CN103361311B - 利用清洗一次性使用去白细胞塑料血袋获取白细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用清洗一次性使用去白细胞塑料血袋获取白细胞的方法，是使用灭菌冲洗液冲洗“一次性使用去白细胞塑料血袋”上的白细胞过滤装置及装置上方的三通，去除其上粘附的物质；再使用灭菌高渗液对其浸没静置处理；用灭菌冲洗液冲洗高渗液处理后的过滤装置，同时收集白细胞；用灭菌白细胞保护液重悬白细胞沉淀并培养细胞使白细胞恢复正常形状；然后分离收集获得存活白细胞。本发明方法操作简单，实验设备要求低，且白细胞收集率高，为珍贵的白细胞资源回收利用又提供了一条简便的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种获取白细胞的方法，尤其涉及一种利用清洗一次性使用去白细胞塑料血袋获取白细胞的方法及专用溶液。
背景技术
随着临床手术等医疗手段的不断使用，使输血机率也大大增加，而临床上输血常常只输红细胞。目前血站分离红细胞通常使用“一次性使用去白细胞塑料血袋”，通过血袋中的白细胞过滤装置过滤白细胞，达到收集红细胞的目的，而此过程中存留于白细胞过滤器中的大量白细胞，血站把其作为医疗废弃物处理掉了。白细胞是重要的免疫细胞来源，如作为医疗废弃物扔掉的话，就会造成大量的资源浪费。
近年细胞治疗癌症在疗效上显示出越来越高的应用价值，其中免疫细胞治疗主要通过抽取人的外周血，提取白细胞，富集单个核细胞，通过添加细胞因子进行扩增培养，回输患者体内，达到治疗目的及效果。随着细胞免疫治疗技术越来越多的应用，生物科技工作者不断地探索扩增更高效免疫细胞的方法，而这些方法的建立需要大量以白细胞为基础的实验支持，而这些实验一般不需要红细胞，因此合理有效回收白细胞资源有重要的意义。经检索，通过回收“一次性使用去白细胞塑料血袋”过滤装置中的白细胞，将废弃的白细胞进行收集、分离、富集，达到白细胞的回收及最大化利用的专利及文献还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用清洗一次性使用去白细胞塑料血袋获取白细胞的方法及专用溶液。
本发明所述利用清洗一次性使用去白细胞塑料血袋获取白细胞的方法，步骤是：
（1）在百级洁净区内，使用灭菌冲洗液初步冲洗“一次性使用去白细胞塑料血袋”上的白细胞过滤装置，去除其上粘附的血渍；用注射器吸取冲洗液，***到血袋过滤装置上方的三通中，冲洗2-3次，去除其上粘附的物质；
（2）在百级洁净区内，再使用灭菌高渗液冲洗过滤装置30s，然后用高渗液对其浸没静置处理1-2min；
（3）在百级洁净区内，用灭菌冲洗液冲洗高渗液处理后的过滤装置，同时将含脱落白细胞的冲洗液转移至无菌离心管中；
（4）以1600转/分离心8-15min，弃去上清液，收集白细胞；
（5）在百级洁净区内，用灭菌白细胞保护液重悬白细胞沉淀并将细胞混悬液转移至无菌细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2培养箱中培养细胞2-3h，使白细胞恢复正常形状；
（6）在百级洁净区内，将培养后的白细胞悬液转移至无菌离心管中，以1000转/分离心3-5min，弃去上清液，沉淀即为收获的存活白细胞；
其中：
上述冲洗液配方是：PBS缓冲液、D-Hank’s液、DPBS、0.9%NaCl水溶液、1640培养基溶液或其他淋巴细胞无血清培养基溶液，优选1640培养基溶液；
上述高渗液配方是：NaCl15.0g/L、白蛋白50.0ml/L、NaHCO3适量；渗透压为350～500mOsm/kg，pH值为7.35～7.45，使用NaHCO3调节pH；
上述白细胞保护液配方是：每升1640培养基溶液中含有白蛋白10mg、AB血清60ml、胰岛素5mg、***钠5mg、hepess20mM、L-谷氨酰胺1mM、β-巯基乙醇0.1mM；渗透压为300mOsm/kg，pH值为7.35～7.45。
