CN103393780B - 一种高***连总生物碱提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高***连总生物碱提取方法，其工艺流程如下：原料（黄连或黄连须根或黄连灰渣）——粉碎（如为黄连须根或黄连灰渣不需粉碎）——加入0.1～5%的硫酸浸泡——升温提取四次——过滤——氧化钙（或氢氧化钙）中和——过滤并洗涤沉淀——预浓缩——调酸——氯化钠沉淀——过滤——母液回收生物碱——沉淀烘干——黄连总生物碱产品。产品的主要活性成分为黄连素、黄连碱、巴马汀、表小檗碱、药根碱等黄连有效成分，黄连总生物碱含量为50%以上，其中黄连素的含量25%以上。本发明产品具有很好的降血糖、降血脂、减肥等作用，是治疗糖尿病及心血管类疾病的理想原料。

Description

一种高***连总生物碱提取方法

技术领域

本发明属于生物提取技术，具体涉及一种高***连总生物碱提取技术。

背景技术

黄连始载于《神农本草经》, 列为上品。黄连味苦，性寒，有泻火、解毒、清热、燥湿的功能。用于烦热神昏、心烦失眠、湿热痞满、呕吐、腹痛泻痢、目赤肿毒、口舌生疮、湿疹、烫伤、吐血、衄血等。现代药学研究结果表明，黄连主要活性成分为黄连总生物碱，主要包括小檗碱（黄连素）、巴马汀、黄连碱、表小檗碱和药根碱等（《中国药典》2010版）；黄连（素）具有降血脂和降血糖等广泛的药理活性。最近的研究发现，除黄连素外，黄连其他生物碱活性成分（黄连碱、巴马汀等）也具有降血脂和降血糖等作用（侯 宏等。黄连生物碱抗高脂血症及动脉粥样硬化实验研究。时珍国医国药，2011，22（10）：2462.）；同时还发现，高纯度的黄连生物碱安全性很高，而黄连生物碱粗品将引起肝功升高等安全性问题（Jun Yi etc. Safety evaluation of main alkaloids from Rhizoma Coptidis. Journal of Ethnopharmacology, 2013.145：303-310）。因此，提取高纯度的黄连总生物碱具有很好的开发价值，而低纯度的黄连生物碱价值很小。此外，黄连价格很贵，提高黄连总生物碱的收率是降低生产成本和提高综合经济效益的关键。

目前，关于黄连总生物碱的提取工艺技术已有较多文献报道。

中国专利文献（200510044345.8）报道了一种黄连总生物碱提取技术，主要包括：黄连药材，用水煎煮，上大孔树脂净化，水洗，含水乙醇洗脱，回收乙醇，浓缩干燥，得到产品等过程。其黄连总生物碱含量达到25～100%。根据我们的研究经验，黄连直接用水煎煮，黄连素等总生物碱的提取率较差；黄连生物碱上树脂后，洗脱时树脂难以100%再生，树脂使用率不高；回收乙醇时，乙醇不可避免的损失和高能耗等，造成成本上升等。

中国专利文献（200810069671.8）报道了一种黄连总生物碱提取工艺技术，主要包括：原料（黄连或黄连须根或黄连叶）——粉碎（如为黄连须根或黄连叶不需粉碎）——加入适量0.01～10%的硫酸浸泡——升温提取四次——预浓缩——净化——氯化钠和高价金属盐沉淀——过滤——烘干——黄连总生物碱产品。产品的主要活性成分为黄连素、黄连碱、药根碱、巴马汀、表小檗碱等黄连有效成分，黄连总生物碱含量为20%以上，其中黄连素的含量10%以上。该工艺技术生产的黄连总生物碱含量偏低（25%），产品安全性不高；提取总生物碱后的母液中还含有大量的生物碱，未被回收利用，生物碱总收率不高；为了提高黄连总生物碱的纯度，需要利用吸附剂（如活性白土、硅胶、活性炭或各种大孔树脂等）净化，以及重结晶等操作，工艺较为复杂，生产成本高。

