CN103374759A - 一种检测肺癌转移标志性snp的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测肺癌转移标志性SNP的方法及其应用，具体地，本发明涉及一种基因组测序文库及其衍生物及其用途，所述基因组文库待测序的核苷酸片段均一性强，质量高，通过对所述的文库进行测序，比较肺癌组织、转移灶和血清的SNP的特异性，找到转移灶所有特有的、对蛋白结构有重大影响SNP集合。本发明的SNP集合可以用于制备诊断和检测肺癌转移的试剂或试剂盒，为个体化医疗的有效推广与实施，医疗诊断，疾病预防起到指导作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及检测领域，具体地，本发明涉及一种检测肺癌转移标志性SNP的方法及其应用。
背景技术
人类基因组计划的完成推动了生物医学研究及遗传学的长足进步，带动了基因组学和蛋白质组学等诸多分子生物领域的迅猛发展，为生物技术和医学的研究发展作出了杰出贡献。
在后基因组时代，人类梦想对基因进行注释，在此过程中，发现了大量遗传变异，其中单核苷酸多态性(SNP)在所有已知基因多态性中占90％以上。作为第三代遗传标记，SNP在疾病基因组学，药物基因组学和群体进化等理论研究中具有重大意义，可直接影响个体间对疾病易感性，药物代谢差异以及药物不良反应。
肺癌的发病率和死亡率一直居高不下，肺癌患者的预后一直未得到有效提高，其原因是肺癌是一种极其复杂的肿瘤，肺癌的转移是肺癌的恶性与否的标志和特征，也是导致治疗失败和患者死亡的主要原因。约30％的患者在诊断时已有远处转移，50％-60％在治疗过程中发生远处转移，80％-90％的肺癌患者死亡是由转移引起的。因此，肺癌的转移是一个重大的难题。其中，脑转移和骨转移是最常见的转移部位，约占总转移的60％-70％。因此阐明肺癌转移发生的分子机制，能更好地理解肺癌这种复杂的肿瘤的生物学行为，进一步防止和延缓转移的发生；同时有利于积极治疗远处转移，能改善患者的生存质量，延长患者的存活期。
由于肺癌转移是一个极其复杂的多基因调控、多步骤发展过程。随着分子生物学的发展，各项新技术，尤其是基因组技术、生物芯片技术的不断改进，新的转移相关基因不断被发现，肺癌转移的分子机制将逐步明确，找到标志性的SNP对预测及早期诊断肺癌转移将成为可能，肺癌转移的治疗也将进入分子时代。
目前寻找SNP的方法主要有：
A.限制性片段长度多态性(RFLP)检测
限制性内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4-6bp)，并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的特异性意味着对特定DNA等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的替换或***、缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切割后产生片段的大小和数目。这些酶切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。用RFLP检测SNP位点具有一定准确性，方法简便、快速，可以进行大量样本的分析。由于实际中大约一半的SNP位点并不改变限制性酶切位点，因此该法不适宜大规模寻找。
B.直接测序技术
对于一些比较小、外显子相对较少的基因的SNP检测可直接测序，其检测效率可以达到100％，其主要流程是：PCR扩增目的片段→纯化、回收→4种荧光标记(ddNTP)测序反应→过柱去除多余的荧光和引物→测序仪上电泳→用测序软件分析。但是这种方法花费高昂，限制了大规模应用。
C.质谱分析技术
质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间的荷质比(m/e)的差异来分离并确定分子量。目前用于SNP检测的质谱法主要是基质辅助激光解吸电离--飞行时间质谱法(MALDI-TOF)。利用质谱分析一个样品只需几秒钟，一天可以分析数千个样品，具有快速、准确、自动化程度高等特点，但主要的问题是需对分析样品进行纯化后才能检测。
D.生物芯片技术
将DNA芯片与单碱基引物延伸(SBE)法相结合，研制新型芯片，以对CYP450基因中的SNP位点进行检测。SBE法又称微测序法(mini-sequencing)，是在双脱氧测序法的基础上发展出来的SNP检测方法。首先用PCR的方法，从基因组中扩增出含有目的SNP位点的片断；然后用一条与SNP位点特异互补的引物进行单碱基延伸反应，同时对样本进行荧光标记。该方法来源于测序原理，准确性超过了测序反应，堪称SNP检测的黄金标准。将SBE反应后标记有荧光的样本，与DNA芯片上的互补探针杂交，扫描检测芯片上各个“点”上的荧光信号并进行分析计算，即可完成SNP的分型。
因此目前本领域还没有一种寻找有效的建库的方法以及寻找SNP(尤其是肺癌转移相关)的方法，因此本领域迫切需要建立一种检测肺癌转移标志性SNP和建立基因组测序文库的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供与肺癌相关的标志性SNP位点及其应用。
本发明的另一目的就是提供DNA文库及其构建方法。
在本发明的第一方面，提供了一种基因组测序文库，所述文库中的待测序片段具有式I所示的结构：
5’-A-C-L-C-B-3’
式I
在式I中，
C表示LMP CAP接头；L表示生物素化中间接头，且L与C互补；
A、B分别表示来源于基因组的、长度为50-250bp的待测序的核苷酸序列；
“-”表示磷酸二酯键。
在另一优选例中，A或B的长度为50bp-250bp，较佳地50bp-100bp，更佳地为50bp。
在另一优选例中，式I中，C的核苷酸序列为：5’-GTGCTGTCA-3’，或C的互补序列为：3’-GACGACA-5’。
在另一优选例中，式I中，L的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或L的互补序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明的第二方面，提供了一种基因组测序文库衍生物，所述衍生物具有式II所示的结构：
