CN113025571B - 人外周血t淋巴细胞的处理方法及免疫原制剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人外周血T淋巴细胞处理方法及免疫原制剂、抗血清的制备和应用，具体利用废弃的白细胞滤盘分离纯化T淋巴细胞，并进行增殖培养，对分离后的T淋巴细胞和培养后的T淋巴细胞进行抗原表面标志鉴定比较及活性比较；再将扩增培养后的高活性T淋巴细胞作为免疫原，用健康猪进行抗血清的制备，用E玫瑰花环抑制实验和细胞毒实验结果评价免疫后的效价，制定免疫程序，即可大量制备抗血清；再采集抗血浆进行血浆的分离，用于ALG产品的制备。本发明可以解决抗人T淋巴细胞免疫球蛋白制备原料效价检定、成品效价检定中每次需要采集新鲜全血的限制问题，同时还能够解决抗人T淋巴细胞免疫球蛋白原料瓶颈的问题。

Description

人外周血T淋巴细胞的处理方法及免疫原制剂和应用
技术领域
本发明涉及血液制品技术领域，尤其涉及一种人外周血T淋巴细胞的处理方法及免疫原制剂、抗血清的制备和应用。
背景技术
抗人淋巴细胞免疫球蛋白（ALG）的适应症为主要用于临床器官移植的免疫排斥预防及治疗、骨髓移植的移植物抗宿主反应预防以及再生障碍性贫血等病的治疗。
抗人淋巴细胞免疫球蛋白产品常规采用人体胸腺淋巴细胞作为免疫原，免疫猪后得到抗人淋巴细胞免疫蛋白制品的原料血清，再经提纯、精制等获得猪抗人淋巴细胞免疫球蛋白制剂。
但是，人体胸腺淋巴细胞作为原料获取难度大，效价检定的规范性问题较差。另外，常规采用胸腺细胞作为抗原时，抗原成分比较复杂，免疫过程中会产生红细胞抗体、胸腺组织抗体以及血小板抗体等杂抗体，使得后续ALG产品的生产纯化工艺复杂。
发明内容
基于此，有必要提供一种人外周血T淋巴细胞的处理方法及免疫原制剂、抗血清的制备和应用。
本发明的技术方案如下：
概括地讲，本发明的技术构思在于利用废弃的白细胞滤盘，将T淋巴细胞从中分离纯化和增殖培养，对分离后的T淋巴细胞和培养后的T淋巴细胞进行抗原表面标志鉴定比较及活性比较；再将扩增培养后的高活性T淋巴细胞作为免疫原，免疫健康的猪，进行抗血清制备，用E玫瑰花环抑制实验和细胞毒实验结果评价免疫后的效价，制定免疫程序，即可大量制备抗血清；再采集抗血浆进行血浆的分离，用于ALG产品的制备。
具体地，本发明提供一种人外周血T淋巴细胞处理方法，包括如下步骤：收集白细胞滤盘中的白细胞，采用淋巴细胞分离液处理所述白细胞，获得分离纯化的单核细胞；对分离纯化的单核细胞进行活性鉴定，主要表面抗原分子进行鉴定和细胞计数。将所述分离纯化的单核细胞进行增殖培养，获得高活性T淋巴细胞（活性大于90%）。
本发明人外周血T淋巴细胞处理方法还包括细胞冻存的步骤：收集经表面抗原分子鉴定和细胞计数后的单核细胞，进行批量冻存，获得效价检定用细胞，用于解决每次检定需要采集新鲜全血的限制问题，可以解决效价检定用细胞的规范性问题。
本发明还提供一种T淋巴细胞免疫原制剂，主要由矿物油佐剂、分子佐剂和高活性T淋巴细胞经混合制备而成的水包油抗原制剂。优选地，所述矿物油佐剂优选自四川依思康RM502组分A或RM503组分A，分子佐剂优选自RM502组分B或RM503组分B。
本发明还提供一种T淋巴细胞免疫原制剂的制备方法，包括如下步骤：将所述高活性T淋巴细胞作为抗原，无菌条件下将抗原和矿物油佐剂按照质量比1:1混匀，再加入分子佐剂，震荡形成水包油抗原制剂。
本发明还提供一种含抗人淋巴细胞免疫蛋白的抗血清的生产方法，包括如下步骤：采用所述免疫原制剂颈侧肌注免疫健康猪，免疫程序为1次基础免疫和2次加强免疫，免疫时间间隔为21~28天，于第2次加强免疫后的第9~14天收集含抗人T细胞免疫蛋白的抗血浆，即得。优选地，还包括对所述抗血浆进行抗体效价分析的步骤。
本发明还提供一种抗人淋巴细胞免疫蛋白的生产方法，以白细胞滤盘收集的白细胞为原料，利用增殖培养的高活性T淋巴细胞免疫动物，生产获得的抗血清，分离，纯化，精制获得抗人淋巴细胞免疫蛋白。
本发明的有益效果是：
