CN103409327A - 一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法。本发明提供的培养绿色木霉的方法,包括如下步骤:(1)将绿色木霉进行液体发酵,得到液体发酵产物;(2)将液体发酵产物进行固体发酵。本发明提供的绿色木霉的培养方法,生产工艺经济实用、生产效率高、投资少、占地小、生产可以实现规模化且无三废问题,适于大量推广应用,将产生巨大的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵应用技术领域,具体涉及一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法。
背景技术
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的一种土传毁灭性的病害,已严重危害到香蕉的生产及香蕉产业。目前综合防控技术是香蕉枯萎病防治的主要手段,木霉(Trichoderma spp.)作为一种重要的植病生防菌一直受到普遍关注。绿色木霉菌(Trichoderma viride)广泛地分布于自然界,可在多种营养基质上快速生长,对多种植物病原菌有重寄生作用,能有效地竞争营养和生存空间,还可以产生抗生素和攻击多种病原所需要的酶,所以被认为是一种很有开发潜力的生防菌。
现有的绿色木霉菌的培养方法都存在生产周期长、菌剂含孢量低、成本高的问题,阻碍了绿色木霉菌的生产进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法。
本发明提供的培养绿色木霉的方法,包括如下步骤:
(1)将绿色木霉进行液体发酵,得到液体发酵产物;
(2)将液体发酵产物进行以膨胀蛭石为载体的固体发酵。
所述液体发酵的条件可为:27-29℃,通入空气且通气量为9-11L/min,0.02-0.04Mpa。所述液体发酵的条件具体可为:28℃,通入空气且通气量为10L/min,0.03Mpa。所述液体发酵的发酵体系具体可为60-65L。
所述液体发酵可进行至发酵体系呈如下状态:有菌丝及液生孢子、无断裂的菌丝且菌丝体中无液泡。
所述液体发酵的时间可为65小时-72小时,具体可为65小时、68小时或72小时。
所述液体发酵是在液体发酵培养基中进行的;所述液体发酵培养基的制备方法如下:取蔗糖9-11g、玉米粉9-13g、NH4NO31.8-2.2g、大豆粕4-5.5g、MgSO4·7H2O0.8-1.2g和KH2PO42-4g,溶于水并用水定容至1000mL。所述液体发酵培养基的制备方法具体如下:取蔗糖10g、玉米粉9-13g、NH4NO32g、大豆粕4-5.5g、MgSO4·7H2O1g和KH2PO42-4g,溶于水并用水定容至1000mL。所述液体发酵培养基的制备方法具体如下:取蔗糖10g、玉米粉11g、NH4NO32g、大豆粕4.5g、MgSO4·7H2O1g,KH2PO43g,溶于水并用水定容至1000mL。所述液体发酵培养基的pH具体可为6.5。
所述固体发酵依次包括a阶段、b阶段和c阶段:
a阶段:在温度为23-25℃、湿度为93-97%的条件下培养;
b阶段:在温度为27-29℃、湿度为78-82%的条件下培养;
c阶段:在温度为25-27℃、湿度为38-42%的条件下培养。
所述a阶段具体可为:在温度为24℃、湿度为95%的条件下培养。所述b阶段具体可为:在温度为28℃、湿度为80%的条件下培养。所述c阶段具体可为:在温度为26℃、湿度为40%的条件下培养。所述a阶段中,培养时间可为2-3天。所述b阶段中,培养时间可为3天。所述c阶段中,培养时间可为1天。
所述以膨胀蛭石为载体的固体发酵是在固体发酵培养基中进行的;所述固体发酵培养基的制备方法如下:将300-400质量份膨胀蛭石、50-70质量份玉米粉、10-20质量份麸皮、0.8-1.2质量份KH2PO4、0.4-0.6质量份MgSO4和150-250份水混合均匀。所述固体发酵培养基的制备方法具体如下:将300-400质量份膨胀蛭石、50-70质量份玉米粉、10-20质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和150-250份水混合均匀。所述固体发酵培养基的制备方法具体如下:将300质量份膨胀蛭石、50质量份玉米粉、10质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和150质量份水混合均匀。所述固体发酵培养基的制备方法具体如下:将350质量份膨胀蛭石、60质量份玉米粉、15质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和200质量份水混合均匀。所述固体发酵培养基的制备方法具体如下:将400质量份膨胀蛭石、70质量份玉米粉、20质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和250质量份水混合均匀。
