CN103396480A - 抗体纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体的工业生产方法。
Description
本申请是2009年5月15日提交的题为“抗体纯化方法”的国家申请号为200980118361.3(PCT/EP2009/055900)的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及重组表达抗体的纯化。
背景技术
抗体纯化方法通常基于捕获亲和色谱，通常为Protein A，然后是离子交换和/或疏水作用和/或混合模式色谱步骤。此类方法通常还包括至少两个病毒清除步骤，通常通过亲和步骤洗脱液的低pH和在所述方法合适位置放置病毒过滤器清除。mAb纯化方法去除的杂质包括半抗体、抗体片段、二聚体、以及聚集体、DNA、病毒、HCP、Protein A渗漏物、内毒素以及其它相关杂质。
Protein A为一种最初发现于细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁的40-60kDa表面蛋白。业已发现，由于其结合免疫球蛋白，尤其是IgG的能力，该蛋白已用于生物化学研究。该蛋白通过与重链相互作用结合免疫球蛋白的Fc区域。
WO9856808和WO2005016968描述了Protein A纯化的示例。
Protein A纯化还描述于WO2004076485、US20070060741和Kelley BDBiotechnol Bioeng.101.(3).553-66(2008)。
持续需要工业生产重组抗体的有效方法。
发明内容
本发明涉及一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体复合物，其中
i)所述悬浮液在某些条件下接触Protein A衍生物/类似物，其中所述Protein A衍生物/类似物结合所述抗体复合物，
ii)使用合适的缓冲液洗涤所述Protein A衍生物/类似物结合的抗体，以及
iii)使用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述Protein A衍生物/类似物洗脱并收集在所得洗脱物中。
本发明涉及一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体复合物，其中
i)所述悬浮液在某些条件下接触对所述抗体具有亲和力的配体，其中所述配体结合所述抗体复合物，
ii)使用合适的缓冲液洗涤所述配体结合的抗体，
iii)使用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述配体洗脱并收集在洗脱物中，以及
来自步骤iii)的洗脱物进行阳离子色谱。
本发明涉及一种抗体纯化平台，所述平台包含根据本发明的方法。
本发明涉及一种工业生产抗体的方法，其中所述方法包含根据本发明的方法。
详细说明
抗体纯化的常规方法为本领域所熟知，例如Pete Gagnon：Purification Toolsfor monoclonal Antibodies(单克隆抗体的纯化工具)(1996)ISBN-9653515-9-9中描述的方法。本发明涉及开发抗体复合物纯化的新方法。在本申请上下文中，抗体复合物为免疫球蛋白。术语“免疫球蛋白”系指一种分子，其属于一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链组成，一对轻(L)链和一对重(H)链，全部4条链通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已充分鉴定。参见例如Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W.，编辑，第2版.Raven Press，N.Y.(1989))。简而言之，每条重链通常由重链可变区(VH)和重链恒定区(通常包含3个结构域，CH1、CH2、和CH3)组成。每条轻链通常由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(通常包含1个结构域，CL)组成。
在本发明上下文中术语“抗体复合物”系指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子片段、或者两者之一的衍生物，其具有在通常生理条件下长时间特异性结合抗原的能力，结合时间例如至少约30分钟，至少约45分钟，至少约1小时，至少约2小时，至少约4小时，至少约8小时，至少约12小时，约24小时或更长，约48小时或更长，约3、4、5、6、7或更多天等等，或者任何其它相关功能限定的时间(例如足以引发、促进、增强、和/或调节与抗体结合抗原相关的生理反应的时间)。
免疫球蛋白分子重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体(Abs)的恒定区可能介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，其包括免疫***的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)。
如上面指出，术语抗体在本文中，除非另作说明或明显与上下文矛盾，包括任何合适全长抗体的片段，该片段保留特异性结合抗原的能力，且能够结合Protein A，还能够结合Protein A衍生物/类似物。
抗体可能具有不同于上述“典型”免疫球蛋白结构的结构。其可为单链抗体、双特异性抗体、以及轻链和重链的所有种类的片段和组合。文献中充满此类抗体的描述。对于本发明的目的来说，抗体复合物结合Protein A和抗原即可。
在一种实施方案中，所述抗体复合物为治疗抗体。
在一种实施方案中，所述抗体复合物为IgG抗体。
在一种实施方案中，本发明提供了纯化抗体复合物的方法，该方法包含使用基于Protein A衍生物/类似物而不是常规Protein A柱的亲和色谱。此类ProteinA衍生物/类似物柱减少配体渗漏，改进日常生产成本并改进产品质量。另外，使用比传统Protein A步骤少盐的洗脱条件可避免亲和与离子交换步骤之间的任何浓缩步骤，例如UF/DF。
在一种实施方案中，本发明提供了一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体复合物，其中
i)所述悬浮液在某些条件下接触Protein A衍生物/类似物，其中所述Protein A衍生物/类似物结合所述抗体复合物，
ii)使用合适的缓冲液洗涤所述Protein A衍生物/类似物结合的抗体，以及
iii)使用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述Protein A衍生物/类似物洗脱并收集在所得洗脱物中。
