本申请是国际申请日为2009年1月21日、国际申请号为PCT/US2009/031538、进入国家阶段的申请号为“200980103035.5”、发明名称为“选择用于局部施用组合物的抗氧化剂的方法”的PCT申请的分案申请。
现有技术认识到具有抗氧化剂性质的大量化合物。本文使用的术语“抗氧化剂”指通过本发明的方法测定具有小于100%的%LF的化合物或化合物的组合。本文使用的术语“助氧化剂”指具有大于100%的%LF的化合物或化合物的组合。如本文所确认,现有技术中称为抗氧化剂的某些化合物在根据本发明的方法测试时实际具有助氧化剂性质,这使得它们不适合作为用于局部施用的组合物尤其是防晒剂中的成分,除非如本文中所述以组合形式存在。
包含适宜Aox的本发明的组合物可包括化妆品组合物制备领域中普通技术人员容易得知的任何形式。这类形式的例子包括但不限于非离子气泡分散体、乳液、膏剂、乳剂、凝胶、膏凝胶、软膏、混悬液、分散体、粉剂、固体剂、粘性物、泡沫或喷雾剂。在某些优选实施方案中,组合物可包括无水或含水固体或糊、乳液、混悬液或分散体。组合物的优选形式包括水包油乳液、油包水乳液、醇溶液或气溶胶制剂。
因此,本发明还提供用于局部施用到人皮肤和/或头发的化妆品组合物,其包括适宜的Aox和按本文描述的方法确定的Aox量。这类化妆品组合物的非限制性例子可包括这类产品作为增湿剂、清洁剂、调理剂、洗发剂、沐浴液、发胶/洗液、眼霜和眼线笔、腮红、睫毛油、打底霜、指甲油、洗甲水、眼影膏、口红、润唇膏、唇线笔、唇膏、卸妆液、指甲护理剂、脚护理组合物、粉刺处理剂、红斑/酒糟鼻处理剂、静脉曲张/蜘蛛静脉治疗剂、抗老化组合物、免晒助黑组合物、晒后用组合物、遮瑕膏、头发着色和脱色组合物、皮肤褪色/光亮剂、紧肤霜、剃须膏、须后水、卷发矫直剂、止汗剂和除臭剂、去角质剂、洗剂、洗手液、泡沫剂、疼痛和伤口处理组合物、杀虫剂、止痒和皮疹膏、定型摩丝和泡沫、香味剂、润滑剂、身体护理油、身体喷雾剂、婴儿润肤露、护臀霜、婴儿香皂、婴儿洗发剂、婴儿润肤油、婴儿湿巾、脱发治疗剂、发胶、脱毛剂、毛发生长抑制剂、脱毛蜡、个人洁肤品、科隆香水、控油剂和手用消毒剂。
可用在本发明组合物中的抗氧化剂的例子包括但不限于亚丁香基丙二酸二乙基己酯(diethylhexyl syringylidene malonate)、维生素E、亚香草醛基(vanillidene)丙二酸二异丙酯(也称为DIPVM)和相关的化合物(公开在美国专利6602515、6831191、6936735、7150876和7166273中)、四氢姜黄素(tetrahydrocurcumenoid)、大豆zymbiozome酵母、红三叶草(Red clover)提取物、葡萄(Vitis vinifera,葡萄)籽提取物/Brand B、绿茶提取物、罗布斯塔红藻(Pikea robusta)提取物、生育酚(和)葡萄(葡萄)籽提取物、葡萄(葡萄)籽提取物/Brand A、余甘子果(Phylanthus emblica fruit)提取物和它们的组合。加入到本发明组合物中的抗氧化剂的量通常在约0.01wt%至约10.0wt%之间,优选约0.1wt%至约5.0wt%之间。本领域普通技术人员根据本文描述的测试方法可确定提取物的量。
在一些实施方案中,本发明的组合物可单独包含数量大于约0.05wt%、数量为约0.1wt%或更大、数量为约0.25wt%或更大和数量为约0.5wt%或更大的维生素E作为抗氧化剂。在一些实施方案中,本发明的组合物可包含维生素E作为抗氧化剂和至少一种其它抗氧化剂化合物。
在一些实施方案中,本发明的组合物可包含维生素E以及按本发明的方法确定的助氧化剂化合物,其中这些实施方案中维生素E的存在将抵消这些化合物的助氧化剂效应形成抗氧化剂组合。在这种组合物的一些实施方案中,维生素E以大于约0.05wt%的量、约0.1wt%或更大的量、约0.25wt%或更大的量和约0.5wt%或更大的量存在。能用在包含维生素E的本发明组合物中的这类助氧化剂化合物的例子包括但不限于迷迭香油树脂(Rosemary officinalis oleoresin)、法国蔷薇(Rosa Gallica)提取物、来自绿色植物的生物活性光合成复合物、嗜热栖热菌酶(Thermus Thermophillus ferment)、ergothiotaine和它们的组合。加入到本发明组合物中的助氧化剂的量通常在约0.01wt%至约10.0wt%之间,优选约0.1wt%至约5.0wt%之间。本领域普通技术人员可按照本文描述的测试方法确定提取物的量。
在本发明一种实施方案中,组合物可为气溶胶形式,其中该组合物可与至少一种推进剂组合,推进剂可为能在喷雾给药罐内被压缩或液化并在暴露于环境温度和压力条件下膨胀或蒸发成以气溶胶形式输送组合物的任何合适气体。合适的推进剂包括具有1至5个碳原子的烃,包括但不限于甲烷、乙烷、丙烷、异丙烷、丁烷、异丁烷、丁烯、戊烷、异戊烷、新戊烷、戊烯、氢氟烃(HFCs)、氯氟烃(CFCs)、氮气、醚包括二甲醚和它们的任意混合物。本领域普通技术人员能认识到,在封闭容器如铝罐或玻璃瓶中,推进剂如二甲醚在环境温度下冷凝成液态。因此,气溶胶容器中的组合物为可包含溶解的推进剂、未溶解的液态推进剂和气态推进剂的液体制剂。所有这些由于推进剂的蒸气压而都处于压力下。实施本发明时,基于气溶胶组合物的总重量,可存在数量不超过约90wt%、优选约2wt%至约50wt%、更优选约5wt%至约40wt%、最优选30wt%的推进剂。
