CN103409504B - 一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种用于检测Her2基因不含重复序列的荧光原位杂交探针、试剂盒及其检测方法。以Her2基因为模板，对Her2基因中的非重复序列进行聚合酶连反应，扩增产物为350～800碱基对大小不等的DNA片段，消除Her2基因中的重复序列，从而形成不含重复序列的产物，产物经过荧光标记后获得Her2基因不含重复序列荧光原位杂交探针，用于Her2基因荧光原位杂交检测。本发明获得的Her2基因荧光原位杂交探针可消除重复序列，显著降低Her2基因荧光原位探针的非特异性背景信号，提高荧光原位杂交探针的特异性。

Description

一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术

乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤。2011年美国CA:A Cancer Journalfor Clinicians杂志公布的最新统计数据显示，美国2011年预计将有230480例女性罹患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的30%，排名女性恶性肿瘤发病率第一位。在我国北京、上海、天津等大城市的统计显示乳腺癌同样是我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势。乳腺癌病因尚未完全阐明，但许多研究资料表明，乳腺癌的发生除去出生地的因素外，还与内源性或外源性***的长期刺激：***的活性和表皮生长因子受体（Her2）的过表达对乳癌的发生有重要作用。

原癌基因人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factorreceptor-2,Her2）基因，即c-erbB-2基因，定位于染色体17q12-21.32上，编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。HER2是重要的乳腺癌预后判断因子，Her2过表达或扩增的乳腺癌，其临床特点和生物学行为有特殊表现，治疗模式、疗效和预后与其他类型的乳腺癌有很大的区别。针对Her2基因开发的靶向治疗药物赫赛汀也基于Her2基因的过表达或扩增，临床使用赫赛汀药物对Her2基因过表达或扩增患者有效，无Her2基因过表达者患者无效。

目前，临床上用于检测基因重排、融合、扩增等类型的金标准是荧光原位杂交技术。荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。利用特定核酸经荧光素标记后作为探针，与靶DNA进行杂交后，再通过荧光显微镜直接以单个细胞为观察对象进行计数，可以在36小时内实现对待测染色体片段的定性、定量和定位分析。然而荧光原位杂交探针主要使用人工染色体制备，这些人工染色体包括酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）和噬菌体人工染色体（PAC）等，由于在人工染色体中存在很多的重复序列，这些重复序列在整个基因组中不断出现，从而导致制备的荧光原位杂交探针存在很多的重复序列，这些重复序列在探针与非靶DNA杂交后也能产生荧光，从而产生非特异性的荧光信号，大大降低了FISH检测的特异性和灵敏度。因此，本领域迫切需求开发Her2基因的不含重复序列FISH探针试剂盒，用于提高Her2基因的荧光原位杂交实验的特异性和灵敏度。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法。

一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针，所述FISH探针DNA是以Her2基因和着丝粒（STR）序列为模板，由27对引物组或与引物组具有同一性的核苷酸序列，采用聚合酶链技术进行PCR扩增反应制备得到，所述27对引物组中，1-26组为Her2基因引物序列，第27对引物组为着丝粒STR序列引物，所述引物组为（其中1、2、3……27为引物名称，F为上游引物，R为下游引物）：

1 F：5'  GGTTGGAATGAGTAAGAAGTAGC  3'

1 R：5'  TAGGAATTTTCTAAAGGGGAGAC  3'

2 F：5'  AGGTTAATGGTGGAAGTGGG  3'

2 R：5'  ACACTCTACTATTAACATATGC  3'

3 F：5'  TTTACTTTGGCTGCTGTTGC  3'

3 R：5'  ATATTTTCGGATTTGGTATAGG  3'

4 F：5'  TGGCTGTAGGTCAGAGTGGC  3'

4 R：5'  AAGGATAAGGTGGAGTTTTGT  3'

5 F：5'  TGGGTGATGGAATGATCTGG  3'

5 R：5'  ACGAGTCTCCGAACAAAAGG  3'

6 F：5'  AAAAGAAAACCAATGGGACAG  3'

6 R：5'  CCCACGCCAACATAAATACAC  3'

7 F：5'  TCCTCCCTCTTTGTCCTTATC  3'

7 R： 5'  AAAGTGCCCAGTTGAACTTGTT  3'

8 F： 5'  CTTTGTGGCAGCAGTTTCGT  3'

8 R： 5'  AGAGCAGATGGGTCAGAGGAC  3'

9 F： 5'  GTGGTGGGACTCAAAGACGG  3'

9 R： 5'  AGGAAATGGGTGGTGTAGGC  3'

10F： 5'  CCCTAGAAGGTGATGCTGATG  3'