中国专利文献（02103880.5）报道了黄连总生物碱的提取工艺及其新用途，主要包括：黄连水浸泡并时超声波处理，在温浸条件下进行总生物碱提取，所得提取液进行减压浓缩，然后用浓盐酸调节浓缩提取液的pH值，再加入氯化钠，静置，然后通过抽滤或离心甩干收集提取液中的沉淀物，沉淀物被烘干，烘干后的沉淀物进行粉碎，即可得到黄连总生物碱盐酸盐成品。该工艺生产由于没有纯化操作，总生物碱的纯度不高；同时，由于没有回收母液中的总生物碱，总生物碱的收率也不高。

中国专利文献（200610024364.9）报道了一种岩黄连总生物碱及其纯化方法和药物组合物，主要包括：将岩黄连总生物碱粗提物用酸水溶解后过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，先用水进行洗脱，继而用10-45％的乙醇进行洗脱，收集乙醇部分的洗脱液，浓缩，干燥即得岩黄连总生物碱。该工艺需要大量的乙醇洗脱纯化，生产成本难以控制。

中国专利文献（201110053453.7）报道了一种利用聚酰胺树脂分离纯化黄连生物碱的方法，主要包括：黄连粗浸膏用聚酰胺拌样后上聚酰胺柱，用二氯甲烷洗脱或用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂梯度洗脱，用薄层层析检验流份，合并相同流份，干燥，即可分离得到小檗碱、巴马汀、黄连碱、非洲防己碱、药根碱、木兰花碱、Groenlandcine等七个生物碱。该工艺技术分离的是黄连生物碱单体，由于分离纯化过程中涉及毒性很大的二氯甲烷等溶剂，安全性难以保障。

中国专利文献（200810218824.0）报道了黄连总碱在制备糖尿病并发症治疗药物中的应用，主要包括：1)将黄连药材粉碎成粗粉；2)5-10倍量60-80％乙醇将黄连粗粉回流提取1-3 次，1-2h/次，分次过滤，合并滤液。减压浓缩，干燥，得黄连提取物；3)将黄连提取物加入5倍量0.5％硫酸溶解，滤过，滤液分别用石灰乳调pH9，滤过，用盐酸分别调pH1～2，加氯化钠使含盐量达10％，摇匀，静置，得黄连总碱。该工艺也未涉及黄连总生物碱沉淀后母液中黄连总生物碱的回收等问题。

中国专利文献（201110243033.5）报道了黄连总生物碱泡腾片制法及治疗女性生殖***疾病的用途，主要包括：取黄连植物全草适量，粉碎至粗粉，加4～15倍量浓度为0.1～1％的硫酸水溶液，常温浸泡提取24小时，2～5次过滤；取提取液加入石灰乳调pH7，放置8～12小时，过滤；取提取液加入浓盐酸调pH2-3，放置8～12小时，过滤：取沉淀加入50倍量水煮沸溶解，石灰乳调pH8-9，趁热过滤；取滤液水洗、抽干、干燥，即得黄连总生物碱为a；2～5份聚乙二醇6000加5～15份乙醇溶解，加入15～30份碳酸氢钠，得碳酸氢钠、聚乙二醇、乙醇混合液为b；采用微型胶囊制备方法的喷雾淀粉吸收干燥法，将b经喷雾器喷雾于盛装a的旋转包衣锅内，最后过二号筛整粒成c；将柠檬酸过二号筛成颗粒与c过七号筛一起混匀，压片，每片重1g，压片时填料口处用红外线照射。该发明便于携带、起效快、治疗女性生殖***疾病疗效高而确切。该工艺也未涉及黄连总生物碱沉淀后，母液中黄连生物碱的回收等问题。