本发明的组合物还可包括气溶胶泡沫或通常所说的摩丝组合物。例如,美国专利6627585描述了一种摩丝成形清洁用洗发剂组合物,其包括:包含至少一种表面活性剂、水不溶性调理剂分散颗粒、水性载体的可起泡浓缩物;和气溶胶推进剂。美国专利6264964描述了一种化妆品组合物,其包括交联的非乳化聚硅氧烷弹性体和在加压***中以气溶胶泡沫形式存在的羧基乙烯基聚合物。可通过使用标准气溶胶分配器例如喷雾罐组在填充时将推进剂引入到摩丝组合物中。
本发明考虑在防晒和防晒产品和任何其它局部施用组合物中引入Aox以及防晒活性剂,此时防晒活性剂和/或Aox的加入不能消弱产品的效力也不能影响防晒活性剂的防晒能力。
本发明的组合物可包含各种其它的在本文中被称为“化妆品组分”的任选组分,但其也可包括通常称为药物活性剂的组分。CTFA Cosmetic Ingredient Handbook1997年第七版和2000年第八版描述了各种常用在皮肤护理组合物中的化妆品和药物成分,本文全文引入作为参考,它们适合用于本发明的组合物中。这篇参考文献中公开的这些功能类别的例子包括:吸收剂、研磨剂、防结块剂、消泡剂、抗氧化剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂、化学添加剂、着色剂、化妆品收敛剂、化妆品杀生物剂、变性剂、药物收敛剂、外用止痛剂、薄膜形成剂、香料组分、润湿剂、遮光剂、pH调节剂、增塑剂、还原剂、皮肤增白剂、皮肤调理剂(润肤剂、润湿剂、混杂剂、和闭合剂)、皮肤保护剂、溶剂、发泡剂、水溶助长剂、增溶剂、悬浮剂(非表面活性剂)、防晒剂、紫外光吸收剂、SPF促进剂、防水剂和增粘剂(水性和非水性的)。
在本发明的实施中,组合物可包含一种或多种防晒活性剂。对于本发明,“防晒活性剂”或“防晒活性物质”应包括所有基于其吸收UV辐射的能力被视为可允许用作活性防晒成分的这些材料,单独或组合地。这类化合物一般被描述为UV-A、UV-B或UV-A/UV-B活性剂。管理机构的许可通常要求在打算人用的制剂中包括活性剂。在美国已经或现在被批准用于防晒用途的这些活性剂包括有机和无机物质,包括但不限于对氨基苯甲酸、阿伏苯宗(avobenzone)、西诺沙酯(cinoxate)、二羟苯酮、原膜散酯(homosalate)、邻氨基苯甲酸薄荷酯、水杨酸辛酯、羟苯甲酮、帕地马酯O(padimate O)、苯基苯并咪唑磺酸、磺异苯酮(sulisobenzone)、水杨酸三乙硝胺(trolamine salicylate)、二氧化钛、氧化锌、二乙醇胺甲氧基肉桂酸盐、三油酸二没食子酰基酯(digalloy trioleate)、乙基二羟基丙基PABA、氨基苯甲酸甘油酯、具有二羟基丙酮的2-羟基萘醌(lawsone with dihydroxyacetone)、红凡士林。未在US批准但在US外出售的制剂中允许的其它防晒活性剂的例子包括乙基己基三嗪酮、二辛基丁酰胺基三嗪酮、丙二酸亚苄酯聚硅氧烷、对苯二亚甲基二樟脑磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸二钠、二乙基氨基羟基苯甲酰己基苯甲酸酯、双二乙基氨基羟基苯甲酰基苯甲酸酯、双苯并唑基苯基乙基己基亚氨基三嗪、甲酚曲唑三硅氧烷(drometrizoletrisiloxane)、亚甲基双苯并***基四甲基丁基苯酚和双乙基己氧基苯酚甲氧基苯基三嗪、4-甲基亚苄基樟脑和4-甲氧基肉桂酸异戊酯。但是,由于被批准防晒剂的目录目前正扩大,普通技术人员能认识到本发明不限于目前被批准用于人用的防晒活性剂,而是容易地适用于可在未来被许可的那些。
在本发明的一种实施方案中,其它的防晒活性剂包括光保护有效量的至少一种无机颜料或纳米颜料的颗粒,非限制性例子包括二氧化钛、氧化锌、氧化铁、氧化锆、氧化铈或它们的混合物。
本发明的组合物还可包括还能通过UV辐射散射和分散一类的机理增加最终组合物的SPF的材料。这类材料在本文中被称为“UV辐射散射剂”并包括表现出UV吸收活性或未表现出UV吸收活性的材料。这类UV辐射散射剂的例子包括聚合材料,例如称为SunSpheresTM(Rohm and Haas;Philadelphia,PA)的产品,其被它们的制造商描述为通过乳液聚合制造的中空苯乙烯/丙烯酸酯共聚物球。聚合物球被认为通过在表面如人皮肤上存在的防晒膜上分散和/或散射入射的UV辐射在UVA和UVB区域上增加SPF值。认为球通过使辐射改变方向而朝向防晒制剂中的UV吸收防晒活性剂来使较少的UV辐射渗透到皮肤内,此时辐射与防晒活性剂分子反应并且能量作为热被散出。本文使用的术语“球”或“散射剂”不受化学组成或形状限制,而是包括能产生延长入射的UV辐射的路径、增加辐射接触防晒活性剂分子即UV吸收活性剂的统计可能性的效果的任何试剂。这些材料还可包括同样表现出散射性质的UV吸收材料如ZnO(例子包括可从BASF得到的Z-CoteTM产品)、TiO2(例子包括可从Uniqema(NewCastle、DE、USA)得到的SolaveilTM产品)、化合物如亚甲基双苯并***基四甲基丁基苯酚(可从Ciba Specialty Chemicals,Inc.(Basel,Switzerland)得到的“TinasorbTM M″)。制剂中一般存在数量不超过约10wt%、优选在约0.5wt%至约7.0wt%范围内、尤其优选3%至约5wt%范围内的UV辐射散射剂)。
本文使用的术语“无日照晒黑剂”或“自晒黑组合物”是指当施用到人皮肤时赋予皮肤类似于暴露皮肤到自然或人工日光时获得外观的外观的组合物。无日照晒黑活性剂的例子描述在美国专利6482397、6261541和6231837中。除了人工变黑有效量的自晒黑剂外,这类无日照晒黑组合物一般包括有效量的组合物着色剂和化妆品可接受的适合局部施用到人皮肤的载体。自晒黑剂还可包括本领域中通常接受的用于施用到人皮肤的那些组合物,并且当施用时,它们在其中与氨基酸反应以便形成有颜色的产物。这类反应赋予皮肤类似于暴露于日光足以使皮肤变黑的时间时所得颜色的褐色外观。合适的自晒黑剂包括但不限于α-羟基醛和酮、甘油醛和相关的醇醛、各种吲哚、咪唑和它们的衍生物、和各种批准的染色剂。本文中作为自晒黑剂优选为α-羟基醛和酮。最优选地,自晒黑剂为二羟基丙酮(“DHA”)。其它合适的自晒黑剂包括但不限于甲基乙二醛、甘油醛、赤藓酮糖、阿脲、2,3-二羟基丁二醛、2,3-二甲氧基丁二醛、2-氨基-3-羟基-丁二醛和2-苄基氨基-3-羟基丁二醛。
