CN103406100A - 一种磁性螯合物及其制备方法、用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种磁性螯合物及其制备方法、用途，本发明制备方法包括：纳米四氧化三铁表面修饰、磁性纳米微球表面活化、活化后磁性微球与螯合物偶联等步骤，本发明利用SiO₂包覆的纳米四氧化三铁，极大地降低了四氧化三铁粒子的集聚效应，同时SiO₂本身物理性质和化学性质均十分稳定，包覆后的四氧化三铁也具有良好的化学稳定性以及生物相容性，提高了四氧化三铁的耐酸性和抗氧化性，有利于后续的活化偶联。

Description

一种磁性螯合物及其制备方法、用途

技术领域

本发明涉及一种磁性螯合物及其制备方法、用途，属于分子材料技术领域。

背景技术

金属螯合亲和层析，又称固定金属离子亲和层析，其纯化原理是利用蛋白质表面的组氨酸与多种过渡金属离子如Cu²⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Fe³⁺形成配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。镍离子金属螯合亲和层析介质包括Ni-NTA和Ni-IDA两种配体，具有特异性好、螯合镍更稳定，镍离子脱落少，使用寿命长的优势，使得其应用越来越受到重视。但常规的金属螯合层析柱大多以多孔性的微米级固相载体，如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或合成高分子树脂等，该层析法存在耗时，使用寿命短、容易堵塞、存在分子筛效应，不易大规模连续操作等问题。

磁性螯合物镍，是将镍离子通过螯合剂联接到超顺磁纳米粒子上，是一种新型蛋白质分离试剂，它粒径在纳米级，具有超顺磁性，在外加磁场作用下被磁化而发生定向移动，可以从介质中被分离出来，当外加磁场撤离后，超顺磁纳米粒子又可以重新悬浮在液体中，具有良好的分散性能与可操控性。使用时不需装柱或离心，可以直接处理浑浊液，操作简便、快速、无分子筛效应，分离效果好等优势。

水体污染中重金属的污染占了相当大的比例，对水质产生污染的重金属主要有汞、镉、铬、铅、钒和钴等。其中以汞的毒性最大，镉次之。重金属污染与有机污染物不同，不少有机化合物可以通过微生物降解，使有害性降低或解除。而重金属十分稳定，很难在环境中降解，水中重金属污染物可以通过食物链在生物体内逐步蓄积富集；或者被水中悬浮粒子吸附而沉入水底淤泥中。某些重金属，如无机汞，能够通过微生物转变为毒性更高的金属有机物，例如甲基汞。目前水中重金属离子的处理方法主要有絮凝沉淀法、电化学法、吸附法和膜分离法、生物技术、有机材料法和硫化物沉淀法等，其中有机材料和硫化物沉淀已被越来越多的人关注，因为它具有选择性好，处理能力强，成本低，反复利用等优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种磁性螯合物及其制备方法、用途。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种磁性螯合物的制备方法，包括：

1）1g纳米四氧化三铁分散于10ml无水乙醇中，超声分散20min，滴加25%氨水调整溶液PH值为8-11，加入2ml TEOS（正硅酸乙酯），水浴恒温振荡，磁分离得黑色固体，并用蒸馏水反复洗涤，直到水层不再变浑浊，得到固体，真空干燥，制得二氧化硅包覆的磁性纳米微球；

2）在20ml50%乙醇溶液中，加入0.4g1）制得的磁性纳米微球和1.6gγ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷反应，超声分散15min，加热回流过夜，沉淀用磁分离，并用蒸馏水洗涤多次，直至清洗液中残留的氢氧根和环氧基清洗干净，得到活化的磁性纳米微球；

3）将螯合物IDA(亚氨基二乙酸)0.8g或N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸1.5g加入到30mL磁性纳米微球的DMSO(二甲基亚砜)溶液中，加入170mL0.1%NaOH溶液，在40-60℃下反应20h，磁分离，并用蒸馏水、乙醇洗涤，再用蒸馏水洗涤，每次15mL蒸馏水，洗涤3次，得黑色磁珠，即得所述的磁性螯合物，反应式如反应路线1和反应路线2所示。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，在1）中，所述水浴恒温振荡的条件为50℃，150r/min，振荡5-6h；