在本发明上下文中，Protein A衍生物/类似物为Protein A衍生物/类似物配体，其中Protein A的IgG结合结构域中的碱不稳定氨基酸已用对碱更加稳定的氨基酸替换。在一种实施方案中，Protein A衍生物/类似物为Protein A分子，其中一个或多个天门冬酰胺(Asn)残基已被修饰以增加碱性条件下的蛋白稳定性。在一种实施方案中，修饰两个或更多个Asn残基。在一种实施方案中，修饰所有Asn残基。在一种实施方案中，所述Asn残基用选自赖氨酸、天门冬氨酸和亮氨酸的氨基酸替换。在一种实施方案中，所述Protein A衍生物/类似物为如本文前面所述修饰的结构域Z。在一种实施方案中，所述Protein A衍生物/类似物为如EP1123389A1和/或US6831161所述的Protein A衍生物/类似物。母体Protein A分子也可以其它方式修饰，该方式可能例如增强特性。
在一种实施方案中，所述Protein A衍生物/类似物与惰性树脂共价结合。在一种实施方案中，所述Protein A衍生物/类似物树脂为MabSelect SuReTM。MabSelect SuReTM来自GE Healthcare life Sciences(http://www.gelifesciences.com)。
在一种实施方案中，使用Protein A衍生物/类似物的亲和色谱在低于室温的温度下进行。在一种实施方案中，使用Protein A衍生物/类似物的亲和色谱在2到25℃温度下进行，例如5到25℃，例如10到25℃，例如15到25℃，或者温度为2到20℃，例如5到20℃，例如10到20℃，例如15到20℃，或者温度为2到15℃，例如5到15℃，例如10到15℃，或者温度为2到10℃，例如5到10℃，或者温度为2到5℃。在一种实施方案中，使用Protein A衍生物/类似物的亲和色谱在2、5、10、15、20或25℃的温度下进行。
在一种实施方案中，步骤i)、ii)和iii)可使用膜或固体树脂以流过(flow-through)方式进行。
在一种实施方案中，来自Protein A衍生物/类似物色谱的洗脱物进行病毒灭活。在一种实施方案中，所述病毒灭活通过降低来自Protein A衍生物/类似物色谱的洗脱物的pH进行。在一种实施方案中，所述洗脱物的pH降低至pH3到4持续时间5分钟到1天。在一种实施方案中，所述pH降低至pH 3.1到4，例如3.2到4，例如3.3到4，例如3.4到4，例如3.5到4，例如3.6到4，例如3.7到4，例如3.8到4，例如降低至pH 4。在一种实施方案中，所述pH降低至pH 3到3.9，例如3.1到3.9，例如3.2到3.9，例如3.3到3.9，例如3.4到3.9，例如3.5到3.9，例如3.6到3.9，例如3.7到3.9，例如降低至pH 3.9。在一种实施方案中，所述pH降低至pH 3到3.8，例如3.1到3.8，例如32到3.8，例如3.3到3.8，例如3.4到3.8，例如3.5到3.8，例如3.6到3.8，例如降低至pH 3.8。在一种实施方案中，所述pH降低至pH 3到3.7，例如3.1到3.7，例如3.2到3.7，例如3.3到3.7，例如3.4到3.7，例如3.5到3.7，例如降低至pH3.7。在一种实施方案中，所述pH降低至pH 3到3.6，例如3.1到3.6，例如3.2到3.6，例如3.3到3.6，例如3.4到3.6，例如降低至pH 3.6。在一种实施方案中，所述pH降低至pH 3到3.5，例如3.1到3.5，例如3.2到3.5，例如3.3到3.5，例如降低至pH 3.5。在一种实施方案中，所述pH降低至pH 3到3.4，例如3.1到3.4，例如3.2到3.4，例如降低至pH 3.4。在一种实施方案中，所述pH降低至pH 3到3.3，例如3.1到3.3，例如降低至pH 3.3。在一种实施方案中，所述pH降低至pH 3到3.2，例如降低至pH 3.2，或者降低至pH 3.1，或者降低至pH 3。
如上所述，来自Protein A衍生物/类似物色谱的洗脱物可在任一所述这些pH值下保存5分钟到1天时间。在一种实施方案中，所述时间为10分钟到240分钟，例如20到90分钟。
然后，所述洗脱物的pH调节至pH 4.5到5.5或者适合任意下列步骤的其它值。
在一种实施方案中，来自Protein A衍生物/类似物色谱的洗脱物在所述降低pH值之前和/或重新调节pH之后过滤。
在本发明的一种实施方案中，来自Protein A衍生物/类似物色谱的所得洗脱物，无论是否进行上述pH降低，都进行阳离子交换步骤。在亲和步骤下游安排阳离子交换步骤可能有利，因为所得洗脱物的pH低于7，所述洗脱物可直接处理而无需进一步调节和可能的额外pH调节，所述调节可能跨过mAb的等电点。避免进一步pH调节可帮助避免沉淀和聚集体形成。
可将来自Protein A的洗脱物(可能地，在病毒灭活之后)集合装填到在乙酸钠缓冲液中在pH 4.5-6.0下预先平衡的柱上进行阳离子色谱。未结合物质从柱上洗去，mAb使用乙酸钠缓冲液中的0-0.3M氯化钠的线性梯度洗脱。聚集体作为产品之后的峰值洗脱。杂质例如宿主细胞蛋白、DNA和Protein A渗漏也显著减少。
在一种实施方案中，该阳离子色谱在低于室温的温度下进行。在一种实施方案中，该阳离子色谱在2到25℃温度下进行，例如5到25℃，例如10到25℃，例如15到25℃，或者温度为2到20℃，例如5到20℃，例如10到20℃，例如15到20℃，或者温度为2到15℃，例如5到15℃，例如10到15℃，或者温度为2到10℃，例如5到10℃，或者温度为2到5℃。在一种实施方案中，该阳离子色谱在2、5、10、15、20或25℃的温度下进行。
在一种实施方案中，该阳离子色谱使用膜或固体树脂以流过方式进行。
在流过模式中，柱或膜在乙酸钠缓冲液中在pH 4.5-6.0下平衡。装填柱直至收集集合(样品/产品馏分)中出现HCP(宿主细胞蛋白)、聚集体或其它杂质的不可接受的增长。
在一种实施方案中，在阳离子色谱之后进行病毒过滤。在一种实施方案中，病毒过滤在低于室温的温度下进行。在一种实施方案中，病毒过滤在2到25℃温度下进行，例如5到25℃，例如10到25℃，例如15到25℃，或者温度为2到20℃，例如5到20℃，例如10到20℃，例如15到20℃，或者温度为2到15℃，例如5到15℃，例如10到15℃，或者温度为2到10℃，例如5到10℃，或者温度为2到5℃。在一种实施方案中，所述病毒过滤在2、5、10、15、20或25℃的温度下进行。
病毒过滤可以如本领域已知的方式完成，例如使用病毒过滤器，例如如PeteGagnon：Purification Tools for monoclonal Antibodies (单克隆抗体的纯化工具)(1996)ISBN-9653515-9-9所述。
在一种实施方案中，重复病毒过滤步骤，例如使用相似的病毒过滤器或不同的病毒过滤器进行第二次病毒过滤。在一种实施方案中，第一过滤器比第二过滤器更为多孔。这使在第一步更有效去除聚集体，在第二步更有效去除病毒。
在一种实施方案中，来自阳离子色谱的洗脱物可进行阴离子色谱，可能地，在如上所述的病毒过滤步骤之后。
可将来自阳离子交换色谱步骤的集合装填到在磷酸缓冲液中在pH6-8下预先平衡的柱或膜上进行所述阴离子色谱。装填之前，所述物质可使用水稀释至电导率2-12mS/cm并调节pH至目标pH。产品在流出馏分收集。
在一种实施方案中，在阴离子色谱之后进行病毒过滤。可如上所述进行所述病毒过滤。在一种实施方案中，在阳离子色谱之后和阴离子色谱之后都进行病毒过滤。
在一种实施方案中，所述阴离子色谱使用膜或固体树脂以流过方式进行。