10R： 5'  ATATGCTCCCATTTACAGAAAC  3'

11F： 5'  CCAGCCCACCCTGTCCTAT  3'

11R： 5'  TGCCCACTCTTACCCATCAA  3'

12F： 5'  CCAGCCCACCCTGTCCTA  3'

12R： 5'  TTCTGTCTCCTGCCATCCC  3'

13F： 5'  TGCCTGACCTCAGCGTCTT  3'

13R： 5'  GGTGGGTGTTATGGTGGATG  3'

14F： 5'  ACACCCACCTCTGCTTCGT  3'

14R： 5'  TGCCTTCACTCAAACCCTTT  3'

15F： 5'  TGGGTGAAGAGCAAGGGTG  3'

15R： 5'  GAGTGGGTGCAGTTGATGG  3'

166F：5'  CCAGGAGCATGGCGAAAA  3'

16R： 5'  AAGAGCCCCAGAAAGACCC  3'

17F： 5'  CTCACTTTCCAGAACCTT  3'

17R： 5'  TTATTTGACTCGACCTAA  3'

18F： 5'  CCTTCATTGCCCTTCACTC  3'

18R： 5'  CCTAGCCATCTTTCCTTGC  3'

19F： 5'  ATGTCTTCAAAGTTCTGGTG  3'

19R： 5'  AGATAGTGCATCCTGGGA  3'

20F： 5'  GGGTGGTGAAGGATGTTTG  3'

20R： 5'  TAGTCTAGGTTTGCGGGAGT  3'

21F： 5'  GCCCTATGGCTGCCTCTTA  3'

21R： 5'  CTCTGCTCCTTGGTCCTTCAC  3'

22F：5'  TATGCCCTATGGCTGCCTCT  3'

22R：5'  TGGTCCTTCACCTAACCTTGC  3'

23F：5'  GGTCTGTCTCCTGGCATCAC  3'

23R：5'  ACATCCTGGTCCCCTTTCA  3'

24F：5'  ACAGGCACCGCAGCTCAT  3'

24R：5'  CGCCACTCTGGGGACAAG  3'

25F：5'  TCTCCACTGGCACCCTCC  3'

25R：5'  GACGACCCCATTCTTCCCT  3'

26F：5'  CTTCAAAGGGACACCTACGG  3'

26R：5'  CAAAGCCTGGATACTGACACC  3'

27F：5'  GGCACGGTGGCTCACGCCTGTAAT  3'

27R：5'  GGGAGGCTAAGTTCCTTGTTCG  3'。

上述方案中，在所述27对引物组的5’端均***通用标签序列：

CGCTTTACTGACGCGTTGC，针对通用标签序列可进行PCR产物的二次扩增，从而能够放大PCR产物，降低生产成本，提高探针制备效率。

一种包含上述用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针的试剂盒。

上述试剂盒中，所述FISH探针为荧光原位杂交双色探针，所述FISH双色探针为粉剂，所述FISH双色探针包括Her2红色荧光探针及着丝粒绿色荧光探针，所述Her2红色荧光探针与着丝粒绿色荧光探针的质量比为1:1。

上述试剂盒中，所述FISH探针为荧光原位杂交双色探针，所述FISH双色探针为液体试剂，所述FISH双色探针是通过将Her2红色荧光探针及着丝粒绿色荧光探针溶解在2x柠檬酸钠缓冲液得到，其中Her2红色荧光探针的浓度为5ng/ul（w/v），着丝粒绿色荧光探针的浓度为5ng/ul（w/v），所述2x柠檬酸钠缓冲液是以氯化钠8.8g，柠檬酸钠4.4g，去离子水400ml配置而成。