本发明所述利用清洗一次性使用去白细胞塑料血袋获取白细胞方法使用的冲洗液，其特征在于：所述冲洗液配方是：PBS缓冲液、D-Hank’s液、DPBS、0.9%NaCl水溶液、1640培养基溶液或其他淋巴细胞无血清培养基溶液，优选1640培养基溶液。
本发明所述利用清洗一次性使用去白细胞塑料血袋获取白细胞方法使用的高渗液，其特征在于：所述高渗液配方是：NaCl15.0g/L、白蛋白50.0ml/L、NaHCO3适量；渗透压为350～500mOsm/kg，pH值为7.35～7.45，使用NaHCO3调节pH。
本发明所述利用清洗一次性使用去白细胞塑料血袋获取白细胞方法使用的白细胞保护液，其特征在于：所述白细胞保护液配方是：每升1640培养基溶液中含有白蛋白10mg、AB血清60ml、胰岛素5mg、***钠5mg、hepess20mM、L-谷氨酰胺1mM、β-巯基乙醇0.1mM；渗透压为300mOsm/kg，pH值为7.35～7.45。
血站分离红细胞的“一次性使用去白细胞塑料血袋”中的白细胞过滤装置中有大量的白细胞存在，临床上输血仅使用红细胞，存在于白细胞过滤装置中的白细胞就被作为医疗废弃物处理掉，造成了白细胞的浪费。本发明公开的利用清洗一次性使用去白细胞塑料血袋获取白细胞方法，通过专用特制的试剂改变白细胞的形状大小，使白细胞能够通过过滤装置脱落下来,进而可以实现收集浪费的白细胞的目的。本发明方法中分离活细胞采用机械冲洗及低速离心，操作简单，实验设备要求低，且白细胞收集率高，为珍贵的白细胞资源回收利用又提供了一条简便的途径。
具体实施方式
实施例1
（1）在百级洁净区内，使用灭菌冲洗液初步冲洗“一次性使用去白细胞塑料血袋”上的白细胞过滤装置，去除其上粘附的血渍；用注射器吸取冲洗液，***到血袋过滤装置上方的三通中，冲洗2次，去除其上粘附的物质；
（2）在百级洁净区内，再使用灭菌高渗液冲洗过滤装置30s，然后用高渗液对其浸没静置处理2min；
（3）在百级洁净区内，用灭菌冲洗液冲洗高渗液处理后的过滤装置，同时将含脱落白细胞的冲洗液转移至无菌离心管中；
（4）以1600转/分离心10min，弃去上清液，收集白细胞；
（5）在百级洁净区内，用灭菌白细胞保护液重悬白细胞沉淀并将细胞混悬液转移至无菌细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2培养箱中培养细胞2h，使白细胞恢复正常形状；
（6）在百级洁净区内，将培养后的白细胞悬液转移至无菌离心管中，以1000转/分离心5min，弃去上清液，沉淀即为收获的存活白细胞；
其中：
上述冲洗液配方是：PBS缓冲液；配制过程：分析天平秤取NaCl8.00g、KCl0.20g、Na2HPO4·H2O1.56g、KH2PO40.20g，溶解在800ml超纯水中，然后将其转移到1L的容量瓶中，并补加超纯水至1000ml，混匀。将配好的PBS放入超净台中用0.22um滤膜过滤至50ml离心管中，封口，并放入到4℃冰箱中备用。
上述高渗液配方是：NaCl15.0g/L、白蛋白50.0ml/L、NaHCO3适量；渗透压为350～500mOsm/kg，pH值为7.35～7.45，使用NaHCO3调节pH；配制过程：分析天平秤取NaCl15.00g溶解在800ml超纯水中，然后加入50.0ml白蛋白，并将其转移到1L的容量瓶中，补加超纯水至1000ml，混匀。将配好的高渗液用NaHCO3调节pH至7.35～7.45，然后将其放入超净台中用0.22um滤膜过滤至50ml离心管中，封口，并放入到4℃冰箱中备用。