5’-P1-A-C-L-C-B-P2-3’
式II
在式I中，
C、L、A、B、和“-”的定义如上所述，
P1、P2分别为测序引物，且具有与单链测序引物结合的能力。
在另一优选例中，式I中，C的核苷酸序列为：5’-GTGCTGTCA-3’，或C的互补序列为：3’-GACGACA-5’。
在另一优选例中，式I中，L的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或L的互补序列如SEQ ID NO：2所示。
在另一优选例中，P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；或P1的互补序列如SEQ ID NO：4所示。
在另一优选例中，P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；或P2的互补序列如SEQ ID NO：6所示。
在另一优选例中，所述的单链测序引物具有SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8所示的序列。
在另一优选例中，A、B分别表示来源于基因组的、长度为50-250bp(较佳地50-100bp，更佳地50bp)的待测序的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种SNP集，所述的SNP集包括选自下组的一种或多种：
(a)突变的F5基因，所述基因的第6486位核苷酸由C突变为G；
(b)突变的OR2T11基因，所述基因的第539位核苷酸由C突变为A；
(c)突变的TBRG1基因，所述基因的第2980位核苷酸由A突变为C；
(d)突变的POP5基因，所述基因的第765位核苷酸由C突变为T；
(e)突变的ZNF641基因，所述基因的第3175位核苷酸由T突变为G；
(f)突变的WNK1基因，所述基因的第143752位核苷酸由A突变为T；
(g)突变的MAP1A基因，所述基因的第4565位核苷酸由T突变为A；
(h)突变的GTF3C1基因，所述基因的第68015位核苷酸由G突变为C；
(i)突变的KIAA0556基因，所述基因的第127707位核苷酸由T突变为C；
(j)突变的SERPINB10基因，所述基因的第19344位核苷酸由C突变为？T；
(k)突变的ZNF717基因，所述基因的第215位核苷酸由C突变为T；
(l)突变的MACC1基因，所述基因的第25100位核苷酸由C突变为G；
(m)突变的DEPTOR基因，所述基因的第91670位核苷酸由G突变为T。
在本发明的第四方面，提供了所述SNP集的用途，它被用于制备检测肺癌转移的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的SNP集被用于制备检测肺癌脑转移的试剂或试剂盒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了对基因组文库DNA进行测序的流程。
图2显示了对测序数据的分析流程。
图3显示了样本DNA的质检结果。
图4显示了构建基因组DNA文库的流程。
图5显示样本10-12均被打成1-2kb的片段，条带较清晰集中。
图6显示10-12号样本大部分打断的片段为1-2kb。
图7显示250bp-350bp的片段回收结果。
图8显示10号样本DNA检测纯度结果。
图9显示11号样本DNA检测纯度结果。
图10显示12号样本DNA检测纯度结果。
图11显示了测序文件质评结果。
图12显示了多态性位点鉴别结果。
图13显示与dbSNP匹配的SNP总数结果。
图14显示了本发明的突变筛选流程。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次建立了一种基因组测序文库及其衍生物，所述基因组文库待测序的核苷酸片段均一性强，质量高，通过对所述的文库进行高通量测序，并比较肺癌组织、转移灶和血清SNP的特异性，发明人找到转移灶所有特有的、对蛋白结构有重大影响的SNP集合。本发明的SNP集合可以用于制备诊断和检测肺癌转移的试剂或试剂盒，为个体化医疗的有效推广与实施，医疗诊断，疾病预防起到指导作用。在此基础上完成了本发明。
测序技术
运用大规模测序手段，可以在癌症病理学的指导下，对肿瘤、癌旁和正常组织样品的多个样本点进行基因组测序，分析多样本点上变异之间的关系，从而描述癌症在发生发展过程中的关键变异，以及变异激增过程中的进化关系，最终解释细胞在某种组织环境下形成肿瘤的适应过程，对于阐明肿瘤的发生发展机制和未来提供肿瘤个体化治疗将提供重要的线索。肿瘤从根本上来说是一种基因组发生变异导致的疾病，它不同于一般的疾病，具有高度异质性，也就是说每个肿瘤病人是不同的，同一病人中每个肿瘤细胞也是不同的。因此，需要对每一个肿瘤样本进行高深度的测序，而高通量测序使得这一切成为可能。
DNA测序(DNA sequencing)作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。随着科学技术的不断发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要。
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点(SNP)，***缺失位点(InDel，Insertion/Deletion)、结构变异位点(SV，Structure Variation)位点，通过生物信息手段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完成注释。然而对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。