上述试剂盒中，还包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染液。

一种利用上述试剂盒对Her2基因进行检测的方法，具体包括如下步骤：（1）将待检测组织固定在玻片上，对玻片上的待测组织进行预处理；（2）将探针与玻片上的待测组织进行核苷酸序列的变性杂交；（3）杂交后，对玻片进行洗涤；（4）使用复染液对玻片上的杂交区域进行复染；（5）使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域。

上述方案中，步骤（1）所述待检测组织的预处理为：（1）将待测石蜡组织切片置于破片上，再将玻片置于65℃下烘烤12～16小时，然后用二甲苯脱蜡，随后将玻片依次置于100%（vt%）、85%（vt%）、70%（vt%）乙醇梯度溶液中各2分钟，再浸入去离子水中3分钟，取出后用吸水纸吸取多余的水分；（3）用酸性亚硫酸钠在50℃下处理组织玻片20～30分钟，90℃下用水处理玻片30分钟，再用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗，然后于37℃下将玻片浸泡在蛋白酶K溶液中10～20分钟，随后用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗；（4）用甲醛固定玻片，再将玻片置于乙醇梯度溶液中脱水，最后经自然晾干，并加热到56℃，备用。

上述方案中，步骤（2）所述探针与待测组织的核苷酸序列变性杂交为：（1）取探针试剂各1ul，2x柠檬酸钠缓冲液7ul，去离子水1ul，混合得到探针混合液，于78℃条件下变性5分钟，再迅速置于45℃条件下，杂交前取出；（2）将经预处理后的玻片浸入到78℃甲酰胺/2×柠檬酸钠缓冲液中变性处理30分钟，再置于-20℃预冷的70%（vt%）、85%（vt%）、100%（vt%）乙醇梯度溶液中进行脱水处理，然后将玻片自然干燥后，置于45℃条件预热；（3）将上述变性后的探针混合液滴于玻片杂交区域，置于45℃条件下杂交12～16小时。

上述方案中，步骤（3）所述玻片洗涤为：移去盖玻片，将玻片置于0.3%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/0.4×柠檬酸钠缓冲液中，漂洗2分钟；再将破片置于0.1%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/2×柠檬酸钠缓冲液中，漂洗30秒；最后将玻片置于70%（vt%）乙醇中，漂洗3分钟。

现有技术中，因Her2基因FISH探针中含有大量重复序列，使用前，首先需要用Cot-1DNA试剂将样本DNA中的重复序列封闭，该封闭实验不仅耗时，而且所用的试剂价格昂贵；本发明制备的Her2基因FISH探针不含重复序列，在使用时，无需用Cot-1DNA试剂进行封闭实验，操作方便，经济高效，大大缩短了试剂盒的检测时间。

本发明的有益效果：

（1）本发明FISH探针的制备过程，综合了核酸杂交技术、荧光标记技术、荧光显微显像技术，FISH探针作为基因断裂、融合、扩增等检测的金标准，检测灵敏度高；

（2）本发明制备的不含重复序列FISH探针对Her2核酸分子的杂交识别，具有准确性高，特异性好、及假阳性低的优点；

（3）本发明中探针及试剂盒的生产成本低，便于规模化生产；

（4）本发明所述试剂盒的操作简单、安全，同时减少了Cot-1 DNA试剂、罗丹明抗-地高辛抗体等昂贵试剂的使用，经济高效；

（5）与现有技术相比，本发明所述试剂盒的检测方法，无需使用Cot-1 DNA对样本基因进行封闭，操作方便，检测速度快，可在12-24小试内完成杂交检测实验。

附图说明

图1是Her2基因使用Repeat Masking数据库分析后得出的重复和非重复序列示意图，其中XXX…XXX代表重复序列。

图2是1-27引物对PCR产物电泳图，其中1-26组的模板是BAC克隆的Her2基因DNA，第27组的模板是着丝粒STR序列质粒，图中，分子量标记物(M)是DNA梯（DNA ladder），1、2、3……27为各自对应引物对所扩增的产物。

