mL，1的浓度为1.1×101cfu/mL，2的浓度为1.1×102cfu/mL，3的浓度为1.1×103cfu/mL，4的浓度为1.1×104cfu/mL，5的浓度为1.1×105cfu/mL，6的浓度为1.1×106cfu/mL，7的浓度为1.1×107cfu/mL，8的浓度为1.1×108cfu/mL，9的浓度为1.1×109cfu/mL，10是阴性对照。
图10为本发明的PCR试剂盒对细菌参考品（羊种布鲁氏菌M5）的敏感性检测电泳图；
图中：M是DL1000DNAMarker，0～9是10倍倍比稀释羊种布鲁氏菌M5基因组DNA的PCR扩增图，0的浓度为5.1×100cfu/mL，1的浓度为5.1×101cfu/mL，2的浓度为5.1×102cfu/mL，3的浓度为5.1×103cfu/mL，4的浓度为5.1×104cfu/mL，5的浓度为5.1×105cfu/mL，6的浓度为5.1×106cfu/mL，7的浓度为5.1×107cfu/mL，8的浓度为5.1×108cfu/mL，9的浓度为5.1×109cfu/mL，10是阴性对照。
图11为本发明的PCR试剂盒对细菌参考品（猪种布鲁氏菌S2）的敏感性检测电泳图；
图中，M是DL1000DNAMarker，0～9是10倍倍比稀释猪种布鲁氏菌S2基因组DNA的PCR扩增图，0的浓度为3.5×100cfu/mL，1的浓度为3.5×101cfu/mL，2的浓度为3.5×102cfu/mL，3的浓度为3.5×103cfu/mL，4的浓度为3.5×104cfu/mL，5的浓度为3.5×105cfu/mL，6的浓度为3.5×106cfu/mL，7的浓度为3.5×107cfu/mL，8的浓度为3.5×108cfu/mL，9的浓度为3.5×109cfu/mL，10是阴性对照。
图12为本发明的PCR试剂盒对细菌参考品（犬种布鲁氏菌RM6/66）的敏感性检测电泳图；
图中：M是DL1000DNAMarker，0～9是10倍倍比稀释犬种布鲁氏菌RM6/66基因组DNA的PCR扩增图，0的浓度为2.5×100cfu/mL，1的浓度为2.5×101cfu/mL，2的浓度为2.5×102cfu/mL，3的浓度为2.5×103cfu/mL，4的浓度为2.5×104cfu/mL，5的浓度为2.5×105cfu/mL，6的浓度为2.5×106cfu/mL，7的浓度为2.5×107cfu/mL，8的浓度为2.5×108cfu/mL，9的浓度为2.5×109cfu/mL，10是阴性对照。
图13为牛种布鲁氏菌S19人工感染牛奶样品的敏感性检测电泳图；
图14为羊种布鲁氏菌M5人工感染牛奶样品的敏感性检测电泳图；
图15为猪种布鲁氏菌S2人工感染牛奶样品的敏感性检测电泳图；
图16为犬种布鲁氏菌RM6/66人工感染牛奶样品的敏感性检测电泳图；
图13至图16中：M是DL1000DNAMarker，0的浓度为1.0×100cfu/mL，1的浓度为1.0×101cfu/mL，2的浓度为1.0×102cfu/mL，3的浓度为1.0×103cfu/mL，4的浓度为1.0×104cfu/mL，5的浓度为1.0×105cfu/mL，6的浓度为1.0×106cfu/mL，7的浓度为1.0×107cfu/mL，8的浓度为1.0×108cfu/mL，9的浓度为1.0×109cfu/mL，10是阴性对照。
具体实施方式
实验材料：
牛种布鲁氏菌标准菌株544A（B.abortus544A）、牛种布鲁氏菌疫苗株S19（B.abortusS19）、羊种布鲁氏菌标准菌株16M（B.melitensis16M）、羊种布鲁氏菌疫苗株M5（B.melitensisM5）、猪种布鲁氏菌标准菌株1330S（B.suis1330S）、犬种布鲁氏菌标准菌株RM6/66（B.canisRM6/66）、单增李斯特菌（CMCC54002）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森氏菌O:9、沙门氏菌、猪链球菌2型、大肠杆菌（CMCC44102）均由中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所兽医微生物与免疫学实验室保存；
猪种布鲁氏菌疫苗株S2（B.suisS2）由中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所冯书章研究员惠赠；
PCR引物由华大基因有限公司合成；
MultiplexPCRAssayKit、pMD-18T载体、DNAMakrerDL1000、大肠杆菌DH5α感受态细胞均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；
DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；
TSB培养基购自FLUKA公司；
琼脂糖购自西班牙Biowest公司。
实验仪器：
凝胶图像分析仪选择法国VILBERLOURMAT公司的型号为x-press的凝胶图像分析仪；
稳压稳流电泳仪选择北京市六一仪器厂的型号为DYY-6B的稳压稳流电泳仪；
PCR仪选择Thermo公司的型号为ThermalCyclerPX2的PCR仪。
实施例1本发明的同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒的使用方法如下：
（1）对待检测的样本提取样本DNA，待检测的样本为牛奶、采用液体培养基增菌的牛肉、采用液体培养基增菌的羊肉、采用液体培养基增菌的猪肉、采用液体培养基增菌的狗肉等；