中国专利文献（201010246367.3）报道了黄连总生物碱提取物的新用途，主要包括：黄连总生物碱提取物的制备方法；所谓黄连总生物碱是指黄连药材用一定量水加热提取后，浓缩至干。该工艺得到的黄连总生物碱实际上是黄连全浸膏，纯度很低。

中国专利文献（200710099687.9）报道了岩黄连总生物碱及其制备方法与用途，其总生物碱的生产方法为：原料加0.1～1%的硫酸提取后，提取液加氯化钠沉淀盐析，得到总生物碱再溶于乙醇，脱色纯化，得到纯度较高的总生物碱。该工艺沉淀总生物碱后，没有考虑母液中总生物碱的回收，影响最终得率；粗品溶于乙醇中，脱色纯化，将进一步影响总生物碱的收率。

“黄连生物碱提取及纯化工艺研究”（涂瑶生等。中药新药与临床药理。2012，23（2）：208）报道了一种黄连总生物碱提取及其纯化方法，主要包括：黄连饮片加8倍量1.5 %的硫酸溶液，煎煮3次，每次40 min；黄连提取液用Ca(OH)₂调节pH5～6，抽滤，滤液加热浓缩至浓度为每mL含0.24g生药，抽滤，滤液加盐酸调节 pH1.5～2，加5%氯化钠溶液使溶解，冰箱中静置过夜，抽滤，滤渣真空干燥（50 ℃），收集纯化物。黄连总生物碱提取率93%左右，总生物碱得率60%左右，总生物碱纯度84%左右。该工艺总生物碱的得收率（60%），而且产品的纯度也一般。

综上所述，尽管提取黄连总生物碱的工艺技术非常多，但是，普遍存在总生物碱得率不高，或者纯度不理想，或者工艺复杂，或者加工过程中涉及有毒溶剂等问题。

在本领域中，提取率是指从黄连中溶解到溶液中的生物碱量，收率是经过提取操作后最终得到的产品量。但是，溶解到溶液中的量多，并不一定最后得到的多，因为在后续处理过程中会存在各种损失，有的损失会很大。

而从现有技术的报道可知，现有技术均没有考虑母液中生物碱回收以及沉淀带走生物碱的回收，主要是研究中存在盲点：即许多研究工作者并未进行过***分析，并不清楚沉淀带走多少生物碱，母液带走多少生物碱，即并不清楚生物碱在哪一步损失了，因而没有想过回收生物碱的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高***连总生物碱提取方法，它以黄连及其副产物为原料，即提取黄连及黄连须根和黄连灰渣中的总生物碱，同时提高其最终产品的纯度和收率。

本发明以黄连及黄连副产物为原料，采用硫酸溶液浸泡提取生产黄连总生物碱，所述方法包括：

1）、原料准备

将黄连或黄连须根或黄连灰渣去除泥沙，粉碎或者切丝（如为黄连须根或黄连灰渣不需粉碎或切丝），作为加工的原料。

2）、浸泡

将原料加入到浸泡池或者提取釜中，加入适量（3～15倍体积）浓度为0.1～5%的硫酸水溶液（W/V）浸泡1～48小时。

3）、提取

浸泡后，升温到20～100℃，保温提取0.1～5小时，提取四次。第一次和第二次提取液用于生产产品；第三次提取液用于下一批原料的浸泡液，浸泡液直接作为第一次的提取液；第四次提取液用于下一批原料的第二次提取液。

4）、料液中和

将第一次和第二次提取液合并，过滤；滤液用石灰（或氢氧化钙）中和到溶液的pH=2～12,过滤；残渣再用适量（0.1～3倍残渣量）水洗涤1～3次，回收残渣带走的生物碱。洗涤液留下，到第8步与总生物碱沉淀母液合并，利用大孔树脂处理。