图3是不含重复序列Her2探针荧光原位杂交图，其中模板是乳腺癌样本。图中①是着丝粒绿色荧光探针标记DNA片段；②是Her2红色荧光标记DNA片段；③是Her2红色荧光探针标记DNA片段，表现为基因大量扩增形式。图3中A为Her2基因正常，着丝粒探针标记的DNA和Her2探针标记的DNA的数量比值正常；B为Her2基因异常扩增，从图中白色箭头所示绿色着丝粒探针标记DNA片段①与Her2探针标记DNA片段③的比值可以看出Her2大量扩增。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。

实施例1

引物组的合成：通过在线分析数据库Repeat Masking（http://www.girinst.org/)对Her2基因进行分析，得到Her2基因的重复与非重复序列（如图1所示），将非重复序列导入引物设计软件Primer5进行引物设计，设计引物扩增产物在350～800bp，并用人工合成的方法合成如下26对引物：

1 F：5'  GGTTGGAATGAGTAAGAAGTAGC  3'

1 R：5'  TAGGAATTTTCTAAAGGGGAGAC  3'

2 F：5'  AGGTTAATGGTGGAAGTGGG  3'

2 R： 5'  ACACTCTACTATTAACATATGC  3'

3 F： 5'  TTTACTTTGGCTGCTGTTGC  3'

3 R： 5'  ATATTTTCGGATTTGGTATAGG  3'

4 F： 5'  TGGCTGTAGGTCAGAGTGGC  3'

4 R： 5'  AAGGATAAGGTGGAGTTTTGT  3'

5 F： 5'  TGGGTGATGGAATGATCTGG  3'

5 R： 5'  ACGAGTCTCCGAACAAAAGG  3'

6 F： 5'  AAAAGAAAACCAATGGGACAG  3'

6 R： 5'  CCCACGCCAACATAAATACAC  3'

7 F： 5'  TCCTCCCTCTTTGTCCTTATC  3'

7 R： 5'  AAAGTGCCCAGTTGAACTTGTT  3'

8 F： 5'  CTTTGTGGCAGCAGTTTCGT  3'

8 R： 5'  AGAGCAGATGGGTCAGAGGAC  3'

9 F： 5'  GTGGTGGGACTCAAAGACGG  3'

9 R： 5'  AGGAAATGGGTGGTGTAGGC  3'

10F： 5'  CCCTAGAAGGTGATGCTGATG  3'

10R： 5'  ATATGCTCCCATTTACAGAAAC  3'

11F： 5'  CCAGCCCACCCTGTCCTAT  3'

11R： 5'  TGCCCACTCTTACCCATCAA  3'

12F： 5'  CCAGCCCACCCTGTCCTA  3'

12R： 5'  TTCTGTCTCCTGCCATCCC  3'

13F： 5'  TGCCTGACCTCAGCGTCTT  3'

13R： 5'  GGTGGGTGTTATGGTGGATG  3'

14F： 5'  ACACCCACCTCTGCTTCGT  3'

14R： 5'  TGCCTTCACTCAAACCCTTT  3'

15F： 5'  TGGGTGAAGAGCAAGGGTG  3'

15R： 5'  GAGTGGGTGCAGTTGATGG  3'

166F：5'  CCAGGAGCATGGCGAAAA  3'

16R： 5'  AAGAGCCCCAGAAAGACCC  3'

17F：5'  CTCACTTTCCAGAACCTT  3'

17R：5'  TTATTTGACTCGACCTAA  3'

18F：5'  CCTTCATTGCCCTTCACTC  3'

18R：5'  CCTAGCCATCTTTCCTTGC  3'

19F：5'  ATGTCTTCAAAGTTCTGGTG  3'

19R：5'  AGATAGTGCATCCTGGGA  3'

20F：5'  GGGTGGTGAAGGATGTTTG  3'

20R：5'  TAGTCTAGGTTTGCGGGAGT  3'

21F：5'  GCCCTATGGCTGCCTCTTA  3'

21R：5'  CTCTGCTCCTTGGTCCTTCAC  3'

22F：5'  TATGCCCTATGGCTGCCTCT  3'

22R：5'  TGGTCCTTCACCTAACCTTGC  3'