（2）以提取的样本DNA为模板，将样本DNA、阳性质控标准品和阴性质控标准品分别加入到含有PCR反应液和DNA聚合酶的管中，按照经过优化后的PCR反应条件进行扩增：95℃5min，94℃30sec、62℃30sec、72℃30sec，30个循环，72℃10min；PCR扩增效果直接影响检测的敏感度和特异性，为此需要对PCR反应体系和反应条件中的引物浓度、退火温度、退火时间、循环次数、延伸时间等参数进行优化，PCR反应条件的优化采用现有技术，最终优化后的PCR反应条件为：引物浓度为7.5μmol/L，退火温度为62℃、退火时间30sec、循环次数30次、延伸时间30sec；
（3）取5μLPCR产物，以1.5%琼脂糖凝胶电泳（120V20min）进行检测，观察牛种布鲁氏菌是否扩增出494bp和591bp的条带，羊种布鲁氏菌是否扩增出732bp和591bp的条带，猪种布鲁氏菌是否扩增出272bp和591bp的条带，犬种布鲁氏菌是否扩增出272bp的条带，如果扩增出494bp和591bp的条带，说明待检测的样本中的含有牛种布鲁氏菌；如果扩增出732bp和591bp的条带，说明待检测的样本中的含有羊种布鲁氏菌；如果扩增出272bp和591bp的条带，说明待检测的样本中的含有猪种布鲁氏菌；如果扩增出272bp的条带，说明待检测的样本中的含有犬种布鲁氏菌。
实施例2PCR试剂盒的组装
（1）配制PCR反应液：
①设计四对鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的引物：分别为PIS711f和P494r，PIS711f和P732r，P591f和P591r，P272f和P272r：
正向引物PIS711f：5′-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′，
反向引物P494r：5′-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′，
反向引物P732r：5′-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3′，
正向引物P591f：5′-CTGGTGGGTATCGCATTACTCGG-3′，
反向引物P591r：5′-TTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG-3′，
正向引物P272f：5′-GGAACACTACGCCACCTTGT-3′，
反向引物P272r：5′-GATGGAGCAAACGCTGAAG-3′；
②PCR反应液的配制：PCR反应液由鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的四对引物和含有dNTPs、Mg2+、双蒸水（ddH2O）的PCR缓冲剂组成，PCR反应液的总体积为47.8μL，每条引物的量为1μL（引物浓度为7.5μmol/L），含有dNTPs、Mg2+、双蒸水（ddH2O）的PCR缓冲剂的总量为39.8μL，其中的双蒸水（ddH2O）为14.8μL；
（2）建立阳性质控标准品：
①细菌的培养：TSA平板划线复苏牛种布鲁氏菌标准菌株544A（B.abortus544A）、羊种布鲁氏菌标准菌株16M（B.melitensis16M）、猪种布鲁氏菌标准菌株1330S（B.suis1330S）、犬种布鲁氏菌标准菌株RM6/66（B.canisRM6/66），37℃培养48h，分别挑取单菌落于TSB液体培养基37℃培养48h，180r/min；
②模板DNA的提取：分别对牛种布鲁氏菌标准菌株544A、羊种布鲁氏菌标准菌株16M、猪种布鲁氏菌标准菌株1330S、犬种布鲁氏菌标准菌株RM6/66的菌液提取DNA；
③PCR扩增：以提取的DNA为模板，按照PCR反应体系：DNA模板2μL、DNA聚合酶0.2μL、PCR反应液47.8μL，PCR反应条件为：95℃5min，94℃30sec、62℃30sec、72℃30sec，30个循环，72℃10min，在PCR仪上扩增序列片段，以1.5%的琼脂糖凝胶电泳（120V20min）鉴定PCR目的产物；
④重组质粒的菌液鉴定：利用凝胶回收试剂盒对PCR目的产物回收，连接pMD-18T载体，转化，菌液PCR鉴定；
⑤重组质粒的测序鉴定：选取阳性菌液，提取pMD-18T重组质粒进行测序，测序结果用Blast比对，结果与预扩增序列完全一致，表明***片段正确无突变；
⑥阳性质控标准品的建立：将测序正确的阳性菌液于37℃摇床中培养增菌，采用质粒提取试剂盒提取重组质粒，即获得所需的阳性质控标准品；
所说的阳性质控标准品包括牛种布鲁氏菌阳性质控标准品、羊种布鲁氏菌阳性质控标准品、猪种布鲁氏菌阳性质控标准品和犬种布鲁氏菌阳性质控标准品；
所说的牛种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成；所说的羊种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成；所说的猪种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成；所说的犬种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成；
所说的含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒、含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒、含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒均能在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；
