CN103370456A - 限定母体循环血液中保守的游离浮动胎儿dna的诊断性和治疗性靶物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于在母体宿主的生物学样品中检测胎儿DNA的存在的方法。具体而言,该方法包括基于提供的基因组区段信息鉴定至少一种保守基因组区段的基因型。本公开文本进一步提供了与胎儿异常有关的染色***置中的遗传标志物,用于使用母体宿主的生物学样品检测胎儿的遗传状况。还描述了用于通过DNA大小分级自母体全血样品富集无细胞胎儿DNA的方法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2010年8月24日提交的美国临时申请No.61/376,637的优先权,其通过提述完整并入本文。
发明领域
本发明提供了检测及表征母体样品(例如母体血液)中的胎儿遗传物质(例如胎儿DNA)以及基于非侵入性产前测试来鉴定胎儿状况。
发明背景
与通过游离浮动(free floating)的胎儿DNA的DNA诊断学有关的挑战很多。与DNA量、胎儿特异性DNA的富集、核酸纯度和了解妊娠和受试者间保守的特定胎儿DNA序列有关的问题是最大的障碍。目前,没有用于在诊断测试前测定胎儿DNA存在的令人满意的方法,这不利地影响报告一致的且可靠的数据的能力。还缺乏对可以用于鉴定特定序列(在疾病靶物外)的游离浮动胎儿DNA的充分表征,所述特定序列可以用于在妊娠间测定法开发中获得高成功率。
鉴于与通过母体全血的产前核酸分析有关的变化性,目前难以实施序列和突变特异性测定法开发。
因此,本领域中仍然需要检测胎儿DNA和相关胎儿状况的方法和途径。
本发明描述了用于检测及表征母体样品中胎儿遗传物质的技术办法。另外,本发明提供了基于母体样品中的胎儿遗传物质来鉴定胎儿状况的方法和相关材料。
发明概述
本发明部分基于如下的发现,即某些胎儿遗传物质在母体生物学样品例如母体血液中是保守的。因而,本发明提供了可用于检测胎儿遗传物质以及用于鉴定胎儿状况的方法和材料。
在一个方面,本发明提供了用于检测母体宿主(maternal host)生物学样品中胎儿DNA的存在的方法。在一个实施方案中,所述方法包括鉴定母体宿主生物学样品中至少一种保守基因组区段的基因型,并将该基因型与相应的母体基因型比较,从而基于样品基因型和母体宿主基因型之间的一个或多个差异来测定胎儿DNA的存在。
在一个实施方案中,所述保守基因组区段是表1中提供的基因组区段。在一个实施方案中,所述保守基因组区段包含表1中鉴定的任何探针。在另一个实施方案中,所述保守基因组区段包含表1中鉴定的任何基因。在又一个实施方案中,所述保守基因组区段是表1中鉴定的基因的片段,例如与表1中鉴定的基因的任何基因型标志物有关的片段。在又一个实施方案中,所述保守基因组区段是通过表1中鉴定的探针可鉴定的或与表1中鉴定的探针有关的任何基因。
在一个实施方案中,所述方法包括在母体宿主生物学样品中检测表1中提供的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少20种、至少50种、至少100种、至少150种、至少200种、至少250种、至少500种、至少600种、至少700种、或至少800种保守基因组区段的基因型,并将该基因型与相应的母体基因型比较,从而基于样品基因型和母体宿主基因型之间的一个或多个差异来测定胎儿DNA的存在。
在一个实施方案中,保守基因组区段的基因型包含任何一种或多种遗传组成的概况(profile),其适合于区别一种基因组与另一种基因组。例如,保守基因组区段的基因型可以包含单核苷酸多态性(SNP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、短串联重复(STR)、DNA序列、或其任何组合的概况。在一个实施方案中,保守基因组区段的基因型包含SNP的概况。在又一个实施方案中,一种或多种保守基因组区段的基因型包含一种或多种保守基因组区段中至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、或100个SNP的概况。
