CN103405774A - 一种新型药物靶向运输辅助剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型药物靶向运输辅助剂，为五碳糖、六碳糖、糖醇、二糖中的至少一类。所述五碳糖选自木糖、***糖中的至少一种；所述六碳糖选自葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖中的至少一种；所述二糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖中的至少一种；所述糖醇选自山梨糖醇、甘露醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇中的至少一种；本发明还提供该新型药物靶向运输辅助剂在运输药物中的应用，尤其用于靶向运输反义寡核苷酸药物PMO、PNA、2’ome RNA、肽-PMO和siRNAs以及大分子质粒。该辅助剂靶向运输效果好，能够显著提高药物在目标组织中的作用效果；取自天然产物-糖类，临床安全指数高，对人体基本无伤害，毒副作用小或无。

Description

一种新型药物靶向运输辅助剂

技术领域

本发明属于生命科学及药物载体领域。 

背景技术

药物的靶向运输效率是决定药物药效的重要因素，现在常用来优化基因治疗药物的方法有：对药物本身结构进行优化；使用大分子聚合物作为运输载体，其中最常见的就是纳米材料；组织靶向肽的使用，即将肽段与药物共价结合。 

其中药物载体的应用最为广泛，但是现有的药物运输载体存在的不足之处为： 

1、靶向运输效率低； 

2、对人体存在潜在的危害。 

以杜兴肌肉萎缩症为例，杜兴肌肉萎缩症是一种与人类X染色体连锁遗传的致死性神经肌肉失调症，在新生男孩中的发病率为1∶3500，主要症状表现为全身肌肉持续消耗和退化。若不及时治疗，大多数病人的寿命仅20岁左右，严重地危害人们的健康。 

疾病发生的原因是编码抗肌萎缩蛋白dystrophin的DMD基因发生突变，造成相应mRNA前体的拼接改变和读码框的破坏，不能编码有生物学功能的dystrophin蛋白所致。DMD基因是人类基因组中最大的基因之一，全长为2.4Mbp，由79个外显子组成，因此除从亲本遗传外，DMD基因本身也存在着很高的自发突变几率。在DMD基因的突变中，其中65％的突变是缺失突变，其他的突变类型为重复突变、点突变和小基因片段的重组，这些突变最终都会造成DMD基因编码阅读框的改变，从而产生不稳定、无功能活性的dystrophin蛋白。dystrophin蛋白的缺失会造成肌肉纤维膜的不稳定和细胞外Ca²⁺的大量涌入，以及对外力损 伤修复的功能减退，从而引起肌肉退化和萎缩消耗，临床上表现为严重的杜兴肌肉萎缩症。 

DMD基因编码的dystrophin蛋白是由四个结构区域组成的，其中包括功能重要的N末端-即肌动蛋白结合区(actin-binding domain)、跨度很大的环状区域(rod domain)由24个重复的膜收缩蛋白类似体组成、半胱氨酸富集区和C末端-即dystrophin相关蛋白复合物结合区。研究表明DMD基因的突变热点主要集中在环状区域，而环状区域对dystrophin蛋白的功能不起重要的作用，所以环状区域的部分缺失对dystrophin蛋白的功能无影响。以上这些都为通过强制性地调控DMD基因mRNA前体拼接过程来对突变的DMD基因进行修复提供了理论基础。 

在过去的15年里，这些理论为杜兴肌肉萎缩症拼接修正基因治疗方法的发展起到了巨大的指导作用。最为典型的应用反义寡核苷酸调控DMD基因mRNA前体拼接的过程是，反义寡核苷酸通过与靶向外显子及其邻近区域的结合，阻止转录拼接复合体对靶向外显子的识别，从而将其从成熟的转录本切除掉，完成跳读过程，产生读码框正确的转录本，最终生成短的有生物活性的dystrophin蛋白。能够诱导外显子跳读的反义寡核苷酸通常由20-30个寡核苷酸组成，与靶向外显子或其附近区域的mRNA前体转录本存在序列同源性。其中靶向反义寡核苷酸典型的结合区，通常是目标外显子的保守序列或其他位点，例如外显子增强子区域。除此之外，邻近的内含子/外显子分界处(例如拼接供体-donor site或受***点-acceptor site)或邻近内含子分枝点序列(branch point)也可以作为靶点目标。 

反义寡核苷酸介导的外显子跳读方法在杜兴肌肉萎缩症的应用，最早的证据来自于人类淋巴细胞和mdx小鼠肌纤维细胞的体外试验，这些实验结果证明 了反义寡核苷酸介导的外显子跳读方法的可行性。目前反义寡核苷酸介导的外显子跳读已经成为杜兴肌肉萎缩症基因治疗领域中最为成功、最有应用前景的治疗方法之一。并且已有两种反义寡核苷酸进入临床II/III期试验，试验结果喜人。 

然而，临床测试和临床前研究结果都表明，***运输效率低是目前包括反义寡核苷酸在内的各种基因治疗药物亟需解决的难题，药物运输效率的高低是决定其治疗效果的关键因素之一，也是目前基因治疗的瓶颈。因此发展新的运输***，提高药物运输效率是当务之急。 