第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。几年时间里，测序速度呈指数增长，从根本上改变了人们研究所有生命蓝图的方式，并推动了基因组学及其分支乃至其他密切相关学科的创立与发展，诸如比较基因组学、生物信息学、***生物学以及合成生物学。某种程度上，DNA测序技术的进展已经使生命研究的基本元素发生了转变——从单一、局部的基因或基因的片段转变成整个基因组，使测序技术在对个体化疾病诊断与治疗中具有确定性的推动作用，尤其是在肿瘤疾病的研究，更是取得了史无前例的进步。本领域技术人员通常可以采用三种第二代测序平台进行高通量测序：454FLX(Roche公司)、SolexaGenome Analyzer(Illumina公司)和Applied Biosystems公司的SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列，根据平台的不同，读取长度从25bp到450bp不等，因此不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数。
Solexa高通量测序包括DNA簇形成和上机测序两个步骤：PCR扩增产物的混合物与固相载体上固定的测序探针进行杂交，并进行固相桥式PCR扩增，形成测序簇；对所述测序簇用“边合成-边测序法”进行测序，从而得到样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列。DNA簇的形成是使用表面连有一层单链引物(primer)的测序芯片(flow cell)，单链状态的DNA片段通过接头序列与芯片表面的引物通过碱基互补配对的原理被固定在芯片的表面，通过扩增反应，固定的单链DNA变为双链DNA，双链再次变性成为单链，其一端锚定在测序芯片上，另一端随机和附近的另一个引物互补从而被锚定，形成“桥”；在测序芯片上同时有上千万个DNA单分子发生以上的反应；形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在扩增芯片的表面再次扩增，形成双链，双链经变性成单链，再次成为桥，称为下一轮扩增的模板继续扩增；反复进行了30轮扩增后，每个单分子得到1000倍扩增，称为单克隆的DNA簇。DNA簇在Solexa测序仪上进行边合成边测序，测序反应中，四种碱基分别标记不同的荧光，每个碱基末端被保护碱基封闭，单次反应只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应的颜色后，该保护集团被除去，下一个反应可以继续进行，如此反复，即得到碱基的精确序列。在Solexa多重测序(Multiplexed Sequencing)过程中会使用Index(标签)来区分样品，并在常规测序完成后，针对Index部分额外进行7个循环的测序，通过Index的识别，可以在1条测序甬道中区分12种不同的样品。
图1和图2分布显示了本发明对基因组文库DNA进行测序和测序数据的分析流程。
引物
如本文所用，术语“引物”指的是能与模板互补配对，在DNA聚合酶的作用合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
基因组测序文库及其制备
如本文所用，术语“基因组测序文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定大小的用于测序的DNA片段混合物，所述文库中的待测序片段具有式I所示的结构：5’-A-C-L-C-B-3’
式I
在式I中，C表示LMP CAP接头；L表示生物素化中间接头，且L与C互补；A、B分别表示来源于基因组的、长度为50-250bp的待测序的核苷酸序列；“-”表示磷酸二酯键。
在另一优选例中，C的核苷酸序列为：5’-GTGCTGTCA-3’，或C的互补序列为：3’-GACGACA-5’；L的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或L的互补序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一种基因组测序文库衍生物，所述衍生物具有式II所示的结构：5’-P1-A-C-L-C-B-P2-3’
式II
在式I中，C、L、A、B、和“-”的定义如上所述，P1、P2分别为测序引物，且具有与单链测序引物结合的能力。
在另一优选例中，P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；或P1的互补序列如SEQ ID NO：4所示；或P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；或P2的互补序列如SEQ ID NO：6所示；或所述的单链测序引物具有SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8所示的序列。
在另一优选例中，所述的基因组测序文库或基因组测序文库衍生物中的A和B分别表示来源于基因组的、长度为50-250bp(较佳地50-100bp，更佳地50bp)的待测序的核苷酸序列。
本发明还提供了基因组测序文库的制备方法，在本发明的一个优选例中，所述方法包括步骤(图4)：
1.提供一待检测样本，所述样品含有经打断的、源自基因组DNA的双链核酸片段，并且所述核酸片段具有平末端；2.在双链核酸片段的末端添加LMP-CAP接头(C)，再加入生物素化中间接头(L)；3.连接酶环化DNA，在CAP的5’端留下的缺口处进行缺口平移反应，终止反应后消化DNA，获得50-250bp(较佳地50bp)的待测序核苷酸片段。加上接头，进行cluster制备(Solexa)或E-PCR(SOLiD)，最后利用Paired-End(Solexa)或者Mate-Pair(SOLiD)的方法对***片段进行重测序。
打断产物、末端修复产物、接头产物、富集纯化均为本领域技术人员所熟知，对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。
SIFT
SIFT(Sorting Intolerant From Toleran)是本领域的普通技术人员熟知的用于预测氨基酸替换对蛋白质功能影响的软件，它用于判断特定氨基酸置换在蛋白质功能上是无害的(functionally neutral)的还是有害的(deleterious)。关于该软件的详细信息可以参见http://sift.jcvi.org/。