5)、盐析

将中和液用浓盐酸调节溶液的pH=1～5；然后，加入溶液体积1～20%比例的氯化钠，低温（0～30℃）放置1～48小时，沉淀总生物碱。

    对于第4）步的过滤后的中和液，还可进行预浓缩，即进行减压浓缩1～20倍,然后再进行第5步。

6)、过滤和洗涤

沉淀（总生物碱）采用自然过滤或者离心过滤，同时用适量水洗涤，即为黄连总生物碱。

7）、总生物碱母液处理

沉淀总生物碱后的母液及第4步操作的洗液合并，按照每分钟0.1～5%倍树脂体积的速度上大孔树脂，待大孔树脂吸附后，用0.1～5倍大孔树脂体积的水洗涤树脂；然后10～90%的乙醇洗脱，回收乙醇后，得到黄连总生物碱。

8）、烘干

合并两步操作得到的黄连总生物碱，烘干，即为高***连总生物碱产品。该产品的主要活性成分为黄连素（小檗碱）、黄连碱、表小檗碱、巴马汀、药根碱等黄连总生物碱。总生物碱的收率90%以上，黄连总生物碱的含量50%以上，其中黄连素的含量25%以上。

在正常情况下，该产品中总生物碱含量一般为90%左右，黄连素含量可达45%，其他生物碱含量可达45%，是黄连中总生物碱含量的9倍以上。

本发明生物碱收率高，总生物碱的收率90%以上，操作简单，使工业生产的成本大大降低，生产效益显著提高；本发明生产的产品纯度高，一般可以达到90%以上，安全性极好；本发明得到的黄连总生物碱及其组成，与黄连总生物碱的组成非常类似，具有黄连类似的药理性质，比单一的黄连素有更为理想的降血糖、降血脂和减肥等效果。

本发明的产品（黄连总生物碱）可以作为黄连、黄连浓缩制品、黄连素等产品的代用品，可以用于治疗糖尿病、高血脂、肥胖和心血管类疾病。

以下是有关本发明得到的黄连总生物碱与通常的黄连素在安全性和治疗相关疾病方面的对比实验：

①、亚慢性毒性实验

试验材料为本发明制得的黄连总生物碱（含量90%）、黄连素（含量95%）、黄连总生物碱粗品（总生物碱含量40%）。

亚慢性毒性实验方法参照“天然药物（中药）新药研究指导原则”进行：将SD大鼠分为四组，分别为正常对照组、黄连总生物碱组、黄连素组、黄连总生物碱粗品组，每组10只，给药剂量为1g/Kg；连续灌喂3个月，然后采空腹血监测肝功等生化指标。

从表中可以看到，与正常对照组相比，黄连总生物碱纯品对肝功没有任何影响；小檗碱对实验动物的肝脏也没有影响；黄连总生物碱粗品组老鼠的肝功明显升高，表明低纯度的黄连总生物碱对动物的肝脏有不利影响。这个结果与文献报道的结果类似（Jun Yi etc. Safety evaluation of main alkaloids from Rhizoma Coptidis. Journal of Ethnopharmacology, 2013.145：303-310）。

②、降血脂活性实验

试验材料为本发明制得的黄连总生物碱（总生物碱含量90%）、黄连素（含量95%）、黄连总生物碱粗品（总生物碱含量40%）。

降血脂实验方法参照“天然药物（中药）新药研究指导原则”进行：将金黄地鼠分为5组，一组（10只）给予正常饲料，一组（40只）给予高脂饲料；4周后，检测血脂指标，再将造模成功的金黄地鼠分为4组（每组8～10只）：高脂对照组、黄连总生物碱组、黄连素组、黄连总生物碱粗品组。药物组给予500mg/Kg药物；连续灌喂4周，然后采空腹血检测血脂指标。

 

从表中可以看到，与正常对照组相比，各试验组血脂均有升高，表明造模成功；与高脂组相比，各药物组胆固醇（TC）均有所下降，表明均有降血脂活性；其中高纯度总生物碱的降血脂活性优于小檗碱，也优于总生物碱粗品。