所说的含有494个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-gacgaacggaatttttccaatcccatcgtttccgtttcacttggcctgccggcaacgtttcagtttggcggaatgaaacggacggacccgatcaccaaatatatcctgcaccatggcgacgtggttgtctggggcgggccgtcgcggcttttctatcacggtattctaccattgaagtctggcgagcatgagcggctggggccgtttcggcttaatctgaccttccgaaaggcgttctagggcgtgtctgcatttaacgtaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaaacccatgaatgcggtcaatgttttctcgcatcgcagcgcaatacgacgatagcgtttcaacttgttaaaaaagcattcaatctgatggcgttccttgtacagcctccagtcgattgttggggcactggaacgtgttggattgaccttgatctgagccgttgccttgagatcgctggcaatgaaggcccttaagtgatcggca-3′，
所说的含有732个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-tgccgatcacttaagggccttcattgccagcaatctcaaggcaacggctcagatcaaggtcaatccaacacgttccagtgtcccaacaatcgactggaggctgtacaaggaacgccatcagattgaatgcttttttaacaagttgaaacgctatcgtcgtattgcgctgcgatgcgagaaaacattgaccgcattcatgggcttcgtccatctcgcatgcgctatgatctggttacgttgaatgcagacacgccctaggggtgaatctggaaattgtcagaaagacagtgcttcgtcacgctagagcgctcgctgccatacttgcaacagtgacagcgataattgccgttattggctggtggcagggcgaagattggcgggtaagctattccaatctcgctattgttaatggcgtctattggatattactgctctaccttctgtggattattctgagccgaaacactcctgattttttaggggtgccgcttgttaaggcgattcacgacaagaaacttcttatagtcgatggtgcaccatggctaagtttgggtgtcatgaccgcgatttacgtcaaagacggtgaatatgagcggcttgtgtgcaccggagaggtagtaaacgttcagacaaataagctggttcagattcatatccggggttatgaagaaatttataacgatatcgaagctgttggtgaaaaacttaatcagaccagcaaggacgcgattt-3′，
所说的含有591个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-ctggtgggtatcgcattactcggcgccctggggctgacggggctgacaagtagcggcatcggggcggtggctgccggcgggcttctcggttttgccctgttcaaccgcccgcctgccagcatttttctcggcgattccggaagccccccattggggctgatcgtaggaacagccttgctgctgcttgcgcgtgaaacacacatcgtggtcgcgcttgttctgccgctttattatattctggatgcgggcaccacaattgtcatgcgtgcagcccaaggtgagaacatcctcaaggctcactcgaaacatgcctatcagatagcaaaacgcagtggctggagtgtgccgaaagtggtggcccatgtggcgcttttaaatacaatcctgatcgcctgcgtggtggccttgctggcgctggatcatccgctcgcacaactgacatttctgctggtcgcagccgttgccacactcattctgctgctcgatttccgcgggcgcttcaggaagctatgacctcgaaaagcaccttgcggaccatttcgatatccttcttttccatggcggtccgcagtaccgccaggctttcctgaa-3′，
所说的含有272个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-gatggagcaaacgctgaagcccaagcgaggccccgaaatagaccaggaagagcgtcaggagttccggcagaccgcgaaagatggtggtgtagatattagccgcaagccgcatcgaaggttcgctggactgcttgcccagagcgaccagaaaaccgaggatgagaccaacgggaagtgtggcgagtgccagactgacggtaacaagaagtcctttggcaatgctgataccccagccatcgggaccgaaactcaacaaggtggcgtagtgttcc-3′；
⑦阳性质控标准品的配制：牛种布鲁氏菌阳性质控标准品：含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒各1μL；羊种布鲁氏菌阳性质控标准品：含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒各1μL；猪种布鲁氏菌阳性质控标准品：含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒各1μL；犬种布鲁氏菌阳性质控标准品：含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒2μL；