SIFT对于一个氨基酸置换的预测结果被计算为一个标准化的分值，变化范围从0到1，当其大于0.05的时候，表示该突变是可以容忍的，即对蛋白质功能没有影响或影响很小；小于等于0.05的时候则说明这个突变是有害的，即对蛋白质功能有较大影响，如SIFT软件预测该突变的分值为0，认为该突变是“有害的”，即可能影响蛋白功能。
SNP集
本发明还提供了一种SNP集，所述的SNP集包括选自下组的一种或多种：
(a)突变的F5基因，所述基因的第6486位核苷酸由C突变为G；
(b)突变的OR2T11基因，所述基因的第539位核苷酸由C突变为A；
(c)突变的TBRG1基因，所述基因的第2980位核苷酸由A突变为C；
(d)突变的POP5基因，所述基因的第765位核苷酸由C突变为T；
(e)突变的ZNF641基因，所述基因的第3175位核苷酸由T突变为G；
(f)突变的WNK1基因，所述基因的第143752位核苷酸由A突变为T；
(g)突变的MAP1A基因，所述基因的第4565位核苷酸由T突变为A；
(h)突变的GTF3C1基因，所述基因的第68015位核苷酸由G突变为C；
(i)突变的KIAA0556基因，所述基因的第127707位核苷酸由T突变为C；
(j)突变的SERPINB 10基因，所述基因的第19344位核苷酸由C突变为T；
(k)突变的ZNF717基因，所述基因的第215位核苷酸由C突变为T；
(l)突变的MACC1基因，所述基因的第25100位核苷酸由C突变为G；
(m)突变的DEPTOR基因，所述基因的第91670位核苷酸由G突变为T；
本发明还提供了所述SNP集的用途，它被用于制备检测肺癌转移的试剂或试剂盒；较佳地，所述的SNP集被用于制备检测肺癌脑转移的试剂或试剂盒。
试剂盒
本发明提供了一种用于肺癌转移的试剂盒，包括组分(i)和组分(ii)，其中组分(i)为选自下组的SNP的试剂，所述试剂为引物对、探针、或核酸芯片，或其组合；
(a)突变的F5基因，所述基因的第6486位核苷酸由C突变为G；
(b)突变的OR2T11基因，所述基因的第539位核苷酸由C突变为A；
(c)突变的TBRG1基因，所述基因的第2980位核苷酸由A突变为C；
(d)突变的POP5基因，所述基因的第765位核苷酸由C突变为T；
(e)突变的ZNF641基因，所述基因的第3175位核苷酸由T突变为G；
(f)突变的WNK1基因，所述基因的第143752位核苷酸由A突变为T；
(g)突变的MAP1A基因，所述基因的第4565位核苷酸由T突变为A；
(h)突变的GTF3C1基因，所述基因的第68015位核苷酸由G突变为C；
(i)突变的KIAA0556基因，所述基因的第127707位核苷酸由T突变为C；
(j)突变的SERPINB10基因，所述基因的第19344位核苷酸由C突变为T；
(k)突变的ZNF717基因，所述基因的第215位核苷酸由C突变为T；
(l)突变的MACC1基因，所述基因的第25100位核苷酸由C突变为G；
(m)突变的DEPTOR基因，所述基因的第91670位核苷酸由G突变为T；
组分(ii)为使用说明书
本发明的主要优点包括：
(1)本发明的基因组测序文库片段长度均一，质量高；
(2)使用本发明的基因组测序文库进行重测序反应，可重复性高，检测准确，杂带少；
(3)本发明分别检测出了大量的SNP位点，通过与现有数据库dbSNP对照以及SIFT分析，获得肺癌转移灶特有的13个SNP位点，所述的SNP对蛋白质结构有较大影响。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1肺癌组织样本准备及质检
1.样本取自原发性肺癌病人的肺癌、血清、以及脑转移灶，对5例患者肺癌、转移灶和血清样本进行1-15编号，样本均来源于广州人民医院肺癌患者。
2.样本DNA纯化：常规方法提取DNA，用紫外分光光度计测量制备的DNA在OD260处的光吸收值，按OD260处的光吸收值在1时DNA浓度为50μg/ml计算得到的DNA的质量。取0.5μg DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，以HindIII酶切产物作为对照，观测有无肉眼可见RNA条带。
3.质检要求：对于从同一种样品中制备的DNA，不同批次生产的试剂盒制备的DNA的质量的差别≤±10％；制备的基因组DNA电泳条带要求主条带清晰，无严重拖尾现象；制备的DNA经琼脂糖凝胶电泳，无肉眼可见的RNA条带；纯度要求：制备的DNA的OD260/OD280的比值应处于1.80±0.15。
4.质检结果见图3和表1：
表1
| 样本 | 浓度(ng/μL) | 体积(μL) | A260/A280 | A260/A230 | 总量(μg) |
| 1 | 63.8 | 145 | 2.00 | 1.13 | 9.25 |
| 2 | 195.1 | 325 | 1.96 | 1.83 | 63.4 |
| 3 | 24.7 | 400 | 2.16 | 0.76 | 9.88 |
| 4 | 120.6 | 500 | 2.00 | 1.66 | 60.3 |
| 5 | 77.8 | 100 | 2.01 | 1.48 | 7.78 |
| 6 | 103.4 | 50 | 2.01 | 1.80 | 5.17 |
| 7 | 3.8 | 47 | 3.48 | 0.24 | 0.18 |
| 8 | 360.1 | 200 | 1.98 | 2.10 | 72.02 |
| 9 | 98.0 | 800 | 2.00 | 1.69 | 78.4 |
| 10 | 85.2 | 800 | 2.00 | 1.66 | 68.16 |
| 11 | 317.4 | 250 | 1.95 | 2.10 | 79.35 |
| 12 | 101.5 | 800 | 1.98 | 1.64 | 81.2 |
| 13 | 79.4 | 600 | 2.04 | 1.36 | 47.64 |
| 14 | 45.9 | 280 | 1.96 | 1.07 | 12.85 |
| 15 | 30.1 | 45 | 2.05 | 0.77 | 1.35 |