上述研究结果表明，无论从安全性还是从药效方面看，高纯度的黄连总生物碱开发利用价值明显优于低纯度的黄连总生物碱。

本发明具有以下优点：

①、本工艺技术以黄连及其副产物为原料，尤其是以黄连须根和黄连灰渣等副产物为原料，属于资源综合利用范围，产品成本低廉，加工过程简单，易于制备。

②、本工艺技术获得的产品中除黄连素外，尚含有大量的巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱等黄连其他生物碱，生物效价更高，资源利用更充分。

③、提取液通过石灰（或氢氧化钙）中和硫酸，利用硫酸钙吸附除去提取液中的杂质，保证了盐析沉淀总生物碱的质量。与其他除杂净化工艺相比，本工艺操作简单，成本低廉。

④、利用大孔树脂处理黄连总生物碱沉淀后的母液和硫酸钙沉淀的洗液，不仅回收了母液和硫酸钙沉淀带走的总生物碱，保证了黄连总生物碱的收率；而且通过大孔树脂吸附后，水洗除杂，显著提高了总生物碱的纯度。本工艺黄连总生物碱的总体提取率90%以上，总生物碱的含量（纯度）90%左右。操作简单，实用。

⑤、  本工艺利用硫酸钙沉淀吸附除杂，回收提取的大部分黄连生物碱（60%左右）；再利用大孔树脂吸附回收母液和沉淀中的黄连生物碱，不仅降低了成本，提高了产品纯度，而且保证了总收率。工艺技术简单，比较成本低。

具体实施方式

实施例1：

1公斤黄连粉碎或者切片，加入3升5%的硫酸溶液，浸泡1小时后，升温到100℃回流提取0.1小时，过滤；残渣再用3升5%的硫酸溶液升温到100℃提取三次；合并第一次和第二提取液（三次提取和四次提取用于下一批原料的处理），冷却后将上清液分出（或者过滤得到上清液）；上清液利用石灰（氧化钙）中和到pH=2,过滤，沉淀利用0.1倍沉淀量的水洗涤沉淀3次；中和液利用浓盐酸调节溶液的pH=1左右，添加1%的氯化钠充分搅拌后室温（30℃）静止48小时；过滤，沉淀用适量水洗涤三次，得总生物碱；母液和中和沉淀的洗液合并，利用大孔树脂吸附（上柱速度为0.1%倍树脂体积），用5倍水洗涤，然后用10%乙醇洗脱；回收乙醇，固型物与上面沉淀的总生物碱合并；50～70℃下烘干，即得产品。高效液相色谱（HPLC）分析结果表明，产品中总生物碱含量96%，其中黄连素含量48%，其他生物碱含量48%；黄连总生物碱的收率92%。

实施例2

1公斤黄连须根，加入10升1%的硫酸溶液，浸泡12小时后，升温到60℃提取1小时，过滤；残渣再用10升1%的硫酸溶液升温到60℃提取三次；合并第一次和第二提取液（三次提取和四次提取用于下一批原料的处理），冷却后将上清液分出（或者过滤得到上清液）；上清液利用石灰（氧化钙）中和到pH=12,过滤，沉淀利用3倍沉淀量的水洗涤沉淀1次；中和液减压浓缩5倍，过滤，滤液用浓盐酸调节溶液的pH=5左右，添加10%的氯化钠充分搅拌后低温（0℃）静止1小时；过滤，沉淀用适量水洗涤三次，得总生物碱；母液和中和沉淀的洗液合并，利用大孔树脂吸附（上柱速度为5%倍树脂体积），用1倍水洗涤，然后用90%乙醇洗脱；回收乙醇，固型物与上面沉淀的总生物碱合并；50～70℃下烘干，即得产品。高效液相色谱（HPLC）分析结果表明，产品中总生物碱含量80%，其中黄连素含量40%，其他生物碱含量40%；黄连总生物碱的收率93%。