如果需要，缓冲液交换和抗体浓缩可在最后色谱步骤之后进行(参见例如Pete Gagnon：Purification Tools for monoclonal Antibodies(单克隆抗体的纯化工具)(1996)ISBN-9653515-9-9)，以及例如见于WO2009010269。
如本领域已知，抗体样品还可进一步配制成适于药用的制剂中的药物制剂。
本发明还提供了一种抗体纯化平台，即一种标准化方法，其可用于生产多种不同抗体，一种通用方法，该平台包含根据本发明的方法。
所述标准化平台在生产中具有多种优点：
—节省开发/试验成本和时间，因为每个项目可应用相同的方法
—可应用相同的设备和原料、缓冲液等等，因此无需额外试验以及获得新的核准供应商等等
—病毒确认研究可在不同项目中重复使用
—节省人力并确保产品质量。
在一种实施方案中，所述抗体为IgG抗体。
包含本发明方法的抗体生产平台可具有其它优点，例如亲和配体渗漏减少以及在相同条件下洗脱不同IgG亚型的可能性。
因此，本发明还提供了一种工业生产抗体的方法，其中所述方法包含根据本发明的纯化抗体复合物的方法。在一种实施方案中，所述抗体复合物为治疗抗体。在一种实施方案中，所述抗体复合物为IgG抗体。
在一种实施方案中，本发明提供了一种工业生产抗体的方法，其中所述方法包含根据本发明的纯化抗体复合物的方法，其中从Protein A衍生物/类似物色谱洗脱之后的步骤无需储存罐以连续过程模式进行。
下面是本发明实施方案的非限制性列表。
实施方案1：一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体复合物，其中
i)所述悬浮液在某些条件下接触Protein A衍生物/类似物，其中所述Protein A衍生物/类似物结合所述抗体复合物，
ii)使用合适的缓冲液洗涤所述Protein A衍生物/类似物结合的抗体，以及
iii)使用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述Protein A衍生物/类似物洗脱并收集在所得洗脱物中。
实施方案2：根据实施方案1所述的方法，其中所述Protein A衍生物/类似物为Protein A的衍生物/类似物，其中IgG结合结构域中的碱不稳定氨基酸已用对碱更加稳定的氨基酸替换。
实施方案3：根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述Protein A衍生物/类似物与惰性树脂结合。
实施方案4：根据实施方案3所述的方法，其中所述Protein A衍生物/类似物树脂为MabSelect SuReTM。
实施方案5：根据实施方案1到4中任一实施方案所述的方法，其中步骤i)到iii)中的一步或多步在低于室温的温度下进行。
实施方案6：根据实施方案5所述的方法，其中所有步骤i)、ii)和iii)在低于室温的温度下进行。
实施方案7：根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述低于室温的温度为温度2到25℃，例如5到25℃，例如10到25℃，例如15到25℃。
实施方案8：根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述低于室温的温度为选自温度2到20℃的温度，例如5到20℃，例如10到20℃，例如15到20℃，或者温度为2到15℃，例如5到15℃，例如10到15℃。
实施方案9：根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述低于室温的温度为选自温度2到10℃的温度，例如5到10℃。
实施方案10：根据实施方案5或实施方案6所述的方法，其中所述低于室温的温度为2到5℃的温度。
实施方案11：根据实施方案1到7中任一实施方案所述的方法，其中所述色谱使用膜或固体树脂以流过方式进行。
实施方案12：一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体复合物，其中
i)所述悬浮液在某些条件下接触对所述抗体具有亲和力的配体，其中所述配体结合所述抗体复合物，
ii)使用合适的缓冲液洗涤所述配体结合的抗体，
iii)使用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述配体洗脱并收集在洗脱物中，以及
来自步骤iii)的洗脱物进行阳离子色谱。
实施方案13：根据实施方案12所述的方法，其中所述配体为Protein A。
实施方案14：根据实施方案1到11中任一实施方案所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物进行阳离子色谱。
实施方案15：根据实施方案12到14中任一实施方案所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物在进行阳离子色谱之前进行病毒灭活。
实施方案16：根据实施方案15所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物的pH降低至pH 3到4持续5分钟到1天的时间，然后在阳离子色谱之前重新调节。
实施方案17：根据实施方案16所述的方法，其中所述pH降低至pH3.4-3.9持续20到90分钟的时间。
实施方案18：根据实施方案12到17中任一实施方案所述的方法，其中阳离子色谱在低于室温的温度下进行。
实施方案19：根据实施方案18所述的方法，其中所述低于室温的温度为温度2到25℃，例如5到25℃，例如10到25℃，例如15到25℃。
实施方案20：根据实施方案18或实施方案19所述的方法，其中所述低于室温的温度为选自温度2到20℃的温度，例如5到20℃，例如10到20℃，例如15到20℃，或者温度为2到15℃，例如5到15℃，例如10到15℃。
实施方案21：根据实施方案18或实施方案19所述的方法，其中所述低于室温的温度为选自温度2到10℃的温度，例如5到10℃。
实施方案22：根据实施方案18或实施方案19所述的方法，其中所述低于室温的温度为2到5℃的温度。
实施方案23：根据实施方案12到22中任一实施方案所述的方法，其中所述阳离子色谱使用膜或固体树脂以流过方式进行。
实施方案24：根据实施方案1到7中任一实施方案所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物进行阴离子色谱。
实施方案25：根据实施方案24所述的方法，其中装填之前将来自步骤iii)的洗脱物的电导率调节至2到12mS/cm的电导率。
实施方案26：根据实施方案24或实施方案25所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物在进行阴离子色谱之前进行病毒灭活。
实施方案27：根据实施方案26所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物的pH降低至pH 3到4持续5分钟到1天的时间，然后在阴离子色谱之前重新调节。
实施方案28：根据实施方案27所述的方法，其中所述pH降低至pH3.4-3.9持续20到90分钟的时间。