所述步骤(2)中,将18-22体积份所述步骤(1)得到的液体发酵产物接种至78-82体积份所述固体发酵培养基,即为所述固体发酵的初始时刻。所述步骤(2)中,将20体积份所述步骤(1)得到的液体发酵产物接种至80体积份所述固体发酵培养基,即为所述固体发酵的初始时刻。
所述步骤(1)中,具体可将所述绿色木霉的种子液接种至进行所述液体发酵培养基,即为所述液体发酵的初始时刻。所述步骤(1)中,具体可将4-6体积份种子液接种至94-96体积份所述液体发酵培养基。所述步骤(1)中,具体可将5体积份种子液接种至95体积份所述液体发酵培养基。所述种子液的菌浓度具体可为6.2-8.5×108CFU/mL,具体可为7×108CFU/mL。所述种子液的制备方法具体如下:将所述绿色木霉接种于PDA培养基平板,28℃培养至菌丝长满平板并产孢(通常需要4-5天),然后在液体种子培养基中接种平板菌种,接种量为每400ml液体种子培养基接种1/6培养皿平板菌种(培养皿规格为90mm),28℃、180rpm培养3-4天,得到种子液。所述液体种子培养基的制备方法具体为:取蔗糖20g、NH4NO35g、MgSO4·7H2O1.5g和KH2PO42.5g,溶于水并用水定容至1000mL。所述液体种子培养基的pH具体可为6.5。
所述膨胀蛭石具体可为粒径为3-5mm的膨胀蛭石。
所述麸皮具体可为小麦麸皮。
所述方法中还可包括如下步骤:将所述固体发酵的产物进行干燥,过筛(具体可为80目过筛)后,得到含水量为6%-10%的终产物。
所述绿色木霉具体可为绿色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No.6229。绿色木霉(Trichoderma viride)H06,已于2012年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),其保藏编号为CGMCC No.6229。
所述固体发酵培养基中,利用膨胀蛭石为载体,玉米粉和麸皮为培养基质。生蛭石原矿经过高温焙烧后,成为膨胀蛭石。作为发酵载体,膨胀蛭石具有疏松基质,密度小,质量轻,吸水性好,隔热性好的优点。所述固体发酵的过程中还可包括翻料的步骤。所述固体发酵最好在无菌条件下进行。所述固体发酵具体可采用如下容器:一种培养架,腔内设有若干尼龙纱网隔层的柱体;所述固体培养体系置于位于所述尼龙纱网隔层上。
本发明提供了一种用于绿色木霉的固双相发酵培养法,该方法将液体发酵生产与固体发酵生产相结合,先利用液体培养快速生长的大量孢子、菌丝体,然后转接到固体营养基质上产生分生孢子,从而缩短绿色木霉产孢的生长周期,提高产率,避免前期污染。本发明提供的方法,生产工艺简单,显著减少了培养过程中的污染机率,缩短了发酵时间,而且不需要复杂设备。本发明提供的方法中,培养基的原料主要为农副产品,麸皮、玉米粉来源广泛、充足,成本低廉,易调控,成功率高。固体发酵中,以膨胀蛭石为发酵载体,明显改善了培养基的粘度、空隙率和疏松度,而且膨胀蛭石经过清洗、晾干还可以重复利用。综上所述,本发明提供的绿色木霉的培养方法,生产工艺经济实用、生产效率高、投资少、占地小、生产可以实现规模化且无三废问题,适于大量推广应用,将产生巨大的经济效益。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
绿色木霉(Trichoderma viride)H06,简称绿色木霉H06,分离自香蕉的根际土壤,已于2012年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),其保藏编号为CGMCCNo.6229。
膨胀蛭石:购于灵寿县金土矿产品加工厂,粒径为3-5mm。
实施例1、液固双相发酵培养绿色木霉菌
1、一级平板菌种培养
将绿色木霉H06接种于PDA培养基平板,28℃培养至菌丝长满平板并产孢(通常需要4-5天)。
PDA培养基:马铃薯200g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、琼脂20g,用水定容至1000ml。
2、液体种子培养
在1000ml三角瓶中装入400ml液体种子培养基,然后接种步骤1得到的平板菌种,接种量为每个三角瓶接种1/6培养皿平板菌种(培养皿规格为90mm),28℃、180rpm培养3-4天,得到种子液(种子液中的菌浓度为7×108CFU/mL)。
液体种子培养基:取蔗糖20g、NH4NO35g、MgSO4·7H2O1.5g和KH2PO42.5g,溶于水并用水定容至1000mL;pH=6.5;121℃高压灭菌30分钟,冷却至40℃后用于接种。
3、液体发酵生产
在100升机械搅拌发酵罐中装入60升液体发酵培养基,然后接种步骤2得到的种子液,接种量为5%(即每5体积份种子液接种至95体积份液体发酵培养基)。
培养条件:28℃,通入空气且通气量为10L/min,保压0.03Mpa,培养65小时。
完成上述培养后,将发酵罐内的所有物质记作液体发酵产物。
液体发酵产物中出现大量菌丝及液生孢子,发酵液较粘稠,另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡,发酵液中无明显断裂的菌丝。