（3）牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌鉴定引物的序列：
正向引物PIS711f：5′-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′，
反向引物P494r：5′-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′，
反向引物P732r：5′-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3′，
正向引物P591f：5′-CTGGTGGGTATCGCATTACTCGG-3′，
反向引物P591r：5′-TTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG-3′，
正向引物P272f：5′-GGAACACTACGCCACCTTGT-3′，
反向引物P272r：5′-GATGGAGCAAACGCTGAAG-3′；
（4）阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水，体积为2μL；
实施例3PCR试剂盒的重复性试验
（1）采用细菌基因组DNA提取试剂盒对牛种布鲁氏菌S19、羊种布鲁氏菌M5、猪种布鲁氏菌S2、犬种布鲁氏菌RM6/66分别提取布鲁氏菌DNA，用于PCR扩增；
（2）分别取PCR反应液各47.8uL，取第（1）步所得布鲁氏菌DNA和布鲁氏菌阳性质控标准品各2μL，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在PCR仪上平行做PCR扩增，PCR反应条件为：95℃5min，94℃30sec、62℃30sec、72℃30sec，30个循环，72℃10min。
（3）取5μLPCR产物，以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶图像分析仪上观察牛种布鲁氏菌扩增出494bp和591bp的条带，羊种布鲁氏菌扩增出732bp和591bp的条带，猪种布鲁氏菌扩增出272bp和591bp的条带，犬种布鲁氏菌扩增出272bp的条带。
抽取三个批次的PCR试剂盒进行重复性试验，批次内重复试验5次，批次间重复试验3次，结果如图1、图2、图3所示，所得检测结果均相同，这说明不同批次间的检测结果具有可比性和良好的重复性，PCR试剂盒的重复性较好，而且采用PCR试剂盒对样本（DNA）的检测仅需3个小时就能完成，表明本发明的PCR试剂盒可以快速检测牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌。
实施例4PCR试剂盒的特异性试验
采用本发明的PCR试剂盒对牛种布鲁氏菌S19、羊种布鲁氏菌M5、猪种布鲁氏菌S2、犬种布鲁氏菌RM6/66、沙门氏菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌O:9、大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌2型基因组DNA进行扩增，并设阴性对照，验证多重PCR反应的特异性，PCR反应条件为：95℃5min，94℃30sec、62℃30sec、72℃30sec，30个循环，72℃10min。
结果如图4所示，只有牛种布鲁氏菌S19扩增出494bp和591bp的条带，羊种布鲁氏菌M5扩增出732bp和591bp的条带、猪种布鲁氏菌S2扩增出272bp和591bp的条带、犬种布鲁氏菌RM6/66扩增出272bp的条带，而沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌2型、大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌O:9、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和阴性对照无条带，说明PCR试剂盒具有较好的特异性，且无交叉反应。
实施例5阳性质控标准品的敏感性试验
将测序正确菌液于37℃摇床中培养增菌，采用质粒提取试剂盒提取重组质粒，用核酸浓度测定仪测质粒浓度（ng/μL），将所制备的质粒浓度换算成拷贝数，其中每1μL样品中检测基因拷贝数按照公式计算：质粒拷贝数浓度(copies/μL)=浓度（ng/μL）×阿伏加德罗常数×10-9/重组质粒碱基数×660。得出重组质粒的拷贝数后，按照10倍梯度释释，将质粒稀释成1×101copies/μL、1×102copies/μL、1×103copies/μL、1×104copies/μL、1×105copies/μL、1×106copies/μl、1×107copies/μL、1×108copies/μL、1×109copies/μL。取1μL质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃5min，94℃30sec、62℃30sec、72℃30sec，30个循环，72℃10min。
结果如图5、图6、图7、图8所示，含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒的最低检测限为：1×102copies/μL，由含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒的最低检测限为：1×102copies/μL，由含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒的最低检测限为：1×102copies/μL，由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒的最低检测限为：1×103copies/μL。