在一个实施方案中,母体宿主生物学样品包含任何经加工的或未加工的、固体的、半固体的、或液体的生物学样品,例如血液、尿液、唾液、粘膜样品(诸如来自子宫或***的样品等)。例如,母体宿主生物学样品可以是全血、部***解的全血、血浆、部分加工过的全血的样品。在一个实施方案中,母体宿主生物学样品是来自母体宿主全血的无细胞DNA或游离浮动DNA的样品。
在一个实施方案中,对母体宿主生物学样品富集胎儿DNA。在一个实施方案中,通过DNA大小分级对母体宿主生物学样品富集胎儿DNA。在一个实施方案中,含有胎儿DNA的DNA级分的特征在于具有约小于500个碱基对、或约50-约500个碱基对或约50-约400个碱基对、或约50-约300个碱基对、或约50-约200个碱基对、约50-约100个碱基对的大小。
在一个实施方案中,测定已经富集胎儿DNA的母体宿主生物学样品中至少一种保守基因组区段的基因型,并与母体细胞样品中相同的保守基因组区段的母体基因型比较。在一个实施方案中,富集胎儿DNA的母体生物学样品是全血样品。在别的实施方案中,母体细胞样品自母体全血样品衍生,例如在妊娠前。
在另一个方面,本发明提供了在胎儿中检测遗传状况的存在或缺乏的方法,包括在从胎儿母体宿主获得的生物学样品中检测遗传标志物的存在或缺乏。在一个实施方案中,所述遗传标志物在母体宿主生物学样品中的无细胞胎儿DNA中保守的染色***置内。在一个实施方案中,所述染色***置选自表2中列出的染色***置。在一个实施方案中,所述遗传标志物的存在或缺乏指示胎儿中遗传状况的存在或缺乏。
在一个实施方案中,母体宿主生物学样品包含任何经加工的或未加工的、固体的、半固体的、或液体的生物学样品,例如血液、尿液、唾液、粘膜样品(诸如来自子宫或***的样品等)。例如,母体宿主生物学样品可以是全血、部***解的全血、血浆、部分加工过的全血的样品。在一个实施方案中,母体宿主生物学样品是来自母体宿主全血的无细胞DNA或游离浮动DNA的样品。
在一个实施方案中,对母体宿主生物学样品富集胎儿DNA。在一个实施方案中,通过DNA大小分级对母体宿主生物学样品富集胎儿DNA。在一个实施方案中,含有胎儿DNA的DNA级分的特征在于具有约小于500个碱基对、或约50-约500个碱基对或约50-约400个碱基对、或约50-约300个碱基对、或约50-约200个碱基对、约50-约100个碱基对的大小。
在一个实施方案中,在检测遗传标志物的存在或缺乏之前、与其同时或之后,在生物学样品中确认胎儿DNA的存在。在一个实施方案中,如下在生物学样品中确认胎儿DNA的存在,即鉴定生物学样品中至少一种保守基因组区段的基因型,并将该基因型与相应的母体基因型比较,从而基于样品基因型和母体宿主基因型之间的一个或多个差异来确定胎儿DNA的存在。
在一个实施方案中,所述遗传标志物是来自无细胞胎儿DNA中保守的第一染色***置的第一遗传标志物与来自无细胞胎儿DNA中保守的第二染色***置的第二遗传标志物的组合。在另一个实施方案中,所述第一和第二染色***置是不同的。在别的实施方案中,所述方法进一步包括来自无细胞胎儿DNA中第三染色***置的第三遗传标志物。在又一个实施方案中,所述方法进一步包括来自无细胞胎儿DNA中第四染色***置的第四遗传标志物。在又一个实施方案中,所述方法进一步包括来自无细胞胎儿DNA中第五染色***置的第五遗传标志物。在一个实施方案中,第三、第四和/或第五染色***置不同于前两个且彼此不同。在另一个实施方案中,第一和第二染色***置,以及任选地第三、第四和第五染色***置位于相同或不同的染色体上。
在一个实施方案中,所述遗传标志物与骨骼发育异常有关。在别的实施方案中,所述遗传标志物与脊髓性肌萎缩有关。在又一个实施方案中,所述遗传标志物位于染色***置5q13-5q13内。
在一个实施方案中,所述遗传标志物与非整倍性有关。在一个实施方案中,非整倍性是三体性。在别的实施方案中,与三体性有关的遗传标志物位于一个或多个选自下组的染色***置内:X21.2-Xp21.1,17q11.2-17q11.2,3p26-3p25,5q13-5q13,16q24.3-16q24.3,1q24.2-1q23和/或11q22-11q23。在一个实施方案中,与三体性有关的遗传标志物在染色体13,14,15,16,18,21,22,X或Y的染色***置内。在另一个实施方案中,遗传标志物包含一组来自染色体13,14,15,16,18,21,22,X,Y或其任意组合的染色***置的遗传标志物。在又一个实施方案中,所述遗传标志物包含一组来自X21.2-Xp21.1,17q11.2-17q11.2,3p26-3p25,5q13-5q13,16q24.3-16q24.3,1q24.2-1q23,11q22-11q23或其任意组合的一个或多个染色***置的遗传标志物。