上述白细胞保护液配方是：每升1640培养基溶液中含有白蛋白10mg、AB血清60ml、胰岛素5mg、***钠5mg、hepess20mM、L-谷氨酰胺1mM、β-巯基乙醇0.1mM；渗透压为300mOsm/kg，pH值为7.35～7.45；配制过程：按照白细胞保护液配方，准确秤取培养基添加物，配制好1000ml白细胞保护液。用NaCl和NaHCO3调节培养基渗透压，用NaHCO3调节培养基PH。将调好PH和渗透压的培养基用0.22um滤膜过滤至50ml离心管中，封口，并放入到4℃冰箱中备用。
实施例2
（1）在百级洁净区内，使用灭菌冲洗液初步冲洗“一次性使用去白细胞塑料血袋”上的白细胞过滤装置，去除其上粘附的血渍；用注射器吸取冲洗液，***到血袋过滤装置上方的三通中，冲洗3次，去除其上粘附的物质；
（2）在百级洁净区内，再使用灭菌高渗液冲洗过滤装置30s，然后用高渗液对其浸没静置处理1min；
（3）在百级洁净区内，用灭菌冲洗液冲洗高渗液处理后的过滤装置，同时将含脱落白细胞的冲洗液转移至无菌离心管中；
（4）以1600转/分离心15min，弃去上清液，收集白细胞；
（5）在百级洁净区内，用灭菌白细胞保护液重悬白细胞沉淀并将细胞混悬液转移至无菌细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2培养箱中培养细胞3h，使白细胞恢复正常形状；
（6）在百级洁净区内，将培养后的白细胞悬液转移至无菌离心管中，以1000转/分离心4min，弃去上清液，沉淀即为收获的存活白细胞；
其中：
上述冲洗液配方是：1640培养基溶液；
上述高渗液配方是：NaCl15.0g/L、白蛋白50.0ml/L、NaHCO3适量；渗透压为350～500mOsm/kg，pH值为7.35～7.45，使用NaHCO3调节pH；
上述白细胞保护液配方是：每升1640培养基溶液中含有白蛋白10mg、AB血清60ml、胰岛素5mg、***钠5mg、hepess20mM、L-谷氨酰胺1mM、β-巯基乙醇0.1mM；渗透压为300mOsm/kg，pH值为7.35～7.45。
Claims (1)
1.一种利用清洗一次性使用去白细胞塑料血袋获取白细胞的方法，步骤是：
（1）在百级洁净区内，使用灭菌冲洗液初步冲洗“一次性使用去白细胞塑料血袋”上的白细胞过滤装置，去除其上粘附的血渍；用注射器吸取冲洗液，***到血袋过滤装置上方的三通中，冲洗2-3次，去除其上粘附的物质；
（2）在百级洁净区内，再使用灭菌高渗液冲洗过滤装置30s，然后用高渗液对其浸没静置处理1-2min；
（3）在百级洁净区内，用灭菌冲洗液冲洗高渗液处理后的过滤装置，同时将含脱落白细胞的冲洗液转移至无菌离心管中；
（4）以1600转/分离心8-15min，弃去上清液，收集白细胞；
（5）在百级洁净区内，用灭菌白细胞保护液重悬白细胞沉淀并将细胞混悬液转移至无菌细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2培养箱中培养细胞2-3h，使白细胞恢复正常形状；
（6）在百级洁净区内，将培养后的白细胞悬液转移至无菌离心管中，以1000转/分离心3-5min，弃去上清液，沉淀即为收获的存活白细胞；
其中：
上述冲洗液配方是：PBS缓冲液、D-Hank’s液、DPBS、0.9%NaCl水溶液、1640培养基溶液或其他淋巴细胞无血清培养基溶液；
上述高渗液配方是：NaCl 15.0g/L、白蛋白 50.0ml/L、NaHCO3 适量；渗透压为 350～500 mOsm/kg，pH值为7.35～7.45，使用NaHCO3调节pH；
其特征在于：
步骤（5）所述白细胞保护液配方是：每升1640培养基溶液中含有白蛋白10mg、AB血清60ml、胰岛素5mg、***钠5mg、hepess 20 mM、L-谷氨酰胺1mM、β-巯基乙醇0.1mM；渗透压为300mOsm/kg，pH值为7.35～7.45。
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