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向运输效率高、制备简单、副作用小的新型药物靶向运输辅助剂。 

为实现上述的发明目的，本发明的技术方案如下： 

一种新型药物靶向运输辅助剂，为五碳糖、六碳糖、糖醇、二糖中的至少一类。 

所述五碳糖选自木糖、***糖中的至少一种；所述六碳糖选自葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖中的至少一种；所述二糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖中的至少一种；所述糖醇选自山梨糖醇、甘露醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇中的至少一种。 

优选地，使用如下重量分数组合：葡萄糖、果糖、蔗糖＝3∶5∶2。 

优选地，使用如下重量分数组合：葡萄糖、果糖、蔗糖＝4∶2∶1。 

本发明还提供所述的一种新型药物靶向运输辅助剂的使用方法，包括如下步骤： 

1)制备糖溶液：按照比例配制糖溶液，单糖浓度为50mg/ml，混合糖按照 比例混合，总糖含量为100mg/ml； 

2)按照步骤1中所述浓度的糖溶液运输药物，按照要求剂量给药。 

本发明所述的一种新型药物靶向运输辅助剂在运输药物中的应用。 

一种新型药物靶向运输辅助剂在运输药物中的应用，优选地，用于靶向运输反义寡核苷酸药物PMO、PNA、2’ome RNA、肽-PMO和siRNAs以及大分子质粒。 

进一步地，用于靶向运输治疗杜兴肌肉萎缩症的反义寡核苷酸药物PMO(phos phorodiamidate mrpholino oligomers)、PNA、2’ome RNA、肽-PMO和siRNAs以及大分子质粒。 

PMO为一种新型反义寡核苷酸，抑制天然RNA剪接过程，产生各种mRNA，可抑制基因表达，如抑制原癌基因的表达。PMO与特异病毒mRNA结合形成的双联物可有效阻断病毒RNA转录，抑制病毒复制。此化合物又具有很好的稳定性、溶解度和细胞渗透性，现已用于病毒感染、癌症、肌营养不良症和早老综合征治疗药物的研究中。 

2’ome RNA的全称为：2’-O-甲基化RNA反义寡核苷酸，PNA为肽核酸，肽-PMO为连接了细胞穿梭肽或组织靶向肽的PMO，siRNA为一类双链RNA分子，上述物质均为常见的反义寡核苷酸药物种类，能够调控mRNA的表达，均可由市场购得。 

本发明的有益效果是：靶向运输效果好，能够显著提高药物在目标组织中的作用效果；取自天然产物-糖类，对人体基本无伤害，毒副作用小。 

附图说明

图1为免疫组化分析结果图 

图2为对前胫骨肌横切面dystrophin阳性的肌纤维数的定量分析图 

图3为RT-PCR分析图 

图4为实施例2对四种不同反义寡核苷酸药物的运输效果定量分析图 

图5为实施例2对四种不同反义寡核苷酸药物的运输效果的RT-PCR分析图 

图6为实施例2、4、5、6、7、11、12对能够调控GAPDH持家基因表达的siRNA药物的运输效果定量分析图 

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。 

说明 

下表为实施例1-12选用的糖 

上述代码F1为生理盐水，为常用的药物运输载体，其他常用的药物载体还有PBS溶液等，效果与生理盐水一致。 

上述实施例10和11的比例为葡萄糖∶果糖∶蔗糖的重量比。 

所述实施例的新型药物靶向运输辅助剂的使用方法为： 

如实施例1-9及12的单糖的制备方法为：使用预先配制好的糖的母液配制得到浓度为50mg/ml的单糖溶液，按照给药量将药物直接加入该单糖溶液中即可。 

对于实施例10、11的混合糖溶液，要达到100mg/ml的总糖浓度，则按照3∶5∶2的比例，需要葡萄糖、果糖、蔗糖分别为30mg/ml、50mg/ml、20mg/ml。按照4∶2∶1的比例，则需要葡萄糖、果糖、蔗糖分别为57mg/ml、29mg/ml、14mg/ml。 

使用的上述几类药物，具体序列为： 

PMO 5′ggccaaacctcggcttacctgaaat3′ 

PNA 5′ggccaaacctcggcttacct3′ 

2′OMe RNA 5′GGCCAAACCUCGGCUUACCU3′ 

P007为一段细胞穿梭肽，具体披露在Human Molecular Genetics，2008，Vol.17，No.24 3909-3918中。 

试验一 

针对所述实施例的药物靶向运输辅助剂在运输药物中的应用，尤其是运输治疗杜兴肌肉萎缩症的反义寡核苷酸药物PMO中的作用，进行了下述实验： 

1材料和方法： 

1)Mdx小鼠： 

目前杜兴肌肉萎缩症基因治疗研究中最为常用的动物模型，在其dystrophin基因外显子23上含有一个无义点突变，导致dystrophin(抗肌萎缩蛋白)蛋白翻译提前终止，从而不能翻译有意义的dystrophin蛋白，因此本研究以mdx小鼠为测试动物，该小鼠购自中国南京模式动物研究所。 