在一个方面,本发明提供了用于选择遗传标志物以在胎儿母体宿主的生物学样品中测定胎儿的遗传状况的方法,其如下进行:在母体宿主生物学样品中鉴定与要对所述胎儿测定的遗传状况有关的遗传标志物组,在所述遗传标志物组内鉴定如下的遗传标志物子集,其在所述母体宿主生物学样品中的无细胞胎儿DNA中保守的一个或多个染色***置内,选择遗传标志物子集以进行测定法测试,并基于从所述测定法测试获得的结果来确定所述胎儿的遗传状况。
在另一个方面,本发明提供了计算机可读介质中的数据库,其包含保守基因组区段。在一个实施方案中,所述保守基因组区段是表1中提供的那些保守基因组区段。在别的实施方案中,所述数据库基于表1中提供的每个染色***置或基因的标识符可搜索。
在一个方面,本发明提供了计算机可读介质,其包含表2中提供的染色***置。在一个实施方案中,所述数据库基于表2中提供的每个染色***置的标识符可搜索。
在一个方面,本发明提供了探针阵列,其可用于检测表2中提供的一个或多个染色***置内的一组遗传标志物。
发明详述
本发明部分基于如下的发现,即某些胎儿遗传物质在母体生物学样品例如母体血液中是保守的。因而,本发明提供了可用于检测胎儿遗传物质以及用于鉴定胎儿状况的方法和材料。
在本发明的一个步骤中,在胎儿的母体宿主生物学样品中检测胎儿DNA的存在。具体地,在怀孕女性的全血样品中检测无细胞胎儿DNA。“无细胞胎儿DNA”意指从胎儿而非母亲衍生且不在细胞内的DNA。在一个实施方案中,无细胞胎儿DNA包括在母体血液中循环的胎儿DNA。在另一个实施方案中,无细胞胎儿DNA包括存在于细胞例如胎儿细胞外的胎儿DNA。在又一个实施方案中,无细胞胎儿DNA包括存在于细胞外的胎儿DNA以及在母体血液样品经历部分或温和的细胞裂解后存在于此类血液样品中的胎儿DNA。
在本发明的此方面,从胎儿母体宿主获得生物学样品诸如全血样品,并测定母体宿主生物学样品中至少一种保守基因组区段的基因型。一种或多种保守基因组区段是一种或多种在表1中列出的鉴定的保守基因组区段。然后将母体宿主生物学样品的基因型与母亲的相同保守基因组区段的基因型比较。母体基因型和从胎儿母体宿主生物学样品测定的基因型的差异指示母体宿主生物学样品中胎儿DNA的存在。
在本发明的此方面,可以通过本领域中已知的任何手段对来自母体宿主的生物学样品富集胎儿DNA。在前三个月时间中,胎儿DNA占母体血液中找到的总体无细胞DNA的约6%。此比例随着妊娠龄进展而增加。然而,完整的胎儿DNA基因组不存在于任何给定样品中,例如仅胎儿DNA基因组的某些片段在母体生物学样品中是一致存在或保守的。另外,在循环母体血液中找到的胎儿DNA种类一般在大小上小于母体DNA的。因此,可以通过DNA大小分级来富集胎儿DNA。在此方法中,基于大小将DNA分开。胎儿DNA级分表征为具有小于约500个碱基对,例如约50-约500个碱基对或约50-约400个碱基对、或约50-约300个碱基对或约50-约200个碱基对或约50-约100个碱基对的大小的DNA级分。因此,分离具有小于约500个碱基对的大小的DNA级分,特别是具有约50-约300大小的级分在母体宿主生物学样品中富集胎儿DNA。然后,可以使用富集的胎儿DNA级分来测定胎儿的基因型,其通过测定表1中列出的至少一种保守基因组区段的基因型来进行。然后,将此基因型与来自母亲的相同的一种或多种保守基因组区段的基因型比较。可以通过在富集胎儿DNA前测定生物学样品中一种或多种保守基因组区段的基因型或者通过测定大小分级后含有比约250个碱基对大的DNA的DNA级分中一种或多种保守基因组区段的基因型来测定母体基因型。或者,可以将基因型与妊娠前测定的保守基因组区段的母体基因型比较。
“基因型”意指细胞或个体(即胎儿或胎儿的母体宿主)中的遗传组成。可以通过本领域中已知的任何方法来测定基因型。例如,可以通过DNA测序,例如NextGen测序、SNP、RFLP或STR分析来测定胎儿或胎儿母体宿主的基因型。对于SNP分析,可以使用许多SNP来测定基因型。例如,一组96个SNP允许SNP样式在每2x1023个个体中重复,由此给出遗传身份的高概率。通过DNA测序、SNP、RFLP、和STR来测定基因型的方法是本领域中公知的。