采用本发明人外周血T淋巴细胞处理方法可以利用废弃的白细胞滤盘获得高活性体外增殖T淋巴细胞，配合特定矿物油佐剂、分子佐剂制备免疫原制剂，采用颈侧肌注免疫猪，获得抗血清，能够解决抗人T淋巴细胞免疫球蛋白制备原料效价检定、成品效价检定中每次需要采集新鲜全血的限制问题，可以解决效价检定用细胞规范性问题，同时还能够解决抗人T淋巴细胞免疫球蛋白原料瓶颈的问题。同时，采用本发明增殖培养的T淋巴细胞不掺杂红细胞和血小板等，作为抗原后续免疫健康猪也几乎不会产生红细胞抗体和血小板抗体，更不会产生组织抗体和血浆抗体，可简化后续ALG产品的生产纯化工艺。
附图说明
图1为实施例1中白细胞滤盘的图片。
图2为实施例1中淋巴细胞分离时分层图片。
图3为编号2-6试验组的冻存细胞培养情况图片。
图4和图5为实施例2的流式细胞检测图。
图6为阴性对照和阳性对照的流式细胞检测图。
图7和图8为实施例3的淋巴细胞评价图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1 淋巴细胞的分离、冻存及质量评价
如图1所示，取白细胞滤盘（获取来源：武汉市中心血站）置于在生物安全柜中，用0.9%生理盐水对白细胞滤盘进行反冲，用无菌瓶收集反冲含有白细胞的生理盐水。
用移液管吸取15mL淋巴细胞分离液（厂家型号：福建三一）注入到分离管(规格50mL）中，加入15-30mL稀释血液样品。在1200g条件下离心10min，离心后，分离管内样品从上往下分层：血浆-白膜层-分离液-隔层-分离液-红细胞沉淀，样品分层情况如图2所示。再用移液管将白膜层吸入到新的无菌离心管(规格50mL）中，加入PBS缓冲液（pH≈7.2-7.4）至45mL，用移液管重悬清洗后的细胞样品，室温下采用300g条件离心5min，去除血小板。重复洗涤一次，获得纯度较高的单个核细胞，按照1*107/mL密度冻存或进行培养。冻存液为含10%DMSO的胎牛血清。
采用冻存淋巴细胞作为检定用细胞，具体是通过作为E玫瑰花环抑制试验和对照实验来评判是否可行。每次平行2个对照，不同时间（每间隔2周）取淋巴细胞作为检定，重复检测5次，结果如下表1所示：
表1 冻存淋巴细胞做E玫瑰花环实验
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由表1中结果可以看出，采用冻存淋巴细胞作为检定用细胞是可行的，且能保证每次检定对照组成立的批间一致性。
实施例2 淋巴细胞的增殖培养条件及表面抗原鉴定
本实施例探究培养条件对体外增殖培养淋巴细胞的影响，研究淋巴细胞增殖培养基（培养环境：37℃、5%的CO2培养箱）对细胞增殖周期、状态、密度、活性以及表面抗原分子鉴定情况。部分试验例的探究情况如下表2：
表2 增殖培养探究试验情况统计表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中，编号2-6试验组的冻存细胞培养情况如图3所示，显示：3~6天可以出现明显的淋巴细胞聚集，培养8~10天细胞生长达到高峰，14天后处于平台期，21天后的通过台盼蓝染色检测细胞活性达90%以上。
由上表可以看出：培养过程中，冻存淋巴细胞复苏细胞需要3-4天的恢复期，增殖高峰期有所改变，增殖倍数比新鲜的细胞略低，只能增殖约60~80倍。
另外，值得说明的是，本发明主要是利用废弃的白细胞滤盘获得人外周血T淋巴细胞并进行增殖培养，对T淋巴细胞的培养条件进行优化，对增殖培养前后T淋巴细胞表抗的变化以及与胸腺细胞等表抗的进行全面***的鉴定研究。发明人团队在大量的研究试验过程中发现：能够使T淋巴细胞快速增殖培养的主要条件是采用添加有CD3单抗、IL-2和IGF-1的RPMI1640含非必须氨基酸，保持增殖培养过程中维持高活性的是HSA【优选0.5g/L~1.5g/L】。RPMI1640含非必须氨基酸培养基要比一般用RPMI1640基础培养基要好，增值倍数和增长周期要长。
同时，采用优选培养液增殖培养的T淋巴细胞不掺杂红细胞和血小板等，作为抗原后续免疫健康猪也几乎不会产生红细胞抗体和血小板抗体，更不会产生组织抗体和血浆抗体。