2)测试药物： 

以临床试验中的一种反义寡核苷酸药物-morpholino(PMO)为测试药物，该药物购自美国Gene Tools公司。 

3)试验方法： 

对不同的糖类化合物在小鼠的前胫骨肌运输PMO的效率进行试验。 

将2ug PMO分别与实施例1-12的一定浓度的糖溶液混合，局部注射到mdx小鼠的前胫骨肌中，单次注射，2周后，收取注射过的前胫骨肌组织，通过免疫组化、RT-PCR检测PMO介导的外显子跳读效率和恢复dystrophin蛋白的表达水 平，通过与对照溶液-生理盐水的比较，确定不同糖溶液对PMO的运输效率的提高作用。 

图1为免疫组化分析结果图，其中红色为dystrophin阳性的肌纤维；蓝色为细胞核染色(scale bar＝200um)，c57为野生型的C57BL6小鼠，可以看到，使用本发明所述实施例的药物进行PMO运输后，小鼠的前胫骨肌组织中，dystrophin阳性的肌纤维大量增加，进一步表明PMO在本实施例的运输辅助下，能够显著恢复dystrophin蛋白的表达水平，与F1的生理盐水相比，可以直观地看到，实施例6、7、10、11、12的dystrophin阳性肌纤维数量有了明显的提高，其他实施例也达到了至少等同的效果。 

图2为前胫骨肌横切面dystrophin阳性的肌纤维数的定量分析图，可以看到上述实施例的dystrophin阳性的肌纤维数相对生理盐水有大幅度增加，表明本发明的药物运输辅助剂的效果大大优于生理盐水。 

图3为RT-PCR分析图，图中full-length表示未跳读的PCR产物；exon23表示为外显子23跳读的PCR产物；exon22&23为外显子22和23都跳读的PCR产物，C57为野生型的C57BL6小鼠，Ve为阴性对照。可以看到在实施例1-12的运输辅助剂进行运输的情况下，发生了很明显的外显子跳读，从而导致dystrophin阳性的肌纤维表达量增加。 

试验二 

为了证明本发明的药物运输辅助剂在运输其他反义寡核苷酸药物中的显著作用，使用实施例2即F3与生理盐水进行了对比试验。 

图5为dystrophin阳性的肌纤维的定量分析，四组数据分别表示实施例2与生理盐水对2’ome RNA、PNA、PMO，P007-PMO的运输效果，直接表现为dystrophin阳性的肌纤维的数量增加，可以看到四组数据，使用本发明的实施 例2后效果均比生理盐水有大幅增加。 

图6为生理盐水与实施例2对上述2’ome RNA、PNA、PMO、P007-PMO四种药物运输效果的RT-PCR结果图，可以看出反义寡核苷酸药物介导外显子跳读效率明显提高。 

试验三 

为了证明本发明的运输辅助剂对治疗其他疾病的其他类型药物的运输效果，申请人选用GAPDH持家基因进行了试验，选用一类可以下调其表达水平的siRNA药物进行试验。使用的糖溶液为实施例2、4、5、6、7、11、12，基本实验操作同上。图6为GAPDH持家基因表达水平定量分析图，可以看到，图示的实施例均有不同程度的下调，尤以实施例2即F3效果最佳，这一试验扩大了本发明的应用范围。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改和等同替换，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (8)

1.一种新型药物靶向运输辅助剂，其特征在于：为五碳糖、六碳糖、糖醇、二糖中的至少一类。

2.根据权利要求1所述的一种新型药物靶向运输辅助剂，其特征在于：所述五碳糖选自木糖、***糖中的至少一种；所述六碳糖选自葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖中的至少一种；所述二糖选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖中的至少一种；所述糖醇选自山梨糖醇、甘露醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的一种新型药物靶向运输辅助剂，其特征在于：优选地，使用如下重量分数组合：葡萄糖、果糖、蔗糖＝3∶5∶2。

4.根据权利要求2所述的一种新型药物靶向运输辅助剂，其特征在于：优选地，使用如下重量分数组合：葡萄糖、果糖、蔗糖＝4∶2∶1。

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种新型药物靶向运输辅助剂的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)制备糖溶液：按照比例配制糖溶液，单糖浓度为50mg/ml，混合糖按照比例混合，总糖含量为100mg/ml；

2)按照步骤1中所述浓度的糖溶液运输药物，按照要求剂量给药。

6.根据权利要求1-4任一项所述的一种新型药物靶向运输辅助剂在运输药物中的应用。

7.根据权利要求1-4任一项所述的一种新型药物靶向运输辅助剂在运输药物中的应用，其特征在于：优选地，用于靶向运输反义寡核苷酸药物PMO、PNA、2’ome RNA、肽-PMO和siRNAs以及大分子质粒。

8.根据权利要求1-4任一项所述的一种新型药物靶向运输辅助剂在运输药物中的应用，其特征在于：优选地，用于靶向运输治疗杜兴肌肉萎缩症的反义寡核苷酸药物PMO、PNA、2’ome RNA、肽-PMO和siRNAs以及大分子质粒。

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