CN103389378A - 检测水产品中氯霉素残留的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种检测水产品中氯霉素的液相芯片的试剂盒。该试剂盒包括针对氯霉素的单克隆抗体。利用该试剂盒检测水产品中氯霉素液相芯片的步骤包括：前处理待测样品和用试剂盒检测样品。本发明的试剂盒可以检测氯霉素残留指标，特异性强，敏感性高，安全性好，氯霉素的最低检出限低于0.1ng/mL。利用该试剂盒检测水产品中氯霉素的液相芯片的方法，操作简便快速，结果判定准确、可靠，成本低，投资少。本发明可广泛应用于水产品兽药残留的日常监控。

Description

检测水产品中氯霉素残留的试剂盒

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种液相芯片法检测水产品中氯霉素的试剂盒。本发明还提供了检测水产品中氯霉素残留的方法和上述试剂盒的应用。

背景技术

氯霉素(chloramphenicol,CAP)是从委内瑞拉链丝菌中提取制得的一类广谱抗生素，自1948年上市以来,一直是治疗伤寒、副伤寒和沙门氏菌的首选药物,并因其效高价廉,在国内外畜牧业中也广为应用。但是，随着对氯霉素临床应用的深人研究，发现长期微量摄人氯霉素，不仅使沙门氏菌、大肠埃希菌等产生耐药性，还会引起机体正常菌群失调，抑制骨髓机能,导致再生障碍性贫血和其他恶性血液病等相关疾病，严重危害着人类的健康。近年来美国、欧盟、日本等国家都规定禁止氯霉素用于食用动物，而且在出口产品中不得检出氯霉素。

我国农业部2002年《动物性食品中兽药最高残留限量》文件中明文规定该药为禁止用于所有食品的动物兽药，食品中不能检出。但是部分畜禽养殖户盲目追求经济效益、滥用CAP的现象仍然存在。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可检测氯霉素的试剂盒，该试剂盒不仅可以实现快速、大批量检测，而且检测特异性和灵敏度高，更重要的在于它的高通量。

本发明要解决的另一个技术问题是，提供一种可检测水产品中CAP残留的方法。旨在解决兽药残留检测单一、耗时、成本高等问题，也为进一步同时检测四个兽药残留指标奠定了基础；该方法的建立可满足水产品中CAP残留检测快速、准确的要求，同时，为我国水产品兽药残留的日常监控提供一种新的适用方法。

液相芯片技术（xMAP）是一种可广泛应用于蛋白质、基因、受体/配体等多种生物反应的生物芯片技术平台，主要包括微球、探针分子、被检测物和报告分子四种成分；在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合；反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。液相芯片技术的高灵敏度、高通量、检测迅速等突出优点，对水产品中氯霉素残留进行检测，并可用于兽药残留的日常监控中。实验结果表明，通过调配微球、探针分子、被检测物和报告分子四种成分的比例，以及荧光成分的种类和比例，可以检测液体中的氯霉素。本发明在上述基础上完成。

本发明提供了一种检测水产品中氯霉素残留的试剂盒，包括抗体。所述的抗体是针对氯霉素的单克隆抗体。

所述的抗体的制备方法是以氯霉素与卵清白蛋白的偶联物作为免疫原，制备出单克隆抗体，并将之生物素化。

所述的试剂盒中的抗原为氯霉素与卵清白蛋白偶联所得到的偶联物，随后分别与液相芯片荧光微球偶联。

所述的试剂盒还包括SA-PE溶液和终止液，还可包括微球稀释液。

所述的试剂盒还包括氯霉素的标准品溶液。

所述的标准品溶液的浓度包括25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/ml和0.1ng/ml。

本发明还提供了上述试剂盒的应用，即利用该试剂盒检测水产品中氯霉素残留，包括以下步骤：

前处理待测样品；

用上述试剂盒检测样品。

所述的检测水产品中氯霉素残留的步骤依次为：包被好的微球加入处理好的氯霉素样品溶液，随后分别加入偶联有CAP的微球以及生物素化的氯霉素抗体；然后加入稀释好的SA-PE，最后加入终止液，检测荧光强度。

所述前处理待测样品的步骤包括：匀浆好的组织加入蒸馏水和乙酸乙酯；离心，移取上清，氮气吹干；残留物用正己烷溶解，再加入PBS，离心；吸除上层正己烷，取下层溶液用于检测。

所述的前处理待测样品的步骤包括：准确称取已匀浆好的组织3.0g，3ml的蒸馏水混合，再加入6mL乙酸乙酯，最大速度震荡10min；室温条件下，6000rpm离心10min；移取4mL上清到另一新的试管，60℃水浴氮气吹干，残留物用1.0mL的正己烷溶解，再加入0.5mL的PBS，漩涡振荡1min；室温条件下，6000rpm离心10min，吸除上层正己烷，取50μL下层溶液用于检测。

在本发明的一个方面，提供了一种检测水产品中氯霉素的检测试剂盒，包括所有试剂，所述试剂包括抗体，所述抗体是用氯霉素与卵清白蛋白的偶联物作为免疫原制备出的单克隆抗体。