图3显示了15个样本的电泳结果，结果表明，10-12号样本主带清晰，无严重拖尾现象，OD260分布在1.98-2，无降解，且属于同一名患者的组织样本，因此选取10-12号样本进行下一步的建库步骤
实施例2建立Mate-paired库
本实施例通过设计环化接头和CAP接头，精确控制反应温度和时间，并利用缺口平移反应，获得核酸片段为50bp的DNA文库。
1.建库流程：
1.1.将基因组DNA打断，在打断的片段两端连接LMP CAP接头，再加入生物素化的环化接头，用连接酶使DNA环化，在CAP 5’端留下的缺口处进行缺口平移反应，移动50bp终止反应后消化DNA为线性，最后连接测序引物P1和P2。
1.2缺口平移反应：
本发明中采用缺口平移反应，精确控制片段长度。E.coli DNA polymeraseI在模板和引物(DNA或RNA)存在的条件下，以dNTP作底物，沿5′→3′方向合成与模板互补的DNA；E.coli DNA Polymerase I还具有双链特异性的5′→3′外切核酸酶活性以及单链特异性的3′→5′外切核酸酶校正的活性。由于在CAP接头的5’端存在一个磷酸缺失的缺口，大肠杆菌DNA聚合酶I在切口的3’-OH端逐个加入新的核苷酸，同时由于该酶具有5’-3’外切酶的活性，它同时切除5’端游离的核苷酸，3’端核苷酸的加入和5’端核苷酸的切除同时进行导致切口沿着DNA链移动，所以缺口在两个CAP接头的5’端同时延相反方向同时进行延伸。新链核苷酸的合成是以另一互补链为模板，按碱基互补的原则合成，所以新旧链的核苷酸序列完全相同。由于E.coli DNA polymerase I对温度和时间十分敏感，发明人通过反复实验确定了当控制温度在5℃，反应时间在11min，使得缺口平移在50个bp左右，即在5℃条件下，该酶的反应速度为4.5核苷酸/min。从而保证了稳定获得特定长度的测序片段。
2.引物设计：
2.1以待测样本中超声破碎后的全基因组基因作为模板，连接3类引物(LMP CAP，环化引物和测序引物)，使得待测序片段具有式I结构：
P1-A-C-L-C-B-P2
式中，L表示与C互补的生物素化中间接头；C表示LMP CAP接头，与L互补，5’端有一个磷酸缺失，作为缺口反应的起始位点；A和B表示来源于基因组的待测序的核苷酸序列；P1和P2为测序引物，在上机测序时会结合单链测序引物而进行测序反应。
2.2用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3)在线软件进行引物设计，引物均进行了BLAST分析，保证序列的特异性；本实施例用到的PCR引物序列见表2：
表2
其中P1接头和P2接头分别与测序反应中的测序引物(购自SOLiD公司，序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示)互补。
2.3超声样本DNA
利用Covaris S2System对10-12号样本进行超声，每组样本取25μg，将样本打断至1-2kb，利用SOLiD提供的SOLiDTM Library Column Purification Kit试剂盒，对超声后的样本进行纯化富集，测其浓度，1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图5：由图5可知，样本10-12均被打成1-2kb的片段，且条带较清晰集中，可进行下步实验。
2.4DNA末端修饰
为了更快速有效的进行末端连接反应，用End Polishing Enzyme I和II(EndPolishing Enzyme I和II的购自Invitrogen公司)切割DNA片段，使其由粘性末端转变为平头末端。End Polishing Enzyme II具有5’→3’聚合酶活性以及3’→5’外切酶活性，End Polishing Enzyme I利用ATP能对5’端进行磷酸化从而能够将5’和3’突出单链末端补平；按照每10μL DNA加入12U End Polishing Enzyme I P和16U End Polishing Enzyme II，体系中其他组分为5×reaction buffer、dNTP Mix 10mM，反应的总体系为200μL；在20℃温育30min，加入55％异丙醇终止反应而并纯化(同上)。
2.5连接LMP CAP接头
T4-DNA连接酶可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，利用该酶将CAP接头连接到超声并末端修饰后的DNA片段上，由于该接头在5’段缺少一个磷酸，使得片段与接头连接处留下一个缺口(nick)，成为下步缺口平移反应的起始点。
向10-12号DNA中分别加入LMP CAP Adaptor 50μM(购自上海生工)各37.5μL、36.6μL、33.1μL、T4DNA Ligase 5U/μL 10μL、5×reaction buffer 40μL，反应的总体系为200μL，在25℃温育15min或可连接过夜，并纯化。
2.6DNA切胶回收：为去除多余CAP接头，在0.8％的凝胶上进行电泳，对1-2kb的片段进行回收，电泳结果如图6所示：10-12号样本大部分在1-2kb，切割回收后用Nano Drop测其含量，10号4.53μg，11号2μg，12号3.8μg，进行下步反应。
2.7DNA环化
加入biotinylated internal接头，利用T4-DNA连接酶进行连接反应，由于CAP接头与环化接头互补，连接后DNA片段被连接为环状，按照每40μL反应体系加入1μL的T4-DNA连接酶，并加入DNA量1.5倍的Internal Adaptor 2μM(购自上海生工)，DNA量73倍的5×reaction buffer，反应的总体系为DNA量的365倍，在25℃温育1hr，并纯化准备分离环化DNA。由于Plasmid-SafeTM ATP-DependentDNase对环化DNA不敏感，会将其他线性DNA降解，Plasmid-Safe ATP-依赖的DNase在微碱性pH条件下消化线性双链DNA为脱氧核苷酸，对有缺口的，闭环双链DNA或超螺旋DNA没有活性。反应体系中加入组分为，10×reaction buffer10μL，ATP 25mM 5μL，Plasmid-SafeTM ATP-Dependent DNase 10U/μL 1μL，反应的总体系为100μl，在37℃温育40min，再进行纯化，对洗脱后的样本进行定量，10号为920ng，11号560ng，12号843ng。