23F：5'  GGTCTGTCTCCTGGCATCAC  3'

23R：5'  ACATCCTGGTCCCCTTTCA  3'

24F：5'  ACAGGCACCGCAGCTCAT  3'

24R：5'  CGCCACTCTGGGGACAAG  3'

25F：5'  TCTCCACTGGCACCCTCC  3'

25R：5'  GACGACCCCATTCTTCCCT  3'

26F：5'  CTTCAAAGGGACACCTACGG  3'

26R：5'  CAAAGCCTGGATACTGACACC  3'；

再根据着丝粒STR序列设计1对着丝粒引物序列：

27F：5'  GGCACGGTGGCTCACGCCTGTAAT  3'

27R：5'  GGGAGGCTAAGTTCCTTGTTCG  3'；

其中1、2、3……27为引物名称，F为上游引物，R为下游引物。进一步，将上述27对引物组的5’端均添加通用标签序列：CGCTTTACTGACGCGTTGC，用于PCR产物的二次扩增。

实施例2

Her2基因BAC克隆构建，其步骤如下：

① 基因组DNA制备：采用市售DNA提取试剂盒对乳腺癌组织中的DNA进行提取；

② 基因组DNA酶切：选择限制性内切酶HindⅢ对基因组DNA进行酶切，酶切产物进行DNA电泳，电泳后选取并回收200～300kb片段的DNA片段；

③ 大片段DNA与BAC克隆连接：采用市售pIndigoBAC-5为载体，按照载体与大片段DNA的质量比为1:10比例构建连接体系：

16℃，连接16小时；65℃处理20分钟灭活T4连接酶；连接产物用0.025umMillipore膜透析3小时，透析完的连接产物分装于0.5ml的离心管中，转化入DH10B细胞中并培养筛选；

④ Her2基因克隆筛选：针对Her2基因设计引物，采用PCR方法对上述构建的BAC克隆进行筛选，将具有PCR产物的片段进行回收，转入T载体后进行测序分析，比对Her2基因序列，与Her2基因匹配者即为含有Her2基因的BAC克隆。

实施例3

着丝粒STR序列质粒构建，其步骤如下：

① 由于着丝粒STR序列较短（>700bp），采用化工合成的方式得到STR序列；

② STR序列与市售质粒连接：采用市售的T载体质粒为载体，以10ul体系构建连接体系：

③ 上述混合液轻轻震荡后，12000rpm，30秒离心，然后置于14℃中保温过夜（12-16h）；

④ 连接后的产物置4℃冰箱备用或-85℃长期保存。

实施例4

用实施例1中合成的1-26对引物组PCR扩增实施例2制备得到的Her2基因BAC克隆，用实施例1中合成的第27对引物组PCR扩增实施例3制备得到的着丝粒STR序列质粒。

PCR扩增的具体操作步骤为：

① 培养BAC克隆菌或STR序列质粒菌，涂抹于培养基平板上，培养，挑选单克隆，摇瓶培养该克隆菌，从克隆菌中提取BAC克隆DNA或质粒DNA；

② 用PCR反应扩增不含重复序列的BAC克隆或质粒DNA，PCR反应体系为25ul：

PCR扩增程序：

③ 对PCR扩增产物的进行电泳分析，结果见图2。

如图2所示，1-26组为Her2基因的PCR扩增产物电泳结果，27组为着丝粒STR序列的PCR扩增产物电泳结果，所有PCR产物长度为350-800bp不等。

实施例5

将实施例4所得PCR产物克隆到市售T载体中，以便保存，PCR产物克隆到T载体中，包括如下步骤：

① 取4个灭菌的200ul微量离心管，反应体系10ul：

② 上述混合液轻轻震荡后，12000rpm，30秒离心，然后置于14℃中保温过夜（12-16h）；

③ 连接后的产物置4℃冰箱备用或-85℃长期保存。

当需要二次PCR扩增时，对通用标签序列CGCTTTACTGACGCGTTGC进行扩增，上游引物为CGCTTTACTGACGCGTTGC，下游引物为GCAACGCGTCAGTAAGCG，扩增反应体系和反应程序如实施例4所述，得到大量的不含重复序列的PCR产物，减少生产环节和成本，提高生产效率。