其中，本实施例还分别将实施例1中冻存淋巴细胞和本实施例2-6增殖培养淋巴细胞分别用1%BSA的PBS缓冲液（pH≈7.2-7.4 ）重悬进行洗涤，1000rpm离心5min，弃上清，重复洗涤2-3次，再用流式细胞缓冲液配制为细胞密度7*106/mL的细胞悬液。取100μL细胞悬液，加入5~10μL抗体（类型：CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD56等）在常温下避光反应20min后，1000rpm离心5min去除上清。加入2mL、1%BSA的PBS缓冲液（pH≈7.2-7.4 ）洗涤一次，1000rpm离心5min，去除上清。再加入0.5mL含1%BSA的PBS缓冲液重悬，应用流式细胞仪检测。
检测结果如下表3所示，分离的初始淋巴细胞CD3+平均约为分析的淋巴细胞的59.81%，CD2+CD3+约为61.8%，CD3+CD4+约为32.73%，CD3+CD56+约为18.45%，CD3+CD8+22.15%，CD3+CD25约为8.23%。
对培养14天的淋巴细胞再进行检测，分析CD3+平均约为分析的淋巴细胞的98.8%，CD2+CD3+约为97.5%，CD3+CD4+约为18.32%，CD3+CD56+约为2.91%，CD3+CD8+75.31%，CD3+CD25约为10.6%。流式分析图见图4和图5。
收集增殖培养后的淋巴细胞，取出少量细胞用流式细胞仪分析CD2、CD3、CD4、CD8、CD44、CD45、CD98、CD38、CD99、CD107a等17种淋巴细胞分子，同时与Jurkat细胞（来源：购自Procell公司）和外周淋巴细胞进行了比较，结果下见表4：
表3 流式细胞仪分析淋巴细胞主要的表面抗原分子
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表4 表面抗原比对统计表
Figure DEST_PATH_IMAGE004
备注：（-）未检测。
由上表可以看出，外周血和白细胞滤盘抗原表达分子无太大差异。但与Jurkat细胞相比，CD4、CD8、CD25、CD44表达量均比Jurkat细胞要高；与胸腺细胞相比，CD4、CD50、CD107a要略低，CD3、CD44、CD82、CD49d要略高；而Jurkat细胞中的CD107a、CD50表达量均比外周血和滤盘要高。
实施例3 抗原制备、猪免疫方法及效价检测
将2-6试验组中增殖培养14天的淋巴细胞1500rpm离心5min，收集，用0.9%的NaCl生理盐水洗涤2-3次，应用细胞计数仪进行死活计数，细胞活性必须大于90%。
按照健康猪体重进行配制抗原细胞量：每5~8公斤配1亿增殖淋巴细胞量。无菌条件下取出矿物油佐剂与抗原按质量比 1:1 迅速混匀，再按照每头猪的免疫剂量加入10μL分子佐剂混匀，震荡10-20min，形成水包油抗原。其中，制备包油抗原制剂的配方如下表5：
表5 不同抗原制剂的配方用量表
Figure DEST_PATH_IMAGE005
在猪（品种：长白）的颈部两侧进行多点肌注。首次免疫间隔21天后进行第1次加强免疫，最后一次加强免疫在第2次免疫后21天进行。每次免疫前后采血检测效价，第2次加强免疫后连续监测抗体效价波动水平。即对本实施例不同抗原制剂采集的血浆应用E玫瑰花环抑制试验和淋巴细胞毒试验进行抗体效价分析。E玫瑰花抑制试验和淋巴细胞毒试验详细方法介绍请见2020版中国药典三部（通则3515和通则3516）。
通过E玫瑰花环抑制试验结果显示，采用3-1试验组首次经扩增的外周血淋巴细胞免疫健康猪后即产生了较强的免疫反应，有2头猪血浆效价检测合格，2次加强免疫后的第6-15天血浆抗体水平处于高峰期，均100%合格；18天后E玫瑰花环抑制率开始下降，结果见表6和图7。通过分析2次加强免疫后淋巴细胞毒的效价结果显示，在第9天时抗体水平最高，且87.5%的合格；后期开始下降，结果见表7和图8。
同时通过用流式细胞仪分析免疫后血浆的淋巴细胞毒实验结果显示，阳性阴性对照均成立，所有免疫后的猪浆经500倍稀释的淋巴细胞死亡率均很高，达到78%以上，最高的达到92.8%，见表8。
表6 采用3-1免疫猪浆E玫瑰花环抑制试验测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE006
表7 采用3-1的3免后免疫猪浆的细胞毒试验检测结果分析