2.8DNA缺口平移
E.coli DNA polymerase I对温度和时间十分敏感，本实施例控制温度在5℃，反应时间11min，使得缺口平移在50个bp左右，终止反应。反应体系中加入组分为，reaction buffer 10μL，dNTP 10mM 5μL，DNA polymerase I 40U，DNA 400ng，反应的总体系为96μL，再加入除酶之外的所有组分后，在5℃温育5min，加入DNA polymerase I用枪吸打5次，延伸11min后，加入400μL 55％异丙醇以终止反应。利用T7exonuclease(外切酶)和S 1nuclease二种酶可以同时消化DNA，T7exonuclease作用于双链DNA，沿5′→3′方向催化去除5′单核苷酸，从双链DNA的切刻或缺口处起始消化，从而在缺口处将环状DNA转化为线性；而S 1核酸酶的单链水解功能可以作用于双链核酸分子的单链区，并从单链部位切断核酸分子，而且这种单链区可以小到只有一个碱基对的程度。共同使用两种核酸酶，使得所希望获得的50个bp连在中间接头的两边。T7exonuclease反应体系为，10×reaction buffer 20μL，T7exonuclease 10U/μL 5μL，反应的总体系为96μL，37℃反应30min，然后加热至70℃反应20min，冰上5min终止反应；然后向200μL的反应产物中加入3M NaCl 6.6μL，S1nuclease 25U/μL 8μL，37℃反应30min，接着进行DNA末端修饰后并纯化。
2.9连接DNA到链霉素柱子
2.10预扩增94℃，3min；94℃，15s，62℃，15s，70℃，1min，10-14个循环；70℃，5min；4℃保持。与扩增确定反应循环数为12，进行下步扩增反应。反应体系为：
PCR Amplification Mix 70μL，Library PCR Primer 1(50μM)1.4μL，Library PCR Primer 2(50μM)1.4μL，共72.8μL(试剂来源于ABI公司)。
2.11扩增，切胶回收
按照预扩增程序和体系进行扩增，PCR结果进行切胶回收，对250-350bp的片段进行回收，电泳结果如图7所示：将目的片段回收后，取1μL AgilentTechnologies 2100Bioanalyzer上检测，检验DNA的纯度，结果见图8、图9、和图10。
由结果可知，10-12号样本PCR结果集中在250-350bp，且无主要的杂带存在，说明整个建库结果可靠，方法稳定，可重复性高，可进行下步油包水PCR并上机，检测10-12号样本的含量，分别为10ng、5ng、和7.52ng。
实施例3油包水乳滴PCR
1.Full-scale油包水PCR反应的准备
油相的准备：加1.8mL的Emulsion Stabilizer 1、400μL的EmulsionStabilizer2、37.8mL的Emulsion oil(均购自ABI公司)到50ml的锥形瓶中，充分震荡混匀后，开盖脱气20min。
水相的准备：稀释ePCR引物1到10μM，每个ePCR反应，加4μL ePCR引物1到36μL的1×Low TE buffer。最终稀释模板到60pM。
在冰上按操作各种试剂，选择0.5pM的文库浓度。
表3
2.SOLiD P1DNA珠子的准备
彻底震荡SOLiD P1DNA的珠子，磁力架上放置1min，待溶液清澈后，去除上清液；取Bead Block Solution 200μL重悬磁珠，振荡离心，用Bead Block Declumpprogram Covartis S2system来超声混匀磁珠，磁力架上静置1min，待溶液清澈，去除上清液。重悬磁珠于200μL的1×TEX Buffer。
3.用ULTRA-TURRAX Tube创建油包水相
取9mL的油相到ULTRA-TURRAX装置中，取160μL的超声后的SOLiD P1DNA磁珠到水相中，设定ULTRA-TURRAX Tube Drive from IKA后，用Xstreampipettor取5.6mL的混有磁珠的水相加入运转的ULTRA-TURRAX中，取150μL的乳液轻轻地加入每个PCR板的孔中，封膜，按照表4来进行乳滴RCR：
表4
乳滴PCR反应程序
用2-丁醇破乳后，用1×Bead Wash Buffer清洗模板磁珠，1×TEX Buffer重悬磁珠；取出1mL的超声后的磁珠溶液到1.5mL的LoBind管中，用1×TEXBuffer(1∶10)来稀释磁珠溶液。用NanoDrop-1000来测磁珠的浓度。利用已知浓度磁珠标准曲线公式来计算磁珠浓度：
y(吸光值)＝9×107×X(珠子数/μL)+0.0836。
实施例4SOLiD测序模板磁珠的富集
1.模板磁珠的富集
超声富集模板珠。61℃孵育15min，立刻放在冰上2min；加600μL60％甘油到1.5mL的LoBind管中。21000×g离心3min；转移管中上层珠子到1mL1×TEX Buffer的新的2.0mL LoBind管中，21000×g离心1min。用1×TEX Buffer清洗并重悬珠子。
2.P2-富集珠的分离珠的分离
全部回收重悬的磁珠(P1模板磁珠)经变性液变性、1×TEX重悬，用富集珠(P2)富集。经结合和洗涤后，离心分离获得P2-模板珠，1×TEX重悬，末端转移酶和Bead Linker修饰3’末端。测定乳液的OD600nm，用上述公式计算富集后的(P2)磁珠数量，进入后续测序反应。
实施例5上机
按照SOLiD的操作步骤要求，经过富集的P2磁珠被固定到测序芯片上，利用测序仪进行工作流程分析(Work flow analysis，WFA)，判断富集后的磁珠是否达到完全测序标准。主要考察指标：P2#/P1#的比值、On Axis和TitrationMetric指(＝P2#/P1#的比值×On Axis值)。正式经SOLiD4测序获得的数据用Bioscope软件与NCBI的人类基因组数据库(hg18)及目标序列进行比对得出初步的测序结果。
实施例5结论