实施例6

一种Her2基因不含重复序列荧光探针的制备，本实施例中，利用上述实施例4中用27对特异性引物制备的PCR产物，通过常规的随机引物方法来制备FISH探针。使用Life Technology公司的随机引物标记试剂盒，其中使用红色荧光素标记试剂盒制备得到Her2红色荧光探针，使用绿色荧光素标记试剂盒制备得到着丝粒绿色荧光探针。荧光标记的具体操作过程为：

（1）将100mg PCR产物DNA溶入24ul水中，冰浴，加入20ul随机引物溶液，混合后的DNA煮沸变性5分钟，立即置于冰上；

（2）加入5ul10×dNTP溶液，混匀，再加入1ul Taq酶溶液；

（3）混匀后，将反应物在37℃中培养1小时，取2ul做凝胶电泳检查，如果被标记的DNA探针片段在150-350bp之间，标记效果最佳；

（4）75℃加热10分钟终止反应，或者加入5ul反应终止液，即得到荧光标记的FISH探针。

实施例7

一种不含重复序列Her2探针荧光原位杂交试剂盒，包括荧光原位双色探针：Her2红色荧光探针及着丝粒绿色荧光探针，所述双色探针为液体试剂，通过Her2红色荧光探针及着丝粒绿色荧光探针溶液于200ul缓冲液得到，其中Her2红色荧光探针浓度为5ng/ul，着丝粒绿色荧光探针浓度为5ng/ul，所述缓冲液为：氯化钠8.8g，柠檬酸钠4.4g，去离子水400ml配置而成的2x柠檬酸钠缓冲液。

本试剂盒还包括：4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染液300ul。

利用上述不含重复序列Her2探针荧光原位杂交试剂盒对Her2基因进行检测的方法：

① 待测样品石蜡切片的预处理：a.经10%***固定、石蜡包埋的组织切片3～5um，置于干净的涂胶玻片上，将组织切片置于65℃下烘烤过夜（12～16小时），老化玻片，再将组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10分钟，随后浸入100%（vt%）乙醇中5分钟；b.将组织切片依次置于100%（vt%）乙醇、85%（vt%）乙醇和70%（vt%）乙醇中各2分钟，再将组织切片在室温下浸入去离子水中3分钟，取出后用吸水纸吸取多余的水分；c.用30%（wt%）酸性亚硫酸钠在50℃下处理组织切片20～30分钟，90℃下用水处理切片30分钟，然后于室温下用2×柠檬酸钠缓冲液中漂洗2次，每次5分钟，再将组织切片浸泡于200ug/ul蛋白酶K溶液中，37℃，10～20分钟，随后用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗2次，每次5分钟；d.室温下用甲醛固定5分钟，再将组织切片依次置于70%（vt%）乙醇、85%（vt%）乙醇和100%（vt%）乙醇中脱水，各2分钟，最后待破片自然干燥后，加热至56摄氏度，备用；

② 探针与待测组织核苷酸序列杂交：a.室温下将如下液体加入到试管中，

离心1～3秒，混匀后再次离心1～3秒，将试管置于78℃水浴箱中变性5分钟，迅速置于45℃水浴箱中，杂交前取出；b.将上述预处理后的玻片浸入78℃预热的70%（wt%）甲酰胺/2×柠檬酸钠缓冲液中30分钟，再依次置于-20℃预冷的70%（vt%）乙醇、85%（vt%）乙醇和100%（vt%）乙醇中，各2分钟，室温下自然干燥，置于45℃预热5分钟；c.将上述10ul的探针混合液滴于破片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边，将玻片置于湿盒中，45℃中过夜杂交；

③ 玻片洗涤：移去盖玻片，将玻片置于0.3%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/0.4×柠檬酸钠缓冲液中，振荡1～3秒，漂洗2分钟；再将破片置于0.1%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/2×柠檬酸钠缓冲液中，振荡1～3秒，漂洗30秒；最后将玻片置于70%（vt%）乙醇中，漂洗3分钟；