实施例6PCR试剂盒的敏感性试验
分别取牛种布鲁氏菌S19、羊种布鲁氏菌M5、猪种布鲁氏菌S2、犬种布鲁氏菌RM6/66的菌液，利用平板计数法计算菌液浓度，分别以10倍倍比稀释菌液，取相应稀释倍数的菌液各1mL，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，取1μL基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃5min，94℃30sec、62℃30sec、72℃30sec，30个循环，72℃10min。
结果如图9、图10、图11、图12所示，通过实验结果确定PCR试剂盒检测牛种布鲁氏菌S19的敏感性为1.1×102cfu/mL，检测羊种布鲁氏菌M5的敏感性为5.1×102cfu/mL，检测猪种布鲁氏菌S2的敏感性为3.5×102cfu/mL，检测犬种布鲁氏菌RM6/66的敏感性为2.5×103cfu/mL。
实施例7人工感染牛奶的检测
对牛种布鲁氏菌S19、羊种布鲁氏菌M5、猪种布鲁氏菌S2、犬种布鲁氏菌RM6/66四种菌液通过平板计数法，得出菌液浓度，将这四种菌液分别与无菌牛奶混合，使菌液终浓度分别为1×109cfu/mL、1×108cfu/mL、1×107cfu/mL、1×106cfu/mL、1×105cfu/mL、1×104cfu/mL、1×103cfu/mL、1×102cfu/mL、1×101cfu/mL、1×100cfu/mL，采用细菌基因组DNA试剂盒提取基因组DNA，在多重PCR体系下进行扩增，检测所建立的多重PCR反应即PCR试剂盒的实用性。
结果如图13、图14、图15、图16所示，四种布鲁氏菌分别人工感染牛奶的最低检测限为：牛种布鲁氏菌S19为1.0×103cfu/mL，羊种布鲁氏菌M5为1.0×103cfu/mL，猪种布鲁氏菌S2为1.0×103cfu/mL，犬种布鲁氏菌RM6/66为1.0×104cfu/mL。
Claims (9)
1.同时检测牛羊猪犬四种布鲁氏菌的PCR试剂盒，其特征在于，
该PCR试剂盒由PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成；
所述PCR反应液包括鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的四对引物，分别为PIS711f和P494r，PIS711f和P732r，P591f和P591r，P272f和P272r：
正向引物PIS711f：5′-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′，
反向引物P494r：5′-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′，
反向引物P732r：5′-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3′，
正向引物P591f：5′-CTGGTGGGTATCGCATTACTCGG-3′，
反向引物P591r：5′-TTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG-3′，
正向引物P272f：5′-GGAACACTACGCCACCTTGT-3′，
反向引物P272r：5′-GATGGAGCAAACGCTGAAG-3′；
所述阳性质控标准品包括牛种布鲁氏菌阳性质控标准品、羊种布鲁氏菌阳性质控标准品、猪种布鲁氏菌阳性质控标准品和犬种布鲁氏菌阳性质控标准品；
所述牛种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述羊种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述猪种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述犬种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成；
所述含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒、含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒、含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒均能在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；
所述含有494个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-gacgaacggaatttttccaatcccatcgtttccgtttcacttggcctgccggcaacgtttcagtttggcggaatgaaacggacggacccgatcaccaaatatatcctgcaccatggcgacgtggttgtctggggcgggccgtcgcggcttttctatcacggtattctaccattgaagtctggcgagcatgagcggctggggccgtttcggcttaatctgaccttccgaaaggcgttctagggcgtgtctgcatttaacgtaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaaacccatgaatgcggtcaatgttttctcgcatcgcagcgcaatacgacgatagcgtttcaacttgttaaaaaagcattcaatctgatggcgttccttgtacagcctccagtcgattgttggggcactggaacgtgttggattgaccttgatctgagccgttgccttgagatcgctggcaatgaaggcccttaagtgatcggca-3′，