在本发明的一个方面,测定表1中列出的一种或多种保守基因组片段的基因型。“保守基因组片段”意指表1中给出的探针、表1中鉴定的任何基因、或表1中鉴定的任何基因片段的整个长度或其片段。在一个实施方案中,保守基因组片段包含表1中鉴定的一种或多种探针或基因内的一组片段。在本发明的一个方面,测定表1中给出的约5至约500种保守基因组片段的基因型。在本发明的另一个方面,测定表1中给出的约10至约400种保守基因组片段的基因型。在又一个实施例中,测定表1中给出的约20至约300种保守基因组片段的基因型。在又一个实施方案中,测定表1中给出的约30至约200种保守基因组片段的基因型。在另一个实施方案中,测定表1中给出的约40至约100种保守基因组片段的基因型。
“胎儿的母体宿主”意指怀有设法对其DNA检测和/或测试遗传状况的胎儿的女性。术语“胎儿的母体宿主”、“母体宿主”和“母亲”可互换使用。“胎儿”意指子宫中任何妊娠阶段的发育中的后代。可以在人妊娠的11周时开始的“胎儿期”前检测胎儿DNA。因此,“胎儿”不仅涵盖处于胎儿期,而且还有处于人妊娠第11周前的更早胚胎发育阶段的发育中的后代。
“生物学样品”意为自胎儿母体宿主衍生的任何样品。在一个实施方案中,母体宿主生物学样品包含任何经加工的或未加工的、固体的、半固体的、或液体的生物学样品,例如血液、尿液、唾液、粘膜样品(诸如来自子宫或***的样品等)。例如,母体宿主生物学样品可以是全血、部***解的全血、血浆、部分加工过的全血的样品。在一个实施方案中,母体宿主生物学样品是来自母体宿主全血的无细胞DNA或游离浮动DNA的样品。
在别的方面,本发明提供了一种胎儿的非侵入性遗传测试的方法,其通过检测与胎儿中遗传状况有关的遗传标志物的存在或缺乏来进行。例如,提供了用于检测胎儿中遗传标志物的存在或缺乏的方法,其通过在从胎儿母体宿主获得的生物学样品中检测遗传标志物的存在或缺乏来进行。遗传标志物的存在或缺乏指示遗传状况的存在或缺乏。
在一些方面,本发明提供了首先通过上文所描述的方法在来自胎儿母体宿主的样品中检测胎儿DNA的存在,然后对检测的胎儿DNA测试与疾病或状况有关的遗传标志物的存在或缺乏。
“遗传标志物”意指已知与疾病或状况有关的任何遗传标志物。在一个实施方案中,所述遗传标志物位于在母体宿主生物学样品中的无细胞胎儿DNA中保守的染色***置内。例如,所述染色***置是表2中列出的一个或多个染色***置/基因。在一些实施方案中,通过检测位于表2中所列的仅一个染色***置中的标志物的存在或缺乏来在胎儿中检测状况。在其它实施方案中,通过检测表2中所列的一个或多个染色***置/基因中超过一种遗传标志物(例如2种、3种、4种、5种、或超过5种标志物)的存在或缺乏在胎儿中检测状况。在一些实施方案中,所述遗传标志物可以是表2中所列的一个或多个染色***置或基因中的突变。所述突变可以是***、缺失、移码、取代或本领域中已知的任何其它突变。
可以通过本领域中已知的任何方法,例如DNA测序或PCR来测定遗传标志物的存在或缺乏。
在一些实施方案中,可以在自来自胎儿母体宿主的全血样品衍生的富集的胎儿DNA中检测一种或多种遗传标志物的存在或缺乏。举例而言,可以从胎儿母体采集全血样品,并分级大小,如上文所描述的,从而获得富集的胎儿DNA的样品。然后,通过本领域中已知的任何方法,例如DNA测序或PCR来测试富集的胎儿DNA,从而检测表2中所列的一个或多个染色***置内的遗传标志物的存在或缺乏。可以针对自母亲衍生的未富集的全血、或含有较大大小的分级DNA的母体DNA或在妊娠前从母体宿主获得的DNA样品的相同遗传标志物测试进一步比较通过此方法完成的胎儿DNA测试的结果,从而确认在胎儿DNA而非母体DNA中检测遗传标志物的存在或缺乏。
待检测的遗传状况可以是表2中列出的任何状况。例如,所述状况可以是脊髓性肌萎缩,并且可以通过检测5q13-5q13染色***置内一种或多种遗传标志物的存在来检测。