实施方案29：根据实施方案12到23中任一实施方案所述的方法，其中来自阳离子色谱的洗脱物进行阴离子色谱，其中来自阳离子色谱的洗脱物可选地在进行阴离子色谱之前进行病毒过滤。
实施方案30：根据实施方案29所述的方法，其中来自阳离子色谱的洗脱物在进行阴离子色谱之前进行病毒过滤。
实施方案31：根据实施方案30所述的方法，其中病毒过滤包含来自阳离子色谱的洗脱物在第一过滤器然后在第二过滤器上过滤。
实施方案32：根据实施方案42所述的方法，其中该第一过滤器比第二过滤器更多孔。
实施方案33：根据实施方案29所述的方法，其中装填之前将来自阳离子色谱的洗脱物的电导率调节至2到12mS/cm的电导率。
实施方案34：根据实施方案24到33中任一实施方案所述的方法，其中所述阴离子色谱在低于室温的温度下进行。
实施方案35：根据实施方案34所述的方法，其中所述低于室温的温度为2到25℃的温度，例如5到25℃，例如10到25℃，例如15到25℃。
实施方案36：根据实施方案34或实施方案35所述的方法，其中所述低于室温的温度为选自温度2到20℃的温度，例如5到20℃，例如10到20℃，例如15到20℃，或者温度为2到15℃，例如5到15℃，例如10到15℃。
实施方案37：根据实施方案34或实施方案35所述的方法，其中所述低于室温的温度为选自温度2到10℃的温度，例如5到10℃。
实施方案38：根据实施方案34或实施方案35所述的方法，其中所述低于室温的温度为2到5℃的温度。
实施方案39：根据实施方案24到38中任一实施方案所述的方法，其中所述阴离子色谱使用膜或固体树脂以流过方式进行。
实施方案40：根据实施方案24到39中任一实施方案所述的方法，其中来自阴离子色谱的洗脱物进行病毒过滤。
实施方案41：根据实施方案40所述的方法，其中病毒过滤包含来自阴离子色谱的洗脱物在第一过滤器然后在第二过滤器上过滤。
实施方案42：根据实施方案42所述的方法，其中该第一过滤器比第二过滤器更多孔。
实施方案43：根据实施方案1到42中任一实施方案所述的方法，其中最终洗脱物进行渗滤和/或超滤。
实施方案44：根据实施方案1到43中任一实施方案所述的方法，其中最终洗脱物配制成药物制剂。
实施方案45：根据实施方案1到44中任一实施方案所述的方法，其中所述抗体复合物为IgG抗体。
实施方案46：根据实施方案1到45中任一实施方案所述的方法，其中所述抗体复合物为治疗抗体。
实施方案47：一种抗体纯化平台，所述平台包含一种根据实施方案1到46中任一实施方案所述的方法。
实施方案48：一种适合纯化IgG抗体的抗体纯化平台，所述平台包含一种根据实施方案1到46中任一实施方案所述的方法。
实施方案49：根据实施方案47或实施方案48所述的抗体纯化平台，其中所述平台用于生产IgG抗体。
实施方案50：根据实施方案47到49中任一实施方案所述的抗体纯化平台，其中所述平台用于生产治疗抗体。
实施方案51：一种工业生产抗体的方法，其中所述方法包含根据实施方案1到46中任一实施方案所述的方法。
实施方案52：根据实施方案51所述的方法，其中从Protein A衍生物/类似物色谱洗脱之后的步骤无需储存罐以连续过程模式进行。
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本文所述的所有方法可以任何合适的顺序执行，除非本文另有说明或者上下文明显矛盾。
使用本文提供的任何和所有实例、或示例语言(“例如”)，仅意在更好地说明本发明，而非对本发明的范围进行限制，除非另有说明。本说明书中的语言不应解释为提示任何要素对本发明的实践必不可少，除非明确说明如此。
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实施例
实施例1
抗体纯化方法
从CHO细胞培养物中纯化mAb的方法(抗NKG2A，描述于例如WO2006070286和WO2008009545，抗NKG2D，描述于例如WO2005097160，以及抗C5aR，描述于例如WO2003062278和WO2008022390)包含多个步骤。细胞培养上清液过滤并装填到106ml MabSelect SuRe亲和柱(长度11cm)上(关于溶剂和条件，参见下面)。洗脱产物集合通过使用0.2M柠檬酸调节pH至pH 3.7进行病毒灭活并在室温下保持1小时。也可使用其它低pKa缓冲液例如5-100mM浓度的柠檬酸或乙酸进行洗脱。随后，该集合使用0.5M Na2HPO4调节至pH 5.0，然后装填到94ml POROS 50HS阳离子交换柱(长度4.8cm)上。pH调节之后，溶液中的杂质可能发生沉淀，在装填到阳离子柱之前必须通过过滤或离心去除。使用包含超过10CV的0-0.3mol/kg NaCl梯度的25mMCH3COONa，pH 5.0洗脱缓冲液完成洗脱。此步骤的pH可根据实际mAb的pI调节。mAb集合使用0.5M Na2HPO4溶液调节至pH 7.0，并通过由0.1μm过滤器(4.52cm2)接着Planova 20N病毒过滤器(0.001m2)组成的过滤器串过滤。(Millex-W过滤器的替代品为0.1μm Millipore Opticap XLT 20过滤器)。病毒滤液在装填到Sartobind Q SingleSep胶囊(75cm2)阴离子交换膜之前在室温下用水稀释至≤7.0mS/cm。电导率降低也可通过UF/DF实现。阴离子交换膜步骤在非结合条件下以流过方式进行，滤液最终使用50cm2 Biomax 30k膜在
交叉流动仪器上超滤并渗滤至10mM组氨酸缓冲液pH 6.2中，然后加入Tween80至0.01％。药物制剂的最终组成为40mg mAb/mL、25g/L蔗糖、0.01％w/wTween 80、10mM组氨酸，pH 6.2。抗NKG2A、抗NKG2D和抗C5aR的步骤产率和其它条件/结果分别在表1、2和3中提供。Q膜步骤和通过膜的装填溶液的电导率和pH必须根据每种mAb调节以达到具有最高可能产率的最大杂质减少。因此电导率和pH可能分别在2-12mS/cm(由NaCl含量控制)和pH 5.8-8.0范围内变化。
溶剂和条件：
Protein A衍生物/类似物捕获-MabSelect SuRe
●室温
●流速：20倍柱容积每小时(CV/h)
●装填：30g mAb/L树脂，但可在1-50g/L树脂范围内变化
●平衡与洗涤缓冲液：11.5mmol/kg NaH2PO4，38.5mmol/kgNa2HPO4，300mmol/kg NaCl
●洗涤缓冲液：6.5mmol/kg NaH2PO4，43.5mmol/kg Na2HPO4，1000mmol/kg NaCl
●洗脱缓冲液：10mmol/kg甲酸，pH 3.5
●使用分段梯度洗脱
●在pH 3.7(0.2M柠檬酸)病毒灭活1小时，然后使用0.5M Na2HPO4调节pH至pH 5.0
CIEX-Poros 50HS，pH 5
●室温
●流速：25CV/h
●装填：45g mAb/L树脂，但可在40-120g/L树脂范围内变化
●平衡与洗涤缓冲液：25mmol/kg CH3COONa和12.5mmol/kg CH3COOH
●洗脱缓冲液：25mmol/kg CH3COONa和10.1mmol/kgCH3COOH，300mmol/kg NaCl