④ 复染：暗处自然晾干玻片，将15ul DAPI复染剂加于杂交区域，立即盖上盖玻片，暗处放置10～20分钟；

⑤ FISH结果观察：使用荧光显微镜对杂交区域的标本进行观察。

结果如图3所示，图3为不含重复序列Her2探针荧光原位杂交图，其中模板是乳腺癌样本。其中①是着丝粒绿色荧光探针标记DNA片段；②是Her2红色荧光标记DNA片段；③是Her2红色探针标记DNA片段，表现为基因大量扩增形式。图3中A为Her2基因正常，着丝粒探针标记的DNA和Her2探针标记的DNA的数量比值正常；B为Her2基因异常扩增，从图中白色箭头所示绿色着丝粒探针标记DNA片段①与Her2探针标记DNA片段③的比值可以看出Her2大量扩增。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针，其特征在于，所述FISH探针DNA以Her2基因和着丝粒序列为模板，利用27对PCR引物组或与引物组具有同一性的核苷酸序列，进行PCR扩增反应制备得到，其中1~26对引物组为Her2 基因PCR引物组，第27对引物组为STR序列PCR引物组，所述27对引物组为：

1 F：5'  GGTTGGAATGAGTAAGAAGTAGC  3'

1 R：5'  TAGGAATTTTCTAAAGGGGAGAC  3'

2 F：5'  AGGTTAATGGTGGAAGTGGG  3'

2 R：5'  ACACTCTACTATTAACATATGC  3'

3 F：5'  TTTACTTTGGCTGCTGTTGC  3'

3 R：5'  ATATTTTCGGATTTGGTATAGG  3'

4 F：5'  TGGCTGTAGGTCAGAGTGGC  3'

4 R：5'  AAGGATAAGGTGGAGTTTTGT  3'

5 F：5'  TGGGTGATGGAATGATCTGG  3'

5 R：5'  ACGAGTCTCCGAACAAAAGG  3'

6 F：5'  AAAAGAAAACCAATGGGACAG  3'

6 R：5'  CCCACGCCAACATAAATACAC  3'

7 F：5'  TCCTCCCTCTTTGTCCTTATC  3'

7 R：5'  AAAGTGCCCAGTTGAACTTGTT  3'

8 F：5'  CTTTGTGGCAGCAGTTTCGT  3'

8 R：5'  AGAGCAGATGGGTCAGAGGAC  3'

9 F：5'  GTGGTGGGACTCAAAGACGG  3'

9 R：5'  AGGAAATGGGTGGTGTAGGC  3'

10 F：5'  CCCTAGAAGGTGATGCTGATG  3'

10 R：5'  ATATGCTCCCATTTACAGAAAC  3'

11F：5'  CCAGCCCACCCTGTCCTAT  3'

11R：5'  TGCCCACTCTTACCCATCAA  3'

12F：5'  CCAGCCCACCCTGTCCTA  3'

12R：5'  TTCTGTCTCCTGCCATCCC  3'

13F：5'  TGCCTGACCTCAGCGTCTT  3'

13R：5'  GGTGGGTGTTATGGTGGATG  3'

14F：5'  ACACCCACCTCTGCTTCGT  3'

14R：5'  TGCCTTCACTCAAACCCTTT  3'

15F：5'  TGGGTGAAGAGCAAGGGTG  3'

15R：5'  GAGTGGGTGCAGTTGATGG  3'

166F：5'  CCAGGAGCATGGCGAAAA  3'

16R：5'  AAGAGCCCCAGAAAGACCC  3'

17F：5'  CTCACTTTCCAGAACCTT  3'

17R：5'  TTATTTGACTCGACCTAA  3'

18F：5'  CCTTCATTGCCCTTCACTC  3'

18R：5'  CCTAGCCATCTTTCCTTGC  3'

19F：5'  ATGTCTTCAAAGTTCTGGTG  3'

19R：5'  AGATAGTGCATCCTGGGA  3'

20F：5'  GGGTGGTGAAGGATGTTTG  3'

20R：5'  TAGTCTAGGTTTGCGGGAGT  3'