1.测序文件的质评
通过Bioscope在线软件，对SOLiD测序得到的原始数据与UCSC数据库中的Hg18人类基因组对照序列进行匹配，数据结果中包括可匹配到Hg18基因组序列上的读序(reads)，以及可匹配到Hg18基因组序列上唯一的非同源序列上的reads，选择参数为保留小于5个错配碱基的reads。
通过唯一匹配的reads数/总体匹配上的reads来初步评估测序数据的质量。一般地，比值达到60％以上，认为数据可用于后续分析验证；并且完全匹配上的reads数/唯一匹配的reads数也反映了测序数据的质量；保留小于2个错配碱基的reads为候选reads，可用于后续数据分析。
发明人选择3个样本，使用SOLiD4第二代测序仪进行测序，每个样本使用1/2的芯片，产生约30G的数据。用Bioscope软件对SOLiD测序所的50bp长的原始数据与NCBI Build36.1基因组序列(hg18，ref.19)进行匹配。
结果显示，由实体组织样本测序得到的2480287666读序可匹配到基因组序列上，占总读序的74.05％，测序深度均在10左右，见图11。
2.多态性位点的鉴别
通过Bioscope在线软件平台对多态性位点进行预测报告，得到Gff文件，再检测突变后翻译出的氨基酸类型是否发生变化，得到候选的突变位点。这些突变位点分散在可匹配到Hg18基因组序列(Hg18基因组序列是已知的，可从公共的NCBI数据库中获得)的reads上，并且碱基的覆盖度及SNP分值差异较大。
与Hg18基因组序列相比，本发明的检测样品的SNP数量高达一百万以上，其中检测出10号(转移灶)，11号(癌)，12号(血清)的SNP位点分别有1693888、1616345、1024791个。
与dbSNP数据库比对，10号、11号和12号三个样品中的SNP分别有1614608、1545961、和997413个，一致率分别为95.3％，95.6％，97.3％，见图12和图13。
3.新突变的鉴定
筛选方法：为了得到可信度更高的点突变，通过严格的筛选条件得到覆盖度较高及SNP分值较高的候选突变；筛选条件为相关基因外显子区域，覆盖度(depth，也称为“(测序)深度”)≥3×，SCORE≥20(SCORE为Bioscope根据测序信号强烈与否给出的0-100的分值)。保留下来的变异位点具有较高的SNP值和碱基覆盖度，并且位于基因的外显子上。
筛选方法的基本思想是，根据SNP位点的在染色***置，对照标准密码子表，检验翻译后的氨基酸的类型、极性是否发生变化以及移码框是否发生移位，来确定该SNP位点是否为非同义突变位点，筛选倍数达到1000×；将.gff文件转化为.snv文件格式，以便下步数据分析。
筛选结果：分别得到172、103、和129个SNP位点，结果见表5。
表5
新SNP分析及筛选
同时，利用SIFT分析(SIFT是用于预测人类功能及结构中氨基酸替换对蛋白结构和功能可能的影响，http://sift.jcvi.org/)在线平台对我们新发现的突变进行预测。并通过转移灶与癌以及血清之间的比较得到转移灶中所特有的SNP位点。
最后在10号样本中找到13个全新的SNP位点，是转移灶中所特有且没有在癌组织和血清中出现，并且对蛋白结构和功能产生重大影响。这13个位点的信息如表6：
表6
图14显示了突变SNP的筛选流程。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种基因组测序文库，其特征在于，所述文库中的待测序片段具有式I所示的结构：
5’-A-C-L-C-B-3’
式I
在式I中，
C表示LMP CAP接头；
L表示生物素化中间接头，且L与C互补；
A、B分别表示来源于基因组的、长度为50-250bp的待测序的核苷酸序列；
“-”表示磷酸二酯键；
较佳地，A或B的长度为50bp-250bp，更佳地50bp-100bp，最佳地为50bp。
2.如权利要求1所述的基因组测序文库，其特征在于，式I中，C的核苷酸序列为：5’-GTGCTGTCA-3’，或C的互补序列为：3’-GACGACA-5’。
3.如权利要求1所述的基因组测序文库，其特征在于，式I中，L的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或L的互补序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种基因组测序文库衍生物，其特征在于，所述衍生物具有式II所示的结构：
5’-P1-A-C-L-C-B-P2-3’
式II
在式I中，
C、L、A、B、和“-”的定义如上所述，
P1、P2分别为测序引物，且具有与单链测序引物结合的能力；
较佳地，C的核苷酸序列为：5’-GTGCTGTCA-3’，或C的互补序列为：3’-GACGACA-5’；
优选地，L的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或L的互补序列如SEQ IDNO：2所示。
5.如权利要求4所述的基因组测序文库衍生物，其特征在于，P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；或P1的互补序列如SEQ ID NO：4所示。
6.如权利要求4所述的基因组测序文库衍生物，其特征在于，P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；或P2的互补序列如SEQ ID NO：6所示。
7.如权利要求4所述的基因组测序文库衍生物，其特征在于，所述的单链测序引物具有SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8所示的序列。
8.如权利要求1所述的基因组测序文库，或权利要求4所述的基因组测序文库衍生物，其特征在于，A、B分别表示来源于基因组的、长度为50-250bp(较佳地50-100bp，更佳地50bp)的待测序的核苷酸序列。
9.一种SNP集，其特征在于，所述的SNP集包括选自下组的一种或多种：
(a)突变的F5基因，所述基因的第6486位核苷酸由C突变为G；
(b)突变的OR2T11基因，所述基因的第539位核苷酸由C突变为A；