●使用平衡/洗脱缓冲液中的0-300mmol/kg NaCl线性梯度缓冲液pH 5洗脱
病毒过滤-Planova 20N
●室温
●过滤时压力0.8巴
●装填：≤110kg/m2，但可高达500kg/m2
●使用0.5M Na2HPO4溶液调节pH至7.0
●平衡与洗涤缓冲液：7.7mmol/kg NaH2PO4，12.2mmol/kgNa2HPO4，50mmol/kg NaCl
●使用0.1μm过滤器预过滤
●使用Planova 20N过滤
Q膜流过，pH 7
●室温
●流速：300CV/h
●装填：483g/m2，但装填可在200-3000g/m2范围内变化
●用水稀释集合至7mS/cm
●平衡与洗涤缓冲液：7.7mmol/kg NaH2PO4，12.2mmol/kgNa2HPO4，50mmol/kg NaCl
●流过应用与收集
UF/DF-30kDa Biomax
●缓冲液换成10mmol/kg组氨酸，pH 6.2-6.5
●浓缩并配制为30-60mg/ml，在25g/L葡萄糖和0.01％Tween80中，pH 6.2-6.5
表1.抗NKG2A纯化总结
分析方法说明在实施例9中提供。
表2.抗NKG2D纯化总结
分析方法说明在实施例9中提供。
表3.抗C5aR纯化总结
分析方法说明在实施例9中提供。
实施例2
在MabSelect SURE上捕获抗干扰素α(抗IFNα)
使用1.2μm过滤器作为预过滤器将来自CHO细胞培养的细胞培养上清液在0.45μm过滤器上过滤。所述细胞产生的抗IFNα效价(描述于例如WO2006086586)为2mg/ml。
所述单克隆抗体的pI为7.6。MabSelect SURE柱(56ml容积、高度10.5cm、直径2.6cm)预先用10倍柱容积(CV)的50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7.0平衡；流速为20CV/h。用840ml过滤后的细胞培养上清液以流速20CV/h装填柱；装填容量约为30mg/ml基质材料。
洗脱之前，用10CV 50mM磷酸钠+300mM NaCl，pH 7.0洗涤柱，然后用6CV 50mM磷酸钠+1000mM NaCl，pH 7.0洗涤，以及用5CV 50mM磷酸钠+300mM NaCl，pH 7.0洗涤。
使用由10mM甲酸，pH 3.5组成的洗脱缓冲液完成洗脱。洗脱之后，立即用0.2M柠檬酸溶液调节包含抗体集合的洗脱物馏分的pH至pH 37，并在pH3.7保持1小时。然后，用0.5M Na2HPO4调节所述溶液至pH 5.0。
如上所述确定抗体浓度。基于装填前细胞培养上清液溶液效价的回收率为78％；洗脱物溶液中抗体浓度为7mg/ml。
实施例3
在MabSelect SURE上捕获抗IX因子(抗FIX)
来自CHO细胞培养的细胞培养上清液在Sartobran P 10″0.65μm+0.45μm过滤器上过滤。所述细胞产生的抗FIX效价为2mg/ml。
所述单克隆抗体的pI为7.5。MabSelect SURE柱(2.4I容积)预先用10倍柱容积(CV)的50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7.0平衡；流速为12.5CV/h。使用9L过滤后的细胞培养上清液以流速30CV/h装填柱；装填容量约为7.5g/l基质材料。
洗脱之前，用2CV 50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7.0洗涤柱，然后用6CV 50mM磷酸钠、1000mM NaCl，pH 7.0洗涤，以及用5CV 50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7.0洗涤。
用由10mM甲酸，pH 3.5组成的洗脱缓冲液完成洗脱。洗脱之后，立即使用0.2M柠檬酸溶液调节包含抗体峰的洗脱物馏分的pH至pH 3.7，并在pH 3.7保持1小时。然后，使用0.5M Na2HPO4调节所述溶液的pH至pH 5.0。
通过使用消光系数1.71cm-1在280nm测定吸光度确定洗脱物集合中的抗体浓度。使用SE-HPLC方法确定培养上清液中的抗体浓度，其用于通过比较抗FIX单体峰面积与已知浓度的参照样品确定单体IgG含量和％HMWP。
基于装填前细胞培养上清液溶液效价的抗FIX回收率约为100％；洗脱物溶液中抗体浓度为5g/l。
实施例4
POROS 50HS上的抗干扰素α(抗IFNα)CIEX
如实施例2所述，预先在MabSelect SURE柱上纯化并调节pH的1519ml抗IFNα以浓度2.6mg/ml在来自Sartorius的HVLP型0.45μm过滤器上过滤。过滤后的抗体溶液装填到预先用10倍柱容积(CV)的25mM乙酸钠、12.4mM乙酸，pH 5.0平衡的POROS 50HS柱(94ml容积，高度4.8cm，直径5.0cm)；流速为25CV/h；装填容量约为43mg/ml基质材料。
洗脱之前，使用10CV的25mM乙酸钠、12.4mM乙酸洗涤柱。
使用10CV由25mM乙酸钠、10.1mM乙酸、300mM NaCl，pH 5.0组成的线性梯度洗脱缓冲液完成洗脱。通过从上升边OD 0.250到下降边OD 1.125收集获得包含抗IFNα的溶液。
通过使用消光系数1.63cm-1·(g/L)-1在280nm测定样品吸光度确定洗脱物集合与装填溶液中的抗体浓度。抗IFNα的回收率为72％；洗脱物溶液中抗IFNα的浓度为5.4mg/ml。
在CIEX纯化步骤中，方法流体中高分子量蛋白的含量(使用上述SE-HPLC方法)从14.5％降低到2％。
实施例5
POROS 50HS上的抗IX因子(抗FIX)CIEX
将蛋白浓度2.7mg/ml、pH 5.0、磷酸钠缓冲溶液中的490ml抗FIX(如实施例3所述预先在MabSelect SURE柱上纯化并调节pH)装填到预先用5倍柱容积(CV)的25mM乙酸钠、12.4mM乙酸，pH 5.0平衡的POROS 50HS柱(45ml容积，高度8.5cm，直径2.6cm)；流速为25CV/h；装填容量约为43mg/ml基质材料。
洗脱之前，使用10CV的25mM乙酸钠、12.4mM乙酸洗涤柱。
使用10CV由25mM乙酸钠、10.1mM乙酸、300mM NaCl.pH 5.0组成的线性梯度洗脱缓冲液完成洗脱。通过从上升边OD 0.20到下降边OD 0.4收集获得包含抗FIX的溶液。
通过使用消光系数1.71cm-1·(g/L)-1在280nm测定样品吸光度确定洗脱物集合与装填溶液中的抗体浓度。抗FIX的回收率为91％；洗脱物溶液中抗体浓度为3.6mg/ml。
实施例6
Sartobind Q SinqleSep纳米胶囊Q膜上的抗IX因子(抗FIX)流过AIEX
pH 5.1、电导率15.7mS/cm、包含在乙酸钠溶液中、如实施例5所述预先纯化的180ml抗FIX用0.5M磷酸氢二钠调节至pH 7.0(温度15.7℃)。用水调节电导率至7.00mS/cm。电导率调节之后pH为7.03(温度20.1℃)。pH和电导率调节后的样品体积为540ml，抗体浓度为1.15mg/ml。
500ml的该溶液流过预先用15倍膜容积(MV)的20mM磷酸钠、50mMNaCl，pH 7.0平衡的SinqleSep纳米胶囊Q膜(膜容积1ml)；流速为10MV/h。随后使用10MV 20mM磷酸钠、50mM NaCl，pH 7.0洗涤膜。