21F：5'  GCCCTATGGCTGCCTCTTA  3'

21R：5'  CTCTGCTCCTTGGTCCTTCAC  3'

22F：5'  TATGCCCTATGGCTGCCTCT  3'

22R：5'  TGGTCCTTCACCTAACCTTGC  3'

23F：5'  GGTCTGTCTCCTGGCATCAC  3'

23R：5'  ACATCCTGGTCCCCTTTCA  3'

24F：5'  ACAGGCACCGCAGCTCAT  3'

24R：5'  CGCCACTCTGGGGACAAG  3'

25F：5'  TCTCCACTGGCACCCTCC  3'

25R：5'  GACGACCCCATTCTTCCCT  3'

26F：5'  CTTCAAAGGGACACCTACGG  3'

26R：5'  CAAAGCCTGGATACTGACACC  3'；

27F：5'  GGCACGGTGGCTCACGCCTGTAAT  3'

27R：5'  GGGAGGCTAAGTTCCTTGTTCG  3'

所述27对PCR引物组的5’端***通用标签序列：CGCTTTACTGACGCGTTGC。

2.一种包含权利要求1~2所述用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针的试剂盒。

3.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述FISH 探针为荧光原位杂交双色探针，所述FISH双色探针为粉剂，所述FISH双色探针包括Her2红色荧光探针及着丝粒绿色荧光探针，所述Her2红色荧光探针与着丝粒绿色荧光探针的质量比为1:1。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述FISH 探针为荧光原位杂交双色探针，所述FISH双色探针为液体试剂，所述FISH双色探针是通过将Her2红色荧光探针及着丝粒绿色荧光探针溶解在2x柠檬酸钠缓冲液得到，其中Her2红色荧光探针的浓度为5ng/ul （w/v），着丝粒绿色荧光探针的浓度为5ng/ul（w/v）。

5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染液。

6.一种利用权利要求3~6所述试剂盒对Her2基因进行检测的方法，其特征在于， 包括如下步骤：（1）将待检测组织固定在玻片上，对玻片上的待测组织进行预处理；（2）将探针与玻片上的待测组织进行核苷酸序列的变性杂交；（3）杂交后，对玻片进行洗涤；（4）使用复染液对玻片上的杂交区域进行复染；（5）使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域。

7.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于步骤（2）所述探针与待测组织的核苷酸序列变性杂交为：（1）取探针试剂各1 ul，2x柠檬酸钠缓冲液7ul，去离子水1ul，混合得到探针混合液，于78℃条件下变性5分钟，再迅速置于45℃条件下，杂交前取出；（2）将经预处理后的待测组织玻片浸入到78℃甲酰胺/2×柠檬酸钠缓冲液中变性处理30分钟，再依次置于-20℃预冷的70%（vt%）、85%（vt%）、100%（vt%）乙醇梯度溶液中进行脱水处理，然后将玻片自然干燥后，置于45℃条件预热5分钟；（3）将上述变性后的探针混合液滴于玻片杂交区域，置于45℃条件下杂交12~16小时。

8.根据权利要求7所述检测方法，其特征在于步骤（1）所述待检测组织的预处理为：（1）将待测石蜡组织切片置于破片上，再将玻片置于65℃下烘烤12~16小时，然后用二甲苯脱蜡，随后将玻片依次置于100%（vt%）、85%（vt%）、70%（vt%）乙醇梯度溶液中进行水化处理；（2）用酸性亚硫酸钠在50℃下处理组织玻片20~30分钟，90℃下用水处理玻片30分钟，再用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗，然后于37℃下将玻片浸泡在蛋白酶K溶液中10~20分钟，随后用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗；（3）用甲醛固定玻片，再将玻片置于乙醇梯度溶液中脱水，最后经自然晾干，并加热到56℃，备用。

9.根据权利要求7所述检测方法，其特征在于步骤（3）所述玻片洗涤为：将玻片置于0.3%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/0.4×柠檬酸钠缓冲液中，漂洗2分钟；再将破片置于0.1%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/2×柠檬酸钠缓冲液中，漂洗30秒；最后将玻片置于70%（vt%）乙醇中，漂洗3分钟。