免疫原采用药物与卵清白蛋白的偶联物，是因为抗体制备时，只有抗原分子量较大的化合物（>5000D）注射到动物体内时才能诱导动物体内产生抗体。如果是小分子量的化合物（这类化合物叫半抗原），不能直接诱导动物产生抗体，而为了制得抗体，需将该小分子化合物偶联于大分子载体（如卵清白蛋白，OVA）上制得抗原，再将其用于免疫动物，制备抗体。

所述试剂还包括液相芯片荧光微球，偶联有氯霉素的人工抗原（即氯霉素与卵清白蛋白偶联获得的产物）。

本发明采用氯霉素的人工抗原偶联的荧光微球，加入经前处理过的待测样品和抗氯霉素的单克隆抗体，让偶联于微球上的抗原和待测样品两者竞争抗体以检测样品中的氯霉素。

本发明氯霉素检测试剂盒，具有下列优点：

1)特异性强，敏感性高，安全性好。本发明检测水产品中氯霉素残留的试剂盒，以氯霉素药物的单克隆抗体为基础，该抗氯霉素药物的单克隆抗体不含针对载体蛋白的抗体，只与药物的修饰物结合，不与动物其它抗生素药物和消毒药发生交叉反应；因此，本发明试剂盒具有很高的特异性和敏感性，氯霉素的最低检出限低于0.1ng/mL；

(2)操作简便快速；使用液相芯片法检测水产品中氯霉素的试剂盒检测氯霉素残留时，无需另配其它试剂，样品无需无菌处理，按试剂盒说明在2小时内即可判定检测结果；

(3)结果判定准确、可靠；本发明液相芯片法检测水产品中氯霉素的试剂盒以液相芯片仪读数定量显示检测结果，减少主观性，准确可靠；

(4)成本低，投资少；本发明液相芯片法检测水产品中氯霉素的试剂盒可批量检测，一步到位，成本低廉，投资少，见效快。

附图说明

图1是液相芯片检测CAP的标准曲线。

图2是液相芯片检测CAP特异性图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

实施例1氯霉素单克隆抗体的制备

（1）免疫原的制备

用活性酯法将含有梭基的半抗原琥珀氯霉素与载体蛋白(OVA)进行偶联，用重氮化法将含有芳香氨基的半抗原与载体蛋白进行偶联，抗原乳化。

（2）单克隆抗体制备和纯化

取BALB/C小鼠4只，免疫前眼眶取血作为阴性血清，首次免疫用CAP-OVA与等体积完全弗氏佐剂乳化后腹腔注射，剂量为100μg/只；2周后用CAP-OVA与弗氏不完全佐剂混合后再次免疫；以后每隔1周加强免疫1次，改用不完全弗氏佐剂依次在尾部静脉注射注射。融合前3d强化免疫1次，小鼠尾静脉缓慢直接注射CAP-OVA 250μg/只。按常规方法进行细胞融合：将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓细胞融合，再经过4次亚克隆，筛选到能稳定分泌CAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对建株后的杂交瘤细胞进行扩增培养。腹腔注射7周龄的BALB/c雌性小鼠，用灭菌降植烷以每只0.5mL腹腔注射，10d后腹腔接种用不完全培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只分别注射2×10⁶个细胞，待小鼠腹部膨大，精神萎靡时，采集腹水，用硫酸铵沉淀法纯化腹水，并用DEAE纤维素层析柱纯化腹水后，得较纯的CAP单克隆抗体。

实施例2液相芯片法检测水产品中氯霉素残留的试剂盒中试剂的制备

(1)氯霉素单克隆抗体的生物素化

分别取氯霉素单克隆抗体1mg，用45μL 10mM Sulfo-NHS-Biotin进行溶解。室温下，搅拌反应4-5h，使抗体充分生物素化。接着用0.1mol/L，pH7.4的PBS过YM-10柱，置换缓冲液并除去未反应的小分子BNHS。小量分装各种生物素化抗体，-20℃冷冻保存。

(2)制备偶联有氯霉素抗原的液相芯片微球

将4℃保存的微球放置于室温20～30min，涡旋微球（2～3min为宜），各吸取100μL荧光微球加入到2管1.5mL的离心管中，13000r/min离心4min去除保护液，用三蒸水洗涤后，用400μL 0.1M pH6.2磷酸缓冲液重悬微球。分别加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS和10μL 50mg/ml EDC，混匀后37℃作用20min。离心去上清，将微球用900μL 0.05M MES重新悬浮，离心去上清，洗涤微球两次。用400μL 0.05M MES重悬微球，加入纯化的氯霉素人工抗原，混匀后37℃作用2～3h（期间，每隔15min涡旋混匀一次）。离心去上清，加入900μLPBS-TBN（含有0.05%Tween-20、0.1%BSA、0.05%叠氮钠的0.01M PBS）重悬微球，混匀后离心去上清，洗涤微球两次。加入200μL PBS-TBN重悬微球。用血细胞计数器进行计数。

(3)标准溶液的配制

分别精确称取CAP 1mg，先用乙腈溶解并作5倍梯度稀释，然后用PBS（0.01M磷酸盐缓冲液）配制系列浓度为25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、,3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL和0.1ng/mL的标准物质溶液。