本发明的方法还可用于检测非整倍性(包括单体性或三体性)的存在或缺乏。例如,本发明的方法可用于检测三体性13,14,15,16,18,21,22,X,和/或Y。在一个具体的实施方案中,通过测量位于染色体21q22.2-21q22.3处的DCR基因、位于染色体21q22.2-21q22.3处的CBS基因、在21q22.3-21q22.3处的KNO基因和/或在染色体21q22.1-21q22.1处的SOD1基因或其任意组合来检测三体性21。
本发明进一步提供了用于选择遗传标志物以在胎儿母体宿主生物学样品中测定胎儿遗传状况的方法。在本发明的此方面,如下选择遗传标志物,即首先鉴定与要对胎儿测定的遗传状况有关的遗传标志物组,接着确定在鉴定为与特定状况有关的遗传标志物组间的这些标志物中的哪些落入母亲的母体宿主中无细胞胎儿DNA中保守的一个或多个染色***置内。接着,选择落入这一个或多个染色***置内的标志物子集以进行测定法测试,例如PCR或DNA测序分析,从而测定标志物的存在或缺乏。最后,对生物学样品测定选择的遗传标志物的存在或缺乏,并基于测定法结果来确定胎儿的遗传状况。
在检测和表征胎儿DNA的方法以及选择遗传标志物的方法外,本发明还提供了计算机可读介质中的数据库,其包含表1中的保守基因组区段。在一个具体的实施方案中,数据库基于表1中提供的每个保守基因组区段的标识符可搜索。这类标识符包括但不限于染色***置、比对探针ID、区段序列、基因符号、登录号、区段描述和任何其它有用的标识符。
本发明还提供了包含表2中提供的染色***置的计算机可读介质。在一个具体的实施方案中,数据库基于表2中提供的每个染色***置的标识符可搜索。这类标识符包括但不限于基因名称、Genbank ID号、基因序列、染色***置、关联的遗传状况和任何其它有用的标识符。
本发明还提供了可用于胎儿DNA和/或胎儿状况的遗传测试的探针阵列。在一个实施方案中,本发明的阵列包含可用于检测表2中列出的一个或多个染色***置内的一种或多种遗传标志物的探针。在一个实施方案中,本发明的阵列包含可用于检测表1中提供的一种或多种保守区段的探针。在另一个实施方案中,所述阵列含有选自表1中列出的DNA探针的1种或多种、或10种或更多种、或50种或更多种、或100种或更多种限定的DNA探针,所述探针可以与自母体生物学样品衍生的DNA杂交以检测DNA拷贝数变化增加或减少。在此实施方案中,所述阵列可以检测特定探针内涵盖的任何特定DNA区的拷贝数的增加或减少,由此表示增加的拷贝数和胎儿DNA的存在。在一些实施方案中,定制阵列以仅仅检测某些对应于表2中特定遗传标志物的染色***置,其可用于检测特定状况,例如三体性。在此实施方案中,选择来自表1的探针,其对应于涵盖表2中列出的特定目的基因的遗传标志物的染色***置。在其它实施方案中,所述阵列含有表1中所列探针的随机取样。在另一个实施方案中,所述阵列含有表1中列出的所有探针。在一些实施方案中,将探针附着于阵列,该阵列准备好与来自母体生物学样品的DNA杂交。在其它实施方案中,探针包含在准备好由终用户附着的溶液中。在此实施方案中,阵列可以由终用户定制以仅允许附着特定的目的探针。
表1
表2
应当理解,本文中描述的实施例和实施方案仅用于例示性目的,且按照其的各种修改或变化对于本领域中的技术人员会是提示性的,并且要纳入到本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请以及登录号、Agilent探针ID和GenBank ID(尤其是那些在表1和表2中提及的),都通过提述完整据此并入以用于所有目的。
实施例
为了在母体全血中鉴定胎儿来源的无细胞或游离浮动的DNA的保守区,采用以下实验设计。下文所描述的方法的成就已经产生用于在母体DNA背景中鉴定胎儿DNA的既是区域性又是序列特异性的靶物。该实验方法具有4个主要部分,包括:(1)母体全血DNA的温和裂解和基于珠的大小特异性DNA提取,(2)使用大小选择和数字PCR(digital PCR)的胎儿DNA富集和检测,(3)使用阵列CGH进行的母体的、胎儿分级的、胎儿的DNA的扣除杂交来鉴定无细胞胎儿DNA中的保守基因组区,和(4)靶物特异性下一代测序以鉴定供诊断测定法开发用的状况/疾病相关基因座。
实施例1:Dx裂解以进行胎儿DNA提取