进一步，在1)中，所述真空干燥条件为50-60℃干燥4-5h；

进一步，在2）中，所述清洗液中残留的氢氧根用如下方法检测：抽取约3ml清洗液，加入1-2滴酚酞指示剂，震荡后溶液不变红，则氢氧根已清洗干净；

进一步，在2）中，所述清洗液中残留的环氧基用如下方法检测：抽取约3ml清洗液，加入1-2滴酚酞指示剂，再加入1.3mol/L硫代硫酸钠溶液3ml，剧烈震荡后溶液不变红，则说明清洗液中残留的环氧基已被清洗干净。

反应路线1：

（产物1）

=Fe₃O₄-SiO₂，代表SiO₂包覆的纳米四氧化三铁。

反应路线2：

如上所述的磁性螯合物的制备方法制备的磁性螯合物，所得磁性螯合物的结构式如反应路线1和反应路线2中的产物1和产物2结构。

如上所述磁性螯合物用于蛋白质分离纯化，将过量的饱和硫酸镍加到本发明制备的磁性螯合物中，放置几分钟后，磁分离去除水层，再用蒸馏水洗涤直到清洗液为无色为止，即得磁性螯合物镍，所得磁性螯合物镍适用于蛋白质分离纯化，反应式如反应路线3和反应路线4所示。

反应路线3：

反应路线4：

=Fe₃O₄-SiO₂，代表SiO₂包覆的纳米四氧化三铁。

如上所述磁性螯合物用于去除水中重金属离子，本发明制备的磁性螯合物有三、四个配位点，可与多种金属离子螯合，如Cu²⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Fe³⁺，Cd²⁺,Hg²⁺、Pd²⁺等，反应路线如5和反应路线6所示，应用在水体中重金属离子的处理。磁性螯合物具有纳米粒子的比表面积大、超顺磁性等特点，对重金属离子的螯合，具有吸附容量大、吸附速度快、易回收、易洗脱等优点，且无二次污染，所螯合重金属离子可回收利用，适用于多组分重金属离子水环境。

反应路线5：

=Fe₃O₄-SiO₂，代表SiO₂包覆的纳米四氧化三铁。

反应路线6：

本发明的有益效果是：

1）SiO₂包覆的纳米四氧化三铁，极大地降低了四氧化三铁粒子的集聚效应，同时SiO₂本身物理性质和化学性质均十分稳定，包覆后的四氧化三铁也具有良好的化学稳定性以及生物相容性，提高了四氧化三铁的耐酸性和抗氧化性，有利于后续的活化偶联。

2）γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷具有一定长度，这样就在四氧化三铁表面与螯合剂之间引入间隔臂，为螯合剂结合金属离子-蛋白质创造了足够的空间，提高了它的结合量。同时γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷末端含有环氧基，可直接与含氨基的螯合剂联接，大大减少了反应步骤，降低了反应时间和制备成本。

3）本发明制备的磁性螯合物是一种新型的重金属吸附材料，有三、四个配位点，可与多种金属离子螯合，如Cu²⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Fe³⁺，Cd²⁺,Hg²⁺,Pd²⁺等，利用这一特点，可将磁性螯合物应用在水体中重金属离子的处理。磁性螯合物具有纳米粒子的比表面积大、超顺磁性等特点，对重金属离子的螯合，具有吸附容量大、吸附速度快、易回收、易洗脱等优点，且无二次污染，所螯合重金属离子可回收利用，适用于多组分重金属离子水环境。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的磁性螯合物镍蛋白分离纯化电泳图；

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

1、诱导前样品，2、诱导后样品，3、超声破碎后上清，4、超声破碎后沉淀，5、流穿液，6、wash buffer洗脱液，7、洗脱液1,8、洗脱液2,9、洗脱液3。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

1g纳米四氧化三铁（10nm）分散于10mL无水乙醇中超声分散20min，滴加25%氨水调整溶液PH值为8-11，加入TEOS（2mL），水浴恒温振荡5-6h(50℃,150r/min),磁分离得黑色固体，并用蒸馏水反复洗涤，直到水层不再变浑浊；得到固体真空干燥4-5h（50-60℃），制得二氧化硅包覆的磁性纳米微球；