(c)突变的TBRG1基因，所述基因的第2980位核苷酸由A突变为C；
(d)突变的POP5基因，所述基因的第765位核苷酸由C突变为T；
(e)突变的ZNF641基因，所述基因的第3175位核苷酸由T突变为G；
(f)突变的WNK1基因，所述基因的第143752位核苷酸由A突变为T；
(g)突变的MAP1A基因，所述基因的第4565位核苷酸由T突变为A；
(h)突变的GTF3C1基因，所述基因的第68015位核苷酸由G突变为C；
(i)突变的KIAA0556基因，所述基因的第127707位核苷酸由T突变为C；
(j)突变的SERPINB 10基因，所述基因的第19344位核苷酸由C突变为？T；
(k)突变的ZNF717基因，所述基因的第215位核苷酸由C突变为T；
(l)突变的MACC1基因，所述基因的第25100位核苷酸由C突变为G；
(m)突变的DEPTOR基因，所述基因的第91670位核苷酸由G突变为T。
10.权利要求9所述SNP集的用途，其特征在于，它被用于制备检测肺癌转移的试剂或试剂盒。
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Effective date of registration: 20190808 Address after: 250101 Shandong Province Jinan Hi-tech Zone Comprehensive Bonded Zone No. 1 North Section of Gangxing No. 3 Road Jinan Yaogu R&D Platform Area No. 2 Building 2508 Co-patentee after: Shandong Yuexin Inspection and Certification Group Co.,Ltd. Patentee after: JINAN MEASUREMENT METERING RESEARCH INSTITUTE Co.,Ltd. Co-patentee after: Shandong Yue Pin Education Group Co.,Ltd. Address before: 200031 Yueyang Road, Shanghai, No. 319, No. Patentee before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 2508, building 2, Jinan pharmaceutical Valley R & D platform area, No.1, north section of Gangxing Third Road, Jinan City, Shandong Province Patentee after: Measurement Research Institute (Shandong) Group Co.,Ltd. Patentee after: Institute of food, drug and environmental control (Shandong) Group Co.,Ltd. Patentee after: Academy of food, drug and Environmental Sciences (Shandong) Group Co.,Ltd. Address before: 250101 Shandong Province Jinan Hi-tech Zone Comprehensive Bonded Zone No. 1 North Section of Gangxing No. 3 Road Jinan Yaogu R&D Platform Area No. 2 Building 2508 Patentee before: JINAN MEASUREMENT METERING RESEARCH INSTITUTE Co.,Ltd. Patentee before: Shandong Yuexin Inspection and Certification Group Co.,Ltd. Patentee before: Shandong Yue Pin Education Group Co.,Ltd. |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240102 Address after: 250100, Building 2, Jinan Pharmaceutical Valley R&D Platform Area, No. 1, North Section of Gangxing Third Road, Jinan Area, China (Shandong) Pilot Free Trade Zone, Jinan City, Shandong Province, China 2508 Patentee after: Measurement Research Institute (Shandong) Group Co.,Ltd. Address before: 2508, building 2, Jinan pharmaceutical Valley R & D platform area, No. 1, north section of Gangxing Third Road, Jinan City, Shandong Province Patentee before: Measurement Research Institute (Shandong) Group Co.,Ltd. Patentee before: Institute of food, drug and environmental control (Shandong) Group Co.,Ltd. Patentee before: Academy of food, drug and Environmental Sciences (Shandong) Group Co.,Ltd. |
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