从全血分离游离浮动的胎儿DNA呈现独特的挑战。使来自全血的胎儿DNA产量最大化的两个混淆变量是选择性裂解和解聚靶物特异性细胞和DNA,以在母体基因组DNA的背景中有效提取它们。为了完成此任务,规划完成两个关键目的的缓冲液和方案。首先,温和裂解规程选择性地裂解不在其最佳生长环境(即胎儿滋养层)中的细胞,从而允许从此细胞释放出其它情况不存在于非细胞DNA级分中的核酸,其次,解聚在其正常状态中不可用于有效提取的小DNA分子。此裂解缓冲液和规程将任何给定母体全血样品中胎儿DNA的产量增加约15%。在裂解后,在Qiagen Symphony Dx仪上采用用于DNA提取的自动化方法。此仪器利用基于珠的化学来从全血(或在此情况中温和裂解生成的)样品提取高质量DNA。将用于提取的化学进行修改以与Dx裂解产物一致工作,并进行优化以相对于高分子量基因组DNA种类优先分离“小的”DNA产物。在与对于使胎儿特异性突变的检测最大化至关重要的标准DNA提取实践相比时,这导致每份样品中胎儿DNA的富集。
简言之,样品由ACD管中8mL至10mL全血组成。将样品于2°-8°C贮存,并在收到的8小时内加工。将ACD管温和颠倒3次以将血液混合,然后取出10mL全血,并置于干净的15mL锥形底管中。然后,以10%(按体积计)添加BioDx20缓冲液(0.32M蔗糖,5mM MgCl2,3%Triton X-100,皂苷0.1%,10mMTris-HCl,pH7.3),例如对于10mL血液,添加1mL缓冲液。然后,将管颠倒至少4次,并以3000rpm离心5分钟以将液体层与管底部的裂解细胞碎片分开。然后,将细胞裂解物的顶部液体层取到第二个干净的15mL锥形底管中,注意不扰乱细胞碎片层。然后,将裂解物等分取样成1.2mL等分试样,并冷冻,供将来使用。将上文制备的1.2mL细胞裂解物等分试样移液到干净的2mL管中,并在Qiagen Symphony Dx仪上采用用于DNA提取的自动化方法以分离DNA。
实施例2:保守的游离浮动DNA序列的表征
利用扣除杂交办法来鉴定经过Dx裂解的、大小分级的游离浮动DNA中的胎儿特异性序列。简言之,该扣除杂交办法需要对每个临床情况运行两个CGH阵列。第一阵列针对胎儿DNA(受孕产物)分析母体DNA,从而鉴定胎儿基因组DNA的差异。第二阵列针对经富集的、游离浮动胎儿DNA(母体全血的产物)分析母体DNA,从而鉴定游离浮动胎儿DNA中存在的区域。从这两个阵列比较分析独特的胎儿区段鉴定出在分析的每个情况中游离浮动胎儿DNA样品中的保守区。通过遵循此杂交方案,我们可以确认在与完整的胎儿基因组比较时,哪些序列存在于游离浮动胎儿DNA级分中。这是保守序列鉴定过程的第一步。
使用微阵列载玻片通过阵列CGH分析鉴定游离浮动胎儿基因组中相对于完整母体和胎儿DNA的差异,所述微阵列载玻片含有244 000(244K)和100万种(1x1M)寡核苷酸探针(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)。
对于样品制备和杂交,我们遵循了由Agilent开发并详细描述的方案。简言之,如上文所述的,提取基因组DNA。用Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳确认DNA的完整性。对于没有WGA的阵列CGH,我们对每项分析使用2.5μg胎儿DNA和2.5μg母体DNA。用Rsa I和Alu I消化DNA,并使用Cy5-dUTP或Cy3-dUTP通过随机引发来标记。在用Microcon离心滤器,Ultracel YM-30(Millipore,Billerica,Ma,USA)纯化后,将探针变性,并与50μg人Cot-1 DNA(Invitrogen,Burlington,Ontario,Canada)预退火。于65°C在不断旋转的情况下实施杂交40小时。
在杂交后,依照制造商的用法说明书清洗载玻片,并立即用DNA微阵列扫描仪(Agilent Technologies)扫描。使用特征提取软件(Feature Extractionsoftware)第10.7.3.1版(Agilent)从扫描图像提取数据。然后,为了分析将文本文件输入到基因组工作台(Genomic Workbench)5.0.14标准版(Agilent)中。我们使用参照母体DNA来鉴定DNA拷贝数异常。所使用的算法基于统计学得分鉴定出给定样品中具有一致高或低的对数比率的所有异常区间。然后,其对相邻探针取样以达到异常区段(异常是呈现不足的,胎儿分级样品就是如此)的真实范围的估值。统计学得分代表了对数比率平均值与预期零值的偏差,以标准差为单位。该算法寻找如下的区间,其中基于经平均质量加权的样品和参照通道的对数比率的统计学得分超过用户规定的阈值。我们应用区域中最小值5个探针和最小绝对平均log2比率大于0.3的过滤选项。使用USCS人基因组装配hg18作为参照,并用Agilent基因组工作台分析软件中整合的数据库鉴定拷贝数变化(CNV)。