在20mL乙醇/水(v/v=1:1)溶液中，加入磁性纳米微球((0.4g)和γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(1.6g)；超声分散15min，加热回流过夜，沉淀用磁分离，并用蒸馏水洗涤多次，得到活化磁性纳米微球；直接用于下一步；

将N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸（1.5g）加入30mL微球（来自上一步）的DMSO溶液中,加入170mL0.1%NaOH溶液，在40-60℃下反应20h，磁分离，并用蒸馏水、乙醇洗涤几次，再用蒸馏水洗涤，得黑色磁珠，即得所述的磁性螯合物。

实施例2

1g纳米四氧化三铁（20nm）分散于10mL无水乙醇中超声分散20min，滴加25%氨水调整溶液PH值为8-11，加入TEOS（2mL），水浴恒温振荡5-6h(50℃,150r/min),磁分离得黑色固体，并用蒸馏水反复洗涤，直到水层不再变浑浊；得到固体真空干燥4-5h（50-60℃），制得二氧化硅包覆的磁性纳米微球；

在20mL乙醇/水(v/v=1:1)溶液中，加入磁性纳米微球((0.4g)和γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(1.6g)；超声分散15min，加热回流过夜，沉淀用磁分离，并用蒸馏水洗涤多次，得到活化磁性纳米微球；直接用于下一步；

将IDA（0.8g）加入30mL微球（来自上一步）的DMSO溶液中,加入170mL0.1%NaOH溶液，在40-60℃下反应20h，磁分离，并用蒸馏水、乙醇洗涤几次，再用蒸馏水洗涤，得黑色磁珠，即得所述的磁性螯合物。

实施例3

1g纳米四氧化三铁（30nm）分散于10mL无水乙醇中超声分散20min，滴加25%氨水调整溶液PH值为8-11，加入TEOS（2mL），水浴恒温振荡5-6h(50℃,150r/min),磁分离得黑色固体，并用蒸馏水反复洗涤，直到水层不再变浑浊；得到固体真空干燥4-5h（50-60℃），制得二氧化硅包覆的磁性纳米微球；

在20mL乙醇/水(v/v=1:1)溶液中，加入磁性纳米微球((0.4g)和γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(1.6g)；超声分散15min，加热回流过夜，沉淀用磁分离，并用蒸馏水洗涤多次，得到活化磁性纳米微球；直接用于下一步；

将IDA（0.8g）加入30mL微球（来自上一步）的DMSO溶液中,加入170mL0.1%NaOH溶液，在40-60℃下反应20h，磁分离，并用蒸馏水、乙醇洗涤几次，再用蒸馏水洗涤，得黑色磁珠，即得所述的磁性螯合物。

实施例4

1g纳米四氧化三铁（50nm）分散于10mL无水乙醇中超声分散20min，滴加25%氨水调整溶液PH值为8-11，加入TEOS（2mL），水浴恒温振荡5-6h(50℃,150r/min),磁分离得黑色固体，并用蒸馏水反复洗涤，直到水层不再变浑浊；得到固体真空干燥4-5h（50-60℃），制得二氧化硅包覆的磁性纳米微球；

在20mL乙醇/水(v/v=1:1)溶液中，加入磁性纳米微球((0.4g)和γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(1.6g)；超声分散15min，加热回流过夜，沉淀用磁分离，并用蒸馏水洗涤多次，得到活化磁性纳米微球；直接用于下一步；

将N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸（1.5g）加入30mL微球（来自上一步）的DMSO溶液中,加入170mL0.1%NaOH溶液，在40-60℃下反应20h，磁分离，并用蒸馏水、乙醇洗涤几次，再用蒸馏水洗涤，得黑色磁珠，即得所述的磁性螯合物。

实验例1磁性螯合物用于处理水中重金属

分别配备含Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺浓度为10ppm的CuSO₄溶液、CoSO₄溶液、NiSO₄溶液，各量取20mL的溶液放入三个50mL烧瓶中，再各称取0.02g实施例1制备的磁性螯合物加入这三个烧瓶中，瓶口密封，并在室温下摇晃5h,后磁分离出上清液，并检测吸附前后三种离子的浓度变化，实验结果如表1；