合适的润滑剂或表面活性剂包括药物可接受的非毒性的非离子、阴离子和阳离子表面活性剂。合适的非离子表面活性剂的例子包括甘油脂肪酸酯如单硬脂酸甘油酯、二醇脂肪酸酯如单硬脂酸丙二醇酯、多元醇脂肪酸酯如单油酸聚乙二醇(400)酯、聚氧乙烯脂肪酸酯如聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚和如聚氧乙烯(20)硬脂基醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇酯如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、烷基葡糖苷如十六/十八烷基葡糖苷、脂肪酸乙醇酰胺和它们的衍生物如硬脂酸二乙醇酰胺等。合适的阴离子表面活性剂的例子为肥皂,包括碱性皂,如脂肪族羧酸通常是脂肪酸的钠、钾和铵盐,如硬脂酸钠。有机胺皂包括脂肪族羧酸通常是脂肪酸的有机胺盐,如硬脂酸三乙醇胺。金属皂包括多价金属和脂肪族羧酸通常是脂肪酸的盐,如硬脂酸铝。其它类别的合适阴离子表面活性剂包括硫酸化脂肪酸醇如十二烷基硫酸钠、磺化油如蓖麻油酸二钠盐的硫酸酯、和磺化化合物如烷基磺酸酯包括十六烷磺酸钠、氨基磺酸盐如N-甲基-N-油基月桂酸钠、磺化二元酸酯如二辛基磺基丁二酸钠、烷基芳基磺酸盐如十二烷基苯磺酸钠、烷基萘磺酸盐如异丙基萘磺酸钠、石油磺酸盐如具有烷基取代基的芳基萘。合适的阳离子表面活性剂的例子包括胺盐如十八烷基氯化铵、季铵化合物如苯扎氯铵。
润肤剂为有助于平滑和软化皮肤并还可降低皮肤粗糙度、破裂或刺激的含油或油性物质。典型的合适润肤剂包括粘度在50-500厘泊(cps)范围内的矿物油、羊毛脂、椰子油、可可油、橄榄油、杏仁油、澳洲坚果油、芦荟提取物如芦荟lipoquinone、合成霍霍巴油、天然地蛇属(sonara)霍霍巴油、红花油、玉米油、液体羊毛脂、棉籽油和花生油。优选地,润肤剂为可可甘油酯,其为可可油的单、二和三甘油酯的混合物,以商标名Myritol 331由HenkelKGaA出售,或Dicaprylyl Ether,以商标名Cetiol OE由Henkel KGaA出售,或C12-C15烷基苯甲酸酯,以商标名Finsolv TN由Finetex出售。可存在数量为约1wt%至约10wt%、优选约5wt%的一种或多种润肤剂。另一种合适的润肤剂为DC200Fluid350,一种硅酮流体,可从Dow Corning Corp得到。
其它合适的润肤剂包括角鲨烷、蓖麻油、聚丁烯、甜味杏仁油、鳄梨油、美珊瑚油、蓖麻蛋白油、醋酸维生素E、橄榄油、硅油如二甲基聚硅氧烷(dimethylopolysiloxane)和环聚二甲基硅氧烷、亚麻醇、油醇、谷物芽油如小麦芽油、棕榈酸异丙酯、棕榈酸辛酯、肉豆蔻酸异丙酯、硬脂酸十六烷基酯、硬脂酸丁酯、油酸癸酯、乙酰基甘油酯、(C12-C15)醇的辛酸酯和苯甲酸酯、醇和多元醇的辛酸酯和癸酸酯如二醇和三醇的辛酸酯和癸酸酯、蓖麻醇酸酯如己二酸异丙酯、月桂酸己酯和十二烷酸辛酯、马来酸二癸酯、氢化植物油、苯基聚三甲基硅氧烷、霍霍巴油和芦荟提取物。
可使用在环境温度下为固体或半固体的其它合适润肤剂。这类固体或半固体化妆品润肤剂包括二月桂酸甘油酯、氢化羊毛脂、羟基化羊毛脂、乙酰基化羊毛脂、凡士林、羊毛酸异丙酯、肉豆蔻酸丁酯、肉豆蔻酸鲸蜡酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、乳酸肉豆蔻酯、鲸蜡醇、异硬脂醇和羊毛酸异鲸蜡酯。配方中可任选地包含一种或多种润肤剂。
润湿剂为由于其吸湿性而促进水保留的保湿剂。合适的润湿剂包括甘油、聚合醇如聚乙二醇和聚丙二醇、甘露醇和山梨醇。优选地,润湿剂为山梨醇、70%USP或聚乙二醇400NF。配方中可任选地包含数量为约1wt%至约10wt%、优选约5wt%的一种或多种润湿剂。
干燥感调节剂为当加入到乳液中时在乳液干燥时赋予皮肤“干燥感”的试剂。干燥感调节剂可包括滑石、高岭土、白垩、氧化锌、硅酮流体、无机盐如硫酸钡、表面处理的二氧化硅、沉淀二氧化硅、火成二氧化硅如可从New York,N.Y.U.S.A.的Degussa Inc.得到的Aerosil。另一种干燥感改性剂为在美国专利6488916中公开类型的表氯醇交联的甘油淀粉。
引入另外的增稠剂如可从Noveon Co得到的各种Carbopols是有利的。尤其优选的为不会破坏最终产品制剂中薄层状结构的那些试剂,如非离子增稠剂。另外的增稠剂的选择在本领域内是众所周知的。
还可向本发明的组合物中添加另外的天然或合成物质以免受或延缓由于空气中氧气作用(氧化)引起的变质。它们还可减少皮肤组织中的氧化反应。这类物质能防止可能引起腐臭和非酶褐变反应产物的产生的氧化变质。典型的合适物质包括没食子酸的丙基酯、辛基酯和十二烷基酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA,通常以邻位和间位异构体的混合物形式购买)、丁基化羟基甲苯(BHT)、绿茶提取物、尿酸、半胱氨酸、丙酮酸盐(或)酯、去甲二氢愈创木酸、维生素A、维生素E和维生素C和它们的衍生物。可在组合物中任选地包括数量为约0.001wt%至约5wt%、优选约0.01wt%至0.5wt%的一种或多种这类物质。