在用CGH分析软件分析期间,灵敏度阈值是6.0,且移动的平均窗口是1Mb。为了确定在特定基因座中有变化,必须不得不满足3项标准。这些是软件的正呼叫(positive call)、10种指出相同方向的连续探针的存在、和与参照正常DNA相比测试DNA中1.5倍平均倍数差异。
实施例3:NextGen测序
为了完全了解由阵列CGH鉴定的序列的长度和保真度,采用此下一代(NextGeneration)测序方法来验证并最终定位游离浮动胎儿基因组中的保守基因座。测序的基因座自用上文描述的阵列CGH鉴定的保守探查序列衍生。简言之,将鉴定为存在于游离浮动胎儿DNA中的保守探针序列用作“诱饵”来创建捕捉库,其用于对保守游离浮动胎儿DNA的完整区段测序。个体间天然基因组变异的程度在预测个体间胎儿DNA的保守性时产生别的问题。因此,谨慎利用来自同一个体的组成性(“正常”)DNA以及胎儿DNA作为潜在参照物,在此情况中,它是母体DNA。对于DNA分析,使用配对末端基因组文库,使用靶向测序方法。通过溶液杂交实施保守阵列CGH的序列捕捉,并使用Agilent SureSelectXTTM***回收。为此应用选择的30种靶序列的诱饵覆盖所有保守的胎儿区和侧翼10bp以询问剪接/供体/接受位点以及分支位点突变,并且使用Agilent的eArray https://earray.chem.agilent.com/earray设计。
简言之,将分离的DNA用Covaris AFA仪剪切成150-200bp的靶大小,用Agencourt AMPureTMXP珠纯化,使用无杯分光术来量化,并用Agilent2100生物分析仪测定质量。用T4聚合酶将DNA末端平端化,再纯化,并通过在3’添加A核苷酸进行修饰。在又一轮珠纯化后,将条形码编码的配对末端衔接头连接到DNA片段,然后,使用SureSelectTM索引化预捕捉(IndexingPre-Capture)PCR(反向)引物将所述DNA片段PCR扩增5个循环。在另一轮纯化后,将文库与溶液中的生物素化诱饵杂交,并在经链霉亲合素包被的顺磁性珠上回收。在存在互补的寡核苷酸封闭剂的情况下实施杂交以使可潜在降低富集水平的链或环的形成最小化。通过杂交后扩增对基因组片段加索引标签,并以等摩尔浓度合并以用于平衡测序。用配对的100bp阅读(read)以约700簇/mm2的密度完成测序。使用商品化软件(例如SeqNext,NextGene,ZOOM,MAQ)实施所有序列分析和突变检测。使用这些办法来验证初始序列数据比对,并报告覆盖深度上所有dbSNP130的基因型以及与其它基因型分型平台(例如illumina HumanOmni1million SNP芯片)的改善的一致率96%至大于99%。初始测序仪输出在*.bcl二进制文件(每个循环的碱基呼叫)中,其转化成每次阅读具有质量得分的完整阅读(*.qseq文件或质量和序列文件)和每个瓦片(tile)的索引化阅读的三分之一。这是一个必需的但相对快速的过程,并且使用由软件包提供的BCL转换器完成。然后,32个qseq文件/道(lane)在它们经过多路分解(demultiplexing)为其个体样品数据时转化成.fastq(基于文本的形式,用于存储核苷酸序列),并组合成每份样品2个文件,配对运行的每次阅读为1个。依照约定常规的样品ID_流动池ID_道#_阅读#.fastq对文件给出独特名字,从而可以将在不同运行和/或不同道上收集的样品数据置于相同文件结构水平。一旦将安排含有给定样品的数据的所有运行/道多路分解,将阅读与参照基因组比对,经由网络界面对每份样品进行选择。我们使用在BWA(Burrows-Wheeler比对)包中执行的Burrows-Wheeler转换方法,我们发现它比我们已经测试过的其它比对器(ELAND,Bowtie,Zoom,MAQ)在比对质量、比对的阅读数目和打开缺口的能力方面具有更好的表现。在比对要求后,.fastq文件分成10M阅读块,并在簇上产生BWA方法。每种BWA情况产生.SAM形式的比对,并将单一样品的所有.SAM文件连接成遵循约定样品ID_流动池ID_道#.sam具有独特命名的所述样品的最终比对结果文件。