分别配备含Zn²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺浓度为50ppm的ZnSO₄溶液、CdCl₂溶液、HgCl₂溶液、Pb(NO₃)₂溶液、CuSO₄溶液、CoSO₄溶液、NiSO₄溶液，各量取40mL的溶液放入七个100mL烧瓶中，再各称取0.1g实施例1制备的磁性螯合物加入这七个烧瓶中，瓶口密封，并在室温下摇晃5h，后磁分离出上清液，并检测吸附前后七种离子的浓度变化，实验结果如表1；

表1磁性螯合物吸附重金属实验结果

从表1中可以看出，本发明制备的磁性螯合物对Zn²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺等重金属离子均有吸附，且它的吸附量跟水体中重金属离子的初始浓度有关，水体中重金属离子的初始浓度越高，吸附量越大。

实验例2磁性螯合物用于蛋白质的分离纯化

将过量的饱和硫酸镍加到实施例1制备的磁性螯合物中，放置几分钟后，磁分离去除水层，再用蒸馏水洗涤直到清洗液为无色为止，即得磁性螯合物镍；

将磁性螯合物镍用来纯化带His标签的蛋白，操作步骤如下：将本实验室培养的细菌经过诱导、超声破碎后，取超声破碎后上清液即粗蛋白加入磁性螯合物镍中；结合几分钟，磁分离出上清液即流穿液5，继续用wash buffer清洗未结合上去的蛋白及杂蛋白，磁分离收集wash buffer洗脱液6；再用洗脱液洗脱结合到磁性螯合物镍上的蛋白，每次用同样的体积洗脱，磁分离并收集标记为洗脱液17、洗脱液28、洗脱液39；将诱导前样品1、诱导后样品2、超声破碎后上清3、超声破碎后沉淀4、流穿液5、wash buffer洗脱液6、洗脱液17、洗脱液28、洗脱液39，电泳检测，如图1所示。

从图1中说明，超声破碎后上清中的粗蛋白与洗脱液1对比，可以看出，目标蛋白从粗蛋白中分离出来，洗脱液1中目标蛋白条带与其他杂蛋白条带的亮度比较，杂蛋白的含量已经很低了，基本达到纯化效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种磁性螯合物的制备方法，其特征在于，包括：

1）1g纳米四氧化三铁分散于10ml无水乙醇中，超声分散20min，滴加25%氨水调整溶液PH值为8-11，加入2ml TEOS，水浴恒温振荡，磁分离得黑色固体，并用蒸馏水反复洗涤，直到水层不再变浑浊，得到固体，真空干燥，制得二氧化硅包覆的磁性纳米微球；

2）在20ml50%乙醇溶液中，加入0.4g1）制得的磁性纳米微球和1.6gγ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷反应，超声分散15min，加热回流过夜，沉淀用磁分离，并用蒸馏水洗涤多次，直至清洗液中残留的氢氧根和环氧基清洗干净，得到活化的磁性纳米微球；

3）将螯合物IDA0.8g或N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸1.5g加入到30mL磁性纳米微球的DMSO溶液中，加入170mL0.1%NaOH溶液，在40-60℃下反应20h，磁分离，并用蒸馏水、乙醇洗涤，再用蒸馏水洗涤，每次15mL蒸馏水，洗涤3次，得黑色磁珠，即得所述的磁性螯合物。

2.根据权利要求1所述的磁性螯合物的制备方法，其特征在于，在1）中，所述水浴恒温振荡的条件为50℃，150r/min，振荡5-6h。

3.根据权利要求1所述的磁性螯合物的制备方法，其特征在于，在1)中，所述真空干燥条件为50-60℃干燥4-5h。

4.根据权利要求1所述的磁性螯合物的制备方法，其特征在于，在2）中，所述清洗液中残留的氢氧根用如下方法检测：抽取约3ml清洗液，加入1-2滴酚酞指示剂，震荡后溶液不变红，则氢氧根已清洗干净。

5.根据权利要求1所述的磁性螯合物的制备方法，其特征在于，在2）中，所述清洗液中残留的环氧基用如下方法检测：抽取约3ml清洗液，加入1-2滴酚酞指示剂，再加入1.3mol/L硫代硫酸钠溶液3ml，剧烈震荡后溶液不变红，则说明清洗液中残留的环氧基已被清洗干净。

6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法制备的磁性螯合物。

7.根据权利要求6所述的磁性螯合物用于蛋白质分离纯化。

8.根据权利要求6所述的磁性螯合物用于去除水中的重金属离子。

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