Figure DEST_PATH_IMAGE007
表8 3-1的3免免疫猪浆样品500倍稀释后流式检测细胞毒试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE008
实施例4 猪免疫程序的制定
根据实施例3效价检测结果，将免疫程序定为：采用3-1抗原免疫制剂，免疫程序为1次基础免疫和2次加强免疫，免疫时间间隔21-28天。第2次加强免疫后9-14天采集抗血浆即可。
应用上述免疫程序再次免疫10头猪，测试其抗血浆效价检测结果需均符合2020版中国药典抗人T细胞猪免疫球蛋白原料制备的标准，结果统计见下表9：
表9 3免后采集的抗血浆（稀释1000倍）E玫瑰花环抑制试验检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE009
实施例5 应用
应用之一是将用上述实施例1中研究的细胞按批间制备检定用细胞库，解决效价检定用细胞规范性问题。
应用之二是将实施例3-1和3-2中研究抗原制剂制备以及实施例4免疫程序的制定用于生产大量的抗人T细胞免疫血浆，再按照抗人T细胞猪免疫球蛋白的工艺进行生产，并可进行规模化应用。采用特定条件增殖培养的T淋巴细胞作为抗原，几乎不会产生红细胞抗体和血小板抗体，更不会产生组织抗体和血浆抗体，可以简化生产工艺，减少产品成本，从而为广大的病人带来福利。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种人外周血T淋巴细胞处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
收集白细胞滤盘中的白细胞，采用淋巴细胞分离液处理所述白细胞，离心后吸取白膜层，采用PBS缓冲液进行重悬，离心重复洗涤，获得分离纯化的单个核细胞；
收集经活性鉴定合格的单个核细胞，进行批量冻存；
将所述经活性鉴定合格的单个核细胞进行增殖培养，所述增殖培养采用含CD3单抗、IL-2、IGF-1以及Human serum albumin（HSA）的RPMI1640 nonessential amino acids培养基，获得活性大于90%且不掺杂红细胞和血小板的T淋巴细胞。
2.一种T淋巴细胞免疫原制剂，其特征在于，为主要由矿物油佐剂、分子佐剂和按照权利要求1的处理方法制备获得的T淋巴细胞混合制备而成的水包油抗原制剂。
3.权利要求2所述的T淋巴细胞免疫原制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1制备获得的T淋巴细胞作为抗原，无菌条件下将抗原和矿物油佐剂按照质量比1:1混匀，再加入分子佐剂，震荡形成水包油抗原制剂。
4.一种经权利要求1所述的人外周血T淋巴细胞处理方法获得的高活性T淋巴细胞或者权利要求2所述的T淋巴细胞免疫原制剂在生产抗人T细胞免疫蛋白中的应用。
5.一种含抗人T细胞免疫蛋白的抗血清的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用权利要求2所述的T淋巴细胞免疫原制剂颈侧肌注免疫健康猪，免疫程序为1次基础免疫和2次加强免疫，免疫时间间隔为21~28天，于第2次加强免疫后的第9~14天收集含抗人T细胞免疫蛋白的抗血浆。
6.根据权利要求5所述的含抗人T细胞免疫蛋白的抗血清的生产方法，其特征在于，还包括对所述抗血浆进行抗体效价分析的步骤。
7.一种抗人淋巴细胞免疫蛋白的生产方法，其特征在于，以白细胞滤盘收集的白细胞为原料，利用权利要求5的生产方法获得的抗血清，分离，纯化，获得抗人淋巴细胞免疫蛋白。
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白细胞滤板中T 淋巴细胞的分离培养;邹浩勇等;《中国生物制品学杂志》;20171130;第30卷(第11期);全文，尤其是摘要，第1212页第1.3-1.7节，第2.1-2.3节，第1213页右栏第2.4节，第1214页左栏第3节 *

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