通过使用消光系数1.71cm-1·(g/L)-1在280nm测定样品吸光度确定收集的流出物集合与装填溶液中的抗体浓度。抗FIX的回收率为95％，洗脱物溶液中抗体浓度为1.1mg/ml。
实施例7
在Biomax 30K超滤过滤器上的抗干扰素α(抗IFNα)超滤/渗滤
包含在pH 5.0乙酸钠溶液和约0.2M NaCl中的浓度为5.7mg/ml的520ml抗IFNα在使用34mM组氨酸，pH 6.5预先平衡的Biomax 30K Pellicon XL过滤器上浓缩至45ml及抗体浓度51mg/ml。浓缩的样品在Biomax 30K Pellicon XL过滤器上用50ml 34mM组氨酸，pH 6.5交换缓冲液6次。超滤和渗滤之后回收了77％抗体。
14ml缓冲液交换后的抗IFNα浓缩液中加入蔗糖至终浓度86mg/ml和tween 80至终浓度0.03％。最后所述溶液通过0.22μm过滤器过滤。
通过使用消光系数1.63cm-1(g/L)-1在280nm测定样品吸光度确定抗IFNα的浓度。
实施例8
在冷库中在MabSelect SuRe上纯化mAb
使用用于捕获的MabSelect SuRe树脂纯化抗体抗IL20。所述实验在冷库温度进行。冷库温度实验与在室温下进行的相同实验进行比较。条件如下：
来自CHO细胞培养的细胞培养上清液(2.6g mAb/l)过滤并装填到用10CV11.5mmol/kg NaH2PO4+38.5mmol/kg Na2HPO4+300mM NaCl，pH 7.0平衡后的MabSelect SuRe柱。5ml柱以流速20CV/小时运行，洗脱之前使用10CV平衡缓冲液洗涤该柱，然后使用10CV 6.5mmol/kg NaH2PO4+43.5mmol/kgNa2HPO4+1000mM NaCl，pH 7.0洗涤，然后用10CV平衡缓冲液洗涤。用洗脱缓冲液10mM甲酸，pH 3.5完成洗脱，洗脱之后包含mAb的集合用0.2M柠檬酸调节pH至pH 3.7，并随后用0.5M Na2HPO4调节至pH 5.0。Protein A衍生物/类似物的渗漏和聚集体水平如表4所示。
表4
结论：从表2可知在冷库温度在基于Protein A衍生物/类似物的亲和柱上纯化抗体与在室温下纯化相同抗体相比，显著降低集合中的Protein A衍生物/类似物的渗漏(～10倍)和HMWP(聚集体)水平(～2倍)。
实施例9
分析方法
通过Protein A HPLC确定抗体含量
抗体含量使用Protein A HPLC方法确定。样品使用ImmunoDetectionCartridge Protein A柱(直径2.1mm，长度3mm)分析。用25mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH 7.5以流速1ml/min平衡柱3分钟。用约30μg抗体装填柱。用平衡缓冲液洗涤柱，最后用包含10mM HCOONa，pH 3.5的缓冲液以流速1ml/min洗脱2分钟。
通过比较洗脱主峰下面积与已知抗体浓度的参考样品确定抗体含量。确定单体IgG含量和高分子量蛋白(HMWP)百分比
使用尺寸排阻色谱(SE-HPLC)方法确定通过HPLC的纯度。使用TSKG3000 SWXL柱(直径7.8mm，长度30mm)、等度洗脱(洗脱缓冲液200mM磷酸钠，300mM NaCl，10％2-丙醇，和pH 6.9)、以及随后在280nm处UV检测分析样品。所述方法用于确定单体IgG含量(保持时间约9.5分钟)和HMWP百分比(保持时间7-8.5分钟)，所述HMWP由根据大小由凝胶树脂分离的二聚物或更大分子组成。通过与所述方法检测的总蛋白含量比较确定单体含量和HMWP百分比。
确定CHO宿主细胞蛋白
通过两步夹心ELISA方法确定CHO宿主细胞蛋白。测量涉及使用固定于微量滴定板上的多克隆兔HCP抗体捕获样品中存在的任何宿主细胞蛋白。通过随后加入与生物素缀合的多克隆兔HCP抗体检测结合的HCP，然后依次通过与辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白检测该抗体。定量基于与显色底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)温育。微量滴定板在450nm处读数(参考波长620nm)。
确定Protein A衍生物渗漏
使用商业试剂盒通过两步夹心ELISA方法确定Protein A衍生物渗漏。产品中Protein A衍生物的测量涉及使用固定于微量滴定板上的多克隆鸡抗Protein A抗体捕获样品中存在的Protein A衍生物。通过随后加入与生物素缀合的多克隆兔抗Protein A抗体检测Protein A衍生物，然后依次通过与辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白检测该抗体。定量基于与显色底物TMB温育。微量滴定板在450nm处读数(参考波长620nm)。
实施例10
4℃下POROS 50HS上的抗体(抗KIR)CIEX
色谱***(
Explorer100)和溶剂置于设为4℃的冰箱。
浓度为6.2mg/mL的20.3ml抗体(抗KIR，描述于例如WO2005003168、WO2005003172或WO2006003179)装填到预先用10倍柱容积(CV)的25mM乙酸钠、12.4mM乙酸，pH 5.0平衡的POROS 50HS柱(3.1ml容积，直径1cm，高度4cm)；流速为25CV/h。
洗脱之前，使用10CV 25mM乙酸钠、12.4mM乙酸洗涤柱。
使用10CV由25mM乙酸钠、10.1mM乙酸、300mM NaCl，pH 5.0组成的线性梯度洗脱缓冲液完成洗脱。通过从上升边OD 1.0到下降边OD 1.0收集获得包含抗体(抗KIR)的溶液。使用5CV 1M NaOH然后5CV 2M NaCl、50mM乙酸以及10CV 25mM乙酸钠、12.4mM乙酸，pH 5.0使该柱再生。
洗脱物集合中的抗体浓度从色谱图中确定(280nm处吸光度和消光系数＝1.49(g/L)-1·cm-1)。基于装填溶液中的浓度，该抗体的回收率为97％；洗脱物溶液中抗体浓度为3.7mg/ml。
CIEX纯化步骤中，方法流体中HCP(宿主细胞蛋白)的含量减少到1/3。室温(20℃)下对照实验(严格相同的方法和起始原料)的产率为92％。低温CIEX可优选地用于室温下不稳定的抗体。
实施例11
极高装填(流过模式)时POROS 50HS上的抗IL20 CIEX
色谱***(
Explorer100)和溶剂置于20℃。浓度为10mg/mL的215ml抗体(抗IL20，例如描述于WO9927103)装填到预先用10倍柱容积(CV)的25mM乙酸钠、12.4mM乙酸，pH 5.0平衡的POROS 50HS柱(3.1ml容积)；流速为25CV/h。装填之后用5CV 25mM乙酸钠、12.4mM乙酸洗涤柱。
收集的流出物集合中的抗体浓度从色谱图中确定(280nm处吸光度和消光系数＝1.52(g/L)-1·cm-1)。基于装填溶液中的浓度，该抗体的回收率为91％；收集集合中抗体浓度约为9mg/ml。CIEX纯化步骤中，方法流体中HCP(宿主细胞蛋白)的含量减少到1/7。为获得最大杂质减少，色谱过程中pH调节可能必须在pH 4.5-6.0范围内。