所述含有732个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-tgccgatcacttaagggccttcattgccagcaatctcaaggcaacggctcagatcaaggtcaatccaacacgttccagtgtcccaacaatcgactggaggctgtacaaggaacgccatcagattgaatgcttttttaacaagttgaaacgctatcgtcgtattgcgctgcgatgcgagaaaacattgaccgcattcatgggcttcgtccatctcgcatgcgctatgatctggttacgttgaatgcagacacgccctaggggtgaatctggaaattgtcagaaagacagtgcttcgtcacgctagagcgctcgctgccatacttgcaacagtgacagcgataattgccgttattggctggtggcagggcgaagattggcgggtaagctattccaatctcgctattgttaatggcgtctattggatattactgctctaccttctgtggattattctgagccgaaacactcctgattttttaggggtgccgcttgttaaggcgattcacgacaagaaacttcttatagtcgatggtgcaccatggctaagtttgggtgtcatgaccgcgatttacgtcaaagacggtgaatatgagcggcttgtgtgcaccggagaggtagtaaacgttcagacaaataagctggttcagattcatatccggggttatgaagaaatttataacgatatcgaagctgttggtgaaaaacttaatcagaccagcaaggacgcgattt-3′，
所述含有591个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-ctggtgggtatcgcattactcggcgccctggggctgacggggctgacaagtagcggcatcggggcggtggctgccggcgggcttctcggttttgccctgttcaaccgcccgcctgccagcatttttctcggcgattccggaagccccccattggggctgatcgtaggaacagccttgctgctgcttgcgcgtgaaacacacatcgtggtcgcgcttgttctgccgctttattatattctggatgcgggcaccacaattgtcatgcgtgcagcccaaggtgagaacatcctcaaggctcactcgaaacatgcctatcagatagcaaaacgcagtggctggagtgtgccgaaagtggtggcccatgtggcgcttttaaatacaatcctgatcgcctgcgtggtggccttgctggcgctggatcatccgctcgcacaactgacatttctgctggtcgcagccgttgccacactcattctgctgctcgatttccgcgggcgcttcaggaagctatgacctcgaaaagcaccttgcggaccatttcgatatccttcttttccatggcggtccgcagtaccgccaggctttcctgaa-3′，
所述含有272个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-gatggagcaaacgctgaagcccaagcgaggccccgaaatagaccaggaagagcgtcaggagttccggcagaccgcgaaagatggtggtgtagatattagccgcaagccgcatcgaaggttcgctggactgcttgcccagagcgaccagaaaaccgaggatgagaccaacgggaagtgtggcgagtgccagactgacggtaacaagaagtcctttggcaatgctgataccccagccatcgggaccgaaactcaacaaggtggcgtagtgttcc-3′。
2.根据权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液。
3.根据权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述含有494个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌标准菌株544A中克隆得到，所述含有732个碱基的核苷酸片段是从羊种布鲁氏菌标准菌株16M中克隆得到，所述含有591个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌标准菌株544A、羊种布鲁氏菌标准菌株16M、猪种布鲁氏菌标准菌株1330S中同时克隆并测序一致后从中取出的一个标准品，所述含有272个碱基的核苷酸片段是从犬种布鲁氏菌标准菌株RM6/66中克隆得到。
4.根据权利要求1所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性质控标准品为无菌双蒸水。
5.制备权利要求1所述的PCR试剂盒的方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下：