实施例3

1公斤黄连灰渣，加入15升0.1%的硫酸溶液，浸泡48小时后，升温到20℃（如果温度超过20℃，可以不用升温）提取5小时，过滤；残渣再用15升0.1%的硫酸溶液升温到20℃提取三次；合并第一次和第二提取液（三次提取和四次提取用于下一批原料的处理），冷却后将上清液分出（或者过滤得到上清液）；上清液利用石灰（氧化钙）中和到pH=6,过滤，沉淀利用1倍沉淀量的水洗涤沉淀2次；中和液减压浓缩20倍，过滤，滤液用浓盐酸调节溶液的pH=3左右，添加20%的氯化钠充分搅拌后低温（10℃）静止12小时；过滤，沉淀用适量水洗涤三次，得总生物碱；母液和中和沉淀的洗液合并，利用大孔树脂吸附（上柱速度为2%倍树脂体积），用0.1倍水洗涤，然后用40%乙醇洗脱；回收乙醇，固型物与上面沉淀的总生物碱合并；50～70℃下烘干，即得产品。高效液相色谱（HPLC）分析结果表明，产品中总生物碱含量50%，其中黄连素含量25%，其他生物碱含量25%；黄连总生物碱的收率95%。

Claims (6)

1.一种以黄连及黄连副产物为原料，采用硫酸溶液浸泡提取生产高***连总生物碱的方法，所述方法包括：

1）、原料准备

将黄连或黄连须根或黄连灰渣去除泥沙，粉碎或者切丝；

2）、浸泡

将原料加入硫酸水溶液浸泡；

3）、提取

浸泡后，提取至少两次；

4）、料液中和

将第一次和第二次提取液合并，过滤；滤液用石灰或氢氧化钙中和到溶液的pH=2～12,过滤；残渣再用水洗涤，回收残渣带走的生物碱，得到洗涤液；

5）、盐析

将中和液用浓盐酸调节溶液的pH=1～5；然后，加入溶液体积1～20%比例的氯化钠，0～30℃低温下放置1～48小时，沉淀总生物碱；

6）、过滤和洗涤

将沉淀得到的总生物碱采用自然过滤或者离心过滤，同时用水洗涤，即为黄连总生物碱；

7）、总生物碱母液处理

将沉淀总生物碱后得到的母液及步骤4）留下的洗涤液合并，按照每分钟0.1～5%倍树脂体积的速度上大孔树脂，待大孔树脂吸附后，用0.1～5倍大孔树脂体积的水洗涤树脂，除去总生物碱中的杂质；然后10～90%的乙醇洗脱，回收乙醇后，得到黄连总生物碱；

8）、烘干

合并两步操作得到的黄连总生物碱，烘干，即为高***连总生物碱产品。

2.根据权利要求1所述的提取生产高***连总生物碱的方法，其特征在于：对于第4）步的过滤后的中和液，还可进行预浓缩，即进行减压浓缩1～20倍，再进行第5步处理。

3.根据权利要求1或2所述的提取生产高***连总生物碱的方法，其特征在于：所述2）的浸泡时间将原料加入3～15倍体积、浓度为0.1～5%的硫酸水溶液（W/V），浸泡1～48小时。

4.根据权利要求1或2所述的提取生产高***连总生物碱的方法，其特征在于：所述步骤3）的提取是升温到20～100℃后进行保温提取0.1～5小时。

5.根据权利要求1或2所述的提取生产高***连总生物碱的方法，其特征在于：所述步骤3）的提取为四次，第一次和第二次提取液用于生产产品；第三次提取液用于作为下一批原料的浸泡液，并直接作为第一次的提取液；第四次提取液用于下一批原料的第二次提取液。

6.根据权利要求1或2所述的提取生产高***连总生物碱的方法，其特征在于：黄连总生物碱的主要活性成分为黄连素即小檗碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀、药根碱等黄连总生物碱，总生物碱的含量50%以上，其中黄连素的含量25%以上。