实施例3运用本发明试剂盒检测氯霉素

(1)样品前处理

准确称取已匀浆好的组织3.0g，3ml的蒸馏水混合，再加入6mL乙酸乙酯，最大速度震荡10min；室温条件下，6000rpm离心10min；移取4mL上清到另一新的试管，60℃水浴氮气吹干，残留物用1.0mL的正己烷溶解，再加入0.5mL的PBS，漩涡振荡1min；室温条件下，6000rpm离心10min，吸除上层正己烷，取50μL下层溶液用于检测。

(2)试剂盒检测步骤如下：

①取包被好的微球放置室温20～30min，涡旋微球（2～3min为宜），于96孔培养板中分别加入25μL/孔配好的系列氯霉素标准溶液（25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、,3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL和0.1ng/mL），在另外的微孔中加入处理好的样品溶液25μL，随后加入偶联有CAP微球1μL/2000个，以及生物素化的氯霉素抗体各25μL，还在一孔中加入25μL洗涤液作空白对照，其余步骤同样品溶液的操作。37℃振荡作用60min。

②加入稀释好的SA-PE，37℃振荡作用30min。

③加入100μL终止液，通过Luminex 200仪器检测荧光强度值（median fluorescenceintensity，MFI），并用Luminex version 2.1软件分析数据。

(3)结果判定标准

先计算标准样品的平均荧光强度（median fluorescence intensity，MFI）为纵坐标，以CAP的浓度的对数值分别做横坐标，做标准曲线。根据每个检测样品的MFI就可从标准曲线上读出其相对应的样品的浓度。再乘以相应的稀释倍数。

1）标准曲线与灵敏度

以MFI为纵坐标，CAP标准溶液浓度的对数值为横坐标，绘制出标准曲线（图1）。从图1可以看出，该方法绘制出的两种兽药残留液相芯片检测的Logistic回归标准曲线方程，曲线关系良好，决定系数R²＞0.99。该方法的检测灵敏度低于0.1ng/ml。

2）结果再现性

以批内误差和批间误差来表示该方法的精确度。①批内误差：每一标准样品浓度作5次重复，以其批内变异系数表示批内误差。②批间误差：重复已建立的方法操作，连续作5次，以其批间变异系数表示批间误差。检测结果经SPSS检验，批内（见表1）和批间的结果都无显著性差异，重复性好。

表1同一批标准品重复结果

3）回收率计算

在3g空白黄鳝肉样中分别加入氯霉素，添加量分别为20ng/g、8ng/g、1ng/g，各添加浓度样品作三个重复，进行样品前处理，提取液进行测定。从标准曲线上求出浓度值，以回收率确定其准确度（见下表2）。

表2黄鳝肉样氯霉素添加回收试验结果

4)液相芯片特异性检测

用梯度稀释的醋酸甲孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、已烯雌酚、无色孔雀绿、有色孔雀石绿、醋酸甲羟孕酮、甲砜霉素、氟苯尼考作为抑制物，进行实验，得到样品的平均荧光强度，结果如图2所示，图2显示了各药品浓度为100ng/ml的平均荧光值，其中氯霉素对荧光强度有强抑制，而其他药物的平均荧光强度则于空白对照值相近，结果表明，该体系中无交叉反应，与醋酸甲地孕酮、甲羟孕酮、已烯雌酚、无色孔雀绿、有色孔雀石绿、醋酸甲羟孕酮、甲砜霉素、氟苯尼考等其他兽药物无交叉反应。

Claims (9)

1.一种检测水产品中氯霉素残留的试剂盒，包括抗体，其特征在于，所述的抗体是针对氯霉素的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗体的制备方法是以氯霉素与卵清白蛋白的偶联物作为免疫原，制备出单克隆抗体，并将之生物素化。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中的抗原为氯霉素与卵清白蛋白的偶联获得的产物。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括SA-PE溶液和终止液。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括氯霉素的标准品溶液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，标准品溶液的浓度包括25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL、0.4ng/ml、0.2ng/ml和0.1ng/mL。

7.权利要求1所述的试剂盒的应用，其特征在于，利用该试剂盒检测水产品中氯霉素残留，包括以下步骤：

前处理待测样品；

用权利要求1-6中的试剂盒检测样品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述前处理待测样品的步骤包括：准确称取已匀浆好的组织3.0g，3ml的蒸馏水混合，再加入6mL乙酸乙酯，最大速度震荡10min；室温条件下，6000rpm离心10min；移取4mL上清到另一新的试管，60℃水浴氮气吹干，残留物用1.0mL的正己烷溶解，再加入0.5mL的PBS，漩涡振荡1min；室温条件下，6000rpm离心10min，吸除上层正己烷，取50μL下层溶液用于检测。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的检测水产品中氯霉素残留的步骤依次为：包被好的微球加入处理好的氯霉素样品溶液，随后加入偶联有CAP的微球以及生物素化的氯霉素抗体；然后加入稀释的SA-PE，最后加入终止液，检测荧光强度。

Images