收集集合可如实施例6所述进一步进行流过AIEX处理。
实施例12
在MabSe1ect SuRe上捕获抗体抗IFNa
来自CHO细胞培养的细胞培养上清液通过过滤(Clarigard 3.0μm，Polysep1/0.5μm，Durapore 0.22μm)粗略提纯。所述细胞产生的抗体效价为3.4mg/ml。
所述单克隆抗体的pI为7.7。MabSelect SuRe柱(1000ml容积、高度13cm、直径10cm)预先用5倍柱容积(CV)的20mM磷酸盐(Na2HPO4/NaH2PO4)、150mM NaCl，pH 7.2平衡；流速为24CV/h。使用10750ml过滤后的细胞培养上清液以流速18CV/h装填柱；装填容量约为36mg/ml基质材料。
洗脱之前，用4CV 20mM磷酸盐(Na2HPO4/NaH2PO4)、150mM NaCl，pH7.2洗涤柱。用10CV由10mM甲酸，pH 3.5组成的洗脱缓冲液以流速6CV/h完成洗脱。洗脱之后，立即使用0.2M柠檬酸溶液将包含抗体集合的洗脱物馏分的pH从pH 4.0(电导率0.12mS/cm)调节至pH 3.7，并在室温下pH 37保持1小时。然后，用0.5M Na2HPO4所述溶液调节至pH 6.1。然后所述材料在储存之前过滤(0.8+0.45μm，Sartopore 2 300，0.03m2)。
此步骤的抗体产率为62％，洗脱物溶液中抗体浓度为9.1mg/ml。
实施例13
在MabSelect SuRe上捕获抗体抗IL-20
来自瞬时转染培养的细胞培养上清液通过过滤粗略提纯。所述单克隆抗体的pI为7.1。MabSelect SuRe柱(1ml容积、高度2.5cm、直径0.7cm)预先用10倍柱容积(CV)的20mM磷酸盐(Na2HPO4/NaH2PO4)、150mM NaCl，pH 7.2平衡；流速为60CV/h。使用500ml过滤后的细胞培养上清液以流速30-60CV/h装填柱。
洗脱之前，用25CV 20mM磷酸盐(Na2HPO4/NaH2PO4)、150mM NaCl，pH 7.2洗涤柱。用20 CV 0到100％线性梯度洗脱缓冲液完成洗脱。试验的洗脱缓冲液由以下成分组成：(1)10mM柠檬酸pH 3.0，(2)0.1M甘氨酸pH3.0或(3)10mM甲酸pH 3.5。洗脱以流速60CV/h进行。通过另加10CV洗脱缓冲液((1)10mM柠檬酸pH 3.0，(2)0.1M甘氨酸pH 3.0或(3)10mM甲酸pH 3.5)以及5CV 0.1M NaOH使该柱再生。用10CV 20mM磷酸盐(Na2HPO4/NaH2PO4)、150mM NaCl，pH 7.2重新平衡柱。产率在85-90％范围内。
实施例14
Fab
2
纯化方法
从CHO细胞培养中纯化抗KIR的Fab2片段的方法由下列步骤组成：亲和捕获、病毒灭活/裂解(胃蛋白酶消化)、以及阳离子交换色谱。纯化如下所述进行。
总体方法
来自CHO细胞培养的细胞培养上清液过滤并装填到500ml MabSelectSuRe亲和柱上(关于溶剂和条件，参见下面)。用洗脱缓冲液60mM柠檬酸钠pH 4.0完成洗脱，洗脱之后mAb集合用冷0.5M HCl调节至pH 3.75。加入10mg胃蛋白酶/g mAb并在37℃下温育3到6小时。随后通过加入冷0.5MNaOH将所述集合调节至pH 7.0并在4℃下温育至少8小时。温育之后将集合pH调节至5.0。所述集合进一步用H2O稀释至电导率低于2mS/cm，并装填到FineLINE 100柱中的500ml SOURCE 30S。用20CV 20mM NaOAc pH 5.0缓冲液中的0-0.2M NaCl的线性梯度完成洗脱。
溶剂和条件：
亲和色谱：
装填：细胞上清液通过0.45μm过滤器过滤
测量pH和电导率。
柱材料：MabSe1ect SuRe，500ml柱XK50。
缓冲液A：20mM磷酸钠pH 7.2+150mM NaCl
缓冲液B：60mM柠檬酸钠pH 4.0
缓冲液D：0.1M NaOH
循环：使用3CV缓冲液B再生
使用10CV缓冲液A平衡
使用10CV缓冲液A洗涤(大量洗涤可去除某些内毒素)
使用15CV缓冲液B分步洗脱
使用5CV缓冲液D进行CIP
使用缓冲液A重新平衡
流速：30-180CV/h
色谱温度：室温
裂解(胃蛋白酶消化)
来自Sigma-Aldrich的猪胃粘膜冻干粉、含量3,200-4,500单位/mg蛋白质的胃蛋白酶用于裂解。
胃蛋白酶储备溶液制备：胃蛋白酶以浓度10mg/ml溶于H2O。
在-20℃下储存胃蛋白酶溶液。
mAb样品：使用冷0.5M HCl调节来自亲和步骤的集合到pH 3.75。
胃蛋白酶消化：向样品加入10mg胃蛋白酶/g mAb，混合并在37℃下温育3到6小时。通过SEC-HPLC控制所述反应。通过加入冷0.5M NaOH至pH7然后在4℃下温育至少8小时(过夜)终止所述反应。
阳离子交换色谱
装填溶液制备：胃蛋白酶消化步骤所得溶液用H2O稀释至电导率低于2mS/cm。然后调节pH至5。
柱材料：SOURCE 30S，柱尺寸500ml
容量至少10mg/ml柱材料
缓冲液A：20mM NaOAc pH 5.0
缓冲液B：20mM NaOAc pH 5.0+1.0M NaCl
储备溶液1：100mM EDTA+100mM盐酸苯甲脒
循环：使用10CV缓冲液A平衡
装填样品
使用10CV缓冲液A洗涤
使用盐梯度第一次洗脱；超过20CV的0-20％缓冲液B
使用5CV 100％缓冲液B最终洗脱
使用1M NaOH再生
流速：馏分收集时100ml/分钟
色谱温度：室温
实施例15
鼠抗C5aR和人源化抗C5aR的亲和色谱纯化
来自CHO细胞培养的mAb的亲和纯化如下进行。来自CHO细胞培养的细胞培养上清液过滤并装填到1ml MabSelect SuRe亲和柱(关于溶剂和条件，参见下面)。使用洗脱缓冲液10mM甲酸，pH3.0或10mM柠檬酸，pH3.0完成洗脱；洗脱之后mAb集合用0.5M NaH2PO4，pH 7.6调节至pH 7.2。
溶剂和条件：
柱材料：MabSelect SuRe(GE HealthCare cat no 17-5438-01)，1ml柱，5cm高度×0.5cm直径
缓冲液A：20mM磷酸钠pH 7.2+150mM NaCl
缓冲液B1：5mM柠檬酸氢二钠pH 3
缓冲液B2：10mM甲酸钠pH 3.0
缓冲液D：0.1M NaOH
缓冲液E：0.5M NaH2PO4，pH 7.6
循环：使用3CV缓冲液B1或B2再生
使用10CV缓冲液A平衡
装填样品
使用10CV缓冲液A洗涤
使用15CV缓冲液B1或B2分步洗脱
使用5CV缓冲液D进行CIP
使用缓冲液A重新平衡
馏分收集：汇集产品馏分，使用缓冲液E调节pH至7.2
流速：30-180cv/h
色谱温度：室温
分析方法说明在实施例9中提供。
实施例16
制剂
实施例1所述的UF/DF步骤，通过缓冲液交换到下列溶液应用于抗KIR：
●50mM磷酸盐，250mM蔗糖，0.001％Tween 80，pH 7。
●20mM磷酸盐，220mM蔗糖，0.001％Tween 80，pH 7。
在两种溶液中抗体的终浓度均为10mg/ml。