液体发酵培养基:取蔗糖10g、玉米粉11g、NH4NO32g、大豆粕4.5g、MgSO4·7H2O1g和KH2PO43g,溶于水并用水定容至1000mL;pH=6.5;121℃高压灭菌30分钟,冷却至40℃后用于接种。
4、固体发酵生产
培养架:腔内具有尼龙纱网隔层的四立柱架子,长3.2m、宽0.7m、高2.6m,用尼龙纱网隔成7层结构,层间距30cm,四立柱材质是碳钢喷塑。
固体发酵培养基:将300质量份膨胀蛭石、50质量份玉米粉、10质量份小麦麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和150质量份水混合均匀;自然pH;121℃蒸汽灭菌60分钟。
在经甲醛和高锰酸钾薰蒸灭菌的发酵室内,将液体发酵产物接种至固体发酵培养基并混合均匀,接种量为20%(即20体积份液体发酵产物接种至80体积份固体发酵培养基),然后将混合物置于发酵室内的培养架的尼龙纱网上,依次按如下阶段培养:
a阶段:在温度为24℃、湿度为95%(体积百分含量)的条件下培养,时间为2d,期间用塑料薄膜覆盖以保持湿度;该阶段为菌丝生长阶段,要求低温高湿;
b阶段:在温度为28℃、湿度为80%(体积百分含量)的条件下培养,时间为3d;期间用灭过菌的报纸覆盖以保持湿度;该阶段开始形成孢子,要求高温中湿;
c阶段:在温度为26℃、湿度为40%(体积百分含量)的条件下培养,时间为1d;期间不需要覆盖;该阶段菌要求高温低湿。
上述培养过程中,要经常进行翻料。
完成上述培养后,将容器内的所有物质记作固体发酵产物。
5、发酵产物的干燥
将固体发酵产物在发酵室里用空调和抽湿机干燥,80目过筛,得到终产物(经检测,含水量为6.0%)。
采用平板计数计算终产物中绿色木霉H06的孢子浓度,为1.39×1010个活性孢子/克终产物。
实施例2、液固双相发酵培养绿色木霉菌
1、一级平板菌种培养
同实施例1的步骤1。
2、液体种子培养
在1000ml三角瓶中装入400ml液体种子培养基,然后接种步骤1得到的平板菌种,接种量为每个三角瓶接种1/6培养皿平板菌种(培养皿规格为90mm),28℃、180rpm培养3-4天,得到种子液(种子液中的菌浓度为6.2×108CFU/mL)。
液体种子培养基:同实施例1的步骤2中的液体种子培养基。
3、液体发酵生产
在100升机械搅拌发酵罐中装入60升液体发酵培养基,然后接种步骤2得到的种子液,接种量为5%。
培养条件:25℃,通入空气且通气量为10L/min,保压0.03Mpa,培养68小时。
完成上述培养后,将发酵罐内的所有物质记作液体发酵产物。
液体发酵产物中出现大量菌丝及液生孢子,发酵液较粘稠,另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡,发酵液中无明显断裂的菌丝。
液体发酵培养基:取蔗糖10g、玉米粉9g、NH4NO32g、大豆粕4g、MgSO4·7H2O1g和KH2PO42g,溶于水并用水定容至1000mL;pH=6.5;121℃高压灭菌30分钟,冷却至40℃后用于接种。
4、固体发酵生产
培养架:腔内具有尼龙纱网隔层的四立柱架子,长3.2m、宽0.7m、高2.6m,用尼龙纱网隔成7层结构,层间距30cm,四立柱材质是碳钢喷塑。
固体发酵培养基:将350质量份膨胀蛭石、60质量份玉米粉、15质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和200质量份水混合均匀;自然pH;121℃蒸汽灭菌60分钟。
在经甲醛和高锰酸钾薰蒸灭菌的发酵室内,将液体发酵产物接种至固体发酵培养基并混合均匀,接种量为20%,然后将混合物置于发酵室内的培养架的尼龙纱网上,依次按如下阶段培养:
a阶段:在温度为24℃、湿度为95%(体积百分含量)的条件下培养,时间为3d,期间用塑料薄膜覆盖以保持湿度;该阶段为菌丝生长阶段,要求低温高湿;
b阶段:在温度为28℃、湿度为80%(体积百分含量)的条件下培养,时间为3d;期间用灭过菌的报纸覆盖以保持湿度;该阶段开始形成孢子,要求高温中湿;
c阶段:在温度为26℃、湿度为40%(体积百分含量)的条件下培养,时间为1d;期间不需要覆盖;该阶段菌要求高温低湿。
上述培养过程中,要经常进行翻料。
完成上述培养后,将容器内的所有物质记作固体发酵产物。
5、发酵产物的干燥
将固体发酵产物在发酵室里用空调和抽湿机干燥,80目过筛,得到终产物(经检测,含水量为8%)。
实施例3、液固双相发酵培养绿色木霉菌
1、一级平板菌种培养
同实施例1的步骤1。
2、液体种子培养
在1000ml三角瓶中装入400ml液体种子培养基,然后接种步骤1得到的平板菌种,接种量为每个三角瓶接种1/6培养皿平板菌种(培养皿规格为90mm),28℃、180rpm培养3-4天,得到种子液(种子液中的菌浓度为8.5×108CFU/mL)。
液体种子培养基:同实施例1的步骤2中的液体种子培养基。
3、液体发酵生产