（1）配制PCR反应液：所述PCR反应液由鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的四对引物和含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液组成，所述四对引物分别为PIS711f和P494r，PIS711f和P732r，P591f和P591r，P272f和P272r：
正向引物PIS711f：5′-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′，
反向引物P494r：5′-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′，
反向引物P732r：5′-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3′，
正向引物P591f：5′-CTGGTGGGTATCGCATTACTCGG-3′，
反向引物P591r：5′-TTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG-3′，
正向引物P272f：5′-GGAACACTACGCCACCTTGT-3′，
反向引物P272r：5′-GATGGAGCAAACGCTGAAG-3′；
（2）建立阳性质控标准品：
所述阳性质控标准品包括牛种布鲁氏菌阳性质控标准品、羊种布鲁氏菌阳性质控标准品、猪种布鲁氏菌阳性质控标准品和犬种布鲁氏菌阳性质控标准品；
所述牛种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述羊种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述猪种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成，所述犬种布鲁氏菌阳性质控标准品由含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒组成；
所述含有494个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒、含有732个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒、含有591个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒和含有272个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18T重组质粒均能在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；
所述含有494个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-gacgaacggaatttttccaatcccatcgtttccgtttcacttggcctgccggcaacgtttcagtttggcggaatgaaacggacggacccgatcaccaaatatatcctgcaccatggcgacgtggttgtctggggcgggccgtcgcggcttttctatcacggtattctaccattgaagtctggcgagcatgagcggctggggccgtttcggcttaatctgaccttccgaaaggcgttctagggcgtgtctgcatttaacgtaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaaacccatgaatgcggtcaatgttttctcgcatcgcagcgcaatacgacgatagcgtttcaacttgttaaaaaagcattcaatctgatggcgttccttgtacagcctccagtcgattgttggggcactggaacgtgttggattgaccttgatctgagccgttgccttgagatcgctggcaatgaaggcccttaagtgatcggca-3′，
所述含有732个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-tgccgatcacttaagggccttcattgccagcaatctcaaggcaacggctcagatcaaggtcaatccaacacgttccagtgtcccaacaatcgactggaggctgtacaaggaacgccatcagattgaatgcttttttaacaagttgaaacgctatcgtcgtattgcgctgcgatgcgagaaaacattgaccgcattcatgggcttcgtccatctcgcatgcgctatgatctggttacgttgaatgcagacacgccctaggggtgaatctggaaattgtcagaaagacagtgcttcgtcacgctagagcgctcgctgccatacttgcaacagtgacagcgataattgccgttattggctggtggcagggcgaagattggcgggtaagctattccaatctcgctattgttaatggcgtctattggatattactgctctaccttctgtggattattctgagccgaaacactcctgattttttaggggtgccgcttgttaaggcgattcacgacaagaaacttcttatagtcgatggtgcaccatggctaagtttgggtgtcatgaccgcgatttacgtcaaagacggtgaatatgagcggcttgtgtgcaccggagaggtagtaaacgttcagacaaataagctggttcagattcatatccggggttatgaagaaatttataacgatatcgaagctgttggtgaaaaacttaatcagaccagcaaggacgcgattt-3′，