实施例17
极高装填(流过模式)的CIEX然后流过AIEX
色谱***(
Explorer100)和溶剂置于20℃。
浓度为5.2mg/mL的478ml抗体(抗NKG2A)溶液(亲和色谱捕获)以流速25CV/h装填到预先用10倍柱容积(CV)的25mM乙酸钠、12.4mM乙酸，pH 5.0平衡的POROS 50HS柱(3.1ml容积)。
装填过程中抗体收集在流出馏分中。收集的流出物集合中的抗体浓度通过吸光度确定(在280nm，消光系数＝1.58(g/L)-1·cm-1)。流出馏分中抗体的回收率高于92％。此馏分中HCP(宿主细胞蛋白)和HMWP(聚集体)分别减少到1/10和1/3。来自捕获步骤的Protein A衍生物的渗漏同样显著减少。由于树脂上的抗体极高装填，装填时结合的单体被HMWP和HCP(宿主细胞蛋白)替换。为获得最大杂质减少，色谱过程中pH调节可能必须在pH 4.5-6.0范围内。同样，电导率可优化在0-100mMNaCl范围内。样品溶液和流出馏分中的HCP和HMWP水平如表5所示。
表5
收集的CIEX流出物集合用0.5M磷酸氢二钠调节至pH 7.0。用水调节电导率至7.0mS/cm。装填溶液体积为825mL，抗体浓度为2.7mg/mL。所述溶液以流速300MV/h流过预先在35倍膜容积(MV)的20mM磷酸钠、50mMNaCl，pH 7.0中平衡的Sartobind Q-MA75(膜容积2.1ml)。随后用20MV 20mM磷酸钠、50mM NaCl，pH 7.0洗涤膜。
抗体收集在流出物集合中。集合中的抗体浓度确定为24.8mg/mL。步骤产率高于99％，HCPCHOP减少到1/3。样品溶液和流出馏分中的HCP和HMWP水平如表6所示。
表6
实施例18
使用2步法纯化抗NKG2D
来自CHO细胞培养的细胞培养上清液(3.5g/l)过滤并装填到106ml ProteinA衍生物(MabSelect SuRe)亲和柱(长度11cm)(关于溶剂和条件，参见实施例1)。所有步骤在室温进行。用洗脱缓冲液10mM甲酸pH 3.5完成洗脱。洗脱的产物集合通过用0.2M柠檬酸调节pH至pH 3.6进行病毒灭活并在室温下保持1小时。随后洗脱物用0.5M Na2HPO4调节至pH 7.0过滤以去除沉淀。所述溶液在装填到Sartobind Q SingleSep胶囊(75cm2)阴离子交换膜之前在室温下调节至7.0mS/cm(水或NaCl)。也可使用阴离子交换树脂。阴离子交换膜步骤在非结合条件下以流过方式进行，滤液最终使用50cm2 Biomax 30k膜在
交叉流动仪器上超滤并渗滤到10mM组氨酸缓冲液pH 6.2中，然后加入Tween 80至0.01％。病毒过滤可加在阴离子交换步骤之后。药物制剂的最终成分为50mg mAb/mL、80g/L蔗糖、0.03％w/w Tween 80、10mM组氨酸，pH 6.2。纯化结果在表7中提供。Q膜步骤和通过膜的装填溶液的电导率和pH必须根据每种mAb调节以达到具有最高可能产率的最大杂质减少。因此电导率和pH可能分别在2-12mS/cm(由NaCl含量控制)和pH 5.8-8.0范围内变化。
表7
抗NKG2D 2步方法总结
分析方法说明在实施例9中提供。
Claims (22)
1.一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体复合物，其中
i)所述悬浮液在某些条件下接触Protein A衍生物/类似物，其中所述Protein A衍生物/类似物与所述抗体复合物结合，
ii)用合适的缓冲液洗涤所述Protein A衍生物/类似物结合的抗体，以及
iii)用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述Protein A衍生物/类似物洗脱并收集在所得洗脱物中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Protein A衍生物/类似物树脂为MabSelect SuReTM。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤i)到iii)中的一步或多步在低于室温的温度下进行。
4.一种从悬浮液中纯化抗体复合物的方法，所述悬浮液包含所述抗体复合物，其中
i)所述悬浮液在某些条件下接触对所述抗体具有亲和力的配体，其中所述配体与所述抗体复合物结合，
ii)用合适的缓冲液洗涤所述配体结合的抗体，
iii)用合适的缓冲液将所述抗体复合物从所述配体洗脱并收集在洗脱物中，以及
来自步骤iii)的洗脱物进行阳离子色谱。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述配体为Protein A。
6.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物进行阳离子色谱。
7.根据权利要求4到6中任一权利要求所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物在进行阳离子色谱之前进行病毒灭活。
8.根据权利要求4到7中任一权利要求所述的方法，其中所述阳离子色谱在低于室温的温度下进行。
9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物进行阴离子色谱。
10.根据权利要求9所述的方法，其中来自步骤iii)的洗脱物在进行阴离子色谱之前进行病毒灭活。
11.根据权利要求4到10中任一权利要求所述的方法，其中来自阳离子色谱的洗脱物进行阴离子色谱，其中来自阳离子色谱的洗脱物在进行阴离子色谱之前任选进行病毒过滤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中来自阳离子色谱的洗脱物在进行阴离子色谱之前进行病毒过滤。
13.根据权利要求9到12中任一权利要求所述的方法，其中所述阴离子色谱在低于室温的温度下进行。
14.根据权利要求9到13中任一权利要求所述的方法，其中所述阴离子色谱使用膜或固体树脂以流过方式进行。
15.根据权利要求9到14中任一权利要求所述的方法，其中来自阴离子色谱的洗脱物进行病毒过滤。
16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中最终洗脱物进行渗滤和/或超滤。
17.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的方法，其中最终洗脱物配制成药物制剂。
18.一种抗体纯化平台，所述平台包含根据权利要求1到17中任一权利要求所述的方法。
19.一种适合纯化IgG抗体的抗体纯化平台，所述平台包含根据权利要求1到17中任一权利要求所述的方法。
20.根据权利要求18所述的抗体纯化平台，其中所述平台用于生产治疗IgG抗体。
21.一种工业生产抗体的方法，其中所述方法包含根据权利要求1到17中任一权利要求所述的方法。
22.根据权利要求21所述的方法，其中从Protein A衍生物/类似物色谱洗脱之后的步骤无需储存罐以连续过程模式进行。
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