这些方法已经总共鉴定出30位不同的独立受试者间的67,848个保守区,并且将该保守区与157处独特的疾病突变相关联。此外,该方法已经鉴定出目前在标准遗传分析中使用的70%产前标志和完整基因组间的保守区,提供了调查的新靶物。
从本发明的方法披露的大量数据可用于通过鉴定测定法开发的靶物进行的靶向诊断学、探索无细胞胎儿DNA基因组作为早期风险评估的筛选工具的全局筛选、以及采用无细胞胎儿DNA作为出生后分析工具的“随访”诊断学。
Claims (20)
1.一种在胎儿的母体宿主的生物学样品中检测胎儿DNA的存在的方法,包括
在所述母体宿主的所述生物学样品中鉴定表1中提供的至少一种保守区段的基因型;
将所述基因型与相应的母体基因型比较;
其中与所述相应的母体基因型不同的基因型指示所述胎儿的胎儿DNA的存在。
2.权利要求1的方法,其中所述生物学样品是富集胎儿DNA的母体宿主生物学样品。
3.权利要求1的方法,其中经由DNA大小分级对所述生物学样品富集胎儿DNA。
4.权利要求1的方法,其中所述生物学样品是来自母体宿主全血的无细胞DNA样品。
5.权利要求1的方法,其中所述基因型是SNP、RFLP、STR、DNA序列、或其组合。
6.权利要求1的方法,其中所述基因型是至少50个SNP的组。
7.权利要求1的方法,其中所述生物学样品是富集胎儿DNA的样品,且其中使用母体细胞样品来测定所述相应的母体基因型。
8.一种检测胎儿中遗传状况的存在或缺乏的方法,包括
在从所述胎儿的母体宿主获得的生物学样品中检测所述遗传状况的遗传标志物的存在或缺乏;
其中所述遗传标志物在所述母体宿主的所述生物学样品中的无细胞胎儿DNA中保守的染色***置内;
其中所述染色***置选自由表2中列出的染色***置组成的组;且
其中所述遗传标志物的存在或缺乏指示所述胎儿中所述遗传状况的存在或缺乏。
9.权利要求8的方法,其中所述生物学样品是富集胎儿DNA的母体宿主生物学样品。
10.权利要求8的方法,其中对所述生物学样品确认胎儿DNA的存在。
11.权利要求8的方法,其中所述遗传标志物是来自在无细胞胎儿DNA中保守的第一染色***置的第一遗传标志物和来自在无细胞胎儿DNA中保守的第二染色***置的第二遗传标志物的组合,其中所述第一和第二染色***置是不同的。
12.权利要求8的方法,其中所述遗传标志物与脊髓性肌萎缩有关,且所述染色***置是5q13-5q13。
13.权利要求8的方法,其中所述遗传标志物与三体性有关,且在选自下组的染色***置内:X21.2-Xp21.1,17q11.2-17q11.2,3p26-3p25,5q13-5q13,16q24.3-16q24.3,1q24.2-1q23和11q22-11q23。
14.权利要求8的方法,其中所述遗传标志物在染色体13,14,15,16,18,21,22,X和或Y上的染色***置内。
15.一种用于选择遗传标志物以在胎儿的母体宿主的生物学样品中测定胎儿的遗传状况的方法,包括
在所述母体宿主的所述生物学样品中鉴定与要对所述胎儿测定的遗传状况有关的遗传标志物组;
在所述遗传标志物组内鉴定如下的遗传标志物子集,其在所述母体宿主的所述生物学样品中的无细胞胎儿DNA中保守的一个或多个染色***置内;
选择遗传标志物子集以进行测定法测试;并
基于从所述测定法测试获得的结果来确定所述胎儿的遗传状况。
16.一种在计算机可读介质中的数据库,其包含表1中提供的保守基因组区段,其中所述数据库基于表1中提供的每种保守基因组区段的标识符可搜索。
17.一种在计算机可读介质中的数据库,其包含表2中提供的染色***置,
其中所述数据库基于表2中提供的每个染色***置的标识符可搜索。
18.一种探针阵列,其可用于检测表1中提供的至少一种保守基因组区段。
19.一种探针阵列,其可用于检测表2中提供的至少一个染色***置。
20.权利要求18的阵列,其可用于检测表1中提供的至少一种保守基因组区段的基因型。
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