螯合剂为用于螯合或结合金属离子如具有杂环结构从而离子被每个构成环的化学键固定的物质。合适的螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA二钠、乙二胺四乙酸二钠钙、EDTA三钠、白蛋白、转铁蛋白、去铁敏、甲磺酸去铁敏(desferal)、甲磺酸去铁敏(desferoxamine mesylate)、EDTA四钠和EDTA二钾或这些物质的任意组合。
芳香剂为能赋予防晒组合物美学上令人愉悦的香味的芳香物质。典型的芳香剂包括从植物源(例如玫瑰花瓣、栀子花、茉莉花等)提取的芳族物质,它们可单独或以任意的组合形式使用来形成香精油。或者,可制备醇提取物用于混合芳香剂。但是,由于由天然物质获取芳香剂的较高成本,现代的趋势是使用合成制备的芳香剂,尤其在大量生产制品中。防晒组合物中可任选地包含数量为约0.001wt%至约5wt%、优选约0.01wt%至约0.5wt%的一种或多种芳香剂。如果需要,还可使用另外的防腐剂,其包括众所周知的防腐剂组合物,例如尤其是苄醇、苯基乙基醇和苯甲酸、二偶氮烷基(diazolydinyl)、脲、氯苯甘油醚(chlorphenesin)、丙炔基碘和丁基氨基甲酸酯。
本发明的组合物还可包括皮肤保护活性剂。合适的例子包括(优选重量百分比范围)尿囊素(0.5-2%)、氢氧化铝凝胶(0.15-5%)、菱锌矿(1-25%)、可可油(大于50)、鳕鱼肝油(5-14%)、胶体燕麦(Colloidal oatmeal)、聚二甲基硅氧烷(1-30%)、甘油(20-45%)、硬化脂(大于50)、高岭土(4-20%)、羊毛脂(12.5-50%)、矿物油(大于50%)、凡士林(大于30%)、碳酸氢钠、局部淀粉(topical starch)(10-98%)、白凡士林(大于30%)、醋酸锌(0.1-2%)、碳酸锌(0.2-2%)和氧化锌(1-25%)。
本发明的组合物还可包括驱虫组分。用于个人护理产品的最常用的驱虫活性剂为N,N-二乙基-间-甲苯甲酰胺,通常称为“DEET”,并可以以包含至少约95%DEET的浓缩物的形式得到。其它合成的化学驱虫剂包括丁基乙酰基氨基丙酸乙酯(也称为IR3535)、邻苯二甲酸二甲酯、乙基己二醇、避虫酮、二-正-丙基isocinchoronate、双环庚烯、二羧酰亚胺和四氢糠醛。某些源于植物的物质也具有驱虫活性,包括香茅油和其它香茅油源(包括柠檬草油)、苧烯、迷迭香油和桉叶油。引入到防晒乳液内的驱虫剂的选择经常受驱虫剂气味影响。使用的驱虫剂的量将取决于试剂的选择;DEET在高浓度下是有用的,如最高约15%或更高,而一些植物衍生的物质一般使用少得多的量,如0.1%或以下。
局部施用本文描述的本发明组合物到人头发或皮肤能提供对紫外线辐射(UVR)有害效应的增强防护。因此,本发明进一步提供一种保护人皮肤和/或头发免受太阳辐射更具体地说是UVR的有害效应的方法,该方法包括向其局部施用有效量的如本文描述的包含防晒剂和一种或多种抗氧化剂的组合物。暴露皮肤到UVR(即从280nm至400nm的光辐射波长)的美学有益结果是促进人表皮的变黑。日照的另一个益处来自于皮肤内维生素D的产生。UVR一般被分成UV-A(320-400nm的光波长)和UV-B(280-320nm的波长)区域。过度暴露于UV-B辐射通常被认为导致皮肤灼伤和红斑。另外,过度暴露于UV-A辐射可能导致皮肤弹性丧失和皱纹出现,加快过早的皮肤老化。这类辐射促进红疹反应的触发或在某些个体中放大了这种反应,并甚至是光毒性或光过敏反应的来源。越来越多的人认为,过度暴露于UV-A还可能导致黑色素瘤。因此,施用本发明的组合物到个体的皮肤和/或头发将提供对个体皮肤和/或头发的增强UVR光保护(UV-A和/或UV-B)。
本发明还提供一种通过施用本发明的组合物到将要或已经暴露于UVR的皮肤来治疗和/或逆转皮肤光损伤的方法。术语“治疗和/或逆转光损伤”旨在指皮肤状态的一个或多个属性如干燥度、肌理、弹性/结实性/张弛性、皱褶/皱纹、皮肤色调/透明度、色素沉着均匀性和/或因暴露于UVR而被恶化的红斑得到改善。
本发明的包含防晒剂的组合物旨在提供级别为至少2的防晒因子(SPF),另外优选的实施方案具有至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95和至少100的防晒因子。本发明的含防晒剂的组合物还旨在提供至少一星、至少二星、至少三星和直到四星的U.S.FDA UV-B“星级”。
将借助下面的实施例进一步描述本发明,这些实施例不打算以任何方式限制由所附的权利要求限定的本发明。
实验
DPPH(α,α-二苯基-β-苦基偕腙肼基)自由基试验
DPPH为当溶解在溶液中时形成强紫色的稳定自由基。当被抗氧化剂还原时,紫色逐渐消失直到当DPPH被完全还原时其最终消失。可容易地测量颜色逐渐消失的程度并用于将被认为具有抗氧化剂性质的不同材料的相对效力进行分级。
在简单甲醇溶液中记录抗氧化剂原料的测量值。通过在甲醇中以不同浓度溶解抗氧化剂制备样品。在样品制备后,将125μl样品或作为对照的纯甲醇移液到样品测试管内,然后加2ml甲醇并旋转。然后将2mlDPPH储备溶液(在甲醇中0.25mM)加入到每个管(每个样品达到4.125ml的总体积)中并旋转。在加入DPPH后,立即盖住测试管并放到30℃水浴中保持20分钟。在温育20分钟后,使用Perkin Elmer Lambda40分光光度计在517nm处记录每个样品的吸光度。所有样品均制备一式三份,并使用它们的平均吸光度值通过使用下面的公式以抗氧化剂还原单位(ARU)计来表示各种浓度下抗氧化剂的效力:
ARU=(甲醇对照吸光度-样品吸光度)×10