所述含有591个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-ctggtgggtatcgcattactcggcgccctggggctgacggggctgacaagtagcggcatcggggcggtggctgccggcgggcttctcggttttgccctgttcaaccgcccgcctgccagcatttttctcggcgattccggaagccccccattggggctgatcgtaggaacagccttgctgctgcttgcgcgtgaaacacacatcgtggtcgcgcttgttctgccgctttattatattctggatgcgggcaccacaattgtcatgcgtgcagcccaaggtgagaacatcctcaaggctcactcgaaacatgcctatcagatagcaaaacgcagtggctggagtgtgccgaaagtggtggcccatgtggcgcttttaaatacaatcctgatcgcctgcgtggtggccttgctggcgctggatcatccgctcgcacaactgacatttctgctggtcgcagccgttgccacactcattctgctgctcgatttccgcgggcgcttcaggaagctatgacctcgaaaagcaccttgcggaccatttcgatatccttcttttccatggcggtccgcagtaccgccaggctttcctgaa-3′，
所述含有272个碱基的核苷酸片段的序列为：
5′-gatggagcaaacgctgaagcccaagcgaggccccgaaatagaccaggaagagcgtcaggagttccggcagaccgcgaaagatggtggtgtagatattagccgcaagccgcatcgaaggttcgctggactgcttgcccagagcgaccagaaaaccgaggatgagaccaacgggaagtgtggcgagtgccagactgacggtaacaagaagtcctttggcaatgctgataccccagccatcgggaccgaaactcaacaaggtggcgtagtgttcc-3′；
（3）阴性质控标准品：所述阴性质控标准品为无菌双蒸水。
6.根据权利要求5所述的PCR试剂盒的制备方法，其特征在于，所述含有494个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌标准菌株544A中克隆得到，所述含有732个碱基的核苷酸片段是从羊种布鲁氏菌标准菌株16M中克隆得到，所述含有591个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌标准菌株544A、羊种布鲁氏菌标准菌株16M、猪种布鲁氏菌标准菌株1330S中同时克隆并测序一致后从中取出的一个标准品，所述含有272个碱基的核苷酸片段是从犬种布鲁氏菌标准菌株RM6/66中克隆得到。
7.如权利要求1所述的PCR试剂盒的使用方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下：
（1）对待检测的样本提取样本DNA；
（2）以提取的样本DNA为模板，将样本DNA、阳性质控标准品和阴性质控标准品分别加入到含有PCR反应液和DNA聚合酶的管中，按照经过优化后的PCR反应条件进行扩增：95℃5min，94℃30sec、62℃30sec、72℃30sec，30个循环，72℃10min；
（3）取5μLPCR产物，以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察牛种布鲁氏菌是否扩增出494bp和591bp的条带，羊种布鲁氏菌是否扩增出732bp和591bp的条带，猪种布鲁氏菌是否扩增出272bp和591bp的条带，犬种布鲁氏菌是否扩增出272bp的条带。
8.根据权利要求7所述的PCR试剂盒的使用方法，其特征在于，所述待检测的样本为牛奶、采用液体培养基增菌的牛肉、采用液体培养基增菌的羊肉、采用液体培养基增菌的猪肉和采用液体培养基增菌的狗肉。
9.根据权利要求7所述的PCR试剂盒的使用方法，其特征在于，所述PCR反应液由鉴定牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌的四对引物和含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液组成；
所述四对引物分别为PIS711f和P494r，PIS711f和P732r，P591f和P591r，P272f和P272r：
正向引物PIS711f：5′-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′，
反向引物P494r：5′-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′，
反向引物P732r：5′-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3′，
正向引物P591f：5′-CTGGTGGGTATCGCATTACTCGG-3′，
反向引物P591r：5′-TTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG-3′，
正向引物P272f：5′-GGAACACTACGCCACCTTGT-3′，
反向引物P272r：5′-GATGGAGCAAACGCTGAAG-3′。
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Granted publication date: 20141126 Termination date: 20190806 |