在100升机械搅拌发酵罐中装入60升液体发酵培养基,然后接种步骤2得到的种子液,接种量为5%。
培养条件:28℃,通入空气且通气量为10L/min,保压0.03Mpa,培养72小时。
完成上述培养后,将发酵罐内的所有物质记作液体发酵产物。
液体发酵产物中出现大量菌丝及液生孢子,发酵液较粘稠,另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡,发酵液中无明显断裂的菌丝。
液体发酵培养基:取蔗糖10g、玉米粉13g、NH4NO32g、大豆粕5.5g、MgSO4·7H2O1g和KH2PO44g,溶于水并用水定容至1000mL;pH=6.5;121℃高压灭菌30分钟,冷却至40℃后用于接种。
4、固体发酵生产
培养架:腔内具有尼龙纱网隔层的四立柱架子,长3.2m、宽0.7m、高2.6m,用尼龙纱网隔成7层结构,层间距30cm,四立柱材质是碳钢喷塑。
固体发酵培养基:将400质量份膨胀蛭石、70质量份玉米粉、20质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和250质量份水混合均匀;自然pH;121℃蒸汽灭菌60分钟。
在经甲醛和高锰酸钾薰蒸灭菌的发酵室内,将液体发酵产物接种至固体发酵培养基并混合均匀,接种量为20%,然后将混合物置于发酵室内的培养架的尼龙纱网上,依次按如下阶段培养:
a阶段:在温度为24℃、湿度为95%(体积百分含量)的条件下培养,时间为2d,期间用塑料薄膜覆盖以保持湿度;该阶段为菌丝生长阶段,要求低温高湿;
b阶段:在温度为28℃、湿度为80%(体积百分含量)的条件下培养,时间为3d;期间用灭过菌的报纸覆盖以保持湿度;该阶段开始形成孢子,要求高温中湿;
c阶段:在温度为26℃、湿度为40%(体积百分含量)的条件下培养,时间为1d;期间不需要覆盖;该阶段菌要求高温低湿。
上述培养过程中,要经常进行翻料。
完成上述培养后,将容器内的所有物质记作固体发酵产物。
5、发酵产物的干燥
将固体发酵产物在发酵室里用空调和抽湿机干燥,80目过筛,得到终产物(经检测,含水量为10%)。
Claims (10)
1.一种培养绿色木霉的方法,包括如下步骤:
(1)将绿色木霉进行液体发酵,得到液体发酵产物;
(2)将液体发酵产物进行以膨胀蛭石为载体的固体发酵。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述液体发酵的条件为:27-29℃,通入空气且通气量为9-11L/min,0.02-0.04Mpa。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述液体发酵进行至发酵体系呈如下状态:有菌丝及液生孢子、无断裂的菌丝且菌丝体中无液泡。
4.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述液体发酵的时间为65小时-72小时。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法,其特征在于:所述液体发酵是在液体发酵培养基中进行的;所述液体发酵培养基的制备方法如下:取蔗糖9-11g、玉米粉9-13g、NH4NO31.8-2.2g、大豆粕4-5.5g、MgSO4·7H2O0.8-1.2g和KH2PO42-4g,溶于水并用水定容至1000mL。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法,其特征在于:所述固体发酵依次包括a阶段、b阶段和c阶段:
a阶段:在温度为23-25℃、湿度为93-97%的条件下培养;
b阶段:在温度为27-29℃、湿度为78-82%的条件下培养;
c阶段:在温度为25-27℃、湿度为38-42%的条件下培养。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述a阶段中,培养时间为2-3天;所述b阶段中,培养时间为3天;所述c阶段中,培养时间为1天。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法,其特征在于:所述固体发酵是在以膨胀蛭石为载体的固体发酵培养基中进行的;所述固体发酵培养基的制备方法如下:将300-400质量份膨胀蛭石、50-70质量份玉米粉、10-20质量份麸皮、0.8-1.2质量份KH2PO4、0.4-0.6质量份MgSO4和150-250份水混合均匀。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,将18-22体积份所述步骤(1)得到的液体发酵产物接种至78-82体积份所述固体发酵培养基,即为所述固体发酵的初始时刻。
10.如权利要求1至9中任一所述的方法,其特征在于:所述绿色木霉为绿色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No.6229。
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