ARU值具有0到约15的大小,0代表“无”效力,15代表具有高抗氧化剂效力的原料。
被认为具有抗氧化剂性质的各种油和水溶性原料的抗氧化剂效力列在表1中。原料除了包括众所周知的植物提取物如绿茶、玫瑰、葡萄和蘑菇外,还包括大家熟知的抗氧化剂如维生素E。效力被表示为抗氧化剂还原单位(ARU),其范围从无效力的0值到具有还原DPPH基的高效力的抗氧化剂的12。油和水溶性抗氧化剂的例子覆盖这个范围。
表1
与维生素E相比,部分物质明显具有较低(ARU<6.5)而另外一些具有较高(>6.5)的抗氧化剂效力。单独基于ARU值,期望ARU>6.5的抗氧化剂在中和UVR引起的皮肤内ROS形成的能力方面超过维生素E。但是,认识到ROS涵盖了各种反应性化合物,包括自由基以及其它氧化剂如过氧化氢、单态氧或过氧化亚硝酸盐,因此DPPH自由基试验的结果可能不能充分预测在暴露于UVR的皮肤上的抗氧化剂效力。因此,我们从表1中选择涵盖一系列ARU值的几种抗氧化剂(用*指示)在更严密地模拟暴露于UVR的完整人皮肤的模型***中进行测试,以理解通过DPPH自由基测试测量的溶液中Aox效力能否转化成皮肤上类似的效力水平。
评价抗氧化剂抑制脂质过氧化能力的体外带剥离法(Ex Vivo Tape StripMethod)
为了确定抗氧化剂(Aox)能否在UVR存在下在皮肤上保持其效力,我们设计了利用人皮肤脂质作为UVR引起的过氧化的底物的新的更相关模型。将在宽带片上从皮肤取下的脂质作为随后暴露于UVR的底物。通过在带剥离前施用有或没有Aox的标准洗液到皮肤上,可在有或没有Aox的条件下在带剥离物上收集皮肤脂质,所述Aox基本保持脂质和Aox在皮肤上所具有的接近性。在UVR暴露后,可测量Aox的存在保护脂质免受ROS过氧化相对于抗氧化剂不存在时脂质的程度。
征募人志愿者进行试验并要求他们在试验前至少2天不要施用任何产品到其手臂。在任何产品处理前,用异丙醇润湿的KimwipeTM擦拭对象左和右前臂内侧以除去可能存在于皮肤表面上的任何残余物。施用轻微压力擦拭手臂仅仅一次,然后在处理前使其干燥至少10分钟。将模板(90mm×50mm)定位在每个内前臂上使得能清楚描绘二个区域。使用尖超细的SharpieTM笔,在模板的每个角处做标记以勾勒出每个施用部位,每个前臂描绘二个部位。使用指套,施用空白对照剂或抗氧化剂洗液(100mg)到前臂上的描绘的部位。要小心以确保在整个施用区域内均匀地施用产品。施用后,使部位风干30分钟,在此期间,指示对象不能使任何衣服接触试验区域。
在洗液干燥30分钟后,使用4.0英寸的Brand No.800PrescriptionLabel带片(1.5英寸宽)对每个部位进行带剥离。将带的一端折叠提供不会粘着到皮肤上的边缘以方便取下。将带片定位在部位上,然后使用手指轻轻按压带到皮肤上以便良好接触。然后从对象手臂上快速取下带。取下后,将所有带存放在黑暗位置如抽屉中直到它们被UV辐照或用异丙醇提取(即非辐照对照)。使用1000W Xe弧太阳模拟器(WG320过滤)用10焦/cm2的剂量照射每个对象的皮肤的所选带剥离物。使用Optronics OL-754分光辐射度计调节太阳模拟器的输出以输送恒定剂量的UVR。辐照后,将带修剪至三英寸的长度并放在20ml玻璃闪烁瓶中。然后向每个瓶中加入4ml异丙醇,然后盖上盖子。然后再次强烈振荡瓶并放在-20℃冷冻机中提取过夜。在取出等分试样用于脂质氢过氧化物(LOOH)分析前振荡第二天的样品。
按照生产商的指示使用Lipid Hydroperoxide Assay Kit(Kamiya BiomedicalCompany,Thousand Oaks,CA)分析每个带提取物的总LOOH含量。然后通过使用分光光度计在675nm下测量亚甲基蓝形成来对脂质氢过氧化物进行定量。使用氢过氧化枯烯制备标准曲线,标准曲线在这些实验中检测的LOOH的范围内是线性的。分析每种提取物三次,本文提供的结果代表这些分析的平均值。标准偏差一般小于10%。
通过将每个志愿者上四个施用部位测定的LOOH值代入到下面的公式中计算抗氧化剂(Aox)或空白对照剂洗液抑制UVR引起的脂质氢过氧化物(LOOH)形成的程度:
“LOOH形成%”的计算能使每个对象成为他个人的内部对照并使与用于剥离皮肤的带(3英寸)的面积相关的数据标准化。按照这种方式,可比较不同人身上的部位之间的LOOH形成%的值。
使用配对t-检验分析数据以确定抗氧化剂或空白对照剂处理是否产生显著不同的结果。.05的α水平和80%的功效用于所有统计检验。
所选抗氧化剂(表1中的*)保护脂质不受UVR引起的ROS形成的结果显示在图1中,其揭示了几个显著特征。水和油溶性物质都能保护脂质免受UVR引起的过氧化;但是,原料必须能分成有保护性的脂质双层。维生素E以剂量无关的方式(黄柱)保护皮肤脂质。四氢姜黄素(THC)与维生素E一样有效。维生素E联合Emblica、GT或THC(橙色柱)也能与单独维生素E(黄柱)大约一样好地保护。令人惊奇地,一些物质(红柱)增加而不是降低脂质氢过氧化物(LOOH)水平,用作助氧化剂而不是抗氧化剂。维生素E的加入能降低抗氧化剂的助氧化剂性质(蓝条),但不能达到与单独维生素E观察到的一样的程度。
这些结果说明,单独的DPPH自由基测试不能预测Aox在皮肤上有效用于保护脂质不受来自UV引起的ROS形成的过氧化的能力。
角质层的双光子荧光显微镜成像
使用前面描述的过程(Hanson KM,Clegg RM.Photochemistry andPhotobiology,2002,76(1):57-63)在人胸部皮肤切片(~0.5cm×0.5cm)上体外进行双光子荧光强度成像以检测并对UV引起的角质层中活性氧(ROS)的水平进行定量。使用玻璃棒顶端将试验制剂以2mg/cm2施用到皮肤样品的表面上。在辐照前,在磷酸盐缓冲的盐水-乙醇中的100微摩尔二氢若丹明(DHR)中培育皮肤样品。DHR分配到组织内,它在那里与UV引起的ROS反应产生强荧光若丹明-123,其随后被成像和量化作为UV引起的ROS形成的度量。从每个皮肤样品和至少每个深度处成像至少二个唯一区域。使用没有防晒活性剂或抗氧化剂的基础制剂作为对照。
图2中显示的图像说明了在施用每种制剂到完整的人皮肤片并辐照后在角质层整个厚度内产生的UV引起的ROS形成的程度。图像清楚表明,暴露于4MED全光谱UV辐照产生充足的ROS形成。在辐照前施用SPF30宽光谱防晒制剂利用其在与皮肤相互作用产生ROS前吸收UV的能力而相对于对照制剂减少ROS形成39%。但是,施用SPF30制剂加抗氧化剂(0.5%维生素E,0.1%Emblica)相对于对照制剂减少ROS形成总计73%,这表示与只包含防晒活性剂的制剂相比有34%的额外ROS减少。
因此,这些结果有说服力地说明,适宜类型和水平的抗氧化剂的加入能作为辅助策略帮助防晒剂保护皮肤免受UV引起的ROS形成的有害影响。暴露皮肤到UVR可产生充足的ROS,即使通过宽光谱SPF30防晒剂的保护层。利用中和ROS的能力,抗氧化剂(Aox)能提供可测量和有意义的对ROS破坏效应的保护水平,按照这种方式,显著增大了所提供的防晒剂的保护力,但是,条件是适当选择用在防晒剂中的Aox。
抗氧化剂组合对基底层的保护
A.脂质过氧化抑制
维生素E在中和表皮外层、角质层中的UV引起的ROS方面非常有效。制备空白对照剂和实验制剂以比较制剂抑制脂质过氧化的能力。使用的制剂显示在表2中。
表2
带剥离研究中使用的空白对照剂和抗氧化剂洗液
通过添加十六/十八烷基硫酸钠到A部分的水中并混合,然后添加Simulgel NS或Sepigel305并充分混合来制备制剂。然后,在搅拌下加入B部分成分,然后是C部分中的Germaben II。在加入所有成分后,充分混合乳液。
使用上面描述的体外带剥离方法,发现单独包含维生素E或包含维生素E与Emblica的组合物在保护皮肤外表面脂质不受ROS介导的UV引起的氧化方面非常有效(表3)。
表3
B.双光子荧光显微检测
然后对包含维生素E和Emblica的制剂进行双光子荧光显微分析以确定抑制ROS形成的能力。使用的方法类似于上面描述的那些,使用共焦显微镜观察整个皮肤切片内不同深度处的细胞,然后使用荧光对ROS形成的程度进行定量。但是,在本实验中,不是使用人胸部皮肤,使用的皮肤为EpiDermTMSkin Model(MatTek Corporation,Mass,USA),其由正常的人得到的表皮角质化细胞组成,这些角质化细胞已被培养形成人表皮的多层高度分化型模型。在超微结构上,EpiDermTM Skin Model 与人皮肤高度相似,因此提供研究抗氧化剂中和暴露于UVR向下直到基底层期间形成的ROS的能力的体外模型。
在UVR暴露前,用二氢若丹明处理EpiDermTM皮肤切片,二氢若丹明分配到组织的整个含水和脂质区域内。当暴露于UVR时,组织中的二氢若丹明与在任何地方形成的ROS起化学反应产生高度荧光分子。随后检测荧光并进行定量以提供在皮肤较深层中形成的UV引起ROS的水平的指示。通过在辐照射前局部施用抗氧化剂,可测量ROS形成并与在将没有抗氧化剂的空白对照剂洗液施用到皮肤后形成的ROS比较。按照这种方式,可测量抗氧化剂中和皮肤较深层内的ROS的效力并确定它们的相对效率。
使用这种方法,测试包含维生素E和Emblica的实验制剂以确定其在表皮暴露于4MED后中和表皮基底层和底层内ROS的能力。这个实验中使用的实验制剂和空白对照剂洗液制备如下。
表4-空白对照剂洗液
表5-抗氧化剂洗液
通过添加丙烯酸酯/C10-30烷基丙烯酸酯交联聚合物到A部分的水中同时搅拌和混合直到透明和无块来形成水相。在搅拌的同时,向A部分的水相混合物中加入丙二醇和EDTA二钠并充分混合10分钟。然后向水相混合物中加入B部分的三乙醇胺并继续充分混合。另外通过混合C部分的成分到一起并在充分搅拌的同时加热到140-145°F形成油相。然后将油相加入到水相中并继续混合形成乳液。将乳液冷却到室温然后向冷乳液中加入D部分的苄醇并充分混合。加入足够重量的补充的水。空白对照剂和实验制剂之间的差异是往油相中添加抗氧化剂。
如图3中所示,尽管在表皮外层中非常有效,但0.5%维生素E和0.1%Emblica的组合减少表皮基底层中的ROS形成仅仅约5%。
接下来我们评价了化妆品工业使用的各种成分所声称的抗氧化剂能力,并令人惊奇地发现它们中的许多在暴露于UVR皮肤上的基底层处表现为像助氧化剂。如图4中所证明,不是降低ROS水平,这些成分在表皮基底层内相对于没有任何抗氧化剂的空白对照剂增加ROS水平达到250%。表现为像助氧化剂的这些成分中的许多种代表来自茴香籽、玫瑰和白葡萄的天然植物提取物。这些结果共同说明,在有意识的日光暴露时,需要审慎选择防晒产品中使用的抗氧化剂。此外,试验说明,本发明的方法揭示了不是所有被确定为“抗氧化剂”的成分都能在UVR暴露现实使用中提供实际的抗氧化剂性能。
接下来我们测试了包含抗氧化剂维生素E和亚丁香基丙二酸二乙基己酯(ST,Merck KGaA,德国)组合的实验制剂以确定该组合能否有效防护整个表皮内UV引起的ROS形成。通过类似于上面描述的方法,制备空白对照剂和实验制剂。
表6-空白对照剂洗液
表7-抗氧化剂洗液
通过添加丙烯酸酯/C10-30烷基丙烯酸酯交联聚合物到A部分的水中同时搅拌和混合直到透明和无块来形成水相。在搅拌的同时,向A部分的水相混合物中加入丙二醇和EDTA二钠并充分混合10分钟。然后向水相混合物中加入B部分的三乙醇胺并继续充分混合。另外通过混合C部分的成分到一起并在充分搅拌的同时加热到140-145°F形成油相。然后将油相加入到水相中并继续混合形成乳液。将乳液冷却到室温然后向冷乳液中加入D部分的苄醇并充分混合。加入足够重量的补充的水。空白对照剂和实验制剂之间的差异是该油相中添加抗氧化剂。
如表8和图5和6中所示,体外ROS结果说明,同时包含维生素E和ST的洗液提供了比利用维生素E和Emblica高得多的对UV引起ROS形成的防护。
表8
抗氧化剂 |
基底层中中和的ROS% |
1MED暴露后 |
|
|
|
0.5%维生素E+0.1%Emblica |
ND |
0.5%维生素E+0.9%Oxynex ST |
47 |
|
|
4MED暴露后 |
|
|
|
0.5%维生素E+0.1%Emblica |
5 |
0.5%维生素E+0.9%Oxynex ST |
33 |
ND=未确定。
添加ST到包含维生素E的洗液中在暴露于4MED的UVR后中和了基底层内33%ROS,在暴露于1MED的UVR后中和了47%ROS。这些结果明显好于仅包含维生素E和Emblica的洗液的5%ROS中和。
还在上面描述的脂质过氧化试验中测试了包含0.5%维生素E和0.9%ST组合的组合物,并表明阻止UV引起的脂质过氧化75%。这与0.5%维生素E加0.1%Emblica得到的结果类似。但是,尽管组合物在抑制脂质过氧化的能力上类似,但通过组合维生素E和ST,我们观察到在表皮整个厚度上防护ROS形成这一点出乎意料地增加。
这些结果还确认,ST在皮肤暴露于UVR时在皮肤内保持了其抗氧化剂能力,而不是变成助氧化剂。综合考虑,这些结果表明了组合维生素E和ST用于防护表皮整个厚度内UV引起的ROS形成的出乎意料的益处。
高SPF抗氧化剂配方的化妆品临床效力评价
按照本发明的方法生产包含防晒剂和抗氧化剂(antioxidant loads)的二种典型抗氧化剂防晒剂配方:
成分 |
SPF70 |
SPF30 |
|
|
|
防晒剂 |
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|
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|
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胡莫柳酯 |
15% |
15% |
氰双苯丙烯酸辛酯(Octocrylene) |
10% |
2% |
阿伏苯宗 |
3% |
2% |
羟苯甲酮 |
6% |
5% |
奥替柳酯(Octisalate) |
5% |
5% |
|
|
|
抗氧化剂 |
|
|
|
|
|
亚丁香基丙二酸二乙基己酯 |
0.9% |
- |
维生素E |
0.5% |
0.5% |
Emblica |
- |
0.01% |
所有百分比都为w/w。
在按照U.S.F.D.A.批准的试验规程进行的体内SPF试验中,确定第一制剂被评定为至少SPF70,第二制剂为至少SPF30。为了方便,它们在本文中将被称为SPF70和SPF30。SPF的体外和体内测量方法描述在例如美国专利申请公开No.20070160549和20080081024中。
进行临床效力评价以确定按上文所述生产的高SPF抗氧化剂制剂对皮肤健康指标包括皮肤干燥性(水份)、皮肤肌理(粗糙度、光滑度)、弹性(即结实性或张弛性)、皮肤色调和透明度、色素沉着均匀性、细皱纹和皱褶、红斑、光损伤和暗伤(潜在性色素沉着)的影响。研究为单盲、平行、随机、受控、十二(12)周使用试验,具有七(7)天的附加起始平衡期。注册一百零九个(109)对象,一百零五个(105)继续研究。四个(4)对象由于不能做出全部定期计划的观察而退出。没有报告不利的试验。由于使用测试产品12周,下面的结果说明了相对于皮肤起始状态的显著改善。
将合格的对象分成二(2)个产品组和一个未处理的对照组。专业临床评估者在每次观察时将每个对象的脸分级以评价造成过早老化的视觉和触觉性质的独立参数,以及提供可见光损伤程度的总体全面评价。使用在起始(baseline)时的临床分级得分确认对象存在轻度至中度光损伤,并因此被准予参加。
使用生物检仪器量好具体的性质(specific attribute),使用具有图像分析的硅橡胶树脂复制品测量细皱纹和皱褶,用Nova Meter测定水份含量,用Dermalab抽吸设备测量皮肤弹性。受过专门训练的摄影师在起始、第2、4、8和12周时使用固定角标准和交叉偏振光Canfield临床相机装置为每个对象拍照以记录脸侧面(包括鱼尾纹区域)上具体部位的外观。摄影师在起始和在第12周观察时或直到产品被洗掉且没有较长荧光(无论哪个较晚)时取全脸部UV反射照片。专业临床评估师将在起始和在第12周(至洗掉的±天数)时获取的UV照片分级以评估存在的潜在性“暗”伤的程度,然后全面评价与起始相比的变化量。
对试验组合物加外包装以隐藏生产商标识,并用合适的试验件代码和使用指示标记。大约一半研究产品在研究开始前被交付,另一半产品在研究中期前被交付。
在处理期开始前7到10天,对象经历起始平衡期,在此期间他们中断所有面部防晒剂、皮肤处理产品、他们正用的面部清洁皂或膏和任何面部保湿化妆品产品的使用;每天使用Camay皂,每个早晨进行任何脸部清洁,并根据需要全天使用;并且在研究持续期间禁止使用日光浴床。
在平衡期后,通过查看足够的干燥性和外在皮肤老化征兆来定性对象。在定性后,对象被随机分配到二个试验组中的一个或未处理的对照组。在研究持续期间,被分配到处理和非处理组的对象只用提供的Camay皂洗脸。在两个处理组中的对象每天一次(每个早晨)施用指定的试验制品到他们的脸上(和颈上,如果需要),然后按照需要重复施用。
对象在每次观察时都在研究中心提供的日记薄上记录每天的施用时间。非处理组中的对象记录他们在研究期间清洗和施用他们常用的保湿剂、防晒剂和彩妆产品的次数。按与处理组中所列相同的方式收集和再分配日记。
所有对象在2、4、8和12周后都有临床皮肤评价、Nova Meter、Dermalab、硅橡胶树脂复制品和标准灯光照片。对象仅仅在起始和第12周(至洗掉的±天数)时由专业临床评估者获取UV照片,这些专业临床评估者不知道产品分配、哪个对象在处理组以及哪个对象在非处理组。
在每次观察中都对下面列出的光损伤的几个指标进行评价。在每一个分类中列出等级水平。
A.光损伤程度的总体评价
按0-10的等级将对象分级,0代表没有光损伤,10代表严重光损伤。结果如下:
表9
*明显不同于起始值(baseline value),p≤0.050
TTrendwise明显不同于起始值,p-0.150-0.051
B.脸部干燥度
为对象给予如下的0-4的等级:
0 正常皮肤;没有干燥迹象
1 轻度干燥;轻微但明确的干燥,存在的细微起皮可具有粉状或灰状外观
2 中度干燥;稍微粗糙的起皮,一些裂纹明显成为升起的皮屑
3 显著干燥;显著的粗糙起皮,裂纹明显成为升起的皮屑
4 严重干燥;非常显著;非常粗糙的起皮;裂纹向开裂发展;可能存在红斑
结果如下:
表10
C.肌理(粗糙度/光滑度)
用表示光滑均匀表面的0分到表示粗糙、粗劣、不均匀表面的10分将对象分级。结果如下:
表11
*明显不同于起始值,p≤0.050
D.弹性/结实性/张弛性
用表示坚实、有弹性、绷紧皮肤的0分到表示松垮、不结实、不饱满皮肤的10分将对象分级。结果如下:
表12
*明显不同于起始值,p≤0.050
E.皱纹/皱褶
用表示没有皱纹或皱褶的0分到表示包含大量皱褶的粗糙皮肤的10分将对象分级。结果如下:
表13
*明显不同于起始值,p≤0.050
TTrendwise明显不同于起始值,p-0.150-0.051
F.皮肤色调/透明度
用表示明亮、容光焕发、半透明皮肤的0分到表示灰黄、无光泽和/或具有不均匀皮肤色调的皮肤的10分将对象分级。结果如下:
表14
*明显不同于起始值,p≤0.050
G.色素沉着均匀性
用表示一致、均匀色素沉着的0分到表示不均匀、有斑点或有杂色皮肤的10分将对象分级。结果如下:
表15
*明显不同于起始值,p≤0.050
TTrendwise明显不同于起始值,p-0.150-0.051
H.红斑
用表示没有红斑或正常色调的0分到表示显著的极红的10分将对象分级。结果如下:
表16
*明显不同于起始值,p≤0.050
TTrendwise明显不同于起始值,p-0.150-0.051
使用Dermalab、Novameter和复制图像分析在起始和第2、4、8和12周时按如下在所有对象上测量面部皮肤状态。
使用Dermalab(Cortex Technology,Denmark)在所有对象上在脸的一侧(每次观察时在相同位置)测量弹性,Dermalab施用负压到皮肤表面并计算皮肤可被拉起的高度和它恢复到平衡的速度,借此提供弹性测量值。在图像分析复制时,在脸的相对侧上进行Dermalab测量。
在脸的一侧(每次观察时在相同位置)上测量保湿性以记录皮肤表面的水合水平。使用Dermal Phase Meter9003(NOVA meter)评价皮肤水合的相对程度。通过使用一对间距小的电极施用交流电压到皮肤并测量阻抗进行测量。水含量的变化改变了电容电路的阻抗。记录在10%内的头两个连续读数。在每一次观察时测量脸的相同侧。在每组读数期间记录测试室温度和湿度。
轮廓(表面构造)分析提供量化皮肤增大即化妆品减少皱纹和皱褶的作用的方法。对于这种过程,使用图像分析对鱼尾纹区域制成的皮肤复制品分析其轮廓和表面肌理。使用硅橡胶树脂压印材料(Cuderm)制备鱼尾纹区域的皮肤复制品。硅橡胶树脂是使用在施用和去除后保持完整的1cm直径复制环施用的快速固化液体。
在起始和第2、4、8和12周时使用标准和交叉偏振光照相记录所有对象的面部皮肤状态。根据在起始和第12周时获取的UV照片,由专业分类者评价皮肤表面下面积聚的暗伤。
在全部观察中获取所有对象的使用可见和交叉偏振光的数字照片。对象的脸被定位在Canfield立体定位重定位装置中并使用Canfield Clinical Systems照相机和闪光***照相。使用的照相机为尼康D80 SLR35mm型,具有60mm微距Nikkor镜头和改进的SB-23闪光灯头。照相机被设置成在f16处光圈优先自动。对于每个对象,在每个时间间隔时,以1∶6放大率对板(slate)拍照,识别对象和时间间隔。使用标准照明和重复使用交叉偏振光以1∶6放大率获取正面照片和以1∶4和1∶3放大率获取脸每一侧的二个侧面45°角照片。
对象将他们的头放在Canfield立体定位重定位装置中并使用Canfield ClinicalSystems照相机***照相。使用的相机为尼康6006 SLR35mm型。对于每个对象,在每个时间间隔时,以1∶6放大率对板(slate)拍照,识别对象和时间间隔。以1∶6放大率获取正面照片和以1∶6放大率获取脸每一侧的一个侧面45°角照片。随后,使用在镜头上的柯达18A滤镜、Sunpak MS 4000 Monolight和T-Max400黑白印片用胶片以1∶6放大率获取二个正面UV光(UV反射)照片。在f8和1/250秒快门速度下进行曝光。
专业评估者将全部脸部照片针对每个时间点(起始和第12周)的色素沉着均匀性独立分级,按0(一致/均匀)至10(不均匀,到处有斑点)等级进行分级。专业评估者还对每个个体对象的12周照片对起始照片进行对比评价。分级尺